The trypanosomatid parasites T. brucei, T. cruzi and Leishmania spp. are responsible for the ‘neglected diseases’ Human African Trypanosomiasis, Chagas disease and Leishmaniasis respectively. In their human infective form in the bloodstream all three trypanosomatid parasites rely heavily on glycolysis for ATP production. Phosphofructokinase (PFK) catalyses the third step of the glycolytic pathway in all organisms using aerobic respiration. It facilitates the phospho transfer from ATP to fructose 6-phosphate (F6P) to make the products fructose 1,6- bisphosphate (F16BP) and ADP. RNAi knockout of T. brucei PFK has shown the enzyme is essential for survival of the bloodstream form parasites. Trypanosomatid PFKs have a unique set of structural and regulatory differences compared to the mammalian host enzyme. These differences, coupled with the availability of trypanosomatid PFK crystal structures present an opportunity for the structure-based design of specific inhibitors against the enzyme. Here we present an enzymatic characterisation of recombinant PFKs from T. brucei, T. cruzi and Leishmania infantum trypanosomatids, their regulation by the allosteric activator AMP, and their inhibition by drug-like inhibitor compounds. Inhibitor compounds (‘CTCB compounds’) were designed against T. brucei PFK with the aim of developing novel treatments against Human African Trypanosomiasis (HAT). We describe the testing, ranking and biophysical characterisation of these compounds as part of a Wellcome Trust Seeding Drug Discovery program. We found that CTCB inhibitor compounds bound to an allosteric pocket unique to trypanosomatid PFKs. We show that the compounds are specific; neither competing with the natural substrates ATP or F6P nor inhibiting the human PFK enzyme. We describe the development and testing of highly potent and specific low molecular weight PFK inhibitors that translate to both killing of cultured T. b. brucei parasites and a cure of stage I HAT in mice models. We describe the tight, 1:1 binding of these compounds with trypanosomatid PFKs, and the thermodynamic characteristics of binding through various biophysical assays. We also show the unprecedented characterisation of the reverse PFK reaction by trypanosomatid and human forms of the enzymes. We found that PFK can also carry out the reverse enzymatic reaction, under physiologically relevant concentrations of ADP and F16BP to produce F6P and ATP. We show that the reverse reaction is also subject to allosteric regulation by AMP, and can be inhibited by the CTCB compounds with a similar potency to the forward reaction. Finally, we describe the mechanism of allosteric activation by AMP and inhibition by the drug-like compounds against trypanosomatid PFKs.

A Leishmaniose Visceral Humana (LVH) é uma protozoonose sistêmica grave que tem apresentado mudança no comportamento epidemiológico, com uma tendência crescente no Brasil. Na Região Norte, com a criação do Estado do Tocantins em 1989, houve aumento da incidência de LV em decorrência das modificações ecoepidemiológicas. Foi realizado um estudo descritivo de corte transversal para avaliar o quadro da LVH no município de Araguaína (TO) no período de janeiro de 2007 a agosto de 2010. Adicionalmente, foram realizados ensaios para comparar as abordagens diagnósticas sorológicas para o diagnóstico da doença. Na distribuição dos casos de LVH nos municípios do norte do estado do Tocantins, Araguaína representa 79,8% no total dos casos no período de 2.007 a agosto de 2.010. Os resultados deste estudo revelaram que, nesse período, 769 casos foram confirmados, sendo que 98,7% foram de casos novos. Houve um predomínio do sexo masculino de 57,8% e a faixa etária mais acometida foi a de 0 a 14 anos, com 71,3% dos casos notificados. Na distribuição por zona de residência, foram notificados 98,5% dos casos na zona urbana, mostrando a urbanização da doença. Nos ensaios, foram utilizadas uma abordagem usual da rede do SUS: um ensaio de imunofluorescência indireta (IFI), um ELISA convencional, somados a um ELISA dissociativo. Os ensaios de ELISA apresentaram alta reprodutibilidade. Os pacientes positivos à IFI apresentaram uma frequência de 4% de falso-positivos quando testados em ambos os ELISA. Entre os pacientes suspeitos, houve uma alta frequência de positivos ao ELISA, maior no ELISA dissociativo do que no ELISA convencional. Na população assintomática, houve um achado de amostras positivas ao ELISA dissociativo. A presença de imunocomplexos em pacientes assintomáticos no início da doença ou sua presença em pacientes com resposta humoral menos intensa, como crianças, pode explicar estes achados de maior positividade no ELISA dissociativo. A confirmação destes resultados depende da pesquisa parasitológica em pacientes positivos ao ELISA dissociativo. Estes resultados mostram a importância de novas abordagens sorológicas no diagnóstico da LVH que viabilizariam uma triagem de paciente para diagnóstico parasitológico invasivo. / Human visceral leishmaniasis (HVL) is a severe systemic protozoonosis that has presented changes at the epidemiological behavior, with a growing trend in Brazil. It has been conducted a cross sectional study to assess the context of HVL in the city of Araguaina (TO) from January 2007 to August 2010. Additionally, tests were conducted to compare the diagnostic approaches for the serological diagnosis. In the distribution of cases of HVL in the districts of northern state of Tocantins, Araguaina represents 79.8% of the total cases in the period from 2007 to August 2010. The results of this study revealed that in this period, 769 cases were confirmed, while 98.7% are new cases. There was a male predominance of 57.8% and the most affected age group was 0-14 years, with 71.3% of reported cases. In the distribution by area of residence were reported 98.5% of cases in the urban area, showing the urbanization of the disease. In tests, we used the usual approaches network: an indirect immunofluorescence assay (IFA) and a conventional ELISA, plus a dissociative ELISA. ELISA assays showed high reproducibility. Positive patients with IFAT showed a frequency of 4% false-positive when tested in both ELISA. Among patients suspected there was a high frequency of positive to ELISA, the ELISA dissociative higher than in the conventional ELISA. In the asymptomatic population, there was a finding of positive samples by ELISA dissociative. The presence of immune complexes in asymptomatic patients early in the disease or its presence in patients with less intense humoral response, as children, these findings may explain the higher dissociative ELISA positive. Confirmation of these results depends on parasitologic research on dissociative ELISA-positive patients. These results show the importance of new approaches in the serological diagnosis LVH that would make a screening of patients for invasive diagnostic parasitology.

A leishmaniose é uma ameaça para cerca de 350 milhões de pessoas em 88 países no mundo. No município de Bandeirantes, estado do Paraná, Brasil, foram notificados 183 casos de leishmaniose tegumentar americana (LTA) entre 2000 a 2013. Objetivos: Descrever e analisar os casos de LTA ocorridos no município de Bandeirantes Paraná, entre 2007 e 2013 e investigar os fatores de risco associados à ocorrência da doença, considerando-se fatores socioeconômicos, condições habitacionais e do entorno das residências, atividades ocupacionais e de lazer, conhecimento sobre a LTA na população de estudo e algumas práticas; investigar a presença de anticorpos anti Leishmania sp. na população canina e descrever as características socioeconômicas, condições habitacionais e do entorno das residências, atividades ocupacionais, de lazer nos casos que evoluíram para óbitos bem como as características clínicas. Métodos: estudo caso-controle não pareado. A amostra constou de 104 casos autóctones de LTA notificados na Secretaria Municipal de Saúde de Bandeirantes e 90 controles, residentes selecionados aleatoriamente que apresentassem reação de imunofluorescência indireta (RIFI) negativa. A amostra da população canina foi composta por animais presentes nas residências dos casos e dos controles. Foram investigados os óbitos entre os indivíduos que tiveram LTA no período do estudo. Resultados: O sexo feminino prevaleceu entre os casos (62,50 por cento ) e controles (68,89 por cento ), bem como a faixa etária maior ou igual a 60 anos em ambos os grupos (46,15 por cento e 33,33 por cento , respectivamente). Todavia estas condições não se mostraram como fatores de risco significante. Mostraram-se como fatores de risco significantes (p < 0,05) as seguintes variáveis: ser analfabeto (OR = 10,09), aposentados (OR = 2,35), praticar atividades de lazer relacionadas à zona rural (OR = 4,47), frestas na casa (OR = 2,15), presença de matos próximos ao domicílio (OR = 6,92), presença de plantas frutíferas no peridomicílio (OR=2,02), anexos peridomicilares (OR = 4,30), galinheiro (OR=2,15) e canil (OR = 3,90), dormir fora do quarto (OR=4,97), 8 combate a animais sinantrópicos (OR = 2,69), uso de repelente corporal (5,43) e conhecer o mosquito transmissor (OR = 3,48), a relação com outros animais (OR =2,51) e prevenção (OR = 2,24). Como fatores de proteção: renda familiar > 3 salários mínimo (OR = 0,22), casa de alvenaria e reboco (OR = 0,41), abastecimento de água de rede (OR = 0,41), presença de rede de esgoto (OR = 0,33), coleta de lixo pública (OR = 0,35). Os exames sorológicos realizados nos cães do estudo demonstraram que 38,23 por cento foram reagentes para os casos e 2,12 por cento nos controles. Os cães dos casos possuem 28,47 vezes mais chance de contrair a LTA quando comparados com os cães dos controles (p<0,0001). Foram investigados 14 óbitos, 35,71 por cento estavam em tratamento da LTA e 42,86 por cento apresentavam lesões compatíveis com a LTA. Conclusões: A ocorrência da LTA em Bandeirantes mostrou-se associada estatisticamente às variáveis: idade, escolaridade, renda familiar, atividades de lazer relacionadas à zona rural, presença de anexos domiciliares e vegetação próximo ao domicílio, assim como o uso de repelente corporal, dormir fora do quarto e conhecer o mosquito vetor da LTA e a sua forma de prevenção. / The leishmaniasis threat around 350 million people in 88 countries around the world. In Bandeirantes - Parana from 2000 to 2013 183 cases of American tegumentary leishmaniasis (ATL) were reported. Objectives: to describe and analyze the occurrence of ATL in human population in Bandeirantes - Parana, between 2007 and 2013; to investigate the risk factors associated with the disease considering socioeconomic factors, housing conditions and the surrounding residences, occupational and leisure activities, knowledge of the LTA in the study population and some practical; investigate the presence of antibodies against Leishmania sp. the canine population and describe the socio-economic characteristics, housing conditions and the surrounding residences, occupational activities, leisure in cases that evolved to death and the clinical characteristics. Methods: A not paired case-control study was performed in with 104 cases, individuals who had autochthonous ATL notified in the Municipal Health Department of Bandeirantes and 90 controls were randomly selected out of those who presented negative reaction of indirect immunofluorescence (IIF). The canine population was selected from the cases and controls. The deaths among those individuals who had ATL during the study period were investigated. Results: Females were more abundant in case (62,5 per cent ) and control groups (68.89 per cent ) with predominance of age equal or greater than 60 years in both groups (46,15 and 33.33 per cent respectively). However, these conditions were not significant risk factors. The significant risk factors (p < 0,05) were: illiterate people (OR = 10,09), those who receive one to three minimum wages (OR =4,48), retired people (OR=2,35), to practice leisure activities related to rural area (OR=4,47), openings on the house (OR=2,15), presence of forests near the domicilie (OR = 6,92), presence of fruit plants near the house (OR=2,02), attachments to the house (OR = 4,30), chicken stay (OR=2,15), kennel (OR = 3,90), to sleep out of the bedroom (OR=4,97), to combat urban plagues (OR = 2,69), to use repellent (5,43) and to know the phlebotomine (OR = 3,48) and its relation with other animals (OR =2,51), and prevention (OR = 2,24). The protective factors were house of masonry and plaster (OR = 0.41), water supply network (OR = 0.41), 10 presence of sewage (OR = 0.33), public garbage collection (OR = 0.35). The serological tests performed in dogs of the study showed that 38.23 per cent were reactive to the cases and 2.12 per cent to the controls. The dogs of the cases have 28.47 times more chance of catching the ATL when compared with the dogs of the controls (p< 0.0001). Fourteen deaths were investigated, out of which 35.71 per cent were in treatment of ATL and 42.86 per cent had lesions compatible with the ATL. Conclusions: The occurrence of ATL in Bandeirantes proved to be statistically associated with the variables: age, education, family income, leisure activities related to rural area, presence of attachments to the house and vegetation near the domicile, as well as the use of repellent, sleeping outside of the room and knowing the disease vector of ATL and its prevention.

A leishmaniose é uma doença negligenciada causada por protozoários do gênero Leishmania. Esta doença é endêmica em regiões tropicais, áridas e Mediterrâneas afetando mais de 350 milhões de pessoas no mundo. A leishmaniose tem duas formas clínicas principais: visceral (LV) e tegumentar (LT). Sem tratamento médico LV é letal e a LT pode produzir deficiências graves devido à destruição do tecido mucoso nasal-oral. O ciclo de transmissão da Leishmania depende do vetor flebotomíneo (Diptera: Psychodidae); do hospedeiro, que pode ser qualquer mamífero infectado com o parasita; e do reservatório, que pode transmitir o parasita ao vetor, os três devem interagir num meio ambiente permissivo para que aconteça a transmissão da doença. A leishmaniose é uma antiga zoonose cujo ciclo de transmissão restringia-se em paisagens não modificadas, no entanto o desenvolvimento de assentamentos humanos aumentou o contato entre humanos e o ciclo de transmissão. Atualmente, a incidência da doença não só depende das condições ambientais que afetam ao vetor e o reservatório, mas também dependem das condições socioeconômicas das populações humanas. Para entender melhor como estes fatores afetam a transmissão da leishmaniose, este estudo objetiva: 1) Identificar as condições ambientais e fatores socioeconômicos que influenciam a transmissão da LV e a LT, considerando todas as regiões endêmicas tropicais, áridas e Mediterrâneas. 2) Entender como estes fatores influenciam a incidência da leishmaniose e como esta antiga zoonose tem se adaptado a novas condições de ambientes modificados pelo homem. No primeiro capítulo, realizamos uma revisão de literatura e foi proposto um modelo conceitual para LV e LT destacando as diferenças entre os fatores ambientais e socioeconômicos que influenciam o ciclo de transmissão em regiões tropicais, áridas e Mediterrâneas. A principal diferença está associada ao comportamento dos vetores de Leishmania e reservatórios da LV e LT e suas preferências por condições ambientais específicas de cada região; e também na possibilidade de adaptação a ambientes urbanos em países em desenvolvimento onde o baixo nível socioeconômico aumenta a vulnerabilidade ante a leishmaniose. No segundo capítulo, analisamos como os fatores ambientais afetam a transmissão da leishmaniose no estado mais rico de um país tropical, o Estado de São Paulo, no Brasil. Usamos modelos mistos generalizados para analisar as condições ambientais e socioeconômicas que influenciam a ocorrência e o número de casos de LV e LT no estado de São Paulo desde 1998 até 2015. Para LT, a ocorrência aumentou com áreas maiores de vegetação nativa, maior desigualdade econômica (Índice de Gini) e maiores precipitações média do inverno. Para LV, a ocorrência aumentou com um alto índice de desenvolvimento humano (IDH), grande numero de cabeças de gado, maiores temperaturas máximas anuais e maiores precipitações mínimas da primavera. O numero de casos tanto de LV quanto de LT aumentou com maiores temperaturas médias anuais e somente os casos de LV aumentaram com as altas precipitações médias do outono. Estes resultados podem contribuir para predizer futuros picos da doença e desenvolver politicas publicas não só no Estado de São Paulo e também em outras regiões com características similares / Leishmaniasis is a neglected tropical disease caused by a protozoan of Leishmania genus. This disease is present in tropical, arid and Mediterranean regions and affects more than 350 million people around the world. Leishmaniasis has two main clinical forms visceral (VL) and cutaneous (CL).VL is lethal without adequate treatment and CL can produce serious disability due to the destruction of naso-buccal mucosal tissue. The transmission cycle of Leishmania depend on the sand fly vector (Diptera: Psychodidae), the host which are any mammal infected by the parasite and the reservoir which can transmit the parasite to the vector, all three must interact in a permissive environment to occur the transmission of disease. Leishmaniasis is an ancient zoonosis which transmission cycle was present in undisturbed landscapes, but the development of human settlements increased the contact between the humans and the transmission cycle. Nowadays, the incidence of disease does not only depend on environmental conditions which affect the vector and reservoir; but also depends on socioeconomic conditions of the human population. To better understand how these factors affect the transmission of leishmaniasis this study aim: 1) Identify the environmental conditions and socioeconomic factors which influence the transmission of VL and CL, considering all the endemic regions: tropical, arid and Mediterranean regions. 2) Understanding how these factors influence the incidence of leishmaniasis and analyze how this ancient zoonosis has adapted to novel human-modified environmental conditions. In the first chapter, we conducted a literature review and propose a conceptual model for VL and CL highlighting the differences between environmental and socioeconomic factors which influence the transmission cycle in tropical, arid and Mediterranean regions. The main difference was associated with the behavior of Leishmania vector and reservoirs of VL and CL and their preferences in environmental conditions in each region; and also the possible adaptation to urban environments in developing countries where low socioeconomic status increases the vulnerability to leishmaniasis. In the second chapter, we analyze how environmental and socioeconomic factors influence the transmission of leishmaniasis in the wealthiest state of a tropical country, São Paulo state, Brazil. We used generalized mixed models to analyze the environmental and socioeconomic factors which affect the occurrence and the number of cases of VL and CL in the state of São Paulo from 1998 to 2015. For CL, the occurrence increased with larger vegetation cover, high economic inequality (Gini), and high mean winter precipitation For VL, the occurrence increased with high human development index (HDI), a larger number of cattle heads, high maximum annual temperatures and high minimum spring precipitation. The number of cases of both VL and CL increased with high annual mean temperature, and only VL cases increased with high mean fall precipitation. These results can inform predictions of future outbreaks and contribute to the development of public health policies not only in São Paulo state, but in other regions with similar characteristics

A leishmaniose visceral (LV) ou calazar é uma doença endêmica, crônica, grave e de alta letalidade se não tratada. Os estudos apontam a proteína Lectina Ligante de Manose (MBL), codificada pelo gene MBL2, como uma peça-chave na imunidade inata, dada a sua função no reconhecimento microbiano, na eliminação, inflamação e morte celular. Neste trabalho realizamos um estudo do tipo caso-controle que teve como objetivo investigar a associação entre variantes no gene MBL2 e a suscetibilidade à LV em indivíduos residentes em áreas endêmicas da Ilha de São Luís-MA. A amostra foi constituída por 322 indivíduos, sendo 161 casos com LV, não aparentados, de ambos os sexos, residentes em áreas endêmicas da doença na Ilha de São Luís e 161 controles saudáveis, não infectados e não aparentados da mesma região. A identificação dos casos de LV se deu por meio do contato constante com os principais hospitais e ambulatórios de referência para a doença na cidade. Também foram feitas buscas de pacientes com LV em ambiente domiciliar, a partir de registros da FUNASA-MA. A análise molecular consistiu na genotipagem de 6 variantes localizadas na região promotora [posições -550 (C>G), -221(G>C), +4(C>T)] e codificadora [códons 52 (C>T), 54 (G>A) e 57 (G>A)] do gene MBL2, através da reação em cadeia da polimerase e sequenciamento automático. A dosagem da proteína MBL no soro foi realizada pelo teste de ELISA. Verificamos que os fenótipos MBL dependem do conjunto de alelos presentes no gene MBL2, sendo nítido o efeito que as variantes defectivas causam nos níveis da proteína. Não encontramos diferença significativa entre casos e controles em relação à distribuição dos genótipos MBL2 e dos níveis séricos de MBL. As frequências alélicas das variantes exônicas na amostra total mostram que o alelo A é o mais comum (74,8%) e que os alelos defectivos (B, C e D) se encontram principalmente em heterozigose (36,6%), o que reforça a ideia de que alelos MBL2 defectivos são mantidos na população por conferirem vantagem seletiva aos heterozigotos. Em relação aos 3 principais polimorfismos existentes na região promotora, verificamos ser a variante -221G (Y) a mais frequente (88%) seguida de +4C (P) (73%) e de -550C (L) (67%). Identificamos oito haplótipos em MBL2 num total de 644 cromossomos avaliados, em 30 combinações diferentes, sendo HYPA e LYQA os mais frequentes e HYPD e HYPB os mais raros. Todos os portadores de combinações de haplótipos homozigotos para alelos defectivos apresentaram níveis séricos de MBL indetectáveis. Os genótipos LYQA/LYQA e HYPA/HYPA apresentaram as maiores concentrações médias de MBL no soro. A combinação entre SNPs no éxon 1 e na região promotora do gene MBL2 resulta em grande variação nas concentrações de MBL em indivíduos saudáveis. Consideramos que o conjunto de dados gerados é uma contribuição valiosa que poderá ser expandida para outros cenários. / Visceral leishmaniasis (VL), also known as kalazar, is an endemic, chronic, severe and highly lethal disease when not treated. Studies have shown that the protein Mannose-biding lectin (MBL), encoded by the gene MBL2, is the major player in innate immune system due its role in microbial recognition, elimination and inflammation as well as in the cell death. In the current work, we conducted a case-control study which aimed to investigate the association between variants in the gene MBL2 and the susceptibility to VL in individuals living in endemic areas of the São Luís - MA. 322 individuals participated in this study. Of these, 161 were VL cases being unrelated individuals of both sexes, and inhabitants from endemic areas of the disease in São Luís. The other 161 individuals were uninfected healthy controls, being unrelated and from the same region. The identification of VL cases occurred by visiting reference hospitals and clinics in the city. VL patients were identified in the household environment through the records of FUNASA-MA. Molecular analysis consisted in genotyping six variants located in the promoter region [positions -550 (C> G), -221 (G> C), +4 (C> T)] and coding region [codons 52 (C> T), 54 (G> A) and 57 (G> A)] of the MBL2 gene by polymerase chain reaction and automated DNA sequencing. The concentrations of MBL protein in the serum was performed by ELISA. We found that MBL phenotypes depend on the number of alleles present in the gene MBL2, being clear the consequence of the defective variants in the protein levels. There was no significant difference between cases and controls regarding the distribution of MBL2 genotypes and MBL serum levels. The allele frequencies of exon variants in the overall sample showed that the A allele is the most common (74.8%) and that the defective alleles (B, C and D) are mainly heterozygous (36.6%). This highlights the idea that defective MBL2 alleles are maintained in the population to confer selective advantage to heterozygotes. Concerning the three main existing polymorphisms in the promoter region, we noticed that the variant-221G (Y) is more frequent (88%) followed by +4 C (P) (73%) and 550C-(L) (67%) variants. We identified eight haplotypes in MBL2 in a total of 644 chromosomes evaluated in 30 different combinations, being the HYPA and LYQA the most frequent haplotypes and HYPD and HYPB the rarest ones. All carriers with combinations of homozygous haplotypes for defective alleles had undetectable serum levels of MBL. Genotypes LYQA / LYQA and HYPA / HYPA had the highest mean concentrations of MBL in the serum. Combination between SNPs in exon 1 and in the promoter region of the gene MBL2 results in a great variation of MBL concentrations in healthy individuals. We consider that the data set that was generated is a valuable contribution that can be expanded to others cenarios.

Orientador: Caris Maroni Nunes / Banca: Paulo Roberto Martins Ribolla / Banca: Valéria Marçal Felix de Lima / Resumo: A importância da leishmaniose visceral no contexto da saúde pública tem aumentado na ultima década. A manifestação da leishmaniose visceral nos cães é variável e estudos sobre a genética e a sua relação com a leishmaniose visceral têm indicado alguns genes envolvidos na susceptibilidade e resistência a esta doença. O objetivo deste estudo foi avaliar a relação entre as variantes alélicas dos gene Slc11a1 (solute carrier family 11 member 1) e DLA-DRB1 (dog leukocyte antigen) com a positividade para leishmaniose, determinada por meio da amplificação de DNA de cinetoplasto de Leishmania sp., por PCR, e pela presença de anticorpos anti-Leishmania sp. ao teste ELISA indireto. Foram observadas associações estatisticamente significantes entre a positividade para leishmaniose e: i. a presença do alelo (141, 145 ou 149) da região microssatélite (TAAA)n localizada no íntron 1 do gene Slc11a1 (P< 0,0001) ii. a variação do número de guaninas (8 ou 9 G) da região promotora (P=0,0280) (em ambos os casos quando analisados separadamente) e iii. a presença de qualquer dos alelos da região microssatélite associado a 8 ou 9 G da região promotora (P= 0,0025). A presença do alelo 141 foi estatisticamente associada à negatividade em cães (P<0,0001). Não foi observada associação estatisticamente significante entre a positividade à leishmaniose e a freqüência dos alelos do exon 2 do gene DLA- DRB1, embora tenha sido observada associação significante entre a freqüência dos alelos DRB1-W, DRB1*00101 ou DRB1-T e o resultado negativo para leishmaniose, podendo ser estes potenciais marcadores para resistência à leishmaniose em cães / Abstract:he importance of visceral leishmaniasis in the context of public health has increased in the last decade. The manifestation of visceral leishmaniasis in dogs is variable and genetic studies and its relationship with visceral leishmaniasis have shown some candidate genes involved in susceptibility and resistance to this disease. This study aimed at evaluating the relationship between polymorphism of the genes Slc11a (solute carrier family 11 member 1), and DLA-DRB1 (dog leukocyte antigen) and the positivity to leishmaniasis determined by the amplification of Leishmania sp. kinetoplast DNA by PCR and the presence of anti-Leishmania sp. the indirect ELISA. We observed statistically significant associations between the leishmaniasis positive diagnosis and i. the presence of intron 1 microsatellite region alleles (141, 145 or 149) (P<0.0001), ii. the variation on the guanine number (8 or 9) in the promoter region (P=0.0280) (in both cases when analyzed separately), iii. the presence any of the microsatellite alleles associated to 8 or 9 G in the promoter region (P=0.0025). Microsatellite allele 141 was associated to negativity to leishmaniasis (P<0.0001). There was no association between the presence of any of the exon 2 DLA-DRB1 alleles and the leishmaniasis positive animals, although significant association between the frequency of the alleles DRB1-W, DRB1*00101 or DRB1-T and negative results to leishmaniasis were observed. These might be potential markers for dog's resistance to visceral leishmaniasis / Mestre

Orientador: Valéria Marçal Felix de Lima / Coorientador: Rosemari de Oliveira Vasconcelos / Banca: José Angelo Lauletta Lindoso / Banca: Gisele Fabrino Machado / Resumo: Leishmaniose visceral (LV) é uma doença causada pelo parasita intracelular do gênero Leishmania, que acomete o homem e várias espécies animais. O cão é um dos principais reservatórios urbanos do parasita, e desempenha um papel central no ciclo de transmissão aos seres humanos pelos flebotomíneos. Estudos sobre a resposta imune em cães com Leishmaniose Visceral têm demonstrado que a imunidade protetora está associada à resposta imune do tipo celular, enquanto que a progressão da doença está associada à resposta humoral e à produção de IL-10 e TGF-β. Essas citocinas induzem a desativação de macrófagos e têm potencial para incapacitar a defesa do hospedeiro contra Leishmania spp., levando à visceralização da infecção. O objetivo do estudo foi avaliar a produção de IL-10 e de TGF-β por células T regulatórias (Treg) em amostras de sangue e de baço de cães naturalmente infectados por Leishmania spp., e correlacionar à carga parasitária e aos achados histopatológicos. Cinco cães saudáveis e vinte e nove cães com manifestações clínicas de leishmaniose visceral e sorologia positiva para anticorpos anti-Leishmania foram incluídos no grupo de estudo. A PCR em tempo real foi utilizada para a quantificação da carga parasitária e para confirmação da infecção por Leishmania spp. Realizou-se, por citometria de fluxo, a quantificação das células T CD4 regulatórias produtoras de IL-10 e TGF-β. O teste t não pareado foi utilizado para comparar o percentual de células Treg produtoras de IL-10 e TGF-β entre os cães infectados e os saudáveis, e utilizou-se o teste de Mann-Whitney para comparar o percentual de IL-10 e TGF-β no sangue e no baço de cães com LV... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo)) / Abstract: Visceral leishmaniasis (VL) is a disease caused by the intracellular parasite of the Leishmania genus that affects humans and several animal species. The dog is one of the main urban reservoirs of the parasite once it plays a central role in the transmission cycle to humans by sandflies. Studies about the immune response in dogs with visceral leishmaniasis have demonstrated that protective immunity is associated with the immune response of the cellular type, while disease progression is associated with the humoral response and IL-10 and TGF-β production. These cytokines induce the macrophages deactivation and have the potential to disable the host defense against Leishmania spp. leading to infection visceralization. The aim of this study was to evaluate the regulatory T cells (Treg) producing IL-10 and TGF-β in blood and spleen samples from dogs naturally infected by Leishmania spp. and correlate to the parasite load and histopathology. Five healthy dogs and twenty-nine dogs with clinical visceral leishmaniasis manifestations, and seropositivity for anti-Leishmania antibodies were included in the study group. The real-time PCR was used to quantify the parasite load and infection confirmation with Leishmania spp. The regulatory CD4 T cells producing IL-10 and TGF-β quantification was performed by flow cytometry. The unpaired t test was used to compare the percentage of Treg cells producing... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

A taxa de infecção mínima (TIM) em flebotomíneos é uma informação útil para estudos epidemiológicos em leishmaniose. Quando estes estudos de campo contem grande número de insetos, a PCR é a indicada para caracterização por Leishmania nos vetores. Este estudo avaliou a PCR na identificação da (TIM) natural por Leishmania spp. em Lutzomyia longipalpis e, ao mesmo tempo, determinou as (TIM) por Leishmania spp em uma micro-região endêmica do Estado de São Paulo. Na primeira parte deste estudo, as avaliações do desempenho das PCRs convencional (cPCR) e em tempo real (qPCR) foram realizadas em 66 amostras de conteúdo intestinal de flebotomíneos utilizados no xenodiagnóstico (30 positivas e 36 negativas). O material contido nas lâminas foi transferido para tubos com solução salina estéril e congeladas a -20° C por cerca de 12 meses. Os marcadores moleculares utilizados foram RV1/RV2 para L. (L.) infantum na cPCR; e Linj31 para sub gênero (L.) (Leishmania) na qPCR. Das 30 amostras positivas, 20 (67%) e 21 (70%) foram positivas utilizando os marcadores RV1/RV2 e Linj31, respectivamente. Das 36 amostras negativas no xenodiagnóstico, 2 (5%) foram positivas em todos os marcadores moleculares. Na segunda parte foram analisados insetos capturados durante 2 a 3 noites/mês durante 11 meses (janeiro a novembro de 2012) usando 10 armadilhas automáticas de luz do tipo CDC ao redor de um canil em uma transição entre bairro periurbano e urbano de Dracena. As áreas de captura foram agrupadas em 3 zonas para determinar a TIM. Um total de 1.690 Lu. longipalpis foram capturadas durante o período estudado. Destes, 292 (17,25%) eram fêmeas de flebotomíneos e foram agrupadas em 165 pools (1 a 5 insetos) para extração de DNA e análise por PCR. Resultados positivos para L. (L.) infantum na cPCR e qPCR foram vistos em 7,28% (12/165) e 4,85% (8/165) das amostras, respectivamente. Estes dados confirmam que espécimes capturados na área de estudo estavam infectados por L. (L.) infantum. A TIM durante os 11 meses de capturas foi de 4,10% (292 fêmeas coletadas). Os ecótopos com TIM mais altos foram canil, galinheiro e casa 2. Flebotomíneos infectados estavam presentes nos locais de captura com abundância de hospedeiros. O maior número de pools positivos (6/93) foi obtido no galinheiro, todavia a maior TIM foi obtido em um domícilio (1/6) 16,67%. / The minimum infection rate (MIR) in sandflies is a useful information for epidemiological studies on leishmaniasis. When these field studies consider large numbers of insects, PCR is indicated for identification and characterization of Leishmania in the vectors. This study evaluated a PCR in the identification of natural (MIR) by Leishmania spp. in Lutzomyia longipalpis and, at the same time, determined MIR by Leishmania spp in a micro region endemic in São Paulo State . In the first part of this study, the performance evaluation of conventional PCR (cPCR) and real-time PCR (qPCR) were carried out on 66 intestinal contents samples of non-xenodiagnostic sandflies (30 positive and 36 negative). The material contained in the slides was transferred to tubes with sterile saline solution and frozen at -20 ° C for about 12 months. The molecular markers used were RV1 / RV2 for L. (L.) infantum in cPCR; E Linj31 for sub genus (L.) Leishmania on qPCR. From the 30 positive samples, 20 (67%) and 21 (70%) were positive using the RV1 / RV2 and Linj31 markers, respectively. From the 36 negative xenodiagnostic samples, 2 (5%) were positive in all molecular markers. In the second part, we analyzed insects captured during 2 to 3 nights / month for 11 months (January to November 2012) using 10 CDC automatic light traps around a kennel in a transition between urban and suburb of Dracena. Capture areas were grouped into 3 zones to determine MIR. A total of 1,690 Lu. longipalpis were captured during the study period. From these, 292 (17.25%) were female sand flies and were grouped into 165 pools (1 to 5 insects) for DNA extraction and PCR analysis. Positive results for L. (L.) infantum in cPCR and qPCR were seen in 7.28% (12/165) and 4.85% (8/165) of the samples, respectively. These data confirm that the specimens captured in the study area were infected by L. (L.) infantum. The MIR during the 11 months of captures was 4.10% (292 females collected). The highest MIR ecotopes were kennel, chicken coop and house 2. Infected sandflies were presented at capture sites with host abundance. The highest number of positive pools (6/93) was obtained in henhouse, however the highest MIR was obtained in a domicile (1/6) 16.67%.

As espécies do gênero Leishmania parasitam mamíferos do Novo e Velho Mundo e possuem ciclos de vida com alternância entre vertebrados e invertebrados. A maioria das espécies se desenvolve em artrópodes hematófagos, que podem pertencer a diversas ordens e famílias. A Leishmaniose visceral é uma importante zoonose e possui canídeos silvestres e domésticos como importantes reservatórios conhecidos na diversidade genética de Leishmania infantum chagasi no Brasil ainda não é conhecida. Leishmaniose é uma doença severa com ampla distribuição geográfica com uma incidência de dois milhões de casos por ano e 350 milhões de pessoas em áreas de risco de infecção. O objetivo deste projeto foi avaliar a variação intraespecífica e biogeografia de isolados brasileiros de Leishmania infatum chagasi baseados em genes nucleares e mitocondriais. Os marcadores SSUrDNA, gGAPDH, Citocromo b, Hsp 70, Quitinase e ITS1rDNA foram amplificados, sequenciados e comparados filogeneticamente pelos métodos de parcimônia e bayesiana através de análises concatenadas. As sequencias obtidas apresentaram variabilidade entre 0 e 1% e a topologia gerada não evidenciou diferenças intraespecíficas entre os isolados brasileiros de Leishmania infantum chagasi e consequentemente padrões biogeográficos. Apesar dos resultados obtidos não refletirem a variabilidade esperada, as diversas sequencias obtidas darão subsídios para a determinação e padronização de novos testes diagnósticos da Leishmaniose visceral canina. / The Leishmania species parasite mammals in the New World and have life cycles with alternating between vertebrates and invertebrates. Most species develops in blood-sucking arthropods, which may belong to different orders and families. Visceral leishmaniasis is an important zoonosis and has wild and domestic canids as important known reservoirs and genetic diversity of Leishmania infantum chagasi in Brazil is not yet known. Leishmaniasis is a severe disease with wide geographical distribution with an incidence of two million cases per year and 350 million people at risk in endemic areas. The aim of this study was to evaluate the intraspecific variation and biogeography based on nuclear and mitochondrial genes. The SSUrDNA markers, gGAPDH, cytochrome b, hsp 70, chitinase and ITS1rDNA were amplified, sequenced and compared phylogenetically by maximum parsimony and Bayesian methods in concatenated analysis. The variability of sequences was 0 to 1%, and the topology generated showed no intraspecific differences between Brazilian strains of Leishmania infantum chagasi and consequently biogeographic patterns. Although the results do not reflect the expected variability, the various sequences obtained will provide subsidies for the establishment and standardization of new diagnostic tests of canine visceral leishmaniasis.

As leishmanioses americanas são zoonoses em que o homem é um hospedeiro acidental, nas quais várias espécies de Leishmania, de vetores e reservatórios (silvestres, sinantrópicos ou domésticos) estão envolvidas. Com a destruição da cobertura vegetal, várias regiões do Brasil vêm registrando mudanças no seu quadro epidemiológico, frequentemente envolvendo transmissão peridomiciliar tanto na leishmaniose visceral americana (LVA), tendo como agente etiológico a Leishmania (L.) infantum chagasi, como a leishmaniose tegumentar americana (LTA), com várias espécies de Leishmania atuando como agentes. No município de São Paulo casos autóctones de LTA têm sido registrados nas proximidades da Serra Cantareira onde vetores estão presentes, assim como em vários parques públicos. A LVA tem como principal vetor a Lutzomyia longipalpis e o cão doméstico, o principal reservatório e sua ocorrência vem se expandindo através do território brasileiro. O Parque Estadual do Jaraguá está localizado no município de São Paulo em área de confluência de rodovias que percorrem a área de expansão da LVA ou recebem fluxo de veículos destas rodovias. Tendo-se presente o panorama acima, este estudo investigou a fauna flebotomínea no Parque Jaraguá, quanto à diversidade e abundância das espécies, considerando ambientes impactados em maior ou menor grau, assim como a presença de infecção natural pela Leishmania em flebotomíneos, e para a espécie mais abundante, sua distribuição mensal e ritmo horário noturno. As capturas ocorreram de Setembro de 2015 a Dezembro de 2016, utilizando armadilhas do tipo CDC instaladas em oito pontos, e Shannon nas cores branca e preta instaladas na mata em peridomicílio. Fêmeas coletadas nas armadilhas de Shannon e de um dos pontos amostrados com CDC foram dissecadas e submetidas a um PCR para a busca de infecção natural por Leishmania spp. Foram capturados um total de 673 espécimes divididos em 9 gêneros e 15 espécies. Pi. fischeri foi a espécie mais abundante nos diversos pontos de coletas e a única capturada nas armadilhas de Shannon. Destaca-se a coleta de uma fêmea semelhante à de Lu. longipalpis. A armadilha branca possui picos das 19 20h e 00 01h, ao passo que na preta, os picos ocorrerem das 22 23h e das 01 02. Na armadilha branca, a atividade se estendeu durante a noite toda e início da manhã, na preta apenas até no horário das 02-03hr. Nas armadilhas CDC, a média de espécimes de Pi. fischeri por armadilha foi mais elevada no inverno, mas a análise Pearson e de Spearmam não mostrou correlação significante em relação à chuva mensal e temperaturas mínima e máxima no dia da coleta. A investigação da infecção natural obteve resultados negativos para Leishmania spp. Apesar desse resultado, a dominância de Pi. fischeri, espécie antropofílica e suspeita de atuar na transmissão de agente de leishmaniose tegumentar e visceral, assim como a sua presença em mata e peridomicílio, com atividade noturna coincidente com a da população, identifica-se possibilidades e circunstâncias de risco de transmissão leishmanioses na área. A presença de uma fêmea semelhante à de Lu. longipalpis, indica a necessidade de mais estudos para confirmação da espécie e avaliação de risco de instalação da LVA nessa área do município / American leishmaniases are zoonoses in which several species of Leishmania, vectors and reservoirs (wild, synanthropic or domestic) are involved, and the man is considered an accidental host. With the destruction of native vegetation, several Brazilian regions have been registering changes in the epidemiological profile of these zoonoses which often involve peridomestic transmission in both American visceral leishmaniasis (AVL) and American cutaneous leishmaniasis (ACL). In the city of São Paulo autochthonous cases of ACL have been recorded in areas close to the reserve of the Serra Cantareira and state parks with residual forests where vectors have been registered. AVL, having Lutzomyia longipalpis as main vector and domestic dogs as main reservoirs, is spreading through the Brazilian territory. The Jaraguá State Park is located in the municipality of São Paulo in an area of confluence of highways that cross the route of expansion of this disease or receive vehicular flows from these highways. Considering this scenery, this study investigated the phlebotomine fauna in the Jaraguá state Park, regarding the diversity and abundance of the species, taking account the degree of impact in the vegetation coverture, as well as the presence of natural infection by Leishmania spp. in sand flies, and also the monthly distribution and nocturnal rhythm of the most abundant species. Captures were undertaken from September 2015 to December 2016, using CDC light traps installed at eight points, and Shannon traps in the white and black colors installed in the forest and peridomicile. Females collected in the Shannon traps and of one of the CDC trap were dissected and submitted to PCR for investigation of natural infection by Leishmania spp. A total of 673 specimens were collected, divided into 9 genera and 15 species. Pintomyia fischeri was the most abundant species at several collection points and the only one caught in Shannon traps. The collection of a female similar to that of Lutzomyia longipalpis is highlighted. The white trap has peaks from 7-20 p.m. and 10:00 p.m., while in black, peaks occur from 22-23 p.m. and 1-2 p.m. In the white trap, activity lasted all night and early morning, and in the black only until 02-03hr. In the CDC traps, the average of specimens of Pi. fischeri per trap was higher in the winter, but the Pearson and Spearman analysis showed no significant correlation with monthly rainfall and minimum and maximum temperatures on the day of collection. The investigation of the natural infection resulted negative for Leishmania sp. Despite this result, the dominance of Pi. fischeri, an anthropophilic species and suspected of acting on the transmission of ACL agent, as well as its presence in forest and peridomicile, with nocturnal activity coinciding with that of the human population, identifies possibilities and circumstances of risk of leishmaniasis transmission in the area . The presence of a female similar to that of Lu. longipalpis indicates the need for further studies to identify correctly the species and assess the risk of LVA installation in this area of the municipality of São Paulo and other neighbors