Orientador: Iveraldo dos Santos Dutra / Banca: Júlio Cesar de Freitas / Banca: Tereza Cristina Cardoso da Silva / Banca: Raul José Silva Girio / Banca: Samir Issa Samara / Resumo: Foi avaliado pelo teste de ELISA indireto a resposta humoral para as toxinas botulínicas tipos C e D em animais vacinados com quatro diferentes produtos comerciais. Empregou-se duas vacinas bivalentes C e D (vacina 1 e vacina 2) e duas polivalentes contendo ainda os toxóides botulínicos tipos C e D (vacina 3 e vacina 4). Para análise foram realizadas seis colheitas de sangue ao longo do experimento, nos dias 0, 42, 75, 160, 250 e 342 após a vacinação. A imunidade passiva em bezerros até os 90 dias de idade, filhos de mães vacinadas com diferentes toxóides comerciais foram avaliados em 75 bezerros, agrupados de acordo com a vacina utilizada na mãe (B1, B2, B3 e B4). Para análise foram realizadas 3 colheitas de sangue, nos dias 5 (± 2), 45 e 90 dias após o nascimento. A avaliação da resposta humoral de bovinos vacinados em diferentes faixas etárias também foi realizada empregando-se uma vacina antibotulínica bivalente (C e D) comercial. Para análise, 90 bovinos foram divididos em 3 grupos de acordo com a faixa etária; animais com idade inferior a 2 anos, entre 2 e 5 anos e superior a 5 anos. Na avaliação da resposta humoral de animais vacinados com quatro diferentes produtos comerciais, para a toxina tipo C, as vacinas 1, 2, 3 e 4 não apresentaram diferenças significativas aos 42 dias da primeira dose. Aos 75 dias, a vacina 1, foi superior às vacinas 3 e 4, induzindo maior produção de anticorpos nos animais, porém não diferiu da vacina 2. Aos 160 dias houve queda na quantidade de anticorpos em todos os grupos, não havendo mais diferenças significativas entre as quatro vacinas testadas. Para a toxina tipo D, aos 42 dias da vacinação, não houve diferenças significativas entre as vacinas 1, 2 e 4, que apresentaram neste momento, valores superiores a vacina 3. No entanto, quando avaliadas aos 75 dias, a vacina 1 apresentou maior produção de anticorpos, diferindo... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: To compare the efficiency of an "in house" ELISA test, standardized to measure antibody C and D from Clostridium botulinum, a survey to analysis four different commercial vaccines was conducted. The vaccines used were two commercial, bivalent botulinum containing subtypes C and D (vaccine 1 and vaccine 2) and other two polyvalent including subtypes C and D. The first trial was blood samples taken at 0, 42, 75, 160, 250 and 342 days after vaccination, whereas the booster was performed at day 42. The second trial, maternal antibodies were also measured taken blood samples from 1-3 months age steers obtained from vaccinated heifers with the same vaccines described above, and divided into four different groups (B1, B2, B3, B4). The blood samples were taken at days 5, 45 and 90 after birth. Third and last trial was humoral response from vaccinated cattle with different age evaluation performed using the commercial Clostridium botulinum vaccine subtype C and D. For this purpose, 90 animals never vaccinated, were divided into 3 groups: 1 - 2 years old; 2 - animals aged between 2 and 5 years old; 3 - animals 5 years old. The blood samples were taken 30 days after vaccination after second dose of the vaccine. From the first trial, no significant difference was observed when subtype C was search in sera from animals at 42 days after vaccination. However, at 75 days after vaccination, vaccine 1 was able to induce higher levels of antibodies when compared to vaccine 3 and 4. The antibody level was declining after 160 days post vaccination. For subtype D antigen, at 42 days after vaccination, no differences could be observed. However, at 75 day after vaccination, higher levels of antibodies were observed from animals vaccinated with vaccine 1. Comparing the bivalent vaccines, these were able to induce higher antibodies levels at 75 days after vaccination (toxoid C). In addition, the same... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

A leishmaniose tegumentar é uma doença infecciosa, amplamente disseminada, sendo L. (V.) braziliensis e L. (L.) amazonensis, no Brasil, as espécies de maior importância médico-epidemiológica. Devido ao impacto epidemiológico da leishmaniose, medidas profiláticas devem ser desenvolvidas para o controle da doença, tal como vacinas. Portanto, o presente trabalho objetivou avaliar a imunogenicidade e potencial protetor de dois imunógenos denominados como ferro superóxido dismutase (FSD) e serino peptidase (SP). Os genes codificadores dos antígenos foram sintetizados e clonados no plasmídeo pVAX1 (pVAX1-FSD e pVAX1-SP). Camundongos BALB/c foram imunizados com ambos os alvos na concentração de 1,0 ug/uL, por três vezes, a intervalos regulares de 15 dias, e desafiados ou não com formas promastigotas de L. (L.) amazonensis. Os animais foram avaliados clínica, parasitológica e imunologicamente nos estudos de imunogenicidade e proteção. Os resultados obtidos demonstraram que ambas os imunógenos foram pouco imunogênicos, não apresentando alterações em linfócito T CD4; por outro lado, detectaram-se frequências diminuídas de linfócito TCD8 produtores de IFN-y e TNF-alfa. Entretanto, nos experimentos de desafio, verificou-se que os animais imunizados com pVAX1-FSD apresentaram uma resposta mista Th1 e Th2, devido ao aumento de linfócitos T produtores de IFN-y e IL-4, o que se associou a níveis altos de IgG1 e IgG2a, levando a uma diminuição da carga parasitária. O alvo pVAX1-SP também induziu resposta imunológica mista nos animais, todavia foi detectado frequências elevadas de linfócitos T CD8 produtores IL-10, e esta resposta foi associada a ausência de proteção nesses animais / American tegumentar leishmaniasis is an infectious disease, widespread, and in Brazil the species L. (V.) braziliensis and L. (L.) amazonensis are the most relevant in medical-epidemiological studies. Due to the epidemiological impact of leishmaniasis, prophylactic measures should be developed to control this disease, such as vaccines. Therefore, the present study aimed to evaluate the immunogenicity and the protective potential of two vaccine candidates known as iron superoxide dismutase (FSD) and serine peptidase (SP). FSD- and SP-coding genes were synthesized and cloned into plasmid pVAX1 (pVAX1-FSD and pVAX1-SP). BALB/c mice were immunized with both candidates at a concentration of 1.0 ug/uL, three times at intervals of 15 days and challenged or not with L. (L.) amazonensis promastigotes. Animals were evaluated clinically, immunologically and parasitologically in the studies of immunogenicity and protection. The results showed that both vaccines presented low immunogenicity, and after immunization BALB/c mice did not show significant changes in CD4 T lymphocytes, by the other side, the frequency of IFN-y and TNF-alfa producing cells were low. However, after challenge pVAX1-FSD-immunized mice presented a mixed Th1 and Th2 immune response, due to the high frequencies of IFN-ye IL-4-producing T lymphocytes, with association to high levels of IgG1 and IgG2a isotypes, leading to parasite burden decreasing. pVAX1-SP vaccine candidate also induced mixed immune response in animals, however high frequencies of IL-10-producing CD8 T lymphocytes was found, justifying the absence of protection in these animals

Em trabalhos anteriores o nosso grupo mostrou que a vacina celular pertussis (wP) apresenta atividade adjuvante quando combinada a proteína A da superfície de Streptococcus pneumoniae (pneumococo), PspA, A formulação PspA5-wP induz altos níveis de anticorpos e proteção em camundongos após desafio com pneumococo. Neste trabalho foram avaliados os mecanismos da ação adjuvante e os componentes de B. pertussis responsáveis por este efeito. A imunização de camundongos com PspA em combinação a mutantes de B. pertussis ou componentes desta bactéria purificados mostrou que a presença da toxina pertussis (PT) capaz é essencial para induzir altos níveis de anticorpos anti-PspA e proteção significativa contra o desafio letal com pneumococo. Este efeito não foi dependente da atividade enzimática. Anticorpos anti-PspA e as proteínas do sistema complemento foram essenciais para a proteção conferida por PspA-wP. As vacinas celulares BCG e DTP combinadas a PspA, também apresentaram atividade adjuvante, induzindo anticorpos anti-PspA e proteção contra o desafio invasivo por pneumococo. / Previously our group showed that the pneumococcal surface protein A from Streptococcus pneumoniae (pneumococcus), PspA, when combined with cellular pertussis vaccine (wP) as adjuvant, induce high levels of antibodies and mice protection on pneumococcal challenge. In this work were used mutants and purified components derived from B. pertussis for investigate the components responsible for this adjuvant effect, through of mice immunizations in combination with the PspA5 (Clade 5 PspA) antigen. Pertussis toxin (PT) was able to inducing the higher levels of PspA5 specific antibodies and significative protection against the pneumococcal lethal challenge, independently of its enzymatic effect. Was observed that in the protection conferred by the PspA5-wP formulation thus as the anti-PspA5 antibodies, the complements proteins are essentials. Lastly, prime-boost experiments showed that the cellular vaccines BCG and DTP when combined to PspA5, induced high levels of anti-PspA5 antibodies and protection against invasive challenge with pneumococcus.

O câncer cervical é o terceiro tipo de câncer mais comum entre as mulheres, sendo a infecção por HPV16 o principal fator de risco para sua etiopatogênese. Neste trabalho avaliamos o potencial profilático e terapêutico da vacina proteica E6E7, constituída de epítopos imunogênicos de E6 e E7 do HPV16, com ou sem Ubiquitina (Ub) fusionada (E6E7Ub e UbE6E7), contra tumor de células TC-1. A vacina E6E7 conferiu total proteção contra a formação de tumores em animais C57BL/6 selvagens, CD4 nocautes e TLR4 deficientes previamente imunizados e posteriormente desafiados com células TC-1. Entretanto, em animais imunizados após desafio, a fusão da Ub no antígeno E6E7 foi crucial para a vacina promover a regressão do tumor em 60% dos animais. Além da fusão da Ub na extremidade N-terminal do antígeno (UbE6E7) aumentar a poliubiquitinação in vitro, essa estratégia de fusão promoveu uma melhor resposta imunoterapêutica contra o tumor que E6E7 e E6E7Ub, sendo promissora para o desenvolvimento de vacinas terapêuticas contra câncer cervical e também contra outros tipos de câncer. / Cervical cancer is the third most common cancer women worldwide and HPV16 infection is a major risk factor for its ethiopathogenesis. In this study we evaluated in mice the prophylactic and therapeutic potential of the E6E7 proteic vaccine, consisting of immunogenic HPV16 E6 and E7 epitopes, with or without Ubiquitin-fused (E6E7Ub and UbE6E7), against TC-1 tumor cells. The E6E7 vaccine conferred complete protection against tumor growth in previously immunized wild-type, CD4 knockout and TLR4 deficient mice challenged with TC-1 cells. However, immunization of previously challenged animals with TC-1 cells, Ubiquitin-fused antigens promoted tumor regression in 60% of mice against 0% in non-Ubiquitinfused antigens. Besides, the fusion of Ubiquitin at the N-terminus of the antigen (UbE6E7) seems to enhance polyubiquitination in vitro, this Ubiquitin fusion strategy promoted an effective immunotherapeutic response against the tumor, being promising for the development of therapeutic cervical cancer vaccines and also other types of tumor.

O objetivo desta dissertação de mestrado foi avaliar a eficácia de uma vacina autógena no controle do footrot (FR) dos ovinos, para tanto foram desenvolvidos dois experimentos em duas propriedades rurais distintas, no Estado do Rio Grande do Sul (RS). O primeiro experimento foi conduzido em uma propriedade rural do município de Santiago, com um extenso histórico de surtos de footrot no rebanho ovino. Inicialmente foi colhido material infeccioso presente no rebanho para a produção de uma vacina autógena, posteriormente 347 ovelhas foram vacinadas (grupo V) com duas doses da vacina com 30 dias de intervalo, a dose foi 2 ml por via subcutânea. Desse grupo, 150 animais receberam a vacina na região axilar (grupo Va) e 197 animais receberam a vacina na região inguinal (grupo Vb). Um grupo de 75 ovelhas formou o grupo controle (grupo C) sem vacinação. Os dados mostraram que a prevalência do FR no grupo V que inicialmente era de 4%, sofreu uma redução para 2% na semana 23, chegando à zero na semana 30. No grupo C a prevalência de animais infectados foi de 6,7% no início do experimento, teve uma redução para 5,3% na semana 23 e ao final estava em 3,7%. Observou-se uma redução gradativa no número de ovinos infectados nos dois grupos, entretanto a eliminação seletiva ocorrida no grupo controle prejudicou a análise estatística dos dados. Amostras de sangue foram colhidas da jugular dos animais para verificar títulos de anticorpos aglutinantes contra o antígeno presente na propriedade em cinco ocasiões durante o experimento. Os resultados mostraram diferenças significativas (p<0,001) entre os títulos de anticorpos aglutinantes contra Dichelobacter nodosus no soro de ovinos vacinados e não vacinados durante o experimento. A análise das reações vacinais locais apontou a região inguinal como o melhor local para a aplicação da vacina com adjuvante oleoso por via subcutânea e também demonstrou uma relação direta entre a idade dos ovinos e o percentual de reações vacinais locais e a severidade dessas reações. Os resultados sugerem que a vacina autógena com adjuvante oleoso obteve sucesso no controle da doença. O segundo experimento foi conduzido em uma propriedade rural do município de Glorinha, com o objetivo de avaliar a resposta imunológica provocada por uma vacina monovalente e por uma vacina polivalente (7 sorogrupos) contra o FR. Trinta fêmeas ovinas, com idades variadas, foram divididas aleatoriamente em 3 grupos de 10 animais: grupo controle (C) que não foi vacinado, grupo vacinado com vacina monovalente (Vm) e grupo vacinado com vacina polivalente (Vp). Os ovinos vacinados receberam duas doses com quatro semanas de intervalo, a dose foi de 2 ml por via subcutânea na região inguinal. Amostras de sangue foram colhidas da jugular dos animais para verificar títulos de anticorpos aglutinantes contra o D. nodosus em quatro ocasiões durante o experimento. Os resultados mostraram diferenças significativas (p<0,001) entre os títulos médios geométricos (GMT) de anticorpos aglutinantes contra D. nodosus no soro de ovinos dos grupos Vm, Vp e C na quarta, sétima e 12ª semanas do experimento. Em relação aos títulos médios geométricos (GMT) entre os grupos Vm e Vp houve diferenças estatisticamente significativas na quarta e sétima semanas. A vacina monovalente induziu títulos de aglutininas superiores contra o D.nodosus em comparação com a vacina polivalente. / The objective of this work was to evaluate the efficacy of an autogenous vaccine in the control of footrot (FR) in sheep. Two field experimental works were carried on two different farms located in the State of Rio Grande do Sul (RS), Brazil. The first experiment was conducted on a farm in the municipality of Santiago, with a long history of FR outbreaks in their sheep flock. At beginning of the trail samples from FR infected sheep were collected for the production of an autogenous vaccine. Following 347 sheep were vaccinated (group V) with two doses of 2 ml subcutaneously vaccine 30 days apart. Of this group, 150 animals received the vaccine in the axillary region (group Va) and 197 animals received the vaccine in the inguinal region (group Vb). A group of 75 sheep formed the control group (group C) without vaccination. The data showed that the prevalence of FR in the group V initially 4%, was reduced to 2% at 23 weeks, reaching to zero at week 30. In the group C the prevalence of infected animals of 6.7% at the beginning of the experiment, was reduced to 5.3% at week 23, decreasing to 3.7%, at the end. There was a gradual reduction in the number of infected sheep in both groups, however the selective elimination occurred in the group C affected the statistical analysis. Blood samples were collected from the jugular vein of the animals to see evidence of agglutinating antibodies against the antigen present on the property on five occasions during the experiment. The results showed significant differences (p<0,001) between antibody titers against Dichelobacter nodosus in the serum of sheep vaccinated and not vaccinated during the experiment. The analysis of local vaccine reactions showed the inguinal region as the best place for the application subcutaneously oil-adjuvant vaccine and also demonstrated a direct relationship between the age of the sheep and the percentage of local vaccine reactions and the severity of these reactions. The results suggest that autogenous oil-adjuvant vaccine succeeded in controlling the disease. The second experiment was conducted on a farm in the municipality of Glorinha, in order to evaluate the immune response elicited by a monovalent and a polyvalent vaccine against FR, containing seven serogroups. Thirty ewes, of various ages were randomly divided into 3 groups of 10 animals each: control group (C) was not vaccinated, group vaccinated with monovalent vaccine (Vm) and the group vaccinated with polyvalent vaccine (Vp). The sheep were vaccinated with two doses of 2 ml subcutaneously in the inguinal region, four weeks apart. Blood samples were collected from the jugular vein of the animals to determine agglutination titers against D. nodosus in the beginning of the experiment (day zero) and in other three occasions, weeks 4, 7 and 12. The results showed significant differences (p<0,001) between the geometric mean titers (GMT) of antibodies against D. nodosus in the serum of sheep of groups Vm, Vp and group C in the fourth, seventh and 12th weeks of the experiment. For the geometric mean titers (GMT) between the groups Vm and Vp there was statistically significant differences in the fourth and the seventh weeks. The monovalent vaccine induced titers of higher against D. nodosus compared with the polyvalent vaccine.

A laparoscopia de eqüinos em estação tem sido avaliada como uma alternativa diagnóstica e terapêutica, porém, a semelhança do que ocorreu na Medicina Humana e na rotina clínica de pequenos animais, sua utilização na espécie eqüina ainda carece de estudos que estabeleçam de forma mais definitiva as situações específicas onde seu uso possa ser recomendado. Para tal, o conhecimento da anatomia laparoscópica de animais hígidos é fundamental no aprendizado do cirurgião. O presente estudo teve por objetivo realizar uma detalhada descrição anatômica da cavidade abdominal de eqüinos posicionados em estação e distribuídos em três grupos conforme a massa corpórea, verificando possíveis limitações. Foram utilizados 21 eqüinos hígidos, sendo 7 fêmeas e 14 machos, submetidos a jejum alimentar de 18 a 24 horas. No grupo A foram incluídos animais com até 250 kg, enquanto no grupo B utilizaram-se animais entre 251 a 350 kg e no grupo C animais acima de 351 kg. Os animais foram sedados com a associação de detomidina e butorfanol e a dessensibilização cutânea e muscular realizada com infiltração local de lidocaína. A técnica cirúrgica realizada foi a laparoscopia com acesso pelas fossas paralombares esquerda e direita, utilizando a introdução vídeoassistida da cânula EndoTIP™, iniciando sempre pelo flanco esquerdo. Este primeiro acesso permitiu a observação do diafragma, estômago, lobo hepático esquerdo, baço, área renal, intestino delgado, cólon menor, bexiga, órgãos reprodutivos internos do macho (cordão espermático e epidídimo) e da fêmea (ovários e corno uterino) e reto. No acesso paralombar direito foram observados: diafragma, lobo hepático direito, área renal direita, cólon dorsal direito, duodeno, base do ceco, intestino delgado, cólon menor, bexiga, órgãos reprodutivos internos do macho (cordão espermático e epidídimo) e da fêmea (ovários e corno uterino) e reto. A principal complicação transoperatória encontrada foi à insuflação de gás no espaço retroperitoneal, que ocorreu em quatro animais. Não foram visibilizados o forame epiplóico e o pâncreas em nenhum dos animais do estudo. Além disso, as demais estruturas não visualizadas, independentemente do porte físico e do flanco examinado foram: o lobo esquerdo do fígado (2 animais), a porção direita do diafragma (14 animais), o reto (três animais) e a bexiga (um animal). O procedimento videolaparoscópico para estudo da anatomia abdominal de eqüinos adultos hígidos em estação é viável, não sendo observadas limitações decorrentes do tamanho do animal. / Laparoscopy on standing horses has been assessed as a diagnostic and therapeutic alternative. However, similarly as it has been in Human Medicine and in the clinical routine of small animals, its utilization in equines still needs further studies that could establish, with more conviction, specific situations where its use can be recommended. For the purpose, knowledge of laparoscopic anatomy in healthy animals is fundamental for the learning of the veterinary surgeon. The present study aimed at performing a detailed anatomic description of the abdominal cavity of equines in standing position. The animals were distributed into three groups according to the corporal mass, and the possible limitations were verified. Twenty-one healthy equines were used, 7 of which were females and 14 males, and which were submitted to a 18- to 24-hour fasting period. Animals weighing up to 250 kg were included in group A, whereas animals weighing between 251 to 350 kg were used in group B and animals weighing more than 351 kg in group C. The animals were sedated using an association of detomidine and butorphanol, and cutaneous and muscular desensitization was obtained with the local infiltration of lidocaine. Laparoscopy was the surgical technique performed, with access through the left and right paralumbar fossas using a video-assisted introduction of a EndoTIP™ cannula, always starting from the left flank. This first access allowed the observation of the diaphragm, stomach, left hepatic lobe, spleen, renal area, small intestine, small colon, urinary bladder, internal reproductive organs of the male (spermatic cord and epididymis) and rectum. During the right paralumbar access, the following structures were observed: diaphragm, right hepatic lobe, right renal area, right dorsal colon, duodenum, base of the cecum, small intestine, small colon, urinary bladder, internal reproductive organs of the male (spermatic cord and epididymis) and female (ovaries and uterine horns) and rectum. The main transoperative complication encountered was the insufflation of gas in the retroperitoneal space, which occurred in four animals. The epiploic foramen and pancreas were not observed in any of the animals used in the study. Additionally, these other structures were not observed, regardless of the physical size and flank examined: left hepatic lobe (2 animals), right portion of the diaphragm (14 animals), rectum (three animals) and urinary bladder (one animal). Therefore, the video-laparoscopic procedure for the study of the abdominal anatomy of healthy adult equines in standing position is feasible, and no limitations due to animal size have been observed.

Um dos principais limitantes ao desenvolvimento e aprovação para utilização em humanos das vacinas de DNA é a falta de um vetor ideal de entrega gênica, que seja ao mesmo tempo eficiente e seguro. Embora mais seguros, os vetores não virais enfrentam uma série de barreiras físicas, enzimáticas e difusionais que limitam a chegada do transgene ao núcleo das células alvo. Dando continuidade ao trabalho desenvolvido em nosso grupo de pesquisa, o principal objetivo desta dissertação de mestrado foi avaliar o desempenho do vetor não viral comercial Lipofectamina e da proteína multifuncional T-Rp3 na entrega do gene da glicoproteína do vírus da raiva (RVGP) a células BHK-21. Primeiramente, o gene RVGP foi inserido no plasmídeo modelo pVAX1. Foram então realizados estudos de transfecção em células BHK-21 (Baby Hamster Kidney), utilizando-se Lipofectamina como agente de transfecção, no sentido de constatar a correta expressão do gene RVGP contido no novo plasmídeo. Como controle positivo, foi utilizado o plasmídeo pCMV-RVGP. Os estudos de PCR quantitativo da transcrição reversa (qRT-PCR) e imunofluorescência indicaram a expressão da glicoproteína pelo pVAX1RVGP, ainda que em valores de expressão menores se comparados com o plasmídeo controle pCMV-RVGP. Foi também desenvolvido com sucesso um método quantitativo de determinação da expressão da RVGP em células utilizando-se citometria de fluxo, que confirmou os resultados anteriores. Devido ao plasmídeo pVAX1RVGP ter apresentado baixa eficiência de expressão da RVGP, buscou-se a elevação da eficiência a partir da adição da sequência de KOZAK no plasmídeo pVAX1RVGP. Nesse caso, ainda que os resultados indiquem um aumento na expressão, não houve confirmação estatística (p<0,05). Os estudos de entrega com a proteína T-Rp3 foram realizados com um lote da T-Rp3 armazenada em ultrafreezer. A proteína demonstrou-se não ser estável após o congelamento em nitrogênio líquido e armazenamento em ultrafreezer pelo tempo de 10 meses. Apesar de ser capaz de complexar o pDNA após esse tempo, não foi eficiente em ensaios de transfecção, tendendo a agregar em relações molares altas e ausência de soro fetal bovino. / One of the major bottlenecks on the development and approval of DNA vaccines in humans is the lack of an ideal gene delivery vector, which must be safe and efficient at the same time. Although safer, the non-viral vectors face a series of physical, enzymatic and diffusion barriers that limits the arrival of the endogenous gene in the nuclei of the target cells. The main goal of this work was the evaluation of the performances of the commercial non-viral vector Lipofectamine, and the recombinant protein T-Rp3, a multifunctional protein, on the delivery of the rabies virus glycoprotein (RVGP) gene to BHK-21 cells. First, the RVGP gene was inserted into the pVAX1 plasmid, and transfections using BHK-21 (Baby Hamster Kidney) cells were performed using the Lipofectamine reagent to verify the correct expression of the RVGP gene present in the new plasmid. As a positive control, the plasmid pCMV-RVGP was used. The quantitative reverse transcription (qRT-PCR) and immunofluorescence studies indicated the expression of RVGP from pVAX1RVGP, although in lower expression values in comparison to the control plasmid. In addition, a flow cytometry quantitative method to quantify and compare the expression of the RVGP in the membrane of the transfected cells was developed, confirming the previous results. With the purpose of increase, the expression of RVGP, the KOZAK consensus sequence was added to the new pVAX1RVGP plasmid, and despite of the apparent increase of RVGP expression, this could not be confirmed statistically. The experiments of gene delivery using the T-Rp3 protein were performed using a protein batch storaged in ultrafreezer for 10 months. However, the protein has shown not being stable after storage for this long period. Moreover, despite of being capable to complex pDNA after this time, T-Rp3 was not efficient in the transfection assays and tended to aggregate in high molar ratios.

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This is a population-based study that was conducted immediately after the introduction of the vaccine in order to determine the carriage rate of this pathogen in children attending in day care centers in Goiania. These data may be used as a predictor for evaluating the dynamic of the circulating serotypes into the community after the vaccine introduction. Between October and November 2010, nasopharyngeal swabs were collected from 853 children ranging from 36 to 59 months attending in day care centers in Goiania. Isolation and identification of S. pneumoniae were done after the incubation step on broth-enriched for 6 h and posterior plating on blood agar. Isolates that were α-haemolytic, optochin-sensitive and soluble in bile were identified as S. pneumoniae. The isolates were serotyped by cmPCR. The database had been built with the statistical program SPSS (Chicago, IL, USA) version 18.0. The possible risk factors were assessed by multivariate Poisson regression. The level of probability of 0.05 (two-tailed) was used to determine statistical significance. The prevalence of pneumococcus carrier was 57.6% (CI95%: 54.2% - 60.9%). According to the multivariate Poisson regression analysis, children aged 36-47 months (IRR: 1.117; CI95%: 1.007-1.238; p: 0.035) and children in whose houses had four or more residents (IRR: 1.1214; CI95%: 1.078-1.368; p 0.001) were considered risk factors independently associated to pneumococcal colonization. The variable family income equal to or greater than three minimum wages was considered a protective factor independently associated to pneumococcal colonization (IRR: 0.787; CI95%: 0.627-0.990; p 0.041). The most prevalent serotypes and serogroups founded were 6A/6B/6C/6D (n=80; 16.3%), 14 (n=47; 9.6%), 23F (n=46; 9.4%), 19F (n=43; 8.8%), 15B/15C (n=30; 6.1%), 11A/11D (n=28; 5.7%), 3 (n=22; 4.5%) and 19A (n=16; 3.3%). Our results showed a high prevalence of pneumococcal colonization among the study population, indicating that colonization by this microrganism is common among children, especially in environments that favor crowding. The main serotypes/serogroups are cover by PCV10. / Streptococcus pneumoniae é o patógeno responsável pelas maiores taxas de morbidade e mortalidade em crianças, principalmente em países em desenvolvimento. A colonização da nasofaringe é a chave para o desenvolvimento das doenças pneumocócicas, bem como para a transmissão horizontal desse patógeno na comunidade. Crianças são o principal reservatório de S. pneumoniae e atuam como vetores dentro da cadeia de transmissão desse microrganismo. As vacinas pneumocócicas conjugadas (PCV) protegem contra as doenças pneumocócicas causadas pelos sorotipos vacinais, atuando também na proteção contra a colonização pelos mesmos sorotipos. Em 2010, o Brasil introduziu a PCV10 no programa de imunização infantil. Este trabalho é um estudo de base populacional que foi conduzido imediatamente após a introdução da PCV10 para determinar a taxa de portador desse patógeno em crianças não vacinadas que frequentam creches no município de Goiânia. Esses dados poderão ser utilizados como linha de base epidemiológica para avaliação da dinâmica dos sorotipos circulantes na comunidade após a introdução da vacina. Foram coletados, nos meses de outubro e novembro de 2010, 853 swabs de secreção da nasofaringe em crianças entre 36 a 59 meses que frequentavam creches no município de Goiânia. Para o isolamento e identificação de S. pneumoniae as amostras foram incubadas por 6 h em caldo enriquecido e semeadas em ágar sangue. Colônias α-hemolíticas sensíveis à optoquina e à bile foram identificadas como S. pneumoniae. Os isolados foram sorotipados por PCR multiplex convencional. A base de dados foi construída com o programa estatístico SPSS (Chicago, IL, USA) versão 18.0. Os possíveis fatores de risco foram avaliados por regressão de Poisson multivariada. O nível de probabilidade de 0,05 (bi-caudal) foi utilizado para determinar a significância estatística. A prevalência de portador do pneumococo foi de 57,6% (IC95%: 54,2% - 60,9%). De acordo com a análise multivariada crianças com idade entre 36-47 meses de idade (IRR: 1,117; IC95%:1,007 – 1,238; p= 0,035) e crianças em cujos domicílios haviam quatro ou mais pessoas residentes (IRR: 1,1214; IC95%: 1,078 – 1,368; p= 0,001) foram considerados fatores de risco independentemente associados para a colonização pneumocócica. A variável renda familiar igual ou superior a três salários mínimos foi considerada um fator protetor independentemente associado para a colonização pneumocócica (IRR: 0,787; IC95%: 0,627 – 0,990; p= 0,041). Os sorotipos/sorogrupos mais prevalentes foram 6A/6B/6C/6D (n=80; 16,3%), 14 (n=47; 9,6%), 23F (n=46; 9,4%), 19F (n=43; 8,8%), 15B/15C (n=30; 6,1%), 11A/11D (n=28; 5,7%), 3 (n=22; 4,5%) e 19A (n=16; 3,3%). Nossos resultados mostraram uma alta prevalência de colonização por pneumococo entre a população estudada, indicando que a colonização por esse microrganismo é comum entre crianças, principalmente em ambientes que favorecem a aglomeração. Os principais sorotipos/sorogrupos encontrados são contemplados pela PCV10.

A doença pneumocócica invasiva é importante causa de morbi-mortalidade em crianças infectadas pelo HIV. A vacina pneumocócica conjugada 7-valente já teve sua segurança, eficácia e imunogenicidade comprovadas em crianças saudáveis, porém pouco se sabe sobre sua resposta humoral em crianças HIV-positivas. O trabalho avaliou quantitativamente a resposta com anticorpos aos 7 sorotipos pneumocócicos da vacina em um grupo de 40 crianças com infecção pelo HIV. A dosagem de anticorpos IgG contra os polissacárides da cápsula pneumocócica foi realizada através de ensaio imunoenzimático (ELISA). Os anticorpos foram dosados imediatamente antes e um mês após a aplicação da segunda dose da vacina. Utilizaram-se dois diferentes critérios para avaliar a resposta à vacina: títulos de anticorpos > 1.3 µg/mL na sorologia pós-imunização e aumento > 4 vezes nos títulos da sorologia pós em relação à pré-imunização. Observou-se aumento estatisticamente significante dos títulos geométricos médios (TGM) pós-vacinais em relação aos pré-vacinais para todos os sorotipos estudados. Não se observou diferença estatisticamente significante quando se comparou as crianças que haviam recebido a vacina polissacarídea 23-valente e as que não haviam recebido a vacina polissacarídea anteriormente. As crianças menores de 5 anos não apresentaram TGMs pós-imunização significativamente maiores para os sorotipos 6B e 19F. Não foi possível avaliar a interferência do CD4 na resposta sorológica à vacina conjugada pois 95% das crianças apresentavam CD4> 25% no momento da inclusão. Vinte e sete crianças (67.5%) tiveram resposta considerada satisfatória à vacina para 4 ou mais sorotipos vacinais quando se utilizou o valor 1.3 µg/mL como critério de resposta, enquanto, para o critério ascensão de títulos pós-imunização em relação aos pré-imunização de 4 vezes ou mais para pelo menos 4 sorotipos, a resposta foi inadequada (37.5%). / Pneumococcal invasive disease is a important cause of death in HIV-infected children. Heptavalent pneumococcal conjugate vaccine has been shown to be safe, effective and immunogenic in healthy children but little is known about it when it comes to HIV-infected children. We evaluated the quantitative antibody response to the 7 pneumococcal serotypes of the vaccine in a group of 40 HIV-infected children. An enzyme immunoassay (ELISA) was used to measure the IgG antibody response. Antibodies were measured immediately before and 1 month after the second dose of the vaccine. Two criteria of response were used: IgG titers > 1.3µg/mL in the post-immunization serology and an increase of at least 4-fold comparing the post-immunization with the pre-immunization serology. Statistically significant rises in the post-immunization geometric mean titers were observed for the seven serotypes studied. We did not find a statistically significant diference when we compared 2 groups: one that had been previously immunized with the polissacaride vacine and one that had never been immunized with that vaccine before. Children under 5 years of age did not show statiscally diferent median geometric titers for serotypes 6B and 19F when compared to the children > 5 years of age. We could not show CD4 count interference once 95% of the children had CD4 counts > 25%. Twenty-seven (67.5%) of the children were considered to respond satisfactorily to at least 4 of the serotypes included in the conjugate vaccine when the criteria was post-immunization titers > 1.3 µg/mL. When a increase of at least 4-fold between post-immunization and pre-immunization for at least 4 serotypes was used as criteria, our patients did not respond satisfactorily.

INTRODUÇÃO: A doença diarreica aguda é a segunda causa de morte em crianças abaixo de 5 anos de idade. No Brasil, entre 2003 e 2009, a diarreia aguda foi responsável por cerca de 100.000 internações por ano, e por 4% das mortes em crianças abaixo de 5 anos de idade. O rotavírus é a principal etiologia de diarreia aguda grave no mundo todo, sendo responsável por 40% das internações por diarreia aguda, e 29% de todas as mortes por diarreia aguda. A vacina monovalente (RV1) contra o rotavírus foi introduzida no Programa Nacional de Imunizações em 2006. OBJETIVOS: Verificar o impacto da vacina monovalente contra rotavírus nas consultas de pronto-socorro e internações por doença diarreica aguda em crianças menores de 5 anos de idade, verificar a positividade do exame \"pesquisa de rotavírus nas fezes\", e verificar a presença ao ausência de imunidade de rebanho. METODOLOGIA: Foi realizado um estudo ecológico retrospectivo no Hospital Universitário da Universidade de São Paulo. O período foi dividido em pré-vacina (2003 a 2005) e pós-vacina (2007 a 2009). Foram incluídas todas as crianças abaixo de 5 anos que passaram em consulta no pronto-socorro e verificado o diagnóstico do atendimento e internação através de registro eletrônico. Foram obtidas as taxas de consultas no pronto-socorro e internações por doença diarreica aguda, foram selecionadas as crianças não vacinadas para cálculo da imunidade de rebanho, e verificado se houve coleta do exame pesquisa de rotavírus nas fezes. A redução nas taxas foi obtida através da fórmula: redução (%) = (1 - odds ratio) x 100. RESULTADOS: No período pré-vacina a taxa de consultas por diarreia aguda foi de 85,8 consultas por 1.000 consultas gerais, no período pós vacina a taxa de consultas por diarreia aguda foi 80,9 por 1.000, e a redução foi 6% (IC 95%, 4% a 9%, p < 0,001), chegando a 40% (IC 95%, 36% a 44%, p<0,001) nos meses de maio e junho. A taxa de internação por diarreia aguda era 40,8 internações por 1.000 e caiu para 24,9 por 1.000, redução de 40% (IC 95%, 22% a 54%, p < 0,001), chegando a 82% (IC 95%, 62% a 92%, p < 0,001) nos meses de maio e junho. Nas crianças não vacinadas não houve redução na taxa de consultas de pronto-socorro (IC 95%, -4% a 5%, p=0,903), e não se pode afirmar se houve redução ou aumento das internações por diarreia aguda (IC 95%, -212% a 35%, p=0,381). Houve queda da positividade do exame pesquisa de rotavírus em 2009 (redução de 70%, IC 95%, 26% a 88%, p=0,007). CONCLUSÕES: Após a introdução da vacina contra rotavírus (RV1) houve uma redução de 6% nas consultas por diarreia aguda no pronto-socorro, de 40% nas internações por diarreia aguda e de 70% na positividade do exame pesquisa de rotavírus nas fezes. Não foi detectada imunidade de rebanho / INTRODUCTION: Acute diarrheal disease is the second cause of death in children under five years. In Brazil, from 2003 to 2009, acute diarrhea was responsible for nearly 100,000 deaths per year and 4% of the deaths in children under five years. Rotavirus is the leading cause of severe acute diarrhea worldwide, accounting for 40% of hospital admissions and 29% of all the acute diarrhea-related deaths. In 2006, the rotavirus monovalent vaccine (RV1) was added to the Brazilian National Immunization Program. OBJECTIVES: To analyze the impact of the RV1 on Emergency Department (ED) visits and hospital admissions for acute diarrhea, the rates of positivity of the stool rotavirus tests and the presence or absence of herd immunity. METHODS: A retrospective ecologic study at the University Hospital, University of Sao Paulo. The study analyzed two periods: the pre-vaccine (2003-2005) and the post-vaccine (2007-2009) periods. We screened the main diagnosis of all ED attendances and hospital admissions of children under five years in an electronic registry system database and calculated the rates of ED visits, hospital admissions and positivity of the stool rotavirus test in patients with acute diarrhea. Herd immunization was evaluated in non-vaccinated children. The reduction rate was analyzed according to the formula: reduction (%) = (1- odds ratio) x 100. RESULTS: The rates of ED visits for acute diarrhea was 85.8 and and 80.9 per 1,000 total ED visits in the pre and post vaccination periods, respectively, resulting in 6% reduction (95% CI, 4% to 9%, p< 0.001) in the overall period and reaching 40% reduction on May and June. The rates of hospital admissions for acute diarrhea was 40.8 per 1,000 in the pre-vaccine period and dropped to 24.9 per 1,000 hospitalizations, resulting in 40% reduction (95% CI, 22% to 54%, p < 0.001) in the overall period and 82% (95% CI, 62% to 92%, p < 0.001) on May and June. Among non-vaccinated children, no reduction on ED visits was observed (95% CI, -4% to 5%, p=0.903), while an increase or reduction in the hospitalization rates could not be determined (95% CI, -212% to 35%, p=0.381). There was a decrease in the positivity of the stool rotavirus tests in 2009 (70% reduction, 95% CI, 26% to 88%, p=0.007). CONCLUSIONS: The introduction of the RV1 vaccine resulted in 6% reduction in the ED visits and 40% reduction in hospital admissions for acute diarrhea, and 70% reduction in the rates of positive stool rotavirus tests. No herd immunity was observed