A doença pneumocócica invasiva é importante causa de morbi-mortalidade em crianças infectadas pelo HIV. A vacina pneumocócica conjugada 7-valente já teve sua segurança, eficácia e imunogenicidade comprovadas em crianças saudáveis, porém pouco se sabe sobre sua resposta humoral em crianças HIV-positivas. O trabalho avaliou quantitativamente a resposta com anticorpos aos 7 sorotipos pneumocócicos da vacina em um grupo de 40 crianças com infecção pelo HIV. A dosagem de anticorpos IgG contra os polissacárides da cápsula pneumocócica foi realizada através de ensaio imunoenzimático (ELISA). Os anticorpos foram dosados imediatamente antes e um mês após a aplicação da segunda dose da vacina. Utilizaram-se dois diferentes critérios para avaliar a resposta à vacina: títulos de anticorpos > 1.3 µg/mL na sorologia pós-imunização e aumento > 4 vezes nos títulos da sorologia pós em relação à pré-imunização. Observou-se aumento estatisticamente significante dos títulos geométricos médios (TGM) pós-vacinais em relação aos pré-vacinais para todos os sorotipos estudados. Não se observou diferença estatisticamente significante quando se comparou as crianças que haviam recebido a vacina polissacarídea 23-valente e as que não haviam recebido a vacina polissacarídea anteriormente. As crianças menores de 5 anos não apresentaram TGMs pós-imunização significativamente maiores para os sorotipos 6B e 19F. Não foi possível avaliar a interferência do CD4 na resposta sorológica à vacina conjugada pois 95% das crianças apresentavam CD4> 25% no momento da inclusão. Vinte e sete crianças (67.5%) tiveram resposta considerada satisfatória à vacina para 4 ou mais sorotipos vacinais quando se utilizou o valor 1.3 µg/mL como critério de resposta, enquanto, para o critério ascensão de títulos pós-imunização em relação aos pré-imunização de 4 vezes ou mais para pelo menos 4 sorotipos, a resposta foi inadequada (37.5%). / Pneumococcal invasive disease is a important cause of death in HIV-infected children. Heptavalent pneumococcal conjugate vaccine has been shown to be safe, effective and immunogenic in healthy children but little is known about it when it comes to HIV-infected children. We evaluated the quantitative antibody response to the 7 pneumococcal serotypes of the vaccine in a group of 40 HIV-infected children. An enzyme immunoassay (ELISA) was used to measure the IgG antibody response. Antibodies were measured immediately before and 1 month after the second dose of the vaccine. Two criteria of response were used: IgG titers > 1.3µg/mL in the post-immunization serology and an increase of at least 4-fold comparing the post-immunization with the pre-immunization serology. Statistically significant rises in the post-immunization geometric mean titers were observed for the seven serotypes studied. We did not find a statistically significant diference when we compared 2 groups: one that had been previously immunized with the polissacaride vacine and one that had never been immunized with that vaccine before. Children under 5 years of age did not show statiscally diferent median geometric titers for serotypes 6B and 19F when compared to the children > 5 years of age. We could not show CD4 count interference once 95% of the children had CD4 counts > 25%. Twenty-seven (67.5%) of the children were considered to respond satisfactorily to at least 4 of the serotypes included in the conjugate vaccine when the criteria was post-immunization titers > 1.3 µg/mL. When a increase of at least 4-fold between post-immunization and pre-immunization for at least 4 serotypes was used as criteria, our patients did not respond satisfactorily.

O Vírus Respiratório Sincicial Humano é um vírus envelopado de RNA negativo e considerado o patógeno mais importante do trato respiratório de bebês e crianças. As proteínas virais N e P foram expressas em bactérias, purificadas e usadas para a produção de anticorpos policlonais em camundongos. Estudos in silico permitiram a predição de regiões desordenadas da proteína P, as quais foram identificadas por espectrometria de massa como regiões hiper sensíveis a proteases. A otimização dos genes N e P permitiu uma forte e eficiente expressão das proteínas N e P em células humanas. Vacinas de DNA contendo os genes otimizados foram testadas em camundongos e geraram forte resposta imune humoral. As proteínas N e P expressas em células humanas foram imunoprecipitadas e analisadas quanto a interações com proteínas celulares, identificadas por espectrometria de massa. A proteína P mostrou ser capaz de interagir com a HSP70. Por fim, um sistema Minigenoma alternativo, usando o promotor da RNA polimerase II, foi construído para o HRSV mas pouca ou nula atividade foi detectada. / The Human Respiratory Syncytial Virus is a single stranded negative RNA enveloped virus and it is considered the most important pathogen of the respiratory tract of infants and neonates. The viral N and P proteins were expressed in bacteria, purified and used for the production of polyclonal antibodies in mice. In silico studies allowed the prediction of intrinsically disordered domains for P protein, which were identified by mass spectrometry as protease hyper sensible regions. The optimization of N and P genes allowed a robust expression of the N and P proteins in human cells. DNA vaccines containing the optimized genes were tested in mice and generated strong humoral imune response. The N and P proteins expressed in human cells were immunoprecipitated and their interactions with cellular proteins were identified by mass spectrometry. The P protein was able to interact with the HSP70 protein. Finally, an alternative Minigenome system, using an RNA polymerase II promoter, was developed for HRSV but low or no activity was detected.

Paracoccidioides brasiliensis é o agente da paracoccidioidomicose (PCM), uma doença sistêmica crônica prevalente na América Latina. Até o momento, não existe uma vacina eficaz para esta enfermidade. O potencial da radiação gama para a atenuação de patógenos e desenvolvimento de uma vacina foi explorado neste trabalho. Em nosso laboratório desenvolvemos leveduras de P. brasiliensis atenuadas por irradiação gama. Estas perderam a capacidade de reprodução, mas mantiveram a sua morfologia, a síntese e secreção de proteínas, o metabolismo oxidativo e o seu perfil antigênico. O objetivo deste trabalho foi avaliar a capacidade protetora induzida pela imunização com as leveduras radioatenuadas em modelo animal. A atenuação da virulência das leveduras radioatenuadas foi avaliada em camundongos BALB/c e Nude-Nude. O efeito protetor foi avaliado em grupos de camundongos BALB/c submetidos a uma ou duas imunizações. Cada grupo foi dividido em três subgrupos, que foram desafiados 30, 45 e 60 dias após a imunização. Os camundongos foram sacrificados 30 e 90 dias após o desafio. Os órgãos removidos foram usados para recuperação de unidades formadoras de colônias (UFCs), análise histológica e determinação de citocinas. Os soros foram coletados semanalmente para avaliar os títulos de IgG e o padrão de IgG1 e IgG2a produzido no curso da infecção. Para avaliar o tipo de resposta imune desencadeada, as citocinas IFN-g, TNF-a, IL-10 e IL-5 foram determinadas por PCR em tempo real. As leveduras radioatenuadas perderam a sua virulência, pois não foram capazes de provocar infecção em camundongos BALB/c e Nu/Nu. Nenhuma UFC foi recuperada nem foram observadas alterações histopatológicas nos camundongos infectados com o fungo radioatenuado. Os camundongos infectados com P. brasiliensis não irradiado mostraram altos níveis de produção do anticorpo IgG, enquanto a infecção com as leveduras radioatenuadas não estimulou alterações significativas destes níveis. Os camundongos infectados com a levedura radioatenuada apresentaram um aumento na produção de IFN-g e TNF-a, indicando uma estimulação da imunidade celular. O ensaio de proteção realizado com camundongos imunizados uma vez mostrou uma redução significativa na recuperação das UFCs avaliadas 30 dias após o desafio. Entretanto, foi verificado um aumento na recuperação das UFCs dos tecidos 90 dias após o desafio. Apesar de um grau significativo de proteção ter sido alcançado, estes resultados mostram que somente uma imunização não foi suficiente para conferir uma proteção a longo prazo, uma vez que alguns focos do fungo não foram eliminados. Uma proteção eficiente foi desenvolvida no grupo dos camundongos imunizados duas vezes. A imunização foi capaz de reduzir a infecção inicial e desencadear uma proteção a longo prazo. Uma proteção de 99,5% foi obtida nos camundongos analisados 90 dias após desafio. Neste mesmo período os níveis de IFN-g e TNF-a aumentaram significativamente, enquanto os de IL-10 e IL-5 diminuíram. Quando analisados 30 dias após o desafio os camundongos não desenvolveram um padrão totalmente polarizado de resposta Th1/Th2, mas uma tendência para um padrão Th1 foi evidente após 90 dias. Os níveis de IgG aumentaram em ambos os grupos após o desafio. Concluímos que a imunização com as leveduras radioatenuadas foi capaz de desencadear uma resposta imune protetora a longo prazo. Estas células são uma ferramenta valiosa em estudos da imunidade protetora e na pesquisa de vacina para a PCM. / Paracoccidioides brasiliensis is fungus agent of paracoccidioidomycosis (PCM), a chronic systemic disease prevalent in Latin American. To date, there is no effective vaccine. The potential of gamma radiation for pathogens attenuation and vaccine development was explored in this work. In our laboratory were developed yeast cells of P. brasiliensis attenuated by gamma radiation, which lose the reproductive ability, while retaining the morphology, the synthesis and secretion of proteins, the oxidative metabolism and the expression of the antigens present in the native yeast. The aim of the present work was to evaluate the protection elicited by the immunization with this cells in animal model. The virulence attenuated was evaluated in BALB/c and Nude-Nude mice. The protector effect was evaluated in BALB/c mice groups immunized once or twice. Each group was divided in three sub groups that were challenge 30, 45 or 60 days after the immunization. The mice were sacrificed 30 and 90 days after challenge. The removed organs were used for colonyforming units (CFUs) recover, histopathological analysis and cytokine determination. The sera were collected weekly to evaluate the IgG antibody titers and the IgG1 and IgG2a pattern in the course of infection. To evaluate the type of elicited immune response the cytokines IFN-g, TNF-a, IL-10 and IL-5 were determined by real time PCR. The radioattenuated yeast loses its virulence since fails in producing infection in BALB/c and Nude-Nude mice. No CFUs were recovered neither histological changes observed in the mice infected with the radioattenuated cells. The mice infected with the not irradiated P. brasiliensis showed a high level of antibody production while the infection with the radioattenuated yeast did not significantly change the antibody level. The mice infected with the radioattenuated yeast presented an increase in the IFN-g and TNF-a production and an inhibition of the IL-10 synthesis, indicating a stimulation of the cellular response. The protection assay performed with mice immunized once showed a significant reduction in the CFUs recovery evaluated 30 days after the challenge. However, when examined 90 days after the challenge the CFUs recovered from organs increased. Even so a significant degree of protection has been reached these results point that only one immunization was not enough to confer a long lasting protection, since some focus of the fungi were not eliminated. An efficient protection against highly infective forms of P. brasiliensis was developed in the mice group immunized twice. The immunization was able to reduce the initial infection and elicited a long lasting protection. A 99,5 % protection was obtained in the mice analyzed 90 days post challenge. At the same time the levels of IFN-gDQG71). increased significantly while the IL-10 and IL-5 decreased. When analyzed after 30 days, the mice had not developed a totally polarized pattern of Th1/Th2 response but, a trend to a Th1 response was evident after 90 days. The level of IgG increased in both immunized groups after the challenge. We concluded that the immunization with the radioattenuated yeast cells was able to elicit a long lasting protective immune response and these cells are valuable tool for protective immunity studies and vaccine research for PCM.

Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de Minas Gerais / A Esporotricose é uma infecção subaguda ou crônica causada pelo fungo Sporothrix schenckii. A transmissão zoonótica pode ocorrer depois de arranhões ou mordidas de animais, principalmente gatos, roedores e tatus. Até o momento, nenhuma vacina esta em uso para esporotricose ou para qualquer infecção fúngica de importância médica, indicando a necessidade de ampliar a investigação neste campo e explorar novas alternativas. O objetivo deste estudo foi avaliar os efeitos da radiação gama em leveduras de S. schenckii, visando a sua atenuação, para aplicação posterior de leveduras radioatenuadas no desenvolvimento de uma vacina destinada a imunização de gatos e cães. As leveduras S. schenckii foram cultivadas em meio sólido BHI (Infuso Cérebro e Coração) suplementados com tiamina e na temperatura de 36oC. As culturas foram irradiadas com doses variando de 1,0 a 9,0 kGy. Após cada dose foram avaliados a capacidade reprodutiva, a viabilidade, e o metabolismo de síntese de proteínas. A avaliação da virulência foi realizada pela inoculação das leveduras irradiadas em camundongos Balb/c imunossuprimidos e posterior recuperação de unidades formadoras de colônias (UFCs). A integridade do DNA, a ocorrência de apoptose e de alterações ultraestruturais também foram analisada nas leveduras radioatenuadas. Os resultados mostraram uma redução de 6 ciclos log10 no número de UFCs recuperadas na dose de 6,0 kGy e a partir de 8,0 kGy não foram recuperadas UFCs. A análise de viabilidade indicou que as leveduras permaneceram viáveis até a dose de 9,0 kGy, a maior dose testada. As leveduras irradiadas mantiveram a capacidade de síntese de proteínas, porém esta foi reduzida significarivamente na dose de 9,0 kGy, quando avaliada 24 horas após a irradiação. Os ensaios de virulência utilizando leveduras irradiadas com as doses de 7,0 e 9,0 kGy mostraram que não houve recuperação de UFCs dos órgãos dos camundongos imunossuprimidos, indicando que as células estavam atenuadas. O ensaio de integridade do DNA mostrou que com 7,0 kGy o DNA das leveduras estava fragmentado. Nesta mesma dose foi verificada uma diferença discreta, mas significativa, na ocorrência de apoptose entre as células irradiadas e controles 24 horas após a irradiação. Através da microscopia eletrônica de transmissão foram verificadas alterações ultra-estruturais nas leveduras irradiadas com 7,0 kGy. Duas horas após a irradiação as principais alterações verificadas foram a vacuolização e a perda de homogeneidade do citoplasma. Após 24 horas, além destas alterações o citoplasma se mostrou retraído e freqüentemente se descolando da parede celular. Nossos resultados indicaram que para as leveduras do S. schenckii, foi possível encontrar uma dose absorvida em que o agente tem comprometida sua capacidade reprodutiva e perde a virulência, mantendo a sua viabilidade, uma condição desejável para o desenvolvimento de uma vacina radioatenuada. / Sporotrichosis is a subacute or chronic infection caused by the fungus Sporothrix schenckii. Zoonotic transmission can occur after scratches or bites of animals, mainly cats, rodents, and armadillos. Up to the moment, no approved vaccine was reported for S. schenckii or to any important pathogenic fungi infection in humans, indicating the need to expand the research in this field and to explore new alternatives. The aim of this study was to evaluate the effects of gamma radiation on the viability, metabolic activity and reproductive ability of S. schenckii yeast cells for further studies on the development of a vaccine for immunization of cats and dogs. The culture of S. schenckii, in solid medium, was irradiated at doses ranging from 1.0 to 9.0 kGy. After each dose the reproductive capacity, viability and protein synthesis were estimated. The results showed that a reduction of 6 log10 cycles in the number of colonies was achieved at 6.0 kGy and after 8.0 kGy no colonies could be recovered. The viability analysis indicated that yeast cells remained viable up to 9.0 kGy. The results of protein synthesis analysis showed that the yeast cells, irradiated up to 9.0 kGy, were able to synthesize proteins. But this ability was significantly reduced with 9.0 kGy, 24 h after irradiation. The virulence assays using yeast irradiated with doses of 7.0 and 9.0 kGy showed no CFUs recovery from tissues of immunosuppressed mice, indicating that the cells were attenuated. The DNA integrity test showed that the DNA of 7.0 kGy irradiated yeast cells was fragmented. At the same dose was verified a discrete but significant increase in the apoptose occurrence in relation to controls 24 hours after the irradiation. By transmission electron microscopy were observed ultrastructural changes in yeast irradiated with 7.0 kGy. Two hours after irradiation the major changes were the vacuolization and the loss of homogeneity of the cytoplasm. After 24 hours, apart from these changes, the cytoplasm was often retracted and sometimes taking off from the cell wall. Our results indicated that for the yeast cells of S. schenckii, it was possible to find an absorbed dose in which the fungus loses the virulence, while maintaining the viability, a desirable condition for the development of a radioattenuated yeast vaccine.

Uma das estratégias mais promissoras para a biotecnologia de vacinas é o desenvolvimento de linhagens precisamente atenuadas, e que possam ser usadas como carregadoras de antígenos heterólogos. Mutantes de <i}>Salmonella Typhimurium têm sido extensivamente utilizados com essa fmalidade. A flagelina, monômero constituinte do filamento flagelar, vem sendo empregada como carregadora de antígenos heterólogos, inseridos na região central, hipervariável (região IV). Inserções nessa região são freqüentemente funcionais, e levam à exposição do epitopo na superfície do filamento. O presente trabalho explora o potencial de outras regiões da molécula para a inserção de epitopos. Nós inserimos a mesma seqüência usada anteriomente (epitopo da proteína M de S. pyogenes, Tipo 5) em regiões com diferentes níveis de homologia (III e VI), e em região totalmente conservada (VIII). Também foram feitas inserções duplas em regiões que se mostraram toleráveis (III e IV; IV e VI). Todas as proteínas híbridas foram sintetizadas pela Salmonella, como demonstrado em imunoblots, usando anticorpo contra a flagelina e contra o peptídeo. Todas as regiões, exceto a VIII, aceitaram a inserção sem perda de motilidade, apesar de, em alguns casos, ela ter sido extremamente reduzida. A imunogenicidade foi avaliada pela imunização de camundongos com bactérias vivas, inativadas ou, quando possível, flagelina purificada. Os resultados foram similares aos descritos na literatura para inserções envolvendo a região IV, obtendo-se um elevado título de anticorpos contra flagelina. Um baixo nível de anticorpo contra o peptídeo também foi detectado para todas as novas linhagens testadas. Nossos resultados com imunização de bactérias vivas sugerem uma resposta levemente melhor ao peptídeo quando duas cópias estão presentes, mas os dados não são conclusivos. / One of the most promising strategies for the biotechnology of vaccines is the development of precisely attenuated strains, which could be used as carriers of heterologous antigens. Mutants of Salmonella Typhimurium have been extensively explored to this effect, since the infection ofmice by S. Typhimurium mimics the infection of humans by S. Typhi, and the genetics of the species is extremely well known, making it easy the obtention of defined mutants with reduced pathogenicity. Mutants with auxotrofy in genes of the aromatic pathway are particularly attractive, since they need PABA and DHB to grow, and these compounds are unavailable in mammalian tissues. Flagellin, the monomer which constitutes the flagellar filament, has been used as a carrier for heterologous epitopes, inserted in a central, hypervariable region (region IV). Insertions in this region are often functional, and lead to exposition of the epitope at the filament\' s surface. The present work explored the potential of the other regions ofthe molecule for the insertion of epitopes. We inserted the same reporter sequence (MS epitope from S. pyogenes M protein) in regions with different levels of homology (III and VI), and totally conserved (VIII). We also made double insertions in regions shown to be permissive (III and IV; IV and VI). All hybrid proteins were synthesized by Salmonella, as demonstrated by immunoblots using antibody against flagellin and against the synthetic peptide. All regions, except the highly conserved region VIII, accepted the insertions without loss of motility, albeit, in some cases, motility was seriously reduced. Immunogenicity of the hydrids was evaluated by immunization with live bacteria, killed bacteria, and purified flagellin (when possible). Results obtained with the new constructs were similar to the ones published for insertions involving region IV, in the sense that antibody titers to the carrier protein were very high. A low level of antibody to the inserted peptide was also detected in all groups of animals. Our results with live immunization suggest a slightly better response to the peptide when two copies are present, but the data are not conclusive.

O Objetivo deste trabalho foi desenvolver uma estratégia vacinal de utilizando linhagens de salmonellas capazes de expressar uma forma atoxica da principal toxina associada a linhagens de EHEC que causa a síndrome hemolítica urémica. Estas linhagens de salmonellas diferem na expressão de flagelina, a principal unidade estrutural do flagelo. As linhagens foram capazes de expressar uma forma atóxica da proteína \"Shiga-like\" no interior da bactéria e no espaço extracelular, apresentaram alta estabilidade plasmidial in vitro e in vivo e foram capazes de aumentar o grau de colonização intestinal. Além disso, avaliamos o potencial imunogênico de estas linhagens e encontramos que a imunização com três doses de salmonelas foram capazes de gerar anticorpos sistêmicos (IgG) e locais (IgA) com propriedades neutralizantes in vitro e proteção parcial em condições in vivo frente a ensaios de desafios com a toxina nativa. Não fomos capazes de encontrar diferencias significativas em lãs propriedades imunogênicas entre as linhagens que diferem na expressão de flagelina. Nossos resultados indicam que formas atóxicas da proteína Stx2 expressadas em vetores biológicos podem ser uma alternativa de estratégia vacinal para controlar a SHU. / The goal of this study was to develop a vaccine strategy of using Salmonella strains capable of expressing a nontoxic form of the main toxin associated with EHEC strains that cause hemolytic uremic syndrome. These strains of Salmonella differ in flagellin expression, the main structural unit of the flagellum. The strains were capable of expressing a nontoxic form of the protein \"Shiga-like\" within the bacteria and the extracellular space, showed high plasmid stability in vitro and in vivo and were able to increase the degree of intestinal colonization. Furthermore, we evaluated the immunogenic potential of these strains and found that immunization with three doses of salmonella were able to generate (IgA) humoral and (IgG) systemic antibodies with neutralizing properties in vitro and partial protection in vivo conditions facing trials challenges with the native toxin. We were unable to find significant differences in the immunogenic properties between these strains that differ in flagellin expression. Our results indicate that nontoxic forms of Stx2 expressed in biological vectors can be an alternative vaccine strategy to control the SHU.

O HPV (Papilomavírus Humano) causa verrugas anogenitais e alguns tipos de câncer, como o câncer de colo do útero. Seu capsídeo é composto pelas proteínas L1 e L2. A L1 se autoestrutura em VLPs, utilizadas nas atuais vacinas comerciais. Para a geração de vacinas com maior espectro de proteção, a L2 é promissora, pois gera proteção cruzada. Para caracterizar VLPs de L1L2 do HPV16, células HEK293T cotransfectadas tiveram a expressão proteica analisada por citometria de fluxo, Western blotting, microscopia confocal a laser e eletrônica de transmissão. As proteínas L1 (60kDa) e L2 (100kDa) estavam presentes no núcleo e no citoplasma celular, formando VLPs de L1L2 de conformação heterogênea, cuja máxima expressão ocorre 12h após a transfecção. As VLPs extraídas estavam em diferentes estágios de estruturação. Foi possível estabelecer um sistema eficaz de produção heteróloga das proteínas de VLPs de L1L2, que poderão ser utilizadas em testes pré-clínicos, na pesquisa básica e contribuir no desenvolvimento de uma vacina profilática de amplo espectro de ação contra o HPV. / HPV (Human Papillomavirus) is the causative agent of anogenital warts and several types of cancer, as cervical cancer. The HPV capsid is composed of L1 and L2 proteins. L1 can self-assemble into VLPs (virus-like particles), the basis for HPV commercially available vaccines. To generate broad-spectrum vaccines L2 shows the greatest promise, due to cross-protection. To characterize VLPs composed of HPV16 L1 and L2 proteins, cotransfected HEK293T cells were analyzed by flow cytometry, confocal laser scanning microscopy, transmission electron microscopy and Western blotting. Proteins L1 (60kDa) and L2 (100kDa) were present in cell nucleus and cytoplasm, forming heterologous L1L2 VLPs with highest expression at 12h post-transfection. Extracted VLPs were at different maturation stages. It was possible to establish an efficient system of heterologous L1, L2 and L1L2 VLPs production. After some adjustments in protocols, these particles could be used in preclinical tests, HPV basic research and also in the development of an HPV broad-spectrum vaccine.

A sílica nanoestruturada SBA-15 é um polímero que devido à suas propriedades físico-químicas apresenta grande potencial como adjuvante de mucosas. A imunização pela via oral de camundongos com a vacina contra Hepatite A ou gama globulina humana adsorvida a SBA-15 revelou aumento nos títulos de anticorpos específicos IgG e IgA, comprovando que a sílica não interfere na polarização da resposta imunológica dos tipos TH1 ou TH2. Ensaios por citometria de fluxo indicaram que a SBA-15 atuou no recrutamento de fagócitos e no aumento dos números de linfócitos B e T nas placas de Peyer e linfonodos mesentéricos de animais imunizados, sugerindo a proliferação de células imunocompetentes. A administração subcutânea de SBA-15 em camundongos geneticamente selecionados para máxima [AIRMAX] ou mínima [AIRMIN] resposta inflamatória aguda confirmou o baixo potencial inflamatório e a não toxicidade dessa nanopartícula. Os resultados comprovam que a SBA-15 é um adjuvante seguro e eficiente, especialmente nas imunizações pela via oral. / The nanostructured SBA-15 silica is a polymer that due to its physicochemical properties shows great potential as a mucosal adjuvant. Immunization by the oral route of mice with Hepatitis A vaccine or human gama globulin adsorbed/encapsulated in SBA-15 revealed increases in the IgG e IgA specific antibody titers and showed that this silica does not interfere in the polarization of TH1 or TH2 immune responses. Flow cytometry assays demonstrated that SBA-15 was efficient in the recruitment of phagocytes and in the increasing numbers of B and T lymphocytes in Peyer´s patches and mesenteric lymph nodes of immunized mice, promoting the proliferation of immunocompetent cells. Subcutaneous administration of SBA-15 in the genetically selected mice for high [AIRMAX] or low [AIRMIN] acute inflammatory responses indicated the low inflammatory potential and the non-toxicity of this nanoparticle. Results ascertain that SBA-15 silica is an effective and safe adjuvant especially in immunizations by the oral route.

O presente trabalho propõe o desenvolvimento e a caracterização de uma estratégia vacinal de caráter profilático contra o vírus da dengue (VD), baseada nas proteínas NS1 e domínio III da proteína E (EIII), empregando proteínas recombinantes em ensaios de imunização por via sub-cutânea em modelo murino. Estes antígenos foram obtidos pela clonagem e expressão de suas sequências de DNA codificadoras em sistema procarioto (E. coli). Além disso, formas atóxicas da toxina termo-lábil (LTG33D e LTK63) de E. coli enterotoxigência (ETEC) foram obtidas e incorporadas como adjuvantes às formulações vacinais. As respostas celulares e humorais anti-NS1 e anti-EIII foram monitoradas por ELISA para anticorpos e citocinas, ICS (do inglês intracellular citokine staining) e atividade citotóxica in vivo. Observamos que animais imunizados com a NS1 recombinante adicionada da LTG33D foram capazes de gerar respostas imunológicas com produção de anticorpos específicos e alta afinidade pelo antígeno. Em ensaios de desafio realizados para avaliar a proteção vacinal conferida à infecção por uma linhagem referência do o VD tipo 2 (NGC) observamos que essa formulação conferiu uma proteção de 50% aos animais imunizados. Paralelamente a esses resultados, demonstramos que a EIII não é um bom antígeno vacinal e que pode induzir anticorpos capazes de acentuar a infecção do VD. Descrevemos ainda a obtenção e a caracterização genética e patológica de um isolado clínico de VD tipo 2 naturalmente letal para camundongos Balb/C. A nova cepa viral (JHA1) demonstrou ser capaz de induzir perda de peso corporal, dano tecidual geral, e distúrbios hematológicos similares aos observados em humanos infectados pelo VD, podendo ser aplicada como modelo de infecção na avaliação de candidatos vacinais. Os resultados obtidos neste trabalho representam uma importante contribuição na área de desenvolvimento de estratégias vacinais contra a dengue e representam uma base importante para futuros estudos sobre a patologia da dengue. / The present study proposes the development and characterization of a strategy for prophylactic vaccination against dengue virus (VD) based on the NS1 protein and the domain III of the envelope glycoprotein (EIII), using recombinant proteins in subcutaneous immunization in a murine model. These antigens were obtained by cloning and expression of their DNA coding sequences in prokaryotic system (E. coli). In addition, the s non-toxic forms of the heat-labile toxin from enterotoxigenic E. coli (ETEC) (LTK63 and LTG33D) were obtained and incorporated as adjuvants to vaccine formulations. Anti-NS1 and anti-EIII cellular and humoral immune responses were monitored by antibody and cytokine ELISA, , intracellular citokine staining (ICS) and in vivo cytotoxic activity. We observed that animals immunized with the recombinant NS1 and LTG33D were capable to induce immune responses including specific antibodies with high affinity for the antigen. In challenge assays performed to evaluate the immunization protective efficacy such vaccine conferred protection of 50% against infection with a reference type 2 VD (VD2) strain(NGC). Alongside to these results, we demonstrated that EIII is not a good vaccine antigen and can induce the generation of antibodies that enhance DENV infection. We also described the isolation and the genetic and pathological characterization of a VD2 clinical isolate naturally lethal to immunocompetent Balb/c mice. The new strain was shown to cause weight loss, general tissue damage, and hematological disturbances similar to those observed in VDinfected humans, and therefore, may be applied as infection model to evaluate vaccine candidates. The results obtained in this study represent an important contribution to DENV vaccine development and established an important background for future studies of the dengue pathology.

Paracoccidioidomicose (PCM), micose sistêmica prevalente na América Latina, é uma doença granulomatosa causada pelo fungo termodimórfico do gênero Paracoccidioides spp. O maior número de casos dessa doença tem sido reportado no Brasil, Colômbia, Venezuela e Argentina. A existência de extensas áreas endêmicas, alto potencial incapacitante devido a fibroses pulmonares, grande quantidade de mortes prematuras, faz com que a PCM seja considerada um grave problema de Saúde Pública. Apesar do tratamento medicamentoso ser relativamente eficiente, o tempo longo de uso das drogas e os efeitos colaterais provocados podem levar a diminuição da adesão ao tratamento diminuindo assim eficácia. O uso de vacinas terapêuticas pode ser uma importante ferramenta no controle da PCM. Uma das modalidades investigadas pelo nosso grupo é a utilização de células dendríticas (DCs) pulsadas com o peptídeo P10 como vacina terapêutica no controle da PCM. Resultados apresentados por nosso grupo, demonstraram que DCs diferenciadas a partir de células de medula óssea de camundongos saudáveis pulsadas com o peptídeo 10 (P10) podem ser utilizadas como adjuvante no tratamento da paracoccidioidomicose experimental em camundongos imunocompetentes e imunossuprimidos. Assim sendo, nossa proposta no presente trabalho foi avaliar se DCs diferenciadas de células de medula óssea (BMDCs) ou de monócitos circulantes (MoDCs) de camundongos (BALB/c) infectados apresentam modulação prévia devido à exposição a antígenos fúngicos, avaliamos in vitro a capacidade das células dendríticas diferenciadas a partir de monócitos circulantes de camundongos infectados com Pb18 estimular proliferação de linfócitos CD8+ e CD4+, analisamos a capacidade de células dendríticas derivadas de monócitos circulantes de camundongos infectados com Pb18 pulsadas com P10 em induzir uma resposta protetora. Nossos resultados obtidos são promissores e reforçam dados já publicados pelo grupo os quais demonstraram a eficiência do peptídeo P10 no tratamento da paracoccidioidomicose experimental; apontam que o P10 é capaz de modular ativamente células dendríticas diferenciadas de monócitos circulantes e diferenciadas de células de medula óssea; demonstram que BMDCs e MoDCs pulsadas ou não com P10 tem a capacidade de estimular proliferação de linfócitos T CD4+ e CD8+; confirmaram que BMDC e MoDCs pulsadas ou não com P10 diminuem a carga fúngica no tecido pulmonar, estimulando um padrão de citocinas misto, porém com predominância de citocinas pró-inflamatórias que incitam resposta imune celular do tipo Th1, que é protetora na PCM. Estes dados foram respaldados com a análise dos cortes histológicos onde os pulmões dos camundongos tratados com BMDCs ou MoDCs pulsadas com P10 apresentaram parênquima pulmonar mais conservado em comparação com os pulmões dos grupos que não receberam tratamento com BMDCs ou MoDCs, com diminuição significativa de células fúngicas viáveis / Paracoccidioidomycosis (PCM), a systemic mycosis prevalent in Latin America, is a granulomatous disease caused by the thermodymorphic fungus of the genus Paracoccidioides spp. The highest number of cases of this disease has been reported in Brazil, Colombia, Venezuela and Argentina. The existence of extensive endemic areas, a high incapacitating potential due to pulmonary fibroses, and a large number of premature deaths, makes the PCM considered a serious public health problem. Although the drug treatment is relatively efficient, the long time of use of the drugs and the side effects provoked can lead to the decrease of the adherence to the treatment thus diminishing their effectiveness. The use of therapeutic vaccines can be an important tool in the control of PCM. One of the modalities investigated by our group is the use of dendritic cells (DCs) pulsed with the peptide P10 as therapeutic vaccine in the control of PCM. Results presented by our group demonstrated that DCs differentiated from bone marrow cells of healthy mice pulsed with peptide 10 (P10) can be used as an adjuvant in the treatment of experimental paracoccidioidomycosis in immunocompetent and immunosuppressed mice. Thus, our proposal in the present study evaluated the capacity of differentiated DCs of bone marrow cells (BMDCs) or circulating monocytes (MoDCs) of infected mice (BALB/c) exhibited previous modulation due to exposure to fungal antigens, we evaluated in vitro the ability of differentiated dendritic cells from circulating monocytes from Pb18 infected mice to stimulate proliferation of CD8+ and CD4+ lymphocytes, we analyzed the ability of dendritic cells derived from circulating monocytes from mice infected with P. brasiliensis pulsed with P10 to induce a protective response. Our results are promising and reinforce data already published by the group which demonstrated the efficiency of the peptide P10 in the treatment of experimental paracoccidioidomycosis; suggest that P10 is capable of actively modulating differentiated dendritic cells from circulating and differentiated monocytes from bone marrow cells; demonstrate that BMDCs and MoDCs pulsed or not with P10 have the ability to stimulate proliferation of CD4+ and CD8+ T lymphocytes; confirmed that BMDC and MoDCs pulsed or not with P10 decrease the fungal load in lung tissue, stimulating a pattern of mixed cytokines but with a predominance of pro-inflammatory cytokines that stimulate Th1-type cellular immune response that is protective in PCM, these data were supported with analysis of the histological sections where the lungs of the mice treated with BMDCs or MoDCs pulsed or not with P10 showed more conserved pulmonary parenchyma compared to the lungs of the groups that did not receive treatment with BMDCs or MoDCs, with significant decrease of viable fungal cells