ABREU, Virgínia Kelly Gonçalves. Efeito da radiação gama sobre a redução de microrganismos patogênicos, a estabilidade dos lipídios e as características sensoriais em caudas de camarões congelados. 2006. 75 f. : Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Ceará, Centro de Ciências Agrárias, Departamento de Tecnologia de Alimentos, Fortaleza-CE, 2006 / Submitted by Nádja Goes (nmoraissoares@gmail.com) on 2016-06-30T14:52:55Z No. of bitstreams: 1 2006_dis_vkgabreu.pdf: 431632 bytes, checksum: fb4a5fd03cc95a3e25fdd9154f2c1d2c (MD5) / Approved for entry into archive by Nádja Goes (nmoraissoares@gmail.com) on 2016-06-30T14:54:19Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2006_dis_vkgabreu.pdf: 431632 bytes, checksum: fb4a5fd03cc95a3e25fdd9154f2c1d2c (MD5) / Made available in DSpace on 2016-06-30T14:54:19Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2006_dis_vkgabreu.pdf: 431632 bytes, checksum: fb4a5fd03cc95a3e25fdd9154f2c1d2c (MD5) Previous issue date: 2006 / Irradiation represents an efficient technique to extend shelf life of several foods and the interest in using this technology has been growing in the last years because besides improving food safety it produces minimal alterations in the food constituents. Thus, this study investigated the effect of ionizing irradiation (60Co) of frozen and packaged shrimp on microorganisms as well as on some chemical and sensory characteristics of the product. Cultivated shrimp (Penaeus vannamei) from local farms processed into shrimp tails were packaged, frozen, irradiated and analyzed. The study was divided in two stages. The first stage was intended to verify the effect of the gamma radiation on the population of inoculated Vibrio cholerae O1 and Salmonella enteritidis bacteria. It used a complete randomized factorial (4 x 3) design with four irradiation doses (0, 2, 4 and 6kGy) and three inoculation modalities (one with V. cholerae O1, one with S. enteritidis and one without microorganisms). The second stage aiming to verify the effect of the gamma irradiation on the chemical stability of lipids, color and instrumental texture of shrimp followed a complete randomized factorial (4 x 5) design with four irradiation doses (0, 2, 4, and 6kGy) and five replicates. Sensorial analysis followed a complete randomized factorial of balanced complete blocks, where the panelist was considered as block. The experimental units (UE) from the first stage were analyzed for V. cholerae O1 and S. enteritidis survival after the irradiation procedure, while those from the second stage were analyzed for thiobarbituric acid reactive substances (TBARS), instrumental color and texture and sensory evaluation of the meat. As irradiating dose increased a significant (p<0.05) reduction in V. cholerae O1 and S. enteritidis counts was observed. TBARS values decreased (p<0.05) in shrimp irradiated with 6kGy related to those in non irradiated shrimp. Also, color component L* increased (p<0.05) in shrimp irradiated with 6kGy dose as compared to that irradiated with the 2kGy dose. No effect of irradiation was found on color components a* and b* or on instrumental texture values. Sensory global acceptance presented a significant reduction (p <0.05) with the dose of 6kGy as related to the doses of 2kGy or 0kGy. However, color acceptance and texture and the intensity of the attributes aroma, flavor and juiciness were not affected (p>0.05). Therefore, irradiation treatment in doses up to 6kGy on frozen and packaged shrimp tails significantly reduces V. cholerae O1 and S. enteritidis counts with minor effects on sensory characteristics in cooked shrimp. / A irradiação representa uma técnica eficiente na conservação dos alimentos, e o interesse pela sua utilização tem crescido nos últimos anos, pois além de melhorar a qualidade microbiológica, produz mínimas alterações nos constituintes dos alimentos. Sendo assim, este trabalho teve como objetivo estudar o efeito da radiação gama (60Co), aplicada ao camarão congelado e embalado, sobre a microbiota, a estabilidade química de alguns componentes, bem como sobre algumas propriedades sensoriais da carne. Foram avaliadas caudas de camarões da espécie Penaeus vannamei, provenientes da carcinicultura local. O estudo foi dividido em duas etapas, sendo a primeira destinada a verificar o efeito da radiação gama, aplicada nas doses de 0, 2, 4 e 6kGy, sobre a população de duas bactérias patogênicas inoculadas no camarão: Vibrio cholerae O1 e Salmonella enteritidis. Este estudo utilizou um delineamento experimental inteiramente casualizado, em esquema fatorial 4 x 3, em que os fatores avaliados foram as quatro doses de irradiação e três modalidades de inoculação (com V. cholerae O1, com S. enteritidis e sem inoculação de microrganismos). Já na segunda etapa foi usado um delineamento experimental inteiramente casualizado, em esquema fatorial 4 x 5, sendo quatro doses (0, 2, 4 e 6kGy) de irradiação e cinco repetições, para as análises de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS), cor e textura instrumental. Para a análise sensorial foi utilizado um delineamento de blocos completos balanceados, onde o provador foi considerado como bloco. Houve uma redução significativa (p<0,05) do número de V. cholerae O1 e de S. enteritidis de acordo com o aumento da dose de irradiação. Em relação aos valores de TBARS, houve um decréscimo (p<0,05) das amostras irradiadas com 6kGy em relação as não irradiadas. Quanto ao valor do componente de cor L* houve uma elevação significativa (p<0,05) com a dose de 6kGy em relação à dose de 2kGy. Os componentes de cor a* e b* e a textura instrumental não variaram (p>0,05) com as doses de irradiação estudadas. Com relação as características sensoriais, a aceitação global apresentou uma redução significativa (p<0,05) com a dose 6kGy quando comparada com as doses 0 e 2kGy. No entanto, os atributos de aceitação de cor e textura e a intensidade dos atributos aroma, sabor característico e suculência não foram afetados (p>0,05). Desta forma, o tratamento de irradiação com até 6kGy mostra-se efetivo na redução de microrganismos patogênicos, com leves efeitos sobre as características sensoriais da carne, quando aplicado sobre o camarão congelado e embalado.

Amostras de biofilme de biomassa suspensa de tanque de aeração de lodo ativado, de córrego contaminado com esgoto e de vários pontos de planta de tratamento de água foram analisadas com relação à presença de bactérias indicadoras e patogênicas. Nos testes presuntivos foram detectados todos os microrganismos-alvo (Coliformes, Salmonella spp, Klebsiella spp., Staphylococcus spp., Pseudomonas spp., Enterococcus spp., Vibrio spp., Clostridium spp., Shigella spp., Aeromonas spp., Campylobacter spp. e Legionella spp.), porém nos testes confirmatórios por PCR e teste bioquímico somente as espécies E. coli, Salmonella enterica subsp. Enterica serovar Typhi, K. pneumoniae, V. cholerae, A. hydrophila, e L. pneumophila foram confirmadas para algumas cepas selecionadas dos testes presuntivos. S. flexneri foi somente confirmada por teste bioquímico e S. aureus somente por PCR. Nenhuma amostra de C. jejuni foi confirmada por nenhum dos testes. Estes resultados demonstram que os meios seletivos para testes presumptivos não se mostraram confiáveis uma vez que muitas amostras presuntivas não foram confirmadas por PCR ou teste bioquímico específico. Estes resultados demonstram o potencial de biofilmes como reservatório de patógenos. / Biofilm samples from activated sludge reactors, surfaces from water treatment plants and water samples from a creek contaminated with raw sewage were analyzed for the presence of microbial indicator bacteria and pathogens. All target organisms (Coliforms, Salmonella spp, Klebsiella spp., Staphylococcus spp., Pseudomonas spp., Enterococcus spp., Vibrio spp., Clostridium spp., Shigella spp., Aeromonas spp., Campylobacter spp. and Legionella spp.) were detected by using presumptive testing media. Only a small proportion of positive colonies from presumptive tests were confirmed as pathogenic strains of E. coli, Salmonella enterica subsp. Enterica serovar Typhi, K. pneumoniae, V. cholerae, A. hydrophila, and L. pneumophila in confirmatory testing by selective PCR and biochemical tests. S. flexneri was only confirmed in biochemical tests, S. aureus only by PCR and no colony of C. jejuni was confirmed positive by either PCR or biochemical testing. Presumptive media are therefore not safe means for assessing pathogen load in biofilm samples. These results demonstrate the importance of microbial biofilms as reservoirs for microbial pathogens.

Submitted by Fabio Sobreira Campos da Costa (fabio.sobreira@ufpe.br) on 2016-04-15T11:47:50Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) tese.nelson certa.pdf: 11814547 bytes, checksum: 2cbb2aad17bbcac9f45275deb527071a (MD5) / Made available in DSpace on 2016-04-15T11:47:50Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) tese.nelson certa.pdf: 11814547 bytes, checksum: 2cbb2aad17bbcac9f45275deb527071a (MD5) Previous issue date: 2015-07-31 / A ocorrência de tolerância por parte dos micro-organismos contaminantes de alimentos a agentes e/ou tratamentos antimicrobianos clássicos, impõe a busca de tecnologias alternativas para emprego na conservação de alimentos, a exemplo dos óleos essenciais, em especial aqueles obtidos da espécie Rosmarinum officinalis L. (OERO). A ação antimicrobiana do OERO tem sido atribuída ao 1,8-cineol (CIN) frequentemente citado como seu constituinte majoritário. O objetivo deste estudo foi investigar o efeito da exposição a concentrações subinibitórias do OERO e CIN na modificação da tolerância direta e cruzada de algumas bactérias contaminantes de alimentos (Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa e Salmonella Typhimurium). Ainda, foi avaliada a influência dos fatores sigma alternativos σS e σB na tolerância de E. coli MG1655 e L. monocytogenes EGDe, e seus mutantes isogênicos E. coli MG1655 ΔrpoS e L. monocytogenes EGD-e ΔsigB, frente ao OERO e ao óleo essencial de Origanum vulgare L. (OEOV) bem como na modificação da tolerância bacteriana direta e cruzada ao campo elétrico pulsado (CEP). Para isso, foram realizados ensaios de determinação da Concentração Inibitória Mínima (CIM) e de modificação da tolerância direta e cruzada após exposição das cepas às concentrações subinibitórias (sub-CIMs) (1/2 CIM e 1/4 CIM) do OERO ou do CIN em caldo base carne (18 h) e em modelo base carne (72 h). Para os ensaios de verificação de injúria subletal e interferência dos fatores sigma na tolerância bacteriana, células de E. coli MG1655 e L. monocytogenes EGD-e foram expostas a concentrações inibitórias do OERO ou OEOV para, em seguida, serem cultivadas em meios adicionados de agentes seletivos (NaCl ou sais de bile). Os valores de CIM variaram entre 20 e 40 μL/mL e 40 e 80 μL/mL para o OERO e CIN, respectivamente. Os ensaios de modificação de tolerância não revelaram aumento de tolerância direta e cruzada nas cepas bacterianas testadas. A CIM do OERO e OEOV frente às células mutantes foi menor daquele encontrado frente às células parentais. As células mutantes também apresentaram maior diminuição da sua viabilidade quando tratadas com os óleos essenciais (OES) em relação às células parentais, bem como maior proporção de células apresentando lesão subletal. Ainda, as células mutantes mostraram maior sensibilidade ao CEP quando comparadas as parentais. A ausência dos fatores sigma diminuiu a tolerância direta e ao CEP nas células pré-expostas ao OES em sub-CIMs. Os resultados obtidos neste estudo demonstram que: i) a exposição das cepas bacterianas a sub-CIMs do OERO ou CIN não aumentou a tolerância direta e cruzada; ii) os fatores sigma σS e σB influenciaram a sensibilidade das cepas de E. coli MG1655 e L. monocytogenes EGD-e, respectivamente, frente ao OERO e OEOV ao CEP; e iii) os fatores sigma não influenciaram no aumento da tolerância bacteriaia direta e cruzada ao CEP. Estes resultados demonstram o potencial do OERO e do CIN para uso como antimicrobiano na conservação de alimentos, quando considerado o seu efeito inibitório sobre bactérias contaminantes de alimentos e a ausência de indução de aumento na tolerância bacteriana direta e cruzada. / The occurence of tolerance in food contaminant microorganisms to agents and/or classic antimicrobial treatments has required the search of alternative technologies for use in food preservation, such as essential oils, especially those obtained from the specie Rosmarinum officinalis L. (ROEO). The antimicrobial action of ROEO has been attributed to 1.8-cineol (CIN), frequently cited as its main constituent. The aim of this study was to investigate the effect of exposure to subinhibitory concentrations of ROEO and CIN on the modification of direct tolerance and cross-tolerance of some food-contaminant bacteria (Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa and Salmonella Typhimurium). Still, the influence of alternative sigma factors σS and σB on tolerance of E. coli MG1655 and L. monocytogenes EGD-e, and its isogenic mutant E. coli MG1655 and L. monocytogenes EGD ΔrpoS and ΔsigB to the ROEO and the essential oil of Origanum vulgare L. (OVEO), as well as direct on the modification of the bacterial direct tolerance and cross tolerance the pulsed electric field (PEF) were investigated. For this, assays to determine the Minimum Inhibitory Concentration (MIC) and the modification of the direct tolerance and the cross-tolerance after exposure of the strains to subinibitory concentrations (sub-MICs) (1/2 MIC and 1/4 MIC) of ROEO or CIN in meat broth (18 h) and model based meat (72 h) were performed. For verification of sublethal injury and interference of sigma factors on bacterial tolerance, E. coli MG1655 cells and L. monocytogenes EGD-e were exposed to inhibitory concentrations of ROEO or OVEO and further cultivated in media added selective agents (NaCl or bile salts). The MIC values ranged between 20 and 40 μL/mL and 40 to 80 μL/mL for ROEO and CIN, respectively. The tolerance modified assays revealed no increase in either the direct tolerance or the cross-tolerance in the tested bacterial strains. The MIC of ROEO and OVEO against the mutant cells was lower than that found against the parental cells. Mutant cells showed also a greater decrease in viability when treated with essential oils (EOS) compared to the parental cells, as well as a higher proportion of cells with sublethal injury. Still, the mutant cells showed higher sensitivity to PEF when compared to parental cells. The absence of sigma factors decreased the direct tolerance and tolerance to the PEF in cells pre-EOS exposed to sub-MIC. The results of this study show that: i) exposure of the bacterial strains to sub-MICs of ROEO or CIN did not increase the direct or the crosstolerance; ii) the sigma σS and σB factors influenced the sensitivity of strains of E. coli MG1655 and L. monocytogenes EGD-e, respectively, to the OVEO and ROEO and PEF; and i) the sigma factors did not influence the increase in direct bacterial tolerance and cross tolerance to the PEF. These results demonstrate the potential of ROEO and CIN for use as antimicrobials in food preservation, when considering their inhibitory effect on bacterial foodcontaminants and the absence of induction to direct or cross bacterial tolerance.

Intimina é o principal fator de virulência envolvido na patogênese de Escherichia coli enteropatogênica (EPEC) e de Escherichia coli enterohemorrágica (EHEC). A detecção de EHEC e EPEC típica ou atípica é de fundamental importância na definição da conduta terapêutica das infecções promovidas por E. coli, que ainda são a principal causa de diarreia aguda em crianças e adultos em muitos países desenvolvidos e em desenvolvimento. Anticorpos são ferramentas importantes na detecção de diversos patógenos. Neste trabalho avaliou-se a sensibilidade e especificidade dos anticorpos policlonal e monoclonal anti-intimina frente a isolados de EPEC e EHEC por immunoblotting. Os anticorpos apresentaram 100% de especificidade e a sensibilidade foi de 97%, 92% e 78%, quando se utilizou a fração enriquecida em IgG do soro de coelho, antissoro de rato e anticorpo monoclonal, respectivamente. Esse anticorpo monoclonal anti-intimina foi caracterizado como IgG2b e 1 &#181;g desse anticorpo reconheceu 0,6 &#181;g de intimina purificada com uma constante de dissociação de 1.3 x 10-8 M. A menor reatividade do anticorpo monoclonal em relação aos anticorpos policlonais levou-nos à clonagem e expressão do fragmento variável de cadeia simples desse anticorpo (scFv). Para isso, o mRNA do hibridoma anti-intimina foi extraído, reversamente transcrito para cDNA e amplificadas as cadeias leve e pesada da fração variável do anticorpo, utilizando iniciadores aleatórios comerciais. As cadeias amplificadas foram ligadas ao vetor pGEM-T Easy e sequenciadas. Iniciadores específicos foram desenhados e utilizados em uma estratégia de amplificação e união das cadeias, formando o scFv, que por sua vez foi clonado no vetor de expressão pAE. Linhagem de E. coli BL21(DE3)pLys foi transformada com o plasmídeo pAE-scFv antiintimina e submetida à indução protéica. O scFv anti-intimina foi expresso de forma insolúvel, solubilizado, purificado e submetido ao ensaio de refolding. O rendimento obtido foi de 1 mg de proteína por 100 mL de cultivo bacteriano. Para testar a funcionalidade do scFv, foram realizados ensaios de ELISA de captura e imunofluorescência. Os resultados mostraram que 275 ng de scFv reagiram com 2 &#181;g de intimina purificada a uma absorbância de aproximadamente 0,75 e por imunofluorescência mostrou uma forte reatividade ao isolado de EPEC típica E2348/69. Este estudo demonstrou que o anticorpo recombinante anti-intimina obtido foi capaz de reconhecer a região conservada de intimina (Int388-667) na forma purificada e a intimina &#945; no isolado de EPEC típica, e se mostrou mais eficiente que o anticorpo monoclonal nativo. / Intimin is the major virulence factor involved in the pathogenesis of enteropathogenic Escherichia coli (EPEC) and enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC). The detection of EHEC and typical or atypical EPEC has fundamental importance in defining the therapeutic management of infections caused by E. coli, which are still the leading cause of acute diarrhea in children and adults in many developed and developing countries. Antibodies are important tools in the detection of several pathogens. In this study it was evaluated the sensitivity and specificity of polyclonal and monoclonal antibodies against intimin in the detection of EPEC and EHEC by immunoblotting. All employed antibodies showed 100% specificity and the sensitivity was 97%, 92% and 78% for rabbit anti-intimin IgG-enriched fraction, rat antisera and monoclonal antibody, respectively. This anti-intimin monoclonal was characterized as IgG2b and 1 mg recognized 0.6 &#181;g of purified intimin with a dissociation constant of 1.3 x 10-8 M. The less extent reactivity of monoclonal led us to clone and express the single chain fragment variable of this antibody (scFv). Thus, the anti-intimin hybridoma mRNA was extracted, reverse transcribed to cDNA and the light and heavy chains of variable fragment of the antibody were amplified using commercial random primers. The chains were amplified, ligated to the pGEM-T Easy vector and the insert was sequenced. Specific primers were designed and used in a strategy to amplify and link the chains, obtaining the scFv, which was cloned into the pAE expression vector. E. coli BL21(DE3)plys was transformed with the pAE-scFv anti-intimin plasmid and subjected to induction of protein expression. The scFv anti-intimin, expressed in the insoluble fraction, was purified and submitted to refolding. The yield was 1 mg of protein per 100 mL of bacterial culture. To test the functionality of the scFv, ELISA and immunofluorescence assays were performed. The results showed that 275 ng of scFv reacted with 2 &#181;g of purified intimin resulting in an absorbance of 0.75. By immunofluorescence it was observed a strong reactivity to the typical EPEC isolate E2348/69. This study demonstrated that the recombinant anti-intimin antibody obtained was able to recognize the conserved region of intimin (Int388-667) in its purified form and &#945; intimin in a typical EPEC isolate, and was more efficient than the native monoclonal antibody.

Os antibióticos têm sido utilizados como aditivos na alimentação animal para aumentar o desempenho e manter a saúde dos animais, como suínos e frangos, destinadas à produção de alimentos de origem animal. No entanto, desde 2006, a Comunidade Europeia proibiu o uso de antibióticos para esse proposito devido ao desenvolvimento de resistência bacteriana aos antibióticos. Como resultado, várias alternativas foram estudadas e propostas para substituir os antibióticos utilizados na alimentação animal. Os óleos essenciais têm recebido considerável atenção devido às suas propriedades antimicrobianas. Portanto, o objetivo do presente trabalho foi avaliar in vitro a atividade antibacteriana dos óleos essenciais contra a microbiota patogênica e probiótica de ocorrência no trato gastrointestinal de suínos e aves, destinadas à produção de alimentos de origem animal. A atividade antibacteriana seletiva, a qual, significou uma alta atividade antibacteriana contra bactérias patogênicas e reduzida ou nenhuma atividade sobre bactérias probióticas, foi avaliada como característica fundamental dos óleos essenciais com alto desempenho. Esta característica foi avaliada nos óleos essenciais usados individualmente e em combinações binarias. Inicialmente, no Capítulo 2, uma triagem de vinte e oito óleos essenciais (OEs) através do método de difusão em disco mostrou que Eucalyptusglobulus, E. exserta, Pimenta pseudocaryophylllus, Orange Oil Phase Essence, e CitrusTerpens (Os dois últimos OEs foram subprodutos do processamento da laranja para obtenção de suco) tiveram uma atividade antibacteriana seletiva sobre a bactéria patogênica Salmonella Enteritidis e a bactéria probiótica Lactobacillus plantarum. Numa fase posterior, esses cinco óleos foram avaliados individualmente e em misturas binárias, contra cinco bactérias patogênicas e três bactérias probióticas. Os melhores resultados foram observados quando os OEs foram avaliados isoladamente e não em misturas. Assim, Orange Oil Phase Essence e Citrus Terpens destacaram-se por ter a melhor atividade antibacteriana seletiva contra essas bactérias. No Capítulo 3, uma análise mais detalhada da atividade antibacteriana dos óleos essenciais foi realizada utilizando Orange Oil Phase Essence e a mistura composta pelos óleos de E. globulus e P. pseudocaryophyllus. Estes dois óleos foram selecionados com base nos resultados do Capitulo 2 e da disponibilidade de OEs em nosso estoque. Ambos, óleo e a mistura foram avaliados sobre a bactéria patogênica mais resistente, E. faecalis, e a bactéria probiótica menos resistente L. rhamnosus, como observado no Capitulo 2. A avaliação da Concentração Inibitória Mínima e Concentração Bactericida Mínima do Orange Oil Phase Essence e da mistura mostrou que não tiveram um efeito antibacteriano seletivo sobre E. faecalis e L. rhamnosus. Finalmente, no Capitulo 4, foi avaliada a atividade antibacteriana individual e combinada dos óleos de E. globulus e P. pseudocaryophyllus sobre E. faecalis e L. rhmanosus. Os resultados mostraram que a combinação destes dois OEs, avaliadas pelo método checkerboard, não potencializou a atividade antibacteriana seletiva dos dois OEs. Portanto, observou-se que o óleo de E. globulus isoladamente apresentou a melhor atividade antibacteriana seletiva contra E. faecalis e L. rhamnosus. Em conclusão, este trabalho permitiu identificar óleos essenciais com perfil antibacteriano seletivo para eles serem possíveis alternativas botânicas aos antibióticos utilizados na alimentação animal. / Antibiotics have been used in animal feed to maintain health and increase performance, as in the case of pigs and poultry intended for food production of animal origin. However, since 2006 the European Community has banned the use of antibiotics for this purpose due to the emergence and increase of antibiotic-resistant bacteria. As a result, several alternatives have been studied and proposed to substitute antibiotics used in animal feed. Essential oils have received considerable attention due to their antimicrobial properties. Therefore, the objective of this work was to evaluate in vitro the antibacterial activity of essential oils against pathogenic and probiotic bacteria that occur in the gastrointestinal tract of swine and poultry, intended for food production of animal origin. The selective antibacterial activity, which means high antibacterial activity on pathogenic bacteria and reduced or no activity on probiotic bacteria, was evaluated as a fundamental feature of the highest-performance essential oils. This feature was evaluated in essential oils used individually and in binary combinations. Initially, in Chapter 2, the screening of twenty-eight essential oils (EOs) by disk diffusion method showed that Eucalyptus globulus, E. exserta, Pimenta pseudocaryophylllus, Orange Oil Phase Essence, and Citrus Terpens (the last two EOs were by-products of orange juice production) had a selective antibacterial activity against the pathogenic Salmonella Enteritidis and probiotic Lactobacillus plantarum. At a later stage those five oils were evaluated, individually and in binary blends, against five pathogenic bacteria and three probiotic bacteria. Better results were observed when the EOs were checked alone and not in blends. Orange Oil Phase Essence and Citrus Terpens stood out for having the two best selective antibacterial activities against those bacteria. In Chapter 3, a more detailed analysis of essential oil antibacterial activities was perfomed using Orange Oil Phase Essence and the blend composed of E. globulus and P. pseudocaryophyllus. These two oils were selected based on the results of Chapter 2 and from the availability of our EO stock. Both oil and blend were checked on the most resistant pathogenic bacterium, E. faecalis, and on the less resistant probiotic bacterium of the Lactobacillus genus, L. rhamnosus, as observed in Chapter 2. The evaluation of Minimal Inhibitory Concentration and Minimal Bactericidal Concentration for Orange Oil Phase Essence and the blend showed that there was not a selective antibacterial effect against E. faecalis and L. rhamnosus. Finally, in Chapter 4, the individual and combined antibacterial activities of E. globulus and P. pseudocaryophyllus essential oils on E. faecalis and L. rhmanosus were evaluated. The results showed that the combination of two EOs evaluated by checkerboard method did not potentiate the selective antibacterial activity of the two EOs. Therefore, it was observed that the E. globulus essential oil alone had the best selective antibacterial activity against E. faecalis and L. rhamnosus. In conclusion, this work enabled the identification of essential oils with selective antibacterial profile that can become possible botanical alternatives to antibiotics used in animal feed.

Submitted by Viviane Lima da Cunha (viviane@biblioteca.ufpb.br) on 2016-03-10T11:02:20Z No. of bitstreams: 1 arquivototal.pdf: 790398 bytes, checksum: b51b766062a2209adeb3bcf5e938d47c (MD5) / Made available in DSpace on 2016-03-10T11:02:20Z (GMT). No. of bitstreams: 1 arquivototal.pdf: 790398 bytes, checksum: b51b766062a2209adeb3bcf5e938d47c (MD5) Previous issue date: 2016-03-09 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / Coalho cheese is a semi-hard cheese typically produced in the Northeast region of Brazil using an enzymatic coagulating agent and mesophilic lactic acid starter cultures. Some physicochemical characteristics of this product, such as low acidity, high moisture and pH, may favor the survival and growth de pathogenic bacteria frequently associated to food outbreaks. Increasing concerns about the safety of cheeses, have led to the development of alternative preservation techniques using naturally derived ingredients as essential oils (EOs) to ensure the microbiological quality of these products. EO from Origanum vulgare L. (oregano – OVEO) has recognized inhibitory effects against pathogenic bacteria associated to cheeses, however, there is a lack of information regarding the effects of OVEO toward lactic acid bacteria used as starter cultures in processing of these products. Considering these aspects, with the present study aimed to evaluate the effects of OVEO on the cell viabilities of strains Staphylococcus aureus and Listeria monocytogenes, well as of strains Lactococcus spp. used in the processing of coalho cheese. These effects were measured by determination of minimum inhibitory concentration (MIC) of OVEO in microdilution in broth and assessing the viability of pathogenic and starter strains in cheese based broth containing OVEO (0.60 μL.mL-1, 1.25 μL.mL-1, 2.5 μL.mL-1 e 5 μL.mL-1) at 37 °C, 24 h and in semi-solid coalho cheese (0.60 μL.g-1, 1.25 μL.g-1 e 2.5 μL.g-1) at 10 °C during 72 h. The major constituents of OVEO, identified by gas chromatography coupled to mass spectrometry GC-MS were carvacrol (69,0%) and thymol (14.12%). MIC of OVEO was 2.5 μL.mL-1 against both S. aureus and L. monocytogenes and 0.6 μL.mL-1 against the tested starter co-culture. Assays in cheese-based broth containing OVEO at 0.6 μL.mL-1 revealed no decrease in viable cell counts of both pathogenic bacteria, while the starter co-culture decreased 1.0 CFU.mL-1 after 24 h of exposure compared with the initial viable counts. OVEO at 1.25 μL.mL-1 and 2.5 μL.mL-1 caused reductions of up to 2.0 log CFU.mL-1 and 2.5 log CFU.mL-1 in S. aureus and L. monocytogenes, respectively. At these same concentrations, OVEO severely affected the cell viability of the starter co-culture following a short period of exposure. Higher concentrations of OVEO were required to decrease the viable cell counts of all target bacteria in the semi-solid coalho cheese model compared to cheese-based broth. Over the assessed time points, viable cell counts of Lactococcus spp. in coalho cheese containing OVEO were lower than those of S. aureus and L. monocytogenes. These results suggest that the concentrations of OVEO used to control pathogenic bacteria in semi-hard cheese could be carefully evaluated because of their possible inhibitory effects on the growth and survival of starter lactic acid culture used during the production of this product. / O queijo de coalho é um queijo semiduro tipicamente produzido na região Nordeste do Brasil, obtido a partir de agentes enzimáticos coagulantes e/ou pelo uso de bactérias ácido láticas. Algumas características físico-químicas deste produto, como baixa acidez, alta umidade e pH, podem favorecer a sobrevivência e/ou crescimento de bactérias patogênicas associados a surtos alimentares. Crescentes preocupações sobre a conservação de queijos, têm direcionado o desenvolvimento de técnicas de conservação a partir da utilização de ingredientes de origem natural, como óleos essenciais (OEs) para garantir a qualidade microbiológica deste produto. OE de Origanum vulgare L. (orégano - OEOV), possui efeito inibitório reconhecido contra diversas bactérias patogênicas associadas a queijos, no entanto, não existem informações sobre o seu efeito frente as bactérias ácido láticas utilizadas como fermentos no processamento desse produto. Considerando estes aspectos, com o presente estudo objetivou-se avaliar os efeitos do OEOV sobre a viabilidade celular de cepas de Staphylococcus aureus e Listeria monocytogenes, bem como de cepas de Lactococcus spp. utilizadas no processamento de queijo de coalho. Estes efeitos foram medidos pela determinação da Concentração Inibitória Mínima (CIM) do OEOV em microdiluição em caldo, avaliação da viabilidade das cepas patogênicas e bactérias ácido láticas em caldo base queijo contendo OEOV (0,60 μL.mL-1, 1,25 μL.mL-1, 2,5 μL.mL-1 e 5 μL.mL-1) a 37 °C por 24 h e em queijo de coalho semissólido (0,60 μL.g-1, 1,25 μL.g-1 e 2,5 μL.g-1) a 10 °C ao longo de 72 h. Os constituintes majoritários do OEOV identificados por Cromatografia Gasosa acoplada a Espectrometria de Massa (CG-MS), foram carvacrol (69,0%) e timol (14,12%). A CIM do OEOV foi de 2,5 μL.mL-1 frente S. aureus e L. monocytogenes e de 0,6 μL.mL-1 frente Lactococcus lactis subsp. lactis e subsp. cremoris em co-cultura. Nos ensaios em caldo base queijo contendo OEOV a 0,60 μL.mL-1, não ocorreu redução na contagem de células viáveis das bactérias patogênicas. Enquanto que observou-se uma diminuição de 1,0 log UFC.mL-1, nas contagens de células viáveis da co-cultura lática em comparação ao inóculo inicial, após 24 h de exposição. O OEOV a 1,25 μL.mL-1 e 2,5 μL.mL-1 causou redução de até 2,0 log UFC.mL-1 e 2,5 log UFC.mL-1 para S. aureus e L. monocytogenes, respectivamente. Nas mesmas concentrações, após um curto período de exposição o OEOV causou redução brusca na contagem de células viáveis da co-cultura lática. Elevadas concentrações do OEOV foram requeridas para a redução na contagem de células viáveis de todas as bactérias no queijo de coalho semissólido comparado com o caldo base queijo. Ao longo dos tempos avaliados, as contagens de células viáveis de Lactococcus spp. no queijo de coalho contendo OEOV foram menores que as contagens de células viáveis de S. aureus e L. monocytogenes. Os resultados sugerem que concentrações de OEOV usado para controlar bactérias patogênicas em queijo de coalho, devem ser cuidadosamente avaliadas, devido aos seus possíveis efeitos inibitórios sobre o crescimento e sobrevivência das bactérias ácido láticas utilizadas no processamento deste produto.

Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de Minas Gerais / The diagnosis of strongyloidiasis is difficult the irregular larval excretion and in most cases, individuals are asymptomatic; detection of latent cases of Strongyloides stercoralis in immunosuppressed may decrease morbidity and mortality. In this sense, the improvement of reliable diagnostic methods is essential. The objective of the study was to compare the release of eggs in the feces by the technique of Egg counts per gram of feces (EPG), coproantigens detection by ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) and amplification bands by conventional (Polymerase Chain Reaction) PCR from feces of non immunosuppressed and immunosuppressed mice experimentally infected with Strongyloides venezuelensis. In the experimental kinetic days 0 and 5, 8, 13, and 21 after infection p.i. were used. Comparing the EPG, coproantigens detection by ELISA and PCR, it was observed in the non immunosuppressed group the release of eggs from the EPG test day on 5 to day 13 p.i, being absent on day 21 p.i. Coproantigen positivity was observed in 33.3% 5 and 8 p.i. and 100% on days 13:21 p.i. and PCR, the presence of amplified bands was observed along the entire kinetics. In immunosuppressed animals, 100% of the released eggs in the feces, the data of the ELISA, 100% of the animals were evaluated in both positive and PCR, the presence of amplified bands during kinetics. It is concluded that detection of coproantigens by ELISA and PCR diagnosis could be useful tools for diagnosis of strongyloidiasis especially in cases of immunosuppression. / O diagnóstico da estrongiloidíase é difícil, pois, a excreção larval é irregular e na maioria dos casos, os indivíduos são assintomáticos; a detecção de casos latentes de Strongyloides stercoralis em imunossuprimidos pode diminuir a morbidade e mortalidade da infecção. Assim, o aprimoramento de métodos confiáveis de diagnóstico são imprescindíveis. O objetivo do estudo foi comparar a liberação de ovos nas fezes pela técnica de Contagem de Ovos por Grama de Fezes (OPG), a detecção de coproantígenos pelo ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) e amplificação de bandas pela Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) convencional de fezes de ratos não imunossuprimidos e imunossuprimidos e experimentalmente infectados por Strongyloides venezuelensis. Na cinética experimental foram utilizados os pontos 0 e 5, 8, 13 e 21 pós-infecção (d.p.i). Para o cálculo dos resultados foram utilizadas porcentagens simples e descrição dos resultados obtidos. Comparando-se o OPG, a detecção de coproantígenos pelo ELISA e a PCR, observou-se no grupo não imunossuprimido a liberação de ovos no teste OPG do dia 5 ao dia 13 p.i, sendo ausente no 21 d. p.i. Para a detecção de coproantígeno observou-se positividade de 33,3% no 5 e 8 d. p.i e de 100% no 13 e 21 d. p.i e na PCR, a presença de bandas amplificadas em todos os dias da cinética. Nos animais imunossuprimidos, 100% liberaram ovos nas fezes, no teste ELISA, 100% dos animais foram positivos e na PCR, a presença de bandas amplificadas em toda a cinética. Concluiu-se que a detecção de coproantígenos pelo ELISA e o diagnóstico por PCR podem ser ferramentas úteis para o diagnóstico em animais não imunossuprimidos e imunossuprimidos. Em comparação ao OPG, a detecção de coproantígenos pelo ELISA e amplificação de bandas pela PCR mostraram mais sensíveis nos dias analisados e podem ser métodos de escolha para diagnóstico da estrongiloidíase principalmente nos casos de imunossupressão. / Mestre em Imunologia e Parasitologia Aplicadas

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Multiple antibiotic resistant Staphylococcus aureus represent a big problem in the control of hospital infections. Resistance pattern of isolated S. aureus presented in central vascular catheter of patients interned in the Intensive Therapy Center of the School Hospital of the Universidade Federal do Triângulo Mineiro was evaluated by antimicrobial tests, in which it was possible to detect high level of resistance to penicillin (94.7%) and ampicillin (86.8%), only considering the samples that presented resistance, beyond one strain that presented resistance to vancomycin. The oxacillin resistance evaluation was confirmed by PCR with the presence of the gene mecA. The association of the results obtained in the phenotypic test with the presence of the gene mecA, considered the reference method, was confirmed through the Table of Contingency and the Test of &#935;2 with Yates correction. In 49 isolates evaluated, 23 were resistant to oxacillin, being possible to detect the mecA gene in 21 samples. The test of molecular screening by RAPD allowed the separation of the phenotypic groups in two different grouping patterns, the ones that presented resistance to antimicrobials and the sensible ones, with a dissimilarity of 73,3%. There is a higher genetic similarity between groups that present the same type of resistance, thus confirming the phenotypic analyses. Molecular markers for detection of resistance to oxacillin, like the gene mecA, were more sensitive than the phenotypic markers. / Staphylococcus aureus resistentes a múltiplos antibióticos representam um grande problema no controle das infecções hospitalares. O perfil de resistência a antimicrobianos de isolados de S. aureus presentes em cateteres vasculares central de pacientes internados em leitos do centro de terapia intensiva do Hospital Escola da Universidade Federal do Triângulo Mineiro foi avaliado por meio de testes antimicrobianos, pelos quais foi possível detectar um elevado nível de resistência à penicilina (94,7%) e ampicilina (86,8%), considerando-se somente as amostras que possuíam resistência, além de uma cepa resistente à vancomicina. A avaliação da resistência à oxacilina foi confirmada por PCR através da presença do gene mecA. A associação dos resultados obtidos no teste fenotípico com a presença do gene mecA, considerado um método de referência, foi confirmada através da Tabela de Contingência e do Teste de &#935;2 com correção de Yates. Em 49 amostras avaliadas, 23 apresentaram resistência à oxacilina, sendo possível detectar a presença do gene de resistência mecA em 21 amostras. O teste de tipagem molecular por RAPD permitiu a separação dos grupos fenotípicos em dois padrões diferentes de agrupamento, os que possuíam resistência e os sensíveis aos antimicrobianos, com uma dissimilaridade de 73,3%. Há maior similaridade genética entre grupos que apresentam o mesmo tipo de resistência, confirmando assim as análises fenotípicas. Marcadores moleculares para detecção de resistência à oxacilina, como o gene mecA, foram mais sensíveis que os marcadores fenotípicos. / Mestre em Genética e Bioquímica

Made available in DSpace on 2017-07-10T18:01:57Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Edela M dos Santos Boufleuer.pdf: 1243031 bytes, checksum: 7e08e3f33bb967a1e04093cb724e3762 (MD5) Previous issue date: 2015-08-13 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The work aimed to characterize the bacterial diversity and profile of antimicrobial resistance in fish breeding with different densities. Water samples were collected in four points (amount, input, output, and downstream) of nurseries of three fish breeding, each composed of a different stocking density (4 fish by squared meter, 8 fish by squared meter, 10 fish by squared meter). The parameters analized to determine water quality were dissolved oxygen, temperature, water pH, electrical conductivity, phosphorus, ammonia, biochemical oxygen demand, chemical oxygen demand and organic matter. Heterotrophic mesophilic bacteria were isolated as well as their total amount was determined. Subsequently, the identification of isolated species was carried out and then subject ted to qualitative analysis of front resistance profile to seven commercial antibiotics. The set of physical and chemical variables were summarized in three main components by main component analysis. In the first main component (ammonia, phosphorus, organic matter, water temperature and dissolved oxygen), there was a greater amount in the breeding ground than what was expected, where as the dissolved oxygen was higher than downstream. The second main substance (nitrite) showed a difference if compared to the inside of the breeding grounds, being higher than downstream. The interaction between breeding sites and densities, as well as the main density effect were not significant in the first two components. The third component (electrical conductivity) varied significantly between the sites, making it possible to notice that the amount was lower, and it experienced a signify cant raise inside the breeding ground sand went on to an intermediate value downstream. Concerning the values of density, it was possible to realize that the electrical conductivity was higher in the tanks which had the highest concentration of fish. From the 407 that were isolated, 55 bacterial species were recognized and identified, being part of eleven different families. The Enterobacteriaceae family was the one that prevailed among the evaluated densities, followed by Alcaligenaceae. The stocking density of 4 fish by squared meter presented significant statistical differences, with lower frequence of families. A great amount of resistant bacteria was observed, and their resistance was mainly to ampicillin and erythromycin, while fewer than 15% of the isolated were resistant to chloramphenicol and gentamicin. Among the isolated that were analyzed, 96% showed multiple antimicrobial resistance index higher or equal 0,2. The intensification of systems promoted the increase of bacteria concentration, there wasn't relation to the physical and chemical variables was identified a variety of bacterial species and there was high rate of resistance and multidrug resistance to antimicrobials tested. / O trabalho teve o objetivo de caracterizar a diversidade bacteriana e o perfil de resistência a antimicrobianos em pisciculturas com diferentes densidades. Foram coletadas amostras de água em quatro pontos (montante, entrada, saída e jusante) de viveiros de três pisciculturas, cada uma composta por uma densidade de estocagem diferente (4 peixes/m2, 8 peixes/m2 e 10 peixes/m2). Os parâmetros analisados para qualidade da água foram oxigênio dissolvido, temperatura, pH, condutividade elétrica, pH, fósforo, amônia, demanda bioquímica de oxigênio (DBO), demanda química de oxigênio (DQO e matéria orgânica. Também foram isolados e feito a contagem total de bactérias mesófilas heterotróficas. Posteriormente, foi realizada a identificação das espécies isoladas, em seguida submetidas a análise qualitativa do perfil de resistência frente a sete antibióticos comercial. O conjunto de variáveis físicas e químicas foi sumarizado em 3 componentes principais pela análise de componentes principais (ACP). No primeiro componente principal (amônia, fósforo, matéria orgânica e temperatura da água e oxigênio dissolvido) foi identificado valores superiores dentro do viveiro, ao passo que o oxigênio dissolvido foi superior a jusante. O segundo componente principal (nitrito), apresentou diferença em relação ao interior dos viveiros, sendo superior a jusante. Interação entre locais e densidade, bem como efeito principal da densidade não foram significativos no dois primeiros componentes. Já o terceiro componente (condutividade elétrica) variou significativamente entre os locais, observando que foi inferior a montante, sofreu uma elevação significativa no interior dos viveiros e passou a um valor intermediário a jusante. Para as densidades, a condutividade elétrica foi superior nos tanques que apresentaram maiores concentrações de peixes. Dos 407 isolados, identificou-se 55 espécies bacterianas pertencentes a 11 famílias distintas. A família Enterobacteriaceae foi a que predominou dentre as densidades avaliadas, seguida da alcaligenaceae. A densidade de estocagem 4 peixes/m2 apresentou diferenças estatísticas significativa, com menor freqüência de famílias. Observou-se elevado número de bactérias resistentes principalmente à ampicilina e eritromicina, enquanto que menos de 15% dos isolados foram resistentes a gentamicina e cloranfenicol. Dentre os isolados analisados, 96% apresentaram índice de múltipla resistência a antimicrobianos (MAR) maior ou igual a 0,2. A intensificação dos sistemas promoveu o aumento da concentração bacterias, sem relação com as variáveis físicas e químicas, foi identificado uma diversidade de espécies bacterianas e houve alto índice de resistência e multirresistência aos antimicrobianos testados.

Intimina é o principal fator de virulência envolvido na patogênese de Escherichia coli enteropatogênica (EPEC) e de Escherichia coli enterohemorrágica (EHEC). A detecção de EHEC e EPEC típica ou atípica é de fundamental importância na definição da conduta terapêutica das infecções promovidas por E. coli, que ainda são a principal causa de diarreia aguda em crianças e adultos em muitos países desenvolvidos e em desenvolvimento. Anticorpos são ferramentas importantes na detecção de diversos patógenos. Neste trabalho avaliou-se a sensibilidade e especificidade dos anticorpos policlonal e monoclonal anti-intimina frente a isolados de EPEC e EHEC por immunoblotting. Os anticorpos apresentaram 100% de especificidade e a sensibilidade foi de 97%, 92% e 78%, quando se utilizou a fração enriquecida em IgG do soro de coelho, antissoro de rato e anticorpo monoclonal, respectivamente. Esse anticorpo monoclonal anti-intimina foi caracterizado como IgG2b e 1 &#181;g desse anticorpo reconheceu 0,6 &#181;g de intimina purificada com uma constante de dissociação de 1.3 x 10-8 M. A menor reatividade do anticorpo monoclonal em relação aos anticorpos policlonais levou-nos à clonagem e expressão do fragmento variável de cadeia simples desse anticorpo (scFv). Para isso, o mRNA do hibridoma anti-intimina foi extraído, reversamente transcrito para cDNA e amplificadas as cadeias leve e pesada da fração variável do anticorpo, utilizando iniciadores aleatórios comerciais. As cadeias amplificadas foram ligadas ao vetor pGEM-T Easy e sequenciadas. Iniciadores específicos foram desenhados e utilizados em uma estratégia de amplificação e união das cadeias, formando o scFv, que por sua vez foi clonado no vetor de expressão pAE. Linhagem de E. coli BL21(DE3)pLys foi transformada com o plasmídeo pAE-scFv antiintimina e submetida à indução protéica. O scFv anti-intimina foi expresso de forma insolúvel, solubilizado, purificado e submetido ao ensaio de refolding. O rendimento obtido foi de 1 mg de proteína por 100 mL de cultivo bacteriano. Para testar a funcionalidade do scFv, foram realizados ensaios de ELISA de captura e imunofluorescência. Os resultados mostraram que 275 ng de scFv reagiram com 2 &#181;g de intimina purificada a uma absorbância de aproximadamente 0,75 e por imunofluorescência mostrou uma forte reatividade ao isolado de EPEC típica E2348/69. Este estudo demonstrou que o anticorpo recombinante anti-intimina obtido foi capaz de reconhecer a região conservada de intimina (Int388-667) na forma purificada e a intimina &#945; no isolado de EPEC típica, e se mostrou mais eficiente que o anticorpo monoclonal nativo. / Intimin is the major virulence factor involved in the pathogenesis of enteropathogenic Escherichia coli (EPEC) and enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC). The detection of EHEC and typical or atypical EPEC has fundamental importance in defining the therapeutic management of infections caused by E. coli, which are still the leading cause of acute diarrhea in children and adults in many developed and developing countries. Antibodies are important tools in the detection of several pathogens. In this study it was evaluated the sensitivity and specificity of polyclonal and monoclonal antibodies against intimin in the detection of EPEC and EHEC by immunoblotting. All employed antibodies showed 100% specificity and the sensitivity was 97%, 92% and 78% for rabbit anti-intimin IgG-enriched fraction, rat antisera and monoclonal antibody, respectively. This anti-intimin monoclonal was characterized as IgG2b and 1 mg recognized 0.6 &#181;g of purified intimin with a dissociation constant of 1.3 x 10-8 M. The less extent reactivity of monoclonal led us to clone and express the single chain fragment variable of this antibody (scFv). Thus, the anti-intimin hybridoma mRNA was extracted, reverse transcribed to cDNA and the light and heavy chains of variable fragment of the antibody were amplified using commercial random primers. The chains were amplified, ligated to the pGEM-T Easy vector and the insert was sequenced. Specific primers were designed and used in a strategy to amplify and link the chains, obtaining the scFv, which was cloned into the pAE expression vector. E. coli BL21(DE3)plys was transformed with the pAE-scFv anti-intimin plasmid and subjected to induction of protein expression. The scFv anti-intimin, expressed in the insoluble fraction, was purified and submitted to refolding. The yield was 1 mg of protein per 100 mL of bacterial culture. To test the functionality of the scFv, ELISA and immunofluorescence assays were performed. The results showed that 275 ng of scFv reacted with 2 &#181;g of purified intimin resulting in an absorbance of 0.75. By immunofluorescence it was observed a strong reactivity to the typical EPEC isolate E2348/69. This study demonstrated that the recombinant anti-intimin antibody obtained was able to recognize the conserved region of intimin (Int388-667) in its purified form and &#945; intimin in a typical EPEC isolate, and was more efficient than the native monoclonal antibody.