Made available in DSpace on 2015-04-22T22:12:36Z (GMT). No. of bitstreams: 1 carolinie.pdf: 1105289 bytes, checksum: fb4a9af7cf4012e7784dfbcf92246455 (MD5) Previous issue date: 2010-03-09 / FAPEAM - Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Amazonas / In the Amazon agricultural soils are found in soil called Anthropogenic Dark Earths (ADE), a soil rich in organic matter and minerals. The biodiversity is a source of very high value of non-cultivable microorganisms that can be isolated through construction of metagenomic libraries, using vectors of large fragments, with the goal of finding new biocatalytic enzymes. Enzymes widely used in the industrial market are amylase and protease, are applied in industry: chemical, pharmaceutical, textile, detergent and food industries. Amylases degrade starch into smaller units of saccharides, as proteases catalyze the hydrolysis of peptide bonds. The aim of this study was to isolate and partially characterize enzymes amylase and protease of clones isolated from a selection of functional metagenomic library of TPI in the Amazon region. In this study were isolated 1.344 clones, only 4 producing halo of starch hydrolysis and 3 proteolytic clones belonging to metagenomic library constructed with total DNA extracted from microorganisms present in soil samples of the TPI, were partially characterized the enzymes produced by 4 clones amilolytic and 1 proteolytic clone. After isolation, the clones were inoculated in culture medium Luria Bertani (LB) at 37ºC under agitation of 150 rpm and subjected to assays at pHs of 3 to 10 and temperatures ranging from 25 to 100ºC for up to 90 of incubation. Amylases had its highest production in 24 h (4.3 U/mL) and its activity was optimal at neutral pH to slightly alkaline, the clone P1C4 showed the highest production at 70°C (6.93 U/mL), since the clones P5C4 and P6C12 reported higher thermostability at 80°C, these results indicate that the gene for alpha-amylase to be cloned encoding a thermostable enzyme, such as the enzyme produced by Bacillus liqueniformis. Since the clone P3A3 produced 26.3 U/mL protease in 10 hours of production, its activity was optimal at neutral pH, and its optimum temperature at 30ºC (56.0 U/mL) and its thermostability was demonstrated in 50°C (22,0 U/mL). These features contribute to the implementation of these enzymes in industrial sectors as in food production, chemical industry and production of detergents. The enzymes isolated in this study demonstrated new features and performance when compared to enzymes described today, which proves the efficiency of the construction of metagenomic libraries for isolation of new bioproducts. / Na floresta Amazônica são encontrados solos agricultáveis denominado de solo de Terra Preta de Índio (TPI), um solo rico em matéria orgânica e em minerais. A biodiversidade da Amazônia constitui uma fonte de valor altíssimo de micro-organismos não-cultiváveis que podem ser isolados através das construções das bibliotecas metagenômicas, utilizando vetores de grandes fragmentos, com o objetivo de encontrar novas enzimas biocatalíticas. As enzimas de maior aplicação no mercado industrial são as amilases e proteases, aplicadas nas indústrias: química, farmacêutica, têxtil, de detergentes e alimentícia. As amilases são capazes de degradar o amido em unidades de sacarídeos menores, já as proteases catalisam a hidrólise de ligações peptídicas. O objetivo deste trabalho foi isolar e caracterizar parcialmente enzimas amilolíticas e proteolíticas de clones isolados a partir de uma seleção funcional da biblioteca metagenômica de TPI da região Amazônica construída com DNA total extraído dos micro-organismos presentes nas amostras de solos de TPI, inseridos no vetor fosmidial (pCC1Fos ) e clonado na célula hospedeira Escherichia coli (EPI300). De 1.344 clones pertencente a biblioteca metagenômica, apenas 4 clones foram produtores de halo de hidrólise de amido e 3 clones foram proteolíticos, além disso, todas as enzimas produzidas pelos 4 clones amilolíticos e 1 clone proteolítico foram caracterizadas parcialmente. Após o isolamento, os clones foram inoculados em meio de cultura Luria Bertani (LB) a 37oC, sob agitação de 150 rpm e submetidos aos ensaios enzimáticos nos pHs de 3 a 10 e temperatura variando de 25 a 100ºC por até 90 minutos de incubação. As amilases tiveram sua maior produção em 24 horas (4,3 U/mL) e sua atividade ótima foi em pH neutro a levemente alcalino, o clone P1C4 demonstrou a maior produção a 70ºC (6,93 U/mL), já os clones P5C4 e P6C12 demonstraram a maior termoestabilidade a 80°C, tais resultados indicam que o gene de alfa-amilase clonado deve ser codificador de uma enzima termoestável, como por exemplo, a enzima produzida por Bacillus liqueniformis. Já o clone P3A3 produziu 26,3 U/mL de proteases em 10 horas de produção, sua atividade ótima foi em pH neutro, sendo sua temperatura ótima em 30ºC (56,0 U/mL) e sua termoestabilidade foi demonstrada em 50ºC (22,0 U/mL). Estas características contribuem para a aplicação destas enzimas em setores industriais como na produção de alimentos, indústria química e produção de detergentes. As enzimas isoladas neste trabalho demonstraram características e atuações novas quando comparadas a enzimas descritas atualmente, a qual comprova a eficiência da construção de bibliotecas metagenômicas para o isolamento de novos bioprodutos.

Um dos eventos mais importantes durante o amadurecimento da banana é a degradação do amido, concomitante com o acúmulo de açúcares solúveis. Várias enzimas, que supostamente atuam na degradação do amido, já tiveram sua atividade/proteína específica detectadas nesta fase na banana. Entre elas a α-amilase, a β-amilase, as amido-fosforilases, as α-glicosidases e as isoamilases. A síntese do amido e, normalmente, sua degradação, ocorrem dentro do amiloplasto, que possui duas membranas a serem transpostas antes do acesso ao grânulo de amido ou aos produtos da ação de outras enzimas. Uma das isoformas da β-amilase em banana possui um peptídeo de transporte predito em sua seqüência, necessário para transpor estas membranas e entrar no amiloplasto. Uma maneira de contornar a dificuldade em estabelecer a real importância de cada enzima na degradação do amido é isolar os grânulos e as enzimas e submetê-lo à atividade seqüencial das enzimas supostamente responsáveis pela degradação. O ideal é utilizar a enzima endógena, mas o processo de purificação de enzimas em frutos é demorado e nem sempre bom em termos de pureza, quantidade e atividade. Estudos baseados na expressão heteróloga de genes da β-amilase permitiriam melhor compreender os mecanismos de atuação dessa enzima presente na polpa da banana. Assim, foram feitos ensaios de expressão heteróloga em Pichia pastoris na tentativa de produzir essa enzima em quantidade suficiente para purificação, aplicação nos grânulos de amido e produção de anticorpos policlonais. Foram testadas várias condições de indução da proteína, tais como aeração, temperatura, pH, concentração de metanol e tempo de indução, bem como a montagem de uma nova construção gênica com tag de histidina no vetor de expressão pPICZαA com confirmação do fenótipo dos transformantes positivos. Porém, a obtenção de β-amilase recombinante com atividade não foi bem sucedida, necessitando talvez de alterações nesses padrões de indução. / One of the most important events that occurs during ripening of banana is the starch degradation concomitantly with the accumulation of soluble sugars. Several enzymes, known by acting on starch degradation, had their activity and/or specific protein detected at this stage of banana. These include the α-amylase, the β-amylase, the starch-phosphorylases, the α-glucosidase and the isoamilases. The synthesis and starch degradation occur inside of the amyloplast that contain two membranes which has to be reach before accessing the starch granule or the products of the other enzymes. One of the isoforms of β-amylase in bananas has a transit peptide predicted in the sequence, required to access the amyloplast. To establish the real importance of each enzyme in the starch degradation it is necessary to isolate the granules and enzymes and submit them to the sequential activity to confirm the supposed degradation. The idea is to use the endogenous enzyme, but the process of purification of the enzyme in fruits demands a lot of time and the results of purity, quantity and activity are not guaranteed. Studies based on heterologous expression of the β-amylase genes allow us to understand the mechanisms of action of this enzyme present in the pulp of banana. Thus, tests were carried out with heterologous expression in Pichia pastoris in order to produce this enzyme in sufficient quantity to purification, and then, applied on starch granules and produce a polyclonal antibody. We tested different conditions of protein induction such as aeration, temperature, pH, methanol concentration and induction time, as well as the new genic construction with the histidine tag with an expression vector pPICZαA confirming the phenotype of positive transformants. However, recombinant β-amylase with activity was not obtained successfully, necessitating changes in these patterns of induction.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:23:28Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2002-09-23Bitstream added on 2014-06-13T20:10:52Z : No. of bitstreams: 1 rabalho_aa_me_sjrp.pdf: 3150566 bytes, checksum: 6d823b8dd0082afcc44630ccf0ecf00a (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Sabe-se que uma variedade de microrganismos produzem um ou mais tipos de amilases para degradar os amiláceos presentes no ambiente e que as amilases produzidas por microrganismos termofílicos apresentam características mais termoestáveis do que aquelas produzidas por mesófilos. Essas amilases termoestáveis são de grande interesse na indústria de processamento de amido, uma vez a temperatura do gelatinização do mesmo, etapa importante do processo, fica em torno de 70ºC. Além disso, os processos que ocorrem em altas temperaturas, têm menor risco de contaminação por mesófilos e a diminuição da viscosidade do meio permite trabalhar com elevadas concentrações de substrato. No presente trabalho foram isoladas, a partir de amostras de solos, compostagens e resíduos agro-industriais, 339 linhagens microbianas termofílicas (326 bacterianas e 13 fúngicas) capazes de crescer a 55ºC em meio contendo amido como única fonte de carbono. As 163 linhagens (162 bactérias e 1 fungo) que se destacaram quanto à produção de amilases e à velocidade de crescimento em meio sólido, foram selecionadas e submetidas às fermentações submersa (meio nutriente) e semi-sólida (farelo de trigo). As atividades enzimáticas foram determinadas pelo método dextrinizante (a- amilase), pela quantificação da glicose (glucoamilase) e de açúcares redutores liberados a partir da hidrólise do amido. Das linhagens testadas, nove mostraram-se boas produtoras de a-amilase em fermentação submersa e/ou semi-sólida, fato pelo qual foram selecionadas para produção de amilases em meios formulados a partir de resíduos líquidos da extração de mandioca e milho (fermentação submersa) e sólidos, constituídos de farelos de mandioca, milho e trigo (fermentação semi-sólida). Quatro linhagens se destacaram, sendo suas enzimas brutas caracterizadas quanto às propriedades físico-químicas... / It is known that some microorganisms produce one or more amylase types that degrade organic compound present in the environment. The amylases produced by thermophilic microorganisms present characteristics more thermostable than those produced by mesophilics. Since starch gelatinization temperature is around 70ºC, the thermostable amylases are very important to starch processing industry. Besides, the processes that happen in high temperatures have less risk of contamination for the mesophilic microorganisms, the decrease of the viscosity of the media and allows to work with high substrate concentrations. In the present work thermophilic microorganisms (326 bacteria and 13 fungi) were isolated from soil samples, decaying agricultural waste and agriculture-industrial residues. They are able to grow at 55ºC in media containing starch as only carbon source. 163 strains (162 bacteria and 1 fungus) that showed high amylase production and fast growth in solid media were selected and submitted to the submerged (nutrient media) and semi-solid (wheat bran) fermentations. The enzymatic activities were determined by dextrinogenic method (a-amylase), by the quantification of the glucose (glucoamylase) and of the reducing sugars released from the starch hydrolysis. Among the tested strains, nine have shown high a-amylase production in submerged and/or semi-solid fermentations and because of this they were selected for amylase production in medium formulated with liquid wastes of extraction starch from the cassava and corn (submerged fermentation), and solid wastes constituted of cassava, corn, and wheat brans (semi-solid fermentation). Among these strains, four were selected and their crude enzymes were characterized regarding to their physicochemical properties. The strains Bacillus sp A13-22 and Mucor sp A13-36 produced amylases with optimum temperature of 70 and 80 ºC...(Complete abstract click electronic access below)

Orientador: Ely Nahas / Banca: José da Cruz Machado / Banca: Antônio Carlos Monteiro / Resumo: O conhecimento da atividade das enzimas hidrolíticas é essencial para compreender as transformações dos nutrientes no solo. O milho é uma das principais culturas sob o ponto de vista econômico. O objetivo deste estudo foi avaliar a influência do crescimento dos fungos em dois tipos de solos, na presença e ausência de glicose, no desenvolvimento das plântulas de milho, no padrão isoenzimático dos coleóptilos, nos teores de carboidratos totais residuais, nas atividades da desidrogenase e amilase. Utilizou-se delineamento inteiramente casualizado com esquema fatorial. A adição de glicose no meio de cultura aumentou a velocidade de crescimento de A. flavus e Penicillium sp., mas não de F. verticillioides. Na presença de glicose, a produção de esporos aumentou de 1,2 (F. verticillioides) e 8,2 vezes (A. flavus), e reduzido de 3,5 vezes com Penicillium sp. A redução dos teores de carboidratos totais ajustou-se significativamente às equações de 1º e 2º grau. A.flavus e Penicillium sp., apresentaram maior consumo de carboidratos totais que o solo sem inoculação ou inoculado com F. verticillioides. A adição de glicose no solo favoreceu o consumo de carboidratos residuais, provavelmente devido ao estímulo do crescimento dos fungos. Exceto com F. verticillioides, a atividade da desidrogenase aumentou em média de 1,5 a 1,8 vez (p<0,05) nos solos com glicose em relação aos solos sem glicose. À atividade da amilase, aumentou 1,3 a 1,5 vez por efeito da adição de glicose no solo. Maior atividade da amilase foi observada no solo Latossolo Vermelho distrófico (LVd) com glicose e inoculado com A.flavus e Penicillium sp. em relação ao controle. As dimensões das plântulas como altura dos coleóptilos, comprimento das raízes e massa seca das plântulas de milho dos solos adicionados de glicose e/ou inoculados com os fungos foram diminuídas. A expressão genética... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The knowledge about hydrolytic enzymes activity is essential to understand the nutrients transformations in soil. Corn is one of the main crops from the economic view in the whole world. The objective of this study was evaluate the fungi growth in two soil types, in the presence and absence of glucose, coleoptiles development, roots and weight of corn seedlings, coleoptiles isoenzyme pattern, content of total residual carbohydrates, enzymes dehydrogenase and amylase activity. Was used a completely randomized design with factorial arrangement. The glucose addition in culture medium increased the growth rate of A. flavus and Penicillium sp., but not F. verticillioides. In the presence of glucose, the spores number was increased from 1.2 (F. verticillioides) and 8.2 times (A. flavus), but was reduced 3.5 times with Penicillium sp. Reducing the levels of total carbohydrates, significantly adjusted to the equations of 1st and 2nd grade. A.flavus and Penicillium sp., showed higher carbohydrates consumption that the soil control or inoculated with F. verticillioides. The glucose addition in soil, favored the use of residual carbohydrates, probably due fungi growth stimulation. Except F. verticillioides, dehydrogenase activity increased in the range 1.5 to 1.8 times (p<0.05) in soils with glucose compared to glucose free soil. Amylase activity increased 1.3 to 1.5 times by glucose addition effect in soil. Increased amylase activity was observed in the Distrophic Red Latosol (DRL) with glucose and inoculated with A.flavus and Penicillium sp., compared to control. The seedlings dimensions as coleoptiles height, root length and dry weight of maize seedlings of the soils added with glucose and inoculated with fungi were decreased. Gene expression of maize seed was changed due probable by fungi inoculated infection in soil. The coleoptiles isoenzymes pattern was amended as early as 5 incubation... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Para a obtenção da seqüência completa do cDNA da &#945;-amilase foi realizada a varredura de uma biblioteca de cDNA, utilizando-se iniciadores planejados a partir do consenso entre seqüências de DNA ou aminoácidos disponíveis em bancos de dados. Após a excisão do vetor pBK-CMV carregando o inserto, foram obtidos subclones e todos foram seqüênciados. Foi obtida uma seqüência clonada de 1971pb, contendo uma ORF de 1251pb, codificando uma proteina de 416 aminoácidos (aa). Esta proteína apresentou urn provável peptídeo sinal de 15 aa, peso molecular calculado de 45.080 Da e pI 5,84. A seqüência de bases obtida mostrou similaridade de 75% quando comparada corn genes de outras monocotiledôneas como arroz, milho, cevada e trigo. Para a seqüência de aminoácidos, deduzida a partir região codificadora, esta semelhança foi de ate 80%, mostrando-se altamente conservada. Os modelos das estruturas primária, secundária e terciária para a &#945;-amilase de banana coincidem em diversos pontos com estruturas determinadas por cristalografia de raios X para &#945;-amilases de outras espécies, incluindo a disposição espacial de resíduos catalíticos e de ligação de substrato e íons cálcio. Análises por northern e Southern blot sugerem que apesar da existência de uma família de genes corn múltiplas cópias, a expressão destes nas frutas não alcança níveis detectáveis por northern blot. / Abstract not available.

A mandioca (Manihot esculenta Crantz) é uma raiz originária e cultivada na América do Sul, com alta perecibilidade no período pós-colheita. Seus principais processos de deterioração envolvem reações enzimáticas, oxidativas e microbiológicas. Neste trabalho foram estudadas raízes de mandioca da variedade Zolhudinha catalogada pela EMBRAPA como IM-158, provenientes da região amazônica, que se destacam pela alta atividade amilolítica. Foram analisadas as condições físico-químicas junto com o isolamento e purificação da &#945;-amilase da raiz e a possível participação desta enzima no processo deteriorativo pós-colheita. Por ser uma variedade de mandioca não comercial, o tempo de cocção foi em média de 4,30 h, teor de umidade em tomo de 64 % e porcentagem de amido de cerca de 30 %. A atividade amilásica decai em 1/3 de sua intensidade no quinto dia pós-colheita, em contraponto a formação de açúcares redutores, cuja concentração aumenta cinco vezes. A purificação foi obtida com duas etapas cromatográficas, com DEAE-celulose e Sephacryl S-200, revelando duas isoenzimas de &#945;-amilase treze vezes mais purificadas, com recuperação protéica de 7,5 % e com pesos moleculares entre 14 e 19 kDa. / Cassava (Manihot esculenta Crantz) is a root from a native plant, cultivated in South América, that is hightly perish on the post-harvest time. The mechanisms of the root deterioration are due to enzymatic and oxidative reactions as well as the microbiological attack. In this work were studied roots of Zolhudinha variety, EMBRAPA - IM 158, cultivated in Amazonian area, which distinguishes from others varieties by its higher amylase activity. Physicochemical properties were analyzed during the post-harvest time, the purification of &#945;-amylase were performed to establish a possible involvement on the deteriorative process. As a non-commercial variety, the cooking time of the roots was 4.30 hours on average, with 64 % of water content and 30 % of starch. The amylase activity during the post-harvest decrease 1/3 from the original at the day 5, that matches with the reducing sugar in roots by increase of five times. The purification was achieved by two chromatography steps on DEAE-cellulose and Sephacryl S-200, providing two isozymes of &#945;-amylase, thirteen times more purified with a recovery of 7.5 % of the protein fraction, the estimated molecular weights were between 14 and 19 kDa.

Submitted by Maria Beatriz Vieira (mbeatriz.vieira@gmail.com) on 2017-02-21T15:59:01Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) dissertacao_fabio_de_oliveira_gomes.pdf: 605733 bytes, checksum: 828b835237115c312d92d69a1de39520 (MD5) / Approved for entry into archive by Aline Batista (alinehb.ufpel@gmail.com) on 2017-02-22T17:21:29Z (GMT) No. of bitstreams: 2 dissertacao_fabio_de_oliveira_gomes.pdf: 605733 bytes, checksum: 828b835237115c312d92d69a1de39520 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Approved for entry into archive by Aline Batista (alinehb.ufpel@gmail.com) on 2017-02-22T17:25:57Z (GMT) No. of bitstreams: 2 dissertacao_fabio_de_oliveira_gomes.pdf: 605733 bytes, checksum: 828b835237115c312d92d69a1de39520 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Made available in DSpace on 2017-02-22T17:38:56Z (GMT). No. of bitstreams: 2 dissertacao_fabio_de_oliveira_gomes.pdf: 605733 bytes, checksum: 828b835237115c312d92d69a1de39520 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Previous issue date: 2014-05-20 / Sem bolsa / A Beta amilase é uma enzima do malte que tem a propriedade da hidrolise do amido em açúcares fermentescíveis. Atua hidrolisando ligações alfa-1,4 do amido, mais precisamente nas cadeias lineares da amilose e amilopectina, liberando carboidratos de cadeias menores (maltose, glicose e maltotriose), necessários para processo de fermentação pela levedura cervejeira. Essa quebra ocorre basicamente para disponibilizar açúcares que posteriormente servirão para formação de álcool na cerveja. A atividade enzimática é inicialmente dependente da solubilização das enzimas, como exemplo na mosturação onde os grãos moídos são imersos em água. Existem outros fatores como temperatura, tempo e pH que garantem máxima eficiência enzimática, o que de certa forma é de grande importância para cervejaria na busca de um rendimento otimizado durante a brassagem. Este trabalho propôs um estudo da beta amilase em diferentes períodos de atuação sobre o amido presente no mosto cervejeiro avaliando qual o melhor período de atuação enzimática. Foi utilizada uma única temperatura, diferentes tempos de atuação, que vão de zero até 60 minutos, intercalados em cinco minutos. Todas as amostras foram fermentadas e analisadas individualmente, buscando identificar qual o melhor período de atuação desta enzima e como os mostos produzidos em diferentes períodos de tempo sofreram fermentação, de acordo com a graduação alcoólica, teor alcoólico e extrato real. / Beta amylase is an enzyme of the malt that has the property of breaking down starch into fermentable sugars. Connections acts hydrolyzing alpha -1 ,4 starch, more precisely in the linear chains of amylose and amylopectin, lower releasing carbohydrate chains ( maltose, maltotriose and glucose ) necessary to process the fermentation by the brewing yeast. This breakdown occurs primarily to provide sugars that subsequently serve to formation of alcohol in beer . The enzymatic activity is initially dependent on the solubilization of enzymes , such as the mashing where ground beans are immersed in water . There are other factors such as temperature , time and pH to ensure maximum enzyme efficiency, which is of great importance for brewery in search of a performance optimized during mashing somehow . This paper proposed a study of beta amylase in different periods of activity on the starch present in the beer wort evaluating the best period of enzymatic activity . A single temperature , different operating times , ranging from zero to 60 minutes , interspersed in five minutes was used . All samples were fermented individually analyzed in order to identify the best period of activity of this enzyme and the musts produced in different periods of time have undergone fermentation , according to alcohol content , alcohol content , real extract and apparent extract.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The potato (Solanum tuberosum) is important raw material for agro-industrial production of hydrolysates. The lack of information about the process of hydrolysis of potato starch industry hampers the use of regional raw material and promote the use of crops such as maize, cassava and sugarcane to produce ethanol. The objective of this study was to determine the optimum range of the effects of different concentrations of substrate, concentration of enzyme amyloglucosidase (AMG) and reaction times, reduce process time, enzymes and material to be hydrolyzed. This was a central composite experimental design with three independent variables namely: [1] substrate concentration (3-7%) [2] enzyme dosage (0.36 to 1.0 μL.g MS-1) [ 3] time of action of enzymes computed after the addition of AMG in the middle (4 to 48 hours). The α-amylase concentration remained constant at 0.8 μL/g starch. The experiments were conducted in the bioreactor followed by metabolic bath. The dependent variables analyzed were the concentration of reducing sugars (RS) and the efficiency of hydrolysis of starch. The data were processed by Statistica 8.0, to generate predictive models at 95% confidence. The larger fraction of RA was reached in the middle (35.55 g/L), with time (26 hours) and dose of enzyme (0.68 mL) and substrate concentration at the maximum level (7%). The efficiency of hydrolysis (125%) occurred with the minimum ratio of substrate (3%) and enzyme dosage (0.68 mL) and the average time (26 hours). To reduce costs of enzyme (0.36 mL AMG), working with the same concentration of substrate, the model estimated that the hydrolysis for 39 hours was able to release 33.17 g/L of the AR 128, 62% efficiency. The use of different enzyme concentrations showed no significant increase in responses, and the time factor is set lower than recommended by the manufacturer of the enzymes. The concentration of substrate influenced more significantly than other factors, for both dependent variables. The performance presented demonstrates that this process is an efficient alternative to the industry, emerging as an important source this material for the production of hydrolysates. / A batata (Solanum tuberosum) é importante matéria-prima agroindustrial para produção de hidrolisados. A falta de informações sobre o processo de hidrólise do amido de batata na indústria dificulta a utilização desta matéria-prima regional e favorece o uso das culturas como: milho, mandioca e cana de açúcar para produção de álcool etílico. O objetivo deste trabalho foi apurar a faixa otimizada dos efeitos de diferentes concentrações de substrato, concentração de enzima amiloglicosidase (AMG) e períodos reacionais, na redução de tempo do processo, enzimas e material a ser hidrolisado. Foi realizado um desenho experimental central composto, com três variáveis independentes sendo elas: [1] concentração de substrato (3-7%), [2] dosagem enzimática (0,36-1,0μL/g de MS), [3] tempo de ação das enzimas computado após a adição da AMG no meio (4 a 48 horas). A concentração de α-amilase manteve-se constante em 0,8μL/g de amido. Os experimentos foram conduzidos em bioreator seguido de banho metabólico. As variáveis dependentes analisadas foram a concentração de açúcares redutores (AR) e a eficiência de hidrólise do amido. Os dados foram tratados pelo Statistica 8.0, para gerar modelos preditivos a 95% de confiança. O teor maior de AR foi alcançado no meio (35,55g/L), com tempo (26 horas) e dosagem de enzima (0,68μL) e concentração de substrato no nível máximo (7%). A maior eficiência de hidrólise (125%) ocorreu com a razão mínima de substrato (3%) e dosagem de enzimas (0,68μL) e tempo no nível médio (26 horas). Para a redução dos custos com enzima (0,36μL/g MS de AMG), trabalhando-se com a mesma concentração de substrato, o modelo estimou que a hidrólise por 39 horas era capaz de liberar 33,17 g/L de AR , com 128,62% de eficiência. O uso de diferentes concentrações de enzimas não apresentou incremento significativo nas respostas, sendo que o fator tempo se estabeleceu abaixo do recomendado pelo fabricante das enzimas. A concentração de substrato influenciou de forma mais significativa que os demais fatores, para ambas variáveis dependentes. O rendimento apresentado demonstra que este processo é uma alternativa eficiente à indústria, despontando este material como fonte importante para produção de hidrolisados.

Um dos eventos mais importantes durante o amadurecimento da banana é a degradação do amido, concomitante com o acúmulo de açúcares solúveis. Várias enzimas, que supostamente atuam na degradação do amido, já tiveram sua atividade/proteína específica detectadas nesta fase na banana. Entre elas a &#945;-amilase, a &#946;-amilase, as amido-fosforilases, as &#945;-glicosidases e as isoamilases. A síntese do amido e, normalmente, sua degradação, ocorrem dentro do amiloplasto, que possui duas membranas a serem transpostas antes do acesso ao grânulo de amido ou aos produtos da ação de outras enzimas. Uma das isoformas da &#946;-amilase em banana possui um peptídeo de transporte predito em sua seqüência, necessário para transpor estas membranas e entrar no amiloplasto. Uma maneira de contornar a dificuldade em estabelecer a real importância de cada enzima na degradação do amido é isolar os grânulos e as enzimas e submetê-lo à atividade seqüencial das enzimas supostamente responsáveis pela degradação. O ideal é utilizar a enzima endógena, mas o processo de purificação de enzimas em frutos é demorado e nem sempre bom em termos de pureza, quantidade e atividade. Estudos baseados na expressão heteróloga de genes da &#946;-amilase permitiriam melhor compreender os mecanismos de atuação dessa enzima presente na polpa da banana. Assim, foram feitos ensaios de expressão heteróloga em Pichia pastoris na tentativa de produzir essa enzima em quantidade suficiente para purificação, aplicação nos grânulos de amido e produção de anticorpos policlonais. Foram testadas várias condições de indução da proteína, tais como aeração, temperatura, pH, concentração de metanol e tempo de indução, bem como a montagem de uma nova construção gênica com tag de histidina no vetor de expressão pPICZ&#945;A com confirmação do fenótipo dos transformantes positivos. Porém, a obtenção de &#946;-amilase recombinante com atividade não foi bem sucedida, necessitando talvez de alterações nesses padrões de indução. / One of the most important events that occurs during ripening of banana is the starch degradation concomitantly with the accumulation of soluble sugars. Several enzymes, known by acting on starch degradation, had their activity and/or specific protein detected at this stage of banana. These include the &#945;-amylase, the &#946;-amylase, the starch-phosphorylases, the &#945;-glucosidase and the isoamilases. The synthesis and starch degradation occur inside of the amyloplast that contain two membranes which has to be reach before accessing the starch granule or the products of the other enzymes. One of the isoforms of &#946;-amylase in bananas has a transit peptide predicted in the sequence, required to access the amyloplast. To establish the real importance of each enzyme in the starch degradation it is necessary to isolate the granules and enzymes and submit them to the sequential activity to confirm the supposed degradation. The idea is to use the endogenous enzyme, but the process of purification of the enzyme in fruits demands a lot of time and the results of purity, quantity and activity are not guaranteed. Studies based on heterologous expression of the &#946;-amylase genes allow us to understand the mechanisms of action of this enzyme present in the pulp of banana. Thus, tests were carried out with heterologous expression in Pichia pastoris in order to produce this enzyme in sufficient quantity to purification, and then, applied on starch granules and produce a polyclonal antibody. We tested different conditions of protein induction such as aeration, temperature, pH, methanol concentration and induction time, as well as the new genic construction with the histidine tag with an expression vector pPICZ&#945;A confirming the phenotype of positive transformants. However, recombinant &#946;-amylase with activity was not obtained successfully, necessitating changes in these patterns of induction.

Mapeamento dos subsítios de &#945;-amilase de Xanthomonas axonopodis pv. Citri envolvidos na interação com o substrato A família das enzimas &#945;-amilases é um modelo experimental interessante para o estudo das interações entre os aminoácidos e seus ligantes, já que estas enzimas apresentam especificidade variável, são frequentemente alvos de estudos por mutagênese e há estruturas cristalinas disponíveis para alguns membros da família. A proposta deste trabalho foi o mapear subsítios da &#945;-amilase de Xanthomonas axonopodis pv. citri (AXA) envolvidos na interação com substratos, através de comparações estruturais, mutagêneses sítio-dirigidas, análises de parâmetros cinéticos sobre amido e do padrão de clivagem sobre p-nitrofenil malto-oligossacarideos (PNPG7, PNPG5, PNPG4). Foi criado um modelo estrutural para AXA a partir da estrutura tridimensional da &#945;-amilase de Alteromonas haloplanctis (Aghajari et al., 1998). O modelo de AXA foi sobreposto na estrutura da &#945;-amilase pancreática de porco (Qian et al., 1994) e 11 resíduos foram selecionados e mutados para alanina. As &#945;-amilases recombinantes mutantes e selvagem foram secretadas pela levedura Pichia pastoris GS115, apresentando uma massa molecular aparente de 45 kDa. Todos os mutantes analisados reduziram em maior ou menor grau a atividade catalítica da enzima sobre amido e p-nitrofenil maltooligossacarideos. Mutações dos resíduos H88, F136, D196, E223, D295 e N299, deletaram a atividade enzimática, indicando que suas cadeias laterais são essenciais para o desempenho catalítico da enzima. As análises cinéticas e estruturais sugerem fortemente que D196, E223 e D295 são os resíduos catalíticos. Substituições das cadeias laterais de C157, H200, G227, T230 e H294 reduziram a eficiência catalítica (kcat/Km) da &#945;-amilase sobre o substrato amido para, respectivamente, 28%, 41%, 84%, 81% e 51%. As mutações em G227 e T230 foram menos importantes para a atividade da enzima e afinidade pelo amido, entretanto, estes resíduos mostraram-se importantes para a estabilização de complexos com substratos curtos (pNPG4). Os resultados indicam que o sítio ativo de AXA é formado por, no mínimo, seis subsítios. As interações dos anéis de glicose com os subsítios +2 e -2 são favorecidas em relação às interações nos subsítios -3 e +3, respectivamente, e a interação do anel de glicose no subsítio -3 é favorecida em relação à interação no subsítio +3. A enzima selvagem diva preferencialmente a terceira ligação glicosídica de p-nitrofenil maltooligossacarideos. Como produtos de hidrólise a enzima libera maltopentaose, maltotetraose, maltotriose, maltose e glicose. / The &#945;-amylase family is an interesting group for structure/function relationship investigation, as this family exhibits a variable deavage patterm, several crystal structures are available, and its members were studied by mutagenesis. The aim of this study was the mapping of Xanthomonas axonopodis pv. Citri &#945;-amylase (AXA) subsites involved in substrate binding, using structural comparison, site-directed mutagenesis and lcinetics analyses. A structural model for AXA was created from the three-dimensional structure of the &#945;-amylase from Alteromonas haloplanctis (Aghajari et al., 1998). This model was superimposed on the structure ofthe pig pancreatic &#945;-amylase, PPA (Qian et. al., 1994), and 11 residues were selected and changed to alanine. Wild type and mutant AXA were secreted by Pichia pastoris strain GS115 cells and showed apparent molecular mass of 45 kDa. All mutants have reduced &#945;-amylase activity on starch and 4-nitrophenyl maltooligosaccharides (pNPG7, PNPG5 and PNPG4) at different levels. Mutation of residues H88, F136, D196, E223, D295 and N299 indicate their essential role by complete loss of activity. Kinetic and structural analyses strongly suggested that D196, E223 and D295 are the catalytic residues. The substitution of the side chain of C157, H200, G227, T230 and H294 reduced the catalytic efficiency (kcat/Km) of &#945;-amylase on starch to respectively 28%, 41%, 84%, 81% and 51%. Although G227 and T230 were not much important for activity and binding on starch, these residues were important for stabilization of complexes with short substrates (PNPG4). The results indicate that AXA\'s active site is composed of at least six sugar binding subsites. The binding of the glucoses at subsites +2 and -2 are favored against binding at subsites -3 and +3, respectively. The binding of glucose at subsite -3 is favored against binding at subsite +3. The wild type enzyme primarily hydrolyzes the third glucosidic bond in PNPG7, PNPG5 and PNPG4 and the products of hydrolysis were maltopentaose, maltotetraose, maltotriose, maltose and glucose.