Introdução: As queimaduras alcalinas da córnea fazem parte dos ferimentos mais devastadores para o olho. Objetivo: Os objetivos foram investigar o efeito aditivo do olho seco na atividade de proteases na superfície ocular e complicações corneanas apos lesão ocular alcalina e também investigar a eficácia da terapia anti-inflamatória controlar este processo. Métodos: Um modelo combinado (CM) de olho seco e queimadura alcalina unilateral foi usada. Resumidamente, camundongos C57BL /6 foram submetidos à queimadura alcalina unilateral (AB) com ou sem olho seco concomitante por 2 ou 5 dias. Um grupo separado de animais foram submetidos a ambos modelos (AB e olho seco) foram tratados topicamente com a Dexametasona, ou Doxiciclina ou colírio controle de solução salina balanceada (BSS). Os camundongos foram observados diariamente para verificar o aparecimento de perfuração da córnea. Córneas inteiras foram colhidas e homogeneizadas para extração de RNA. PCR quantitativo em tempo real foi realizada para medir a expressão de citocinas inflamatórias, metaloproteinases de matriz (MMP). Ativdade da MMP-9, atividade da gelatinase e da atividade da mieloperoxidase (MPO) foram avaliados em córneas homogeneizadas. A presença da infiltração de neutrófilos foi avaliada por imunohistoquímica e citometria de fluxo. Resultados: Os olhos submetidos ao modelo combinado de AB e olho seco (CM) tiveram 20% de taxa de perfuração estéril da córnea 1 dia após a lesão inicial; que aumentou para 35% em 5 dias. Houve um atraso no fechamento da ferida e aumento de opacidade residual da córnea. Aumento dos níveis de IL-1, IL-6, e as MMPs 1, -3, -8, -9, 13 e CXCL1, foram encontrados após 2 dias no CM comparando com córneas AB. Um aumento da imunorreatividade da MMP-1, -3, -9 e -13 e atividade gelatinolítica da MMP-9 foram observadas em comparação com córneas do grupo CM comparado com AB. O aumento da infiltração de neutrófilos e a atividade da mieloperoxidase foi observado no grupo CM comparando-se com córneas do grupo AB após dois dias da lesão inicial. Não foram observadas perfurações nas córneas tratadas com Dexametasona. Nos olhos tratados com Doxiciclina, 100% do fechamento da ferida pós-lesão no dia 2 e pontuação significantemente menor na escala de opacidade da córnea em relação ao BSS também foram observadas nos dias 4 e 5. Córneas tratadas com Dexametasona apresentaram a menor pontuação de opacidade da córnea. Tratamento com Dexametasona diminuiu significativamente os níveis de mRNA da IL-1, IL-6, e MMP-1, -9, -13, e o TIMP-1 depois de 2 dias, e aumentou os níveis de MMP-8, enquanto que o tratamento com Doxiciclina diminuiu significativamente IL-1, IL-6, MMP-8, -9 e, em comparação com córneas tratadas com BSS. A diminuição da imunorreatividade da MMP-1, -9 e -13 e atividade gelatinolítica foram vistos em córneas tratadas com Doxiciclina e Dexametasona em comparação com o veículo BSS. O aumento da infiltração de neutrófilos e a atividade da mieloperoxidase foi observado no grupo BSS comparação com o grupo Dexametasona 2 dias pós-lesão. Conclusões: O olho seco ambiental piora o resultado da queimadura ocular alcalina, criando uma tempestade de citocinas e proteases, aumentando o risco de perfuração corneana. Entretanto, o tratamento inicial com terapia anti-inflamatória é muito eficaz na preservação da transparência corneana e facilita a cicatrização de feridas, enquanto controla a produção de MMP e a migração de neutrófilos. / Introduction: Alkali burns to the cornea are among the most devastating injuries to the eye. Purpose: To evaluate the effects of dry eye on ocular surface protease activity and sight threatening corneal complications following ocular surface chemical injury and also to investigate the efficacy of anti-inflammatory therapy controlling this. Methods: A combined model (CM) of unilateral alkali burn and dry eye was used. Briefly, C57BL/6 mice were subjected to unilateral alkali burn (AB) with or without concomitant dry eye for 2 or 5 days. A separate group of mice subjected to both AB and dry eye were topically treated with Dexamethasone (Dex), Doxycycline (Doxy) or saline control (BSS). Mice were observed daily for appearance of corneal perforation. Whole corneas were harvested and lysed for RNA extraction. Quantitative real time PCR was performed to measure expression of inflammation cytokines, matrix metalloproteinases (MMP). MMP-9 activity, gelatinase activity and myeloperoxidase (MPO) activity were evaluated in corneal lysates. Presence of infiltrating neutrophils was evaluated by immunohistochemistry and flow cytometry. Results: Eyes subjected to the combined model of AB and dry eye (CM) had 20% sterile corneal perforation rate as soon as 1 day after the initial injury, which increased to 35% by 5 days, delayed wound closure and increased corneal opacity. Increased levels of IL- 1, IL-6, and MMPs 1,-3,-8,-9, 13, and CXCL1 transcripts were found after 2 days in CM compared to AB corneas. Increased MMP-1, -3,-9 and -13 immunoreactivity and gelatinolytic activity were seen in CM corneas compared to AB. Increased neutrophil infiltration and MPO activity was noted in the CM group compared to AB 2 days post injury. No perforations were observed in the Dex treated corneas. Doxy treated eyes had 100% of wound closure 2D post-injury, and significant lower corneal opacity scores at days 4 and 5 compared to BSS. Dex-treated corneas showed the lowest corneal opacity score. Dex treatment significantly decreased mRNA levels of IL-1, IL-6, and MMPs -1,-9, -13, and TIMP-1 after 2 days with increased levels of MMP-8, while Doxy treatment significantly decreased IL-1, IL-6, MMP-8, and -9, compared to BSS-treated corneas. Decreased MMPs -1,-9 and -13 immunoreactivity and gelatinolytic activity were seen in corneas treated with Doxy and Dex compared to BSS vehicle. Increased neutrophil infiltration and MPO activity was noted in the BSS group compared to Dex 2 D post-injury. Conclusions: Desiccating stress worsens outcome of ocular alkali burn, creating a cytokine and protease storm with greater neutrophil infiltration, increasing the risk of corneal perforation. However, early treatment with anti-inflammatory therapy is very efficacious in preserving corneal clarity and facilitating wound healing, while controlling MMP production and migration of neutrophils.

As doenças inflamatórias intestinais são caracterizadas por uma desregulação na resposta imune contra a microbiota. O zebrafish, tem emergido como um novo modelo para o estudo de doenças inflamatórias. Os ácidos graxos de cadeia curta (AGCCs) são produtos da microbiota intestinal, que possuem papéis antiinflamatórios e aparecem como uma das possíveis terapias contra doenças inflamatórias. A implementação do modelo de inflamação intestinal induzido pelo ácido trinitrobenzenesulfônico (TNBS) em larvas de zebrafish aumentou a mortalidade de forma dose-dependente. Se observou dilatação do lúmen com alisamento das vilosidades intestinais. Não se detectaram mudanças na produção de muco nem no número de células caliciformes mas teve um leve aumento da apoptóse e diminuição da proliferação, nos expostos ao TNBS. Teve aumento de células mielóides infiltrantes e de citocinas inflamatórias, assim como disbiose da microbiota. O tratamento com AGCCs gero alta mortalidade a concentrações acima de 10 mM, mas existe ação anti-inflamatória a esta mesma concentração. / Inflammatory bowel diseases are characterized by a dysregulation in immune response against microbiota. The zebrafish has emerged as a new model for the study of inflammatory diseases. Short chain fatty acids (SCFAs) are products of the intestinal microflora, which have anti-inflammatory roles and appear as a possible therapy against inflammatory diseases. The implementation of intestinal inflammation model induced by trinitrobencenesulfonic acid (TNBS) in zebrafish larvae, increased mortality in a dose-dependent manner. Was observe dilatation lumen and straightening of the intestinal villi. No changes were detected in the production of mucus or in the number of goblet cells but had a slight increase in apoptosis and decreased proliferation in exposed to TNBS. Also has, increased cytokines and infiltrating myeloid cells, and dysbiosis of the microbiota. Treatment with SCFAs generate high mortality above 10 mM concentrations, but there anti-inflammatory action to this same concentration.

INTRODUÇÃO: Recentes estudos avaliam o uso da solução salina hipertônica na concentração de 3% no tratamento de pacientes com traumatismos cranioencefálicos, entretanto, poucos trabalhos têm analisado a sua eficácia no tratamento do choque hemorrágico. O objetivo deste trabalho é avaliar os efeitos do tratamento do choque hemorrágico com a solução salina hipertônica a 3%, analisando principalmente seus possíveis efeitos benéficos na atenuação da resposta inflamatória decorrrente do choque. Para tal, esta solução será comparada a outras duas, amplamente estudadas: a solução salina hipertônica a 7,5% e a solução de Ringer lactato. MÉTODOS: Foram utilizados, neste estudo, 26 ratos Wistar. Os animais foram anestesiados com pentobarbital sódico por via intraperitoneal (50 mg/Kg) e, então, submetidos a um protocolo de choque hemorrágico controlado. Neste protocolo, os animais foram sangrados até que fosse atingida uma pressão arterial média (PAM) de 35 mmHg, em um período de 10 minutos, sendo este nível de PAM mantido por 50 minutos. Ao término deste período de choque, os animais foram randomizados em três grupos para reposição volêmica: reposição com solução de Ringer lactato (grupo RL, n=7), na dose de 33 mL/Kg; reposição com solução salina hipertônica a 3% (grupo SH3%, n=7), na dose de 10 mL/Kg; reposição com solução salina hipertônica a 7,5% (grupo SH7,5%, n=7), na dose de 4 mL/Kg. Após a infusão das soluções, metade do volume de sangue retirado foi reinfundido em todos os animais. Sangue arterial foi coletado para análise de gasometria, lactato, concentração plasmática de sódio e osmolaridade plasmática. Para avaliação da resposta inflamatória, os animais foram sacrificados quatro horas após o início do experimento, sendo obtidas amostras de sangue para determinação das concentrações plasmáticas de interleucina (IL) -6 e fator de necrose tumoral (TNF) -alfa. Amostras de tecido pulmonar e intestinal foram obtidas para avaliação histopatológica de lesão orgânica, sendo as lâminas analisadas por dois patologistas sem conhecimento prévio dos grupos, determinando-se, assim, um escore de lesão baseado em um sistema de pontuação. RESULTADOS: Todos os animais submetidos à reposição volêmica apresentaram valores adequados de PAM ao término do tratamento. Nos animais tratados com as duas concentrações de solução salina hipertônica, a concentração plasmática de sódio e o valor da osmolaridade plasmática foram significativamente maiores, quando comparados aos grupos CT e RL. A concentração plasmática de TNF-alfa foi significativamente maior nos animais tratados com a solução de Ringer lactato, não havendo, para tanto, diferenças estatísticas entre os grupos CT, SH3% e SH7,5%. Em relação a IL-6, não se observou diferenças estatisticamente significantes entre os grupos CT, SH3% e SH7,5%, sendo a concentração plasmática deste mediador inflamatório significativamente elevada no grupo RL, quando comparado ao grupo CT. O escore de lesão pulmonar foi significativamente maior no grupo RL, em comparação aos grupos SH3% e SH7,5% (5,7 ± 0,7, 2,7 ± 0,5, 2,1 ± 0,4, respectivamente). Os animais dos grupos SH3% e SH7,5% apresentaram atenuação da lesão intestinal pós-choque em comparação aos animais do grupo RL (2,3 ± 0,4, 2,0 ± 0,6, 5,9 ± 0,6, respectivamente). CONCLUSÕES: O tratamento do choque hemorrágico com as duas concentrações de solução salina hipertônica resultou em atenuação da resposta inflamatória pós-choque. A solução salina hipertônica a 3% apresentou efeitos metabólicos e imunológicos semelhantes à solução salina hipertônica a 7,5%, sendo ambas superiores em relação aos parâmetros estudados à solução de Ringer lactato. / BACKGROUND: Recent studies have been conducted examining the efficacy of 3% hypertonic saline solution (HSS) in traumatic brain injury; however, few studies have analyzed the effects of 3%HSS during hemorrhagic shock. The aim of this study was to test the potential immunomodulatory benefits of 3%HSS resuscitation over standard fluid resuscitation. METHODS: Wistar rats were bled to a mean arterial pressure (MAP) of 35 mmHg and then randomized in 3 groups: LR (lactated Ringer, 33mL/Kg, n=7), 3%HSS (10mL/Kg, n=7) and 7.5%HSS (4mL/Kg, n=7). Half of the shed blood was infused after fluid resuscitation. Animals who did not undergo shock served as controls (CT,n=5). Four hours after HS, blood was collected for evaluation of tumor necrosis factor (TNF)-alpha and interleukin (IL)-6 by enzyme immunoassay. Lung and intestinal samples were obtained for histopathological analysis. RESULTS: Animals in HSS groups had significantly higher MAP than LR one hour after treatment. Osmolarity and sodium levels were markedly elevated in HSS groups. TNF-alpha and IL-6 levels were similar between CT and HSS groups, but significantly higher in LR (p<0.05). Lung injury score was significantly higher in LR when compared to 7.5%HSS and 3%HSS (5.7 ± 0.7, 2.1 ± 0.4 and 2.7 ± 0.5, respectively). Intestinal injury was attenuated in the 7.5%HSS and 3%HSS groups when compared to LR (2.0 ± 0.6, 2.3 ± 0.4 and 5.9 ± 0.6, respectively). CONCLUSIONS: Small volume resuscitation strategy modulates the inflammatory response and decrease the end-organ damage after HS. 3%HSS provides immunomodulatory and metabolic effects similar to those observed with conventional concentration of HSS.

Protein kinase A (PKA) is an important enzyme inside the body; it is responsible for phosphorylation of gene regulatory elements and thus regulation of gene expression inside the nucleus. Malfunction of PKA affects transcriptional and translational levels of cell signaling ligands, leading to abnormal activity of various signaling pathways. PKA holoenzyme is composed of two regulatory and two catalytic subunits; four main regulatory subunit isoforms (R1α, R1β, R2α and R2β) and four main catalytic subunit isoforms (Cα, Cβ, Cγ and Prkx) of PKA have been identified. Mutations in these subunits lead to altered total PKA activities and PKAT-I to PKAT-II ratios, leading to diseases both in human and mice. These diseases include Carney Complex (CNC), fibrous dysplasia (FD) and Cushing syndrome. We studied the effect of PKA subunit mutations on intracellular PKA activities, PKAT-I to PKAT-II ratios, and bone and adrenal gland phenotypes in transgenic mouse models. Firstly, we generated whole-body transgenic mice single or double heterozygous for PKA regulatory subunits. Tail vertebral bone lesions including osteosarcomas, osteochondromas and osteochondrosarcomas were found in these mice and we found that mutations in different PKA subunits affect bone lesion formation, new bone generation, and bone organization and mineralization in mouse tail vertebrae. Elevated Cβ subunit expression in Parkar1a+/-Prkar2a+/- and Prkar1a+/-Prkar2b+/-double heterozygous mice leads to a less severe vertebral bone lesion phenotype, an increased osteogenic activity and a better bone regeneration activity. We then studied mice with tissue specific knock out of Prkar1a, the gene coding for type I regulatory subunit, specifically in adrenal cortex (AdKO). AdKO mice developed pituitary-independent Cushing syndrome with increased PKA activity. They also demonstrated increased plasma corticosterone levels resistant to dexamethasone suppression. Dietary treatment of both mice with bone lesions and mice with adrenal lesions with COX2 inhibitor Celecoxib led to partial rescue of phenotypes; this is due to inhibition of the positive feedback loop between PKA signaling and inflamasome pathway at COX2 induction level by Celecoxib. / 蛋白激酶A（PKA）是人體中重要的蛋白酶， 它通過燐酸化基因調控元件來實現對細胞核內基因表達的調節。PKA異常影響細胞內信號傳遞因子的基因轉錄和蛋白翻譯水平，從而導致各細胞信號通路的異常活動。PKA全酶由兩個調節亞基和兩個催化亞基組成，目前已經發現的有四個調節亞基 (R1α, R1β, R2α 和R2β) 以及四個催化亞基(Cα, Cβ, Cγ和Prkx)。發生在這些亞基中的基因突變會改變總的PKA活動水平，PKA-I 和PKA-II的比例，在人類和實驗鼠中引起疾病。這些疾病包括卡尼綜合症 （CNC），骨纖維性發育不良（FD）和庫欣綜合症。我們在轉基因鼠模型中研究PKA亞基突變對細胞中PKA總活性， PKA-I和PKA-II比例的影響，以及由此帶來的骨和腎上腺表型的改變和病變。我們首先製造了有一個或兩個PKA亞基雜合性缺失的全身轉基因鼠。在這些轉基因鼠中，我們發現了包括骨肉瘤，骨軟骨瘤和骨軟骨肉瘤在內的尾椎骨病變。研究發現在不同PKA亞基中的基因變異對實驗鼠尾椎骨病變的發生，新骨的形成和骨的結構和纖維化均有影響。在Prkar1a+/-Prkar2a+/-和Prkar1a+/-Prkar2b+/-實驗鼠中我們發現了較高的Cβ催化亞基表達，這兩個基因型因此具有更輕度的骨病變和更強的骨再生能力。我們繼續研究了在腎上腺中敲除了標記PKA 第一調節亞基的Prkar1a基因的實驗鼠 （AdKO）。AdKO實驗鼠中產生了與垂體無關的庫欣綜合症，並伴隨PKA活性的增加。它們還表現出耐地塞米松抑制的血漿皮質酮水平增加。對骨病變或腎上腺病變的實驗鼠通過飲食進行COX2抑制劑塞來昔布的治療可以部分緩解病變表型。這是由對PKA和炎性體的正反饋機制在COX2誘導步驟的抑制造成的。 / Liu, Sisi. / Thesis Ph.D. Chinese University of Hong Kong 2015. / Includes bibliographical references (leaves 115-130). / Abstracts also in Chinese. / Title from PDF title page (viewed on 09, September, 2016). / Detailed summary in vernacular field only.

O vírus da cinomose canina (CDV) é um importante patógeno de cães domésticos e carnívoros selvagens. A infecção pelo CDV é relevante a nível mundial e está associada com alta morbidade e mortalidade. Em diversos países a cinomose é considerada controlada pelo uso de vacinas, no entanto, no Brasil ainda é endêmica, principalmente devido ao grande número de animais não domiciliados. Além disso, surtos em cães e várias espécies de animais silvestres ocorrem com frequência, dizimando populações ameaçadas. As vacinas vivas atenuadas são seguras para cães, mas seu uso não é aconselhado em espécies altamente suscetíveis à infecção pelo CDV. Também os relatos de surtos de cinomose em cães supostamente vacinados levantam a hipótese de que as vacinas disponíveis no mercado podem não ser eficientes frente a algumas cepas de campo. Com o objetivo de gerar dados acerca dos mecanismos de evolução do CDV e desenvolver e testar a eficácia de uma vacina bivalente inativada contra o vírus da raiva (RABV) e CDV a presente tese será apresentada na forma de dois artigos científicos. Ainda, um artigo de revisão sobre os modelos animais utilizados para obtenção de informações sobre o vírus do sarampo utilizando a infecção de CDV em furões e cães foi publicada e será apresentada na presente tese. No primeiro artigo, foi analisada a ocorrência de recombinação homóloga em genomas de CDV e detectou-se oito possíveis vírus recombinantes, incluindo um evento de recombinação entre uma cepa de campo e uma cepa vacinal atenuada, sugerindo que o uso de vacinação com vírus vivo atenuado pode influenciar a evolução do CDV. No segundo trabalho, uma vacina recombinante bivalente inativada baseada em RABV expressando as glicoproteínas do envelope do CDV, hemaglutinina e proteína de fusão, mostrou-se eficiente na proteção contra infecção por CDV em furões quando utilizado um protocolo prime/boost. Finalmente, foi publicada uma revisão de literatura sobre os modelos animais utilizados para obtenção de informações sobre a patogênese do vírus do sarampo utilizando a infecção com o vírus da cinomose. / Canine distemper virus (CDV) is an important pathogen of domestic dogs and wild carnivores. CDV infection is globally relevant and it is associated with high morbidity and mortality. In several countries, distemper is considered controlled by vaccination, however, in Brazil it is still endemic, mainly due to the large number of non-domiciliated animals. In addition, outbreaks in dogs and various species of wild animals occur frequently, decimating threatened populations. Live attenuated vaccines are safe for dogs, but their use is not advised in species that are highly susceptible to CDV infection. Also, reports of canine distemper in supposedly vaccinated dogs raise the hypothesis that commercially available vaccines may not be effective against some wild type strains. In order to investigate the mechanisms of CDV evolution and to develop and assess the efficacy of an inactivated bivalent vaccine against rabies virus and CDV, this thesis will be presented in the form of two scientific papers. Furthermore, a review article on the animal models used to gain information on measles virus using CDV infection in ferrets and dogs has been published and will be presented in this thesis. In the first paper, the occurrence of homologous recombination in CDV genomes was analyzed and eight possible recombinant viruses were detected, including a recombination event between a wild type strain and an attenuated vaccine strain, suggesting that the use vaccines based on attenuated live virus may influence CDV evolution. In the second study, an inactivated bivalent recombinant vaccine based on RABV expressing CDV envelope glycoproteins, hemagglutinin and fusion protein, proved to be effective in protecting against CDV infection in ferrets when using a prime/boost protocol. Finally, a literature review was published on the animal models used to obtain information on the pathogenesis of measles virus using infection with canine distemper virus.

L’hypertension artérielle pulmonaire (HTAP) est une maladie grave caractérisée par une obstruction progressive des artères pulmonaires de petit calibre, conduisant à une augmentation des résistances vasculaires pulmonaires et, à terme, à une défaillance cardiaque droite et au décès du patient. La vasoconstriction, le remodelage vasculaire et la dysfonction endothéliale pulmonaire sont autant de facteurs qui contribuent au développement et à la progression de la maladie. Plusieurs arguments sont également en faveur d’une hypothèse de désordres immunologiques, voire autoimmuns, dans la physiopathologie de l’HTAP. Malgré ces données, le lien entre endothélium pulmonaire et système immunitaire dans cette maladie restent peu connus. Ce travail de thèse a donc eu pour objectif d’étudier et mieux comprendre la nature et les conséquences d’une communication aberrante entre cellules endothéliales pulmonaires et système immunitaire dans la pathogénèse de l‘HTAP, afin d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques. Pour cela, nous avons analysé le rôle de la dysfonction endothéliale dans la régulation de deux processus de la dysfonction immunitaire : l’autoimmunité pour la réponse adaptative d’une part, et la sécrétion de cytokines en ce qui concerne la réponse innée d’autre part. A travers ce travail de thèse, nous avons mis en évidence l’existence d’une communication aberrante entre endothélium pulmonaire et système immunitaire dans l’HTAP et montré que l‘endothélium pulmonaire jouait un rôle primordial dans le contrôle des réponses adaptatives, en régulant la fonction des lymphocytes T régulateurs via la leptine, et dans la participation active à la réponse innée, en acquérant un phénotype pro-inflammatoire. Cette meilleure compréhension du rôle de la dysfonction endothéliale dans la dérégulation du système immunitaire présente dans l’HTAP pourrait aider au développement de nouvelles stratégies thérapeutiques dans cette maladie. / Pulmonary arterial hypertension (PAH) is a severe disease characterized by a progressive obstruction of small pulmonary arteries, leading to an increase in pulmonary vascular resistance and ultimately right heart failure and death. Vasoconstriction, vascular remodeling and pulmonary endothelial dysfunction contribute to the disease development and progression. Increasing evidence are also suggesting the importance of immune disorders, such as autoimmunity, in PAH pathophysiology. Despite these data, the link between pulmonary endothelium and immune system is still unclear. The objective of this work was to investigate and elucidate the nature and the consequences of an aberrant communication between pulmonary endothelial cells and immune system in PAH pathogenesis, in order to identify new therapeutical targets. Therefore, we analyzed the role of endothelial dysfunction in the control of two types of altered immune responses: autoimmunity for the adaptive response and cytokine secretion for the innate response. In this work, we highlighted the existence of an aberrant communication between pulmonary endothelium and immune system in PAH and showed that pulmonary endothelium played a key role in the control of adaptive responses, by regulating regulatory T lymphocyte function in a leptin-dependent manner, and by actively participating to the innate responses through a pro-inflammatory phenotype. A better understanding of the role of endothelial dysfunction in PAH immune system dysregulation may help to the development of new therapeutical strategies for this disease.

Wong, Siu Lun. / Thesis (M.Phil.)--Chinese University of Hong Kong, 2007. / Includes bibliographical references (leaves 129-141). / Abstracts in English and Chinese. / Abstract --- p.i / Abstract (Chinese version) --- p.iii / Acknowledgements --- p.iv / List of Abbreviations --- p.v / List of Tables --- p.vii / List of Figures --- p.viii / Chapter 1. --- INTRODUCTION / Chapter 1.1 --- Neurodegenerative disorders - a brief overview --- p.1 / Chapter 1.2 --- Polyglutamine diseases --- p.2 / Chapter 1.3 --- Microscopically visible polyglutamine protein aggregates and its relation to toxicity --- p.7 / Chapter 1.4 --- Polyglutamine protein conformers and their relation to toxicity --- p.10 / Chapter 1.5 --- Modeling polyglutamine diseases in Drosophila / Chapter 1.5.1 --- GAL4/UAS spatial transgene expression system in Drosophila --- p.14 / Chapter 1.5.2 --- Temporal control of GAL4/UAS transgene expression system in Drosophila --- p.16 / Chapter 1.5.3 --- Drosophila as a model to study human pathologies --- p.19 / Chapter 1.5.4 --- Drosophila as a model to study polyglutamine diseases --- p.21 / Chapter 1.6 --- Aims of study --- p.26 / Chapter 2. --- MATERIALS AND METHODS / Chapter 2.1 --- Drosophila culture and manipulation / Chapter 2.1.1 --- Drosophila culture --- p.27 / Chapter 2.1.2 --- Phenotypic examination of adult external eye degeneration --- p.27 / Chapter 2.1.3 --- Pseudopupil assay of adult retinal degeneration and observation of green fluorescent protein in adult eyes --- p.28 / Chapter 2.2 --- Semi-quantitative Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction / Chapter 2.2.1 --- RNA extraction from adult Drosophila heads --- p.30 / Chapter 2.2.2 --- DNase treatment of extracted RNA --- p.31 / Chapter 2.2.3 --- Reverse transcription-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) --- p.31 / Chapter 2.2.4 --- Agarose gel electrophoresis --- p.33 / Chapter 2.3 --- Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis (SDS-PAGE) / Chapter 2.3.1 --- Protein extraction from adult Drosophila heads --- p.33 / Chapter 2.3.2 --- Preparation of SDS-polyacrylamide gel and electrophoresis --- p.34 / Chapter 2.3.3 --- Western blotting --- p.35 / Chapter 2.3.4 --- Immunodetection --- p.36 / Chapter 2.4 --- Immunoprecipitation --- p.38 / Chapter 2.5 --- Filter retardation assay --- p.39 / Chapter 2.6 --- Isolation and solubilization of SDS-insoluble protein --- p.40 / Chapter 2.7 --- Sucrose gradient sedimentation --- p.41 / Chapter 2.8 --- Preparation of Drosophila tissues for immunofluorescence analysis / Chapter 2.8.1 --- Dissection and immunostaining of Drosophila larval imaginal eye discs --- p.42 / Chapter 2.8.2 --- Cryosectioning and immunostaining of adult Drosophila heads --- p.44 / Chapter 2.9 --- Atomic force microscopy --- p.47 / Chapter 2.10 --- Reagents and buffers / Chapter 2.10.1 --- Reagents for Drosophila culture --- p.48 / Chapter 2.10.2 --- Reagents for RT-PCR --- p.52 / Chapter 2.10.3 --- Reagents for SDS-PAGE --- p.54 / Chapter 2.10.4 --- Reagents for immunoprecipitation --- p.57 / Chapter 2.10.5 --- Reagents for filter retardation assay --- p.57 / Chapter 2.10.6 --- Reagents for isolation and solubilization of SDS-insoluble protein --- p.58 / Chapter 2.10.7 --- Reagents for sucrose gradient sedimentation --- p.58 / Chapter 2.10.8 --- Reagents for immunofluorescence --- p.59 / Chapter 3. --- RESULTS / Chapter 3.1 --- Establishment of an inducible transgenic Drosophila model of polyglutamine diseases / Chapter 3.1.1 --- Introduction --- p.60 / Chapter 3.1.2 --- Results / Chapter 3.1.2.1 --- GAL80ts-mediated inducible expression of expanded polyglutamine protein in Drosophila / Chapter 3.1.2.1.1 --- GAL80ts controls GAL4/UAS-mediated polyQ protein expression --- p.61 / Chapter 3.1.2.1.2 --- Inducible expression of SDS-soluble expanded polyglutamine protein --- p.64 / Chapter 3.1.2.1.3 --- Inducible expression of expanded polyglutamine protein accumulates gradually in form of SDS-insoluble protein --- p.66 / Chapter 3.1.2.1.4 --- Inducible expression of expanded polyglutamine protein results in progressive accumulation of microscopically visible aggregates --- p.68 / Chapter 3.1.2.2 --- Inducible expression of expanded polyglutamine protein causes late-onset progressive neuronal degeneration in Drosophila / Chapter 3.1.2.2.1 --- Inducible expression of expanded polyglutamine protein leads to late-onset progressive deterioration of photoreceptor neurons --- p.68 / Chapter 3.1.2.2.2 --- Inducible expression of expanded polyglutamine protein neither causes external eye degenerative phenotype nor disrupts gross retinal morphology despite deterioration of photoreceptor neurons --- p.72 / Chapter 3.1.2.3 --- Co-expression of caspase inhibitor P35 suppresses polyglutamine-induced neuronal degeneration --- p.72 / Chapter 3.1.2.4 --- Co-expression of molecular chaperone Hsp70 suppresses polyglutamine-induced neuronal degeneration --- p.74 / Chapter 3.1.2.5 --- Inducible expression of expanded polyglutamine protein results in biphasic expression of molecular chaperone Hsp70 in Drosophila --- p.76 / Chapter 3.1.3 --- Discussion --- p.76 / Chapter 3.2 --- Involvement of microscopically visible polyglutamine aggregates in neurodegeneration / Chapter 3.2.1 --- Introduction --- p.83 / Chapter 3.2.2 --- Results / Chapter 3.2.2.1 --- Effect of Hsc70-K71S on microscopically visible polyglutamine aggregates and neuronal degeneration / Chapter 3.2.2.1.1 --- Co-expression of Hsc70-K71S reduces the level of microscopically visible polyglutamine aggregates --- p.83 / Chapter 3.2.2.1.2 --- Co-expression of Hsc70-K71S does not alter polyglutamine transgene expression --- p.84 / Chapter 3.2.2.1.3 --- Co-expression of Hsc70-K71S does not modify polyglutamine-induced neuronal degeneration --- p.87 / Chapter 3.2.2.2 --- Microscopically visible polyglutamine aggregates do not correlate with neuronal degeneration --- p.90 / Chapter 3.2.3 --- Discussion --- p.93 / Chapter 3.3 --- Detection of small SDS-insoluble expanded polyglutamine protein species and its association with neurodegeneration / Chapter 3.3.1 --- Introduction --- p.97 / Chapter 3.3.2 --- Results / Chapter 3.3.2.1 --- Accumulation of SDS-soluble expanded polyglutamine protein does not correlate with neuronal degeneration --- p.98 / Chapter 3.3.2.2 --- Identification of small SDS-insoluble expanded polyglutamine protein species / Chapter 3.3.2.2.1 --- Accumulation of total SDS-insoluble expanded polyglutamine protein positively correlates with progressive neuronal degeneration --- p.99 / Chapter 3.3.2.2.2 --- Accumulation of large SDS-insoluble expanded polyglutamine protein does not correlate with neuronal degeneration --- p.99 / Chapter 3.3.2.2.3 --- Accumulation of small SDS-insoluble expanded polyglutamine protein correlates with neuronal degeneration --- p.104 / Chapter 3.3.3 --- Discussion --- p.107 / Chapter 3.4 --- Biophysical characterization of small SDS-insoluble expanded polyglutamine protein species / Chapter 3.4.1 --- Introduction --- p.109 / Chapter 3.4.2 --- Results / Chapter 3.4.2.1 --- Separation of expanded polyglutamine protein species by sucrose gradient sedimentation --- p.110 / Chapter 3.4.2.2 --- Morphological studies of small SDS-insoluble expanded polyglutamine protein species by atomic force microscopy --- p.112 / Chapter 3.4.3 --- Discussion --- p.118 / Chapter 4. --- GENERAL DISCUSSION --- p.124 / Chapter 5. --- CONCLUSION --- p.127 / Chapter 6. --- REFERENCES --- p.129

Este trabalho apresenta a continuidade da avaliação farmacológica das substâncias LASSBio-579, LASSBio-580 e LASSBio-581, através de ensaios in vitro e in vivo, em busca de um novo protótipo para o desenvolvimento de novos fármacos antipsicóticos de segunda geração. LASSBio-581 se liga a receptores D2-like (Ki=0,95 μM), 5-HT1A (Ki=1,2 μM) e 5-HT2A (Ki=11 μM) com afinidades moderadas. Esta substância é capaz de reduzir a temperatura corporal de roedores, um efeito provavelmente mediado pela ativação de receptores 5-HT1A, e inibir o desenvolvimento de head-twiches e ear-scratches induzidos pela administração de um antagonista de receptores 5-HT2A. Estes efeitos demonstram a capacidade de LASSBio-581 em modular o sistema serotonérgico in vivo e in vitro. Porém, quanto avaliado em modelos animais preditivos de ação antipsicótica, LASSBio-581 foi inativo. LASSBio-580 também é capaz de se ligar a receptores D2-like (Ki=0,73 μM), 5-HT1A (Ki=0,48 μM) e 5-HT2A (Ki=5,7 μM) com afinidades moderadas. Esta substância não foi capaz de inibir o desenvolvimento do comportamento de escalada nem a redução da temperatura corporal de roedores induzidos por apomorfina, não apresentando potencial atividade antipsicótica nos ensaios realizados. Já LASSBio-579 é capaz de modular três diferentes sistemas neurotransmissores envolvidos na patofisiologia da esquizofrenia: a neurotransmissão dopaminérgica, serotonérgica e glutamatérgica. Esta substância se liga a receptores D2-like (Ki=0,11 μM), 5-HT1A (Ki=0,09 μM) e 5-HT2A (Ki=2,2 μM) com afinidades adequadas para uma molécula protótipo que se liga a múltiplos alvos. Apresenta ação antidopaminérgica in vivo, demonstrada em três modelos animais preditivos de atividade antipsicótica (sintomas positivos): inibição da estereotipia anfetamínica (NEVES et al., 2003), bloqueio do comportamento de escalada induzido por apomorfina e hipotermia apomorfínica. A ação agonista 5-HT1A de LASSBio-579 in vivo foi claramente demonstrada através de ensaios de aferição da temperatura corporal, onde o efeito hipotérmico induzido por esta substância é completamente bloqueado pela pré-administração de WAY 100635. Porém, a habilidade de LASSBio-579 em modular a atividade de receptores 5-HT2A in vivo permanece incerta. Ensaios eletrofisiológicos preliminares demonstraram um aumento da liberação de glutamato induzido por LASSBio-579 que parece ser mediado pela ativação de receptores 5-HT2A, porém comportamentos ou efeitos relacionados a ativação deste sub-tipo de receptor serotonérgico não foram identificados em roedores tratados com LASSBio-579. Além disso, a administração de LASSBio-579 não induziu efeitos catatônicos em camundongos em doses até 12 vezes superiores àquela ativa no modelo do bloqueio do comportamento de escalada induzido por apomorfina. Estes resultados demonstram que a estratégia de planejamento de fármacos baseado na estrutura do ligante empregada neste trabalho se mostrou bem sucedida. LASSBio-579 pode ser considerado um novo protótipo de fármaco antipsicótico de segunda geração, ativo em modelos animais de sintomas positivos da esquizofrenia e com baixo potencial de indução de efeitos motores. Porém, algumas limitações em seu perfil farmacológico pode ser identificadas. A afinidade desta substância por receptores dopaminérgicos e serotonérgicos é considerada moderada e inferior a de antipsicóticos atualmente no mercado. Ainda, LASSBio-579 induziu um prejuízo na coordenação motora em roedores e apresentou um perfil farmacocinético pouco adequado a utilização clinica (CONRADO et al., 2008). Estes dados encorajam a busca de substâncias com um perfil farmacológico superior ao de LASSBio-579. Neste sentido, uma triagem farmacológica de 18 derivados N-fenilpiperazínicos análogos a LASSBio-579 foi realizada. Os resultados obtidos nos ensaios de radioligação a receptores D2-like, 5-HT1A e 5-HT2A foram utilizados na proposição de relações qualitativas entre estrutura química das substâncias e a afinidade apresentada pelos diferentes receptores. A partir dos resultados obtidos in vitro, cinco outras substâncias foram selecionadas para avaliação da potencial atividade frente a sintomas positivos da esquizofrenia no modelo de bloqueio do comportamento de escalada induzido por apomorfina. Neste ensaio, apenas LASSBio-664 apresentou atividade, sem induzir catatonia nos animais. Porém, esta substância também induz um importante prejuízo motor nos animais. Ensaios adicionais são necessários a fim de diferenciar o perfil farmacológico de LASSBio-664 e LASSBio-579. Outro objetivo deste trabalho foi iniciar o desenvolvimento de um modelo animal de sintomas da esquizofrenia. Os resultados obtidos até o momento apontam para a possibilidade do desenvolvimento de um modelo relacionado a sintomas negativos/cognitivos da esquizofrenia baseados na esposição à natação forçada repetida. Foi demonstrado que apenas clozapina e não imipramina é capaz de reverter o aumento de imobilidade ao longo dos dias acarretado pela exposição repetida à natação forçada em roedores. Este dado demonstra uma potencial validade preditiva, o primeiro grau de validação necessário para um novo modelo animal. O efeito de LASSBio-579 também foi avaliado neste procolo experimental. / This study strengthened the pharmacological evaluation of the heterocyclic Nphenylpiperazine derivatives LASSBio-579, LASSBio-580 and LASSBio-581 by means of in vitro and in vivo pharmacological assays searching a new second generations antipsychotic lead compound. LASSBio-581 presented moderate affinitties for D2-like (Ki=0.95 μM), 5-HT1A (Ki=1.2 μM) e 5-HT2A (Ki=11 μM). This compound induced an hypothermic effect in rodents probably mediated by 5-HT1A receptor activation. LASSBio-581 administration inhibited the induction of head-twiches and ear-scratches by a 5-HT2A agonist. These results shown that LASSBio-581 modulates serotonergic neurotransmission in vivo and in vitro. However, it was inactive on animal models predictive of antipsychotic activity. LASSBio-580 presented moderate affinitties for D2-like (Ki=0.73 μM), 5-HT1A (Ki=0.48 μM) e 5-HT2A (Ki=5.7 μM). This compound did not inhibited apomophine-induced climbing nor apomorphine-induced hypothermia. Thus, among the three compounds initially evaluated, LASSBio-579 was the only one that exhibited promising results. This derivative was able to modulate three neurotransmitter systems involved in schizophrenia’s pathophysiology: dopaminergic, serotonergic and glutamateric ones. As a multi-target lead compound, LASSBio-579 presented adequated affinities for D2-like, 5-HT1A and 5-HT2A receptors (Ki D2-like = 0.11 μM, 5-HT1A = 0.093 μM and 5-HT2A = 2.2 μM). Its antidopaminergic in vivo effect was demonstrated in three animal models of positive symptons of schizophrenia: amphetamineinduced stereotypy (NEVES et al., 2003), apomorphine-induced climbing behavior and apomorphine-induced hypothermia. Regarding the serotonergic system, LASSBio-579 was considered a 5-HT1A receptor agonist, since the hypothermia induced by this compound was blocked by WAY 100,635 pre-administration. The ability of LASSBio-579 to modulate 5-HT2A receptors was not fully characterized. Electrophysiological assays demonstrated an increase on synaptic glutamate release induced by LASSBio-579 that may be related to 5-HT2A receptor activation, however this compound did not induce any behavior related to 5-HT2A activation in rodents. In addition, LASSBio-579 did not induce catalepsy in mice at doses 12 folds higher than those active at apomorphine-induced climbing test. Thus, LASSBio-579 represents a new antipsychotic lead compound active in animal models of positive symptoms of schizophrenia and with a mild propensity to induce motor side effects. However, some limitations on LASSBio-579’s pharmacological profile could be identified. The affinity of LASSBio-579 for dopamine and serotonin receptors is moderate and lower than those presented by second generation antipsychotics. Furthermore, this compound induced a mild decrease on locomotion and exploratory behavior, a meaningful motor coordination impairment and presents a limited oral bioavailability and a low brain penetration (CONRADO et al., 2008). Considering this, a pharmacologycal screening of 18 N-phenylpiperazine derivatives were done in order to achieve an optimized analogue of LASSBio-579. Structural features of this molecular scaffold were discussed regarding binding affinity and selectivity for D2-like, 5-HT1A and 5-HT2A receptors. Among the compounds prepared, LASSBio-664 exhibited an adequate binding profile and a potential for schizophrenia positive symptoms treatment without cataleptogenic effects. However, the motor coordination impairment remained. Additional pharmacological characterization of LASSBio-664 is still needed to find differences from LASSBio-579’s profile. Another aim of this study was to start the development of an animal model of schizophrenia symptons. It was shown that clozapine but not imipramine presented an anti-immobility effect in animals repeated exposed to forced swimming. This result points to the usefullness of repeated forced swimming protocol for developing new animal models predictive of antipsychotic action. The effect of LASSBio-579 in this protocol was also evaluated.

O canabidiol (CBD), um componente não-psicotomomético presente na planta Cannabis sativa, induz efeitos ansiolíticos em roedores e humanos após administração sistêmica. Entretanto, poucos estudos foram feitos para identificar as estruturas cerebrais envolvidas nesses efeitos do CBD. Dados prévios do nosso laboratório apontam para um possível envolvimento do núcleo leito da estria terminal (NLET) nos efeitos ansiolíticos do CBD, como evidenciado pelos níveis alterados (reduzidos) de imunorreatividade para proteína c-Fos (marcador de ativação neuronial) em animais tratados com administração sistêmica de CBD no modelo da resposta emocional condicionada (REC) contextual. Os mecanismos de ação pelos quais o CBD produz seus também são ainda pouco compreendidos, mas pode envolver a ativação de receptores 5-HT1A. Assim, o presente trabalho investigou se a administração de CBD diretamente no NLET atenuaria a expressão da REC contextual. Além disso, nós também avaliamos o envolvimento do NLET nos efeitos ansiolíticos do CBD em outros dois modelos animais de ansiedade amplamente utilizados, o labirinto em cruz elevado e o teste do lamber punido de Vogel e, se os efeitos ansiolíticos do CBD envolveriam a ativação local de receptores 5-HT1A. Os resultados mostraram que o CBD reduziu significativamente o tempo de congelamento e atenuou as respostas cardiovasculares induzidas pela re-exposição ao contexto aversivo no modelo da REC contextual. Além disso, o CBD também aumentou a exploração dos braços abertos do LCE, bem como o número de lambidas punidas no teste de Vogel, sugerindo um efeito ansiolítico. Adicionalmente, o CBD não alterou o número de entradas nos braços fechados do LCE e não interferiu no consumo de água ou no limiar nociceptivo, descartando potenciais interferentes nesses dois modelos. Nós também observamos que o pré-tratamento local com WAY100635, um antagonista de receptores 5-HT1A, foi capaz de bloquear os efeitos do CBD injetado no NLET nos três modelos animais utilizados. Logo, estes resultados dão suporte à proposta que NLET está envolvido nos efeitos ansiolíticos do CBD observado após a administração sistêmica, e que este efeito parece envolver a neurotransmissão mediada por receptores 5-HT1A. / Cannabidiol (CBD), a major non-psychotomimetic compound from Cannabis sativa, induces anxiolytic effects in rodents and humans following systemic administration. Despite the brain structures of CBD acts remain poorly understood, previous results from our laboratory suggest that the bed nucleus of the stria terminalis (BNST) may be involved in the anxiolytic effects of CBD, as evidenced by changed levels (decreased) in c-Fos protein expression (a marker of neuronal activation) in animals treated with systemic administration of CBD in the contextual fear conditioning. The mechanisms of CBD effects are still poorly understood but may involve activation of 5-HT1A receptors. Thus, in the present study, we have investigated the anxiolytic-like effects of intra-BNST administration of CBD in rats submitted to contextual fear conditioning. Moreover, we also evaluated the involvement of the BNST in the anxiolytic effects of CBD in other two widely used animal models of anxiety, the elevated plus-maze and the Vogel conflict test, and if these effects are mediated by local activation of 5-HT1A receptors. The results showed that CBD significantly decreased the freezing time and attenuated the cardiovascular responses induced by contextual fear conditioning. Moreover, CBD has also increased the exploration of open arms in EPM, and the number of punished licks in the Vogel test, suggesting an anxiolytic effect. Additionally, the CBD did not alter the number of entries in closed arms of the EPM and did not affect water consumption or pain threshold, eliminating potential interferences of these two models. We also found that local pretreatment with WAY100635, a 5-HT1A receptor antagonist, was able to block the effects of CBD injected into the BNST in the three animal models of anxiety used. Hence, these results support the proposal that BNST is involved in anxiolytic effects of CBD observed after systemic administration, and this effect seems to involve the neurotransmission mediated by 5-HT1A receptors.

Objetivo: Verificar o remodelamento da pele e produção de anticorpos em modelo experimental de esclerodermia em coelhos, após indução de tolerância nasal com colágeno tipo V. Métodos: Coelhas Nova Zelândia (N=12) foram imunizadas com 1mg/ml de colágeno V (Col V) em adjuvante completo de Freund e dois reforços com adjuvante incompleto de Freund. Seis coelhas imunizadas receberam uma dose diária de 25ug de Col V, iniciado via nasal (grupo tolerado) 150 dias do começo das imunizações e seis animais foram somente imunizadas (grupo imunizado). Um grupo imunizado com adjuvante de Freund serviu como controle. Biopsias de pele foram coletadas em 0, 75, 120, 150 e 210 dias e coradas pelo H&E, tricrômico de Masson e Sírius red para analise morfológica e morfométrica. Os colágenos I, III e V, além de TGFbeta e PDGF foram imunomarcados por imunofluorescência. Os soros dos animais foram coletados em 0, 150 e 210 dias para determinar anticorpos anti-colágenos I, III, IV e V e anti-nucleares. Resultados: Os animais imunizados mostraram progressivo decréscimo da derme papilar, atrofia de anexos, aumento no depósito dos colágenos I, III e V e aumento da expressão de TGFbeta e PDGF. Os tolerados apresentaram aumento dos anexos cutâneos e significante diminuição no depósito dos colágenos I, III e V, TGFbeta e PDGF. O grupo de imunizados e de tolerados apresentaram anticorpos anti-colágenos III e IV e antinucleares. Conclusões: A indução de tolerância nasal com Col V diminuiu o remodelamento da pele observado no modelo experimental de esclerodermia e inibiu a síntese de citocinas fibrogênicas. Portanto, a tolerância nasal com Col V pode ser uma opção terapêutica promissora para o controle do remodelamento cutâneo em pacientes com esclerodermia. / Objective: Our aim was to verify the skin remodeling and antibody production in experimental model of scleroderma in rabbits, after induction of tolerance by daily nasal administration of human type V collagen (Col V). Methods: Female New Zealand rabbits (N=12) were immunized with 1mg/ml of Col V in complete Freund\'s adjuvant, followed by more two boosters in incomplete Freund\'s adjuvant. Six immunized rabbits received daily nasal administrating of 25ug of Col V (tolerated group), started 150 days after the first immunization, and the others animals (N=6) were only immunized (immunized group). Finally a group of rabbits immunized with Freund\'s adjuvant served as control. Skin biopsies were collected at 0, 75, 120, 150 and 210 days, and stained with H&E, Masson\'s trichrome and Sirius red for morphological and morphometric analysis. Types I, III and V collagen, TGFbeta and PDGF were immunostained by immunofluorescence. The sera of animals were colleted at 0, 150 and 210 days to determine anti types I, III, IV and V collagen and antinuclear antibodies. Results: The immunized animals showed progressive decrease of papillary dermis, appendages atrophy, increase of types I, III and V collagen deposition and increased expression of TGF-beta and PDGF. The tolerated rabbits presented increase of cutaneous appendages and significant decrease of types I, III and V and TGF-beta and PDGF. Both immunized and tolerated rabbits presented anti types III and IV antibodies and antinuclear antibodies. Conclusions: Col V nasal tolerance reduced skin remodeling in experimental model of scleroderma and inhibited synthesis of fibrotic cytokines. Therefore, the nasal tolerance with type V collagen can be a promising therapeutic option to control the skin remodeling in patients with scleroderma.