Dissertação (Mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas. / Made available in DSpace on 2012-10-19T00:33:22Z (GMT). No. of bitstreams: 0Bitstream added on 2016-01-09T02:23:12Z : No. of bitstreams: 1 141780.pdf: 27346406 bytes, checksum: 3727318a87d158a4b2e3cfadaece069e (MD5)

O melanoma malígno está entre os cânceres que mais têm aumentado nas últimas décadas representando um grande desafio terapêutico. Quando diagnosticado precocemente, as chances de cura por excisão cirúrgica com margens de segurança adequadas são altas. Entretanto, casos avançados de melanoma são resistentes às formas atuais de terapia; assim, um dos maiores desafios para a pesquisa em melanoma é a identificação de alvos moleculares para o desenvolvimento de novas estratégias de tratamento. A capacidade de impedir o desenvolvimento de um tumor depende do melhor entendimento das vias celulares e moleculares que operam no microambiente tumoral. Uma inflamação crônica e persistente contribui para o desenvolvimento do câncer, e mesmo tumores que não são epidemiologicamente ligados a patógenos, são caracterizados pela presença de componentes inflamatórios em seu microambiente. O Sistema Calicreínas-Cininas (SCC) é responsável por uma série de efeitos biológicos, como vasodilatação, modulação da dor e inflamação, contração/relaxamento da musculatura lisa e efeitos sobre a proliferação celular. A participação do receptor B1 de cininas é bem relacionada a processos inflamatórios; contudo, a relação entre o SCC e câncer ainda é pouco descrita na literatura. Com relação ao melanoma, não existem na literatura, estudos que relacionam a participação do SCC e essa patologia. Portanto, a identificação de mecanismos genéticos e de vias de sinalização que levam à formação e progressão tumoral é de extrema importância para um desenho racional de terapias. Assim, o objetivo desse trabalho foi estudar a participação do receptor B1 de cininas no desenvolvimento de melanoma. Primeiramente realizou-se ensaios in vitro com células de melanoma murino, B16F10, verificando-se a presença dos componentes do SCC nesta linhagem celular, bem como a capacidade de migração das células quando estimuladas com o agonista e antagonista do receptor B1. Posteriormente, induziu-se melanoma em animais selvagens e knockout para o receptor B1 e verificou-se expressão de citocinas, vias de proliferação e apoptose e vascularização nesses tumores a partir técnicas de PCR, western blotting e análise histológica. Observou-se que células B16F10 estimuladas com o agonista do receptor B1, diminuem a capacidade de migração. Tumores desenvolvidos em animais knockout para o receptor B1, possuem uma menor expressão gênica desse receptor quando comparados com tumores desenvolvidos em animais selvagens e apresentam vias de proliferação celular mais ativadas, além de uma vascularização irregular. Considerando esses resultados, sugerimos que o receptor B1 de cininas contribui para o impedimento da progressão tumoral, podendo, futuramente, ser um alvo terapêutico para o tratamento de melanoma. / Malignant melanoma is between the cancer types that most have been increased in the last decades, representing a therapeutic challenge. When it is early detected, chances of cure through surgical excisions with secure margins are high. However, advanced cases of melanoma are resistant to all types of therapies; thus, one of the most challenges for research in melanoma is the identification of molecular targets to further develop new strategies of treatment. The ability to blockade the development of a tumor depends on a better understanding of cellular and molecular pathways that operate in the tumor microenvironment. A chronic and persistent inflammation contributes to cancer development, and, even tumors that are not epidemiologically linked to pathogens present inflammatory components in their microenvironment. The Kallicrein-Kinin System (KKS) is responsible for several biological effects, like, vasodilatation, modulation of pain and inflammation, contraction/relaxation of smooth muscles and cell proliferation. The kinin B1 receptor is well related to inflammatory processes, however, the involvement of the KKS in cancer development is, yet, not well described in the literature. Regarding to melanoma, studies relating the involvement of the KKS in melanoma development is still not available. This way, identification of genetic mechanisms and signaling pathways that drive melanoma formation and progression is extremely important for designing rational therapies in the future. Thus, the aim of this study was evaluate the participation of the kinin B1 receptor in melanoma progression. First, in vitro assays with murine melanoma cells, B16F10, were performed to verify the presence of the KKS components in this cell lineage, as well as the capacity of migration when these cells are stimulated with the B1 receptor agonist and antagonist. Then, melanoma was induced in wild type and B1 receptor knockout mice and the expression of cytokines, proliferation and apoptosis pathways and vascularization were studied by PCR, western blotting and histological analyses. We observed that B16F10 cells stimulated with the B1 receptor agonist had their capacity of migration decreased. Tumors developed in B1 receptor knockout mice showed a lower expression of this gene comparing to the tumors developed in wild type animals, also presenting higher activation of proliferation pathways and abnormal vessels. Considering these results, we suggest that the kinin B1 receptor contributes to blockade, at least in part, the tumor progression which can, in the future, become a therapeutic target for melanoma treatment.

O objetivo deste estudo foi avaliar se a infusão de angiotensina II (ANG II) modulava a expressão do receptor B1 (RB1) de cininas em aorta (AO),arteríolas mesentéricas (AM) de ratos Wistar e também verificar a influência do RB1 na pressão arterial e reatividade desses vasos sanguíneos através do agonista de RB1, DABK. Os ratos receberam por 28 dias infusão de ANG II ou de ANG II e antagonista de RB1. O DABK induziu relaxamento dependente de endotélio e NO em anéis de AO de ratos ANG II. A infusão de ANG II causou hipertensão arterial, aumento da expressão de RNAm de RB1 em AO e AM, da expressão protéica de RB1 em AO e disfunção endotelial caracterizada por diminuída resposta á acetilcolina (ACH).O antagonista de B1R não interferiu no desenvolvimento de hipertensão e na disfunção endotelial causada, mas aumentou a sensibilidade da AO à ACH e a expressão de NO Sintase nos ratos ANG II. Esses resultados nos permitem sugerir que a ANG II e cininas podem atuar sinergicamente no desenvolvimento das alterações vasculares observadas nesse modelo de hipertensão arterial. / The aim of the present study was to evaluate whether the angiotensin II (ANG II) infusion modulates the kinin B1 receptor (B1R) mRNA, protein expression in aorta (AO) and mesenteric arterioles (MA) in Wistar rats. It was also verified the role of RB1 in the control of blood pressure and vascular reactivity using DABK a B1R agonist Rats were infused either with ANG II (400ng/Kg/min) or ANG II plus RB1antagonist(350ng/Kg/min) during 28 days.DABK induced endothelium-NO dependent relaxation in AO of ANG II rats. ANG II infusion caused hypertension, increased RB1 mRNA expression in AO and MA, protein expression in AO and caused endothelial dysfunction, characterized as a decreased maximal response to acetylcholine (ACH). The B1R antagonist did not interfere in the development of hypertension and endothelium dysfunction caused by ANG II, however, increased the sensitivity to ACH and NO synthase expression in AO of ANG II rats. Altogether, we may suggest that ANG II and kinins can act synergistically in the development of vascular changes in this model of hypertension.

Made available in DSpace on 2015-04-14T13:35:28Z (GMT). No. of bitstreams: 1 437983.pdf: 3242745 bytes, checksum: 9b67fa711fdfe3bdd518bb49b3f07fc0 (MD5) Previous issue date: 2012-03-19 / This study was designed to characterize, by means of functional and molecular approaches, the relevance of kinin B1 and B2 receptors in bladder cancer. Our data clearly shows that both B1 des-Arg9-BK and B2 BK receptor agonists were able to stimulate the proliferation of the grade 3-derived bladder cancer T24 cells. Furthermore, the incubation of B1 and B2 receptor antagonists, SSR240612 and HOE140, respectively, markedly inhibited the proliferation rate of T24 cells. In contrast, only higher concentrations of BK elicited the proliferation of the grade 1 bladder cancer cell line RT4, while des-Arg9-BK incubation completely failed to induce its proliferation. Interestingly, real time PCR experiments revealed that mRNA expression of B2, and mainly B1 receptors was found superior in T24 cells, in comparison to the low malignity grade RT4 cells. Furthermore, data obtained using bladder cancer human biopsies revealed that B1 receptor expression was visibly increased in all tumoral samples or under chronic inflammation of bladder. Concerning the signaling pathways related to the mitogenic effects of kinins, we bring novel evidence showing that pharmacological inhibition of PI3Kg with AS252424 concentration-dependently reduced T24 cell proliferation induced by BK or des-Arg9-BK. Finally, the incubation of T24 cells with kinin agonists led to a marked activation of PI3K/AKT and ERK 1/2 signaling pathways, whereas p38 MAP kinase remained unaffected. Our results indicate that kinin B2, and especially B1 receptors appear to be implicated in bladder cancer progression. It is tempting to suggest that selective kinin antagonists might represent potential therapeutic alternatives for bladder cancer control. / O presente estudo teve por objetivo caracterizar, atrav?s de abordagens funcionais e moleculares, a relev?ncia dos receptores B1 e B2 para as cininas no c?ncer de bexiga. Os dados obtidos mostraram que tanto o agonista dos receptores B1, des- Arg9-BK, quanto do receptor B2, BK, foram capazes de estimular a prolifera??o das c?lulas de c?ncer de bexiga grau 3, denominadas T24. Al?m disso, a incuba??o dos antagonistas dos receptores B1 e B2, SSR240612 e HOE140, respectivamente, inibiram acentuadamente a prolifera??o das c?lulas T24. Por outro lado, apenas maiores concentra??es de BK levaram ? prolifera??o das c?lulas de c?ncer de bexiga grau 1 RT4; enquanto a incuba??o com des-Arg9-BK n?o induziu sua prolifera??o. De maneira similar, os resultados revelaram que a express?o de mRNA dos receptores B2 e, principalmente, dos receptores B1 foi superior em c?lulas T24, em compara??o com as c?lulas RT4, que apresentam baixo grau de malignidade. Al?m disso, os dados obtidos com bi?psias de c?ncer de bexiga humano revelaram que a express?o do receptor B1 foi claramente maior em todas as amostras tumorais ou, em uma bi?psia obtida de um quadro de inflama??o cr?nica de bexiga. Em rela??o ?s vias de sinaliza??o relacionadas com os efeitos mitog?nicos das cininas, os dados obtidos mostram que a inibi??o farmacol?gica da PI3Kg com AS252424 reduziu de maneira concentra??o-dependente a prolifera??o das c?lulas T24, quando est? foi induzida por BK ou des-Arg9-BK. Finalmente, a incuba??o das c?lulas T24 com agonistas dos receptores de cininas produziu uma acentuada ativa??o das vias de sinaliza??o PI3K/AKT e ERK 1/2, enquanto a via p38 MAP quinase permaneceu inalterada. Nossos resultados indicam que os receptores de cininas B2 e, especialmente, os receptores B1 parecem estar associados com a progress?o do c?ncer de bexiga. Dessa forma, ? poss?vel sugerir que antagonistas seletivos de receptores de cininas poderiam representar alternativas terap?uticas interessantes para o controle do c?ncer de bexiga.

Made available in DSpace on 2015-07-22T20:50:22Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2011-09-28. Added 1 bitstream(s) on 2015-08-11T03:26:13Z : No. of bitstreams: 1 Publico-12890a.pdf: 1928691 bytes, checksum: e1cbc3ab85af6e4bc90c10550766fe7d (MD5). Added 1 bitstream(s) on 2015-08-11T03:26:13Z : No. of bitstreams: 2 Publico-12890a.pdf: 1928691 bytes, checksum: e1cbc3ab85af6e4bc90c10550766fe7d (MD5) Publico-12890b.pdf: 1540336 bytes, checksum: 7786d4d28a3b5762f4bd7f7137c3c3c0 (MD5) / A ativacao de receptores B1 de cininas no endotelio vascular desencadeia vias de sinalizacao que resultam na elevacao do Ca+2 intracelular e ativacao da enzima oxido nitrico sintase (NOS), seguido por producao de NO e vasodilatacao. Embora a inducao do receptor B1 e sua funcao durante a inflamacao tenha sido abordada por diversos estudos, a importancia de receptores B1 na homeostase vascular em condicoes fisiologicas nao esta totalmente elucidada. Para esclarecer essa questao, o presente estudo analisou a funcao endotelial e a producao de NO em camundongos nocaute do receptor B1 (B1 -/-) e selvagens (WT). O leito arteriolar mesenterico foi perfundido por solucao Krebs e respostas vasculares para Acetil-colina (ACh), nitroprussiato de sodio (SNP) e norepinefrina (NE) foram analisadas por um sistema de aquisicao de dados. Niveis plasmaticos de NO (ƒÊmol/L) foram analisados por deteccao dos derivados nitritos/nitratos atraves de metodo de quimioluminescencia e a producao vascular de NO foi avaliada em cortes histologicos de arteriolas mesentericas incubadas com DAF-2 DA, um marcador fluorescente de NO (unidades arbitrarias, u.a.). A atividade da NOS (pmol/mg.min) foi mensurada atraves da conversao bioquimica de L-[3H]arginina para L-[3H]citrulina em homogenatos de vasos mesentericos na presenca de substrato e co-fatores. Celulas endoteliais primarias foram incubadas com DAF-2 DA e as imagens obtidas em microscopio confocal foram analisadas por densitometria optica (u.a.). Celulas foram estimuladas com ACh [1 mmol/L] na presenca ou ausencia de Larginina, o substrato da NOS, ou tetrahidrobiopterina (BH4), co-fator da NOS, ou acido ascorbico, composto antioxidante. Producao de anion superoxido (u.a.) foi avaliada em celulas endoteliais incubadas com di-hidroetidina, um marcador fluorescente de anion superoxido, na presenca ou ausencia de BH4 ou acido ascorbico. Arteriolas mesentericas de B1 -/- exibiram severo comprometimento da vasodilatacao mediada por ACh, sem alteracoes na resposta ao NPS e NE. Os niveis circulantes de NO foram consideravelmente reduzidos em B1 -/- (49,6 } 10,5*; n=6) vs WT (141,9 } 17,3; n=6 ), acompanhado por reducao da producao basal de NO em arteriolas mesentericas de B1 -/- (0,16 } 0,03*; n=6) quando comparado a WT (0,58 } 0,08; n=4). A atividade da NOS foi elevada em amostras de B1 -/- (3,4 } 0,58*; n=4) em comparacao a WT (1,9 } 0,05; n=5). A producao de NO mediada por ACh foi significantemente reduzida em celulas endoteliais de B1 -/- (35,8 } 3,1*; n=4) quando comparado a celulas de WT (66,9 } 3,2; n=4). A producao de NO em celulas endoteliais de B1 -/- foi revertida por incubacao com BH4 (54,3 } 1,7; n=4) e acido ascorbico (101,8 } 6,0; n=4), mas nao por L-arginina, enquanto incubacao de celulas endoteliais de WT com BH4, acido ascorbico ou L-arginina nao teve efeito. A producao elevada de anion superoxido em celulas endoteliais de B1 -/- (77,1 } 2,5*; n=4) quando comparado a WT (29,3 } 6,9; n=4) foi revertida pela incubacao com acido ascorbico (35,3 } 6,4; n=3). O severo comprometimento da vasodilatacao mediada pelo endotelio acompanhado por reducao da biodisponibilidade de NO, apesar do aumento da atividade da NOS, sugere a exacerbacao da inativacao de NO em endotelio de B1 -/-. A producao elevada de anion superoxido em endotelio de B1 -/- provavelmente e responsavel pela exacerbacao da inativacao de NO nestes animais. Adicionalmente, a inativacao de BH4 por peroxinitrito pode acarretar em desacoplamento da NOS e producao de anion superoxido pela enzima. / Activation of B1 receptor in the vascular endothelium triggers diverse signaling pathways that results in elevation of intracellular Ca2+ and Nitric Oxide Synthase (NOS) activation, followed by NO production and vasodilation. Although much has been investigated about the B1-induction and functionality during inflammation, the importance of B1 subtype in normal vessels remains unclear. To clarify this question, the present study analyzed endothelial function and endothelial NO generation in B1 receptor knockout (B1 -/-) and Wild Type (WT) mice. Mesenteric arteriolar bed was perfused with Krebs solution and vascular responses to Acetilcholine (ACh), sodium nitroprusside (SNP) and norepinephrine (NE) were evaluated by a data acquisition system. Plasmatic NO levels (μmol/L) were analyzed by NO derivatives nitrate and nitrite using NO Analyzer (NOATM280, Sievers Instruments) and vascular NO generation was assessed in mesenteric arterioles slices using DAF -2 DA, a fluorescent cell permeable dye for NO (arbitrary units, a.u.). NOS activity (pmol/mg.min) was measured by the biochemical conversion of L-[3H] arginine to L-[3H] citrulline in homogenates of mesenteric vessels in the presence of optimal levels of substrate and co-factors. Primary endothelial cells were incubated with DAF-2 DA and images obtained in a confocal microscope were analyzed by optic densitometry (a.u.). Cells were stimulated with ACh [1 mmol/L] in presence or absence of the NOS substrate Larginine, or the co-factor tetrahydrobiopterin (BH4), or the antioxidant compound ascorbic acid. Production of superoxide anion (a.u.) was assessed in endothelial cells incubated with dihydroethidine, a fluorescent cell permeable dye for superoxide anion, in the presence or absence of BH4 or ascorbic acid. Mesenteric arterioles from B1 -/- exhibited a severe impairment of ACh-vasodilation for all tested doses, with no changes in the response to SNP and NE. Circulating NO was markedly decreased in B1 -/- (49.6 ± 10.5*; n=6) vs WT (141.9 ± 17.3; n=6 ), accompanied by reduced basal NO release in mesenteric arterioles from B1 -/- (0.16 ± 0.03*; n=6) when compared to WT (0.58 ± 0.08; n=4). NOS activity was elevated in mesenteric homogenates from B1 -/- (3.4 ± 0.58*; n=4) in comparison to WT (1.9 ± 0.05; n=5). ACh-induced NO release was markedly reduced in primary cultured endothelial cells from B1 -/- (35.8 ± 3.1*; n=4) in comparison to WT cells (66.9 ± 3.2; n=4). NO release in endothelial cells from B1 -/- was reversed by incubation with BH4 (54.3 ± 1.7; n=4) and ascorbic acid (101.8 ± 6.0; n=4), but not by L-arginine, while incubation of endothelial cells from WT with BH4, ascorbic acid or L-arginine had no effect. Elevated production of superoxide anion in endothelial cells from B1 -/- (77,1 ± 2,5*; n=4) in comparison to WT (29,3 ± 6,9; n=4) was reversed by incubation with ascorbic acid (35,3 ± 6,4; n=3). The severe impairment in the endothelial-mediated vasodilation accompanied by decreased NO bioavailability, despite the augmented NOS activity, strongly indicates an exacerbation of NO inactivation. Reduced NO availability may be preceded by exacerbation of NO inactivation by superoxide anion, which can leads to inactivation of BH4 in vascular endothelium, resulting in NOS uncoupling and NOS derived production of superoxide anion. / TEDE

O objetivo deste estudo foi avaliar se a infusão de angiotensina II (ANG II) modulava a expressão do receptor B1 (RB1) de cininas em aorta (AO),arteríolas mesentéricas (AM) de ratos Wistar e também verificar a influência do RB1 na pressão arterial e reatividade desses vasos sanguíneos através do agonista de RB1, DABK. Os ratos receberam por 28 dias infusão de ANG II ou de ANG II e antagonista de RB1. O DABK induziu relaxamento dependente de endotélio e NO em anéis de AO de ratos ANG II. A infusão de ANG II causou hipertensão arterial, aumento da expressão de RNAm de RB1 em AO e AM, da expressão protéica de RB1 em AO e disfunção endotelial caracterizada por diminuída resposta á acetilcolina (ACH).O antagonista de B1R não interferiu no desenvolvimento de hipertensão e na disfunção endotelial causada, mas aumentou a sensibilidade da AO à ACH e a expressão de NO Sintase nos ratos ANG II. Esses resultados nos permitem sugerir que a ANG II e cininas podem atuar sinergicamente no desenvolvimento das alterações vasculares observadas nesse modelo de hipertensão arterial. / The aim of the present study was to evaluate whether the angiotensin II (ANG II) infusion modulates the kinin B1 receptor (B1R) mRNA, protein expression in aorta (AO) and mesenteric arterioles (MA) in Wistar rats. It was also verified the role of RB1 in the control of blood pressure and vascular reactivity using DABK a B1R agonist Rats were infused either with ANG II (400ng/Kg/min) or ANG II plus RB1antagonist(350ng/Kg/min) during 28 days.DABK induced endothelium-NO dependent relaxation in AO of ANG II rats. ANG II infusion caused hypertension, increased RB1 mRNA expression in AO and MA, protein expression in AO and caused endothelial dysfunction, characterized as a decreased maximal response to acetylcholine (ACH). The B1R antagonist did not interfere in the development of hypertension and endothelium dysfunction caused by ANG II, however, increased the sensitivity to ACH and NO synthase expression in AO of ANG II rats. Altogether, we may suggest that ANG II and kinins can act synergistically in the development of vascular changes in this model of hypertension.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Gout, or gouty arthritis, has been associated of a range of comorbidities as hypertension and kidney diseases. Some studies have indicated that certain antihypertensive drugs, such as angiotensin I-converting enzyme inhibitors (ACEi), increase the risk of gout. Notably, ACEi block the metabolism of several peptides, in particular bradykinin hydrolysis. Bradykinin is also a substrate for kininase I, which forms des-Arg-kinin B1R agonists. Therefore, ACE inhibition can activate the B1R pathway. Moreover, ACEi are allosteric enhancers of kinin receptors and B1R are linked to inflammatory cardiovascular diseases. However, despite the body of evidence demonstrating a clear contribution of the kinin system to the pathogenesis of some arthritic conditions, the role of the kinin B1 receptor in monosodium urate (MSU) crystals crystal-induced gout is currently unknown, especially in respect to ACEi. Thus, the aim of the present study was to verify the role of the bradykinin B1 receptors and the effect of ACEi on acute gout induced by MSU crystals in rodents. Painful (overt pain and allodynia) and inflammatory parameters (joint edema, leukocyte trafficking, interleukin-1β levels) of acute gout attacks were assessed several hours after intra-articular (IA) injection of MSU (1.25 or 0.5 mg/articulation) in the ankle of rats or mice, respectively. The role of B1R was investigated by pharmacological antagonism or gene deletion. In addition, B1R immunoreactivity on ankle tissue and sensory neurons, kininase I activity and des-Arg9-bradykinin synovial levels were also measured. Similar tools were used to investigate the effects of ACEi on low dose of MSU (0.0125 mg/articulation)-induced inflammation. Bouth, bradykinin B1R antagonism or gene deletion largely reduced all painful and inflammatory signs of gout. Furthermore, MSU increased not only the B1R expression in articular tissues, but also the content of the B1 agonist des-Arg9-bradykinin and the activity of the B1 agonist-forming enzyme kininase I. Finally, low dose of MSU crystals (which did not induced inflammation in control animals) was capable of causing signs of acute gout attacks in ACEi-treated animals, which was B1R-dependent. Concluding, bradykinin B1R activation contributes to acute gouty attacks, including the ones facilitated by ACEi. Thus, B1R is a potential therapeutic target for treatment and prophylaxis of gout, especially in patients taking ACEi. / A gota, ou artrite gotosa, está associada à ocorrência de diversas comorbidades como doenças renais e cardiovasculares. Alguns dos fármacos utilizados para o tratamento destas comorbidades podem ainda precipitar ataques agudos de gota. Um exemplo são os inibidores da enzima cininase II ou enzima conversora de angiotensina (iECA). Muitos dos efeitos cardioprotetores dos iECA são mediados pelos receptores B1 para cininas. Além disso, a inibição da ECA é capaz de bloquear a hidrólise da bradicinina, que por sua vez é também um substrato para a formação do agonista do receptor B1, des-Arg9-bradicinina, pela ação da enzima cininase I. Apesar dos estudos demonstrando o envolvimento do sistema das cininas na gota e do papel do receptor B1 na iniciação e manutenção da inflamação, não se conhece a relação do receptor B1 com a gota, especialmente durante a inibição da ECA. Assim, o presente estudo tem por objetivo verificar o papel do receptor B1 para cininas durante o ataque agudo de gota induzido por cristais de urato monossódico (MSU) em roedores, incluindo aqueles tratados com iECA. Para isso, a dor (alodínia ao toque e comportamento doloroso espontâneo) e alguns parâmetros inflamatórios (edema articular, concentração de proteínas, infiltração leucocitária, avaliação da cinética de leucócitos e níveis de interleucina-1β) causados pelo ataque agudo de gota foram avaliados em diferentes tempos após a injeção intra-articular (IA) de uma alta dose de MSU no tornozelo de roedores. O papel do receptor B1 foi investigado através de seu antagonismo farmacológico, pela utilização de roedores com deleção gênica do receptor e pela inibição da enzima cininase I. Ainda, a expressão do receptor B1 no tecido do tornozelo e neurônios sensoriais, atividade da enzima cininase I e os níveis de des-Arg9-bradicinina foram analisados no fluido sinovial dos roedores submetidos ao modelo de gota. Ferramentas semelhantes foram utilizadas para a investigação do envolvimento dos receptores B1 na inflamação causadas pela inibição da ECA em animais submetidos a injeção IA de uma baixa dose de MSU, que não apresentava efeito per se. Tanto o uso de antagonistas do receptor B1, como sua deleção gênica, foram capazes de reduzir a inflamação neste modelo de gota. Além disso, o MSU causou um aumento na expressão de receptores B1 na articulação, e também um aumento dos níveis do agonista B1, des-Arg9-bradicinina e da atividade da enzima cininase I. Por último, a baixa dose de MSU foi capaz de causar um ataque agudo de gota em animais pré-tratados com iECA, por um mecanismo que envolve a ativação de receptores B1. Concluímos que a ativação do receptor B1 contribui para o desenvolvimento do ataque agudo de gota, incluindo aqueles que são precipitados pelo tratamento com iECA. Assim, o B1 apresenta um potencial terapêutico para o tratamento e profilaxia da gota, especialmente em indivíduos que fazem uso de iECA.

Made available in DSpace on 2015-07-22T20:50:00Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2006-06-28. Added 1 bitstream(s) on 2015-08-11T03:25:41Z : No. of bitstreams: 1 Publico-091.pdf: 651136 bytes, checksum: 35401eae81afb55be34c6f47a332e47e (MD5) / Objetivo: Estudar o efeito da obesidade na regulação do sistema calicreína-cininas por meio da expressão dos receptores B1 e B2 de cininas em humanos e camundongos, e as alterações na síntese e funcionalidade dos receptores em tecidos murinos. Métodos: Foram coletados tecido adiposo branco humano e diferentes tecidos de camundongo. Desses tecidos foi extraído o RNA e analisada a expressão dos receptores de cinina por meio da reação em cadeia da polimerase em tempo real. Tecidos como estômago e aorta de camundongos ob/ob e selvagens foram utilizados para extração de proteínas e estudos fisiológicos. Por Western Blotting estudou-se a quantidade de receptor produzida nos animais. O fundus de estômago e aorta abdominal foram utilizados para se obter registros de contrações isométricas para determinação da potência e eficácia dos agonistas em camundongos obesos e magros. Foram aplicadas doses crescentes cumulativas dos agonistas peptídicos dos receptores B1 e B2, bradicinina e des-Arg9-bradicinina. Resultados: Nos experimentos de PCR em tempo real, a expressão gênica dos receptores B1 e B2 de cininas foi mostrada alterada em alguns tecidos dos animais deficientes na produção do hormônio leptina em relação ao controle. Nos tecidos: adiposo branco, aorta, fígado, hipotálamo e estômago, a expressão do receptor B1 apresentou-se aumentada, porém em tecido cardíaco e tecido adiposo marrom, essa estava diminuída. O receptor B2 teve expressão diminuída em tecido adiposo branco e hipotálamo. Nos demais tecidos estudados não houve alteração da expressão do receptor B2. Em humanos, esses receptores apresentaram-se alterados em indivíduos obesos. O estudo foi realizado em tecido adiposo humano de duas regiões de depósito diferentes, visceral e subcutâneo. Foi observada diferença na expressão do mesmo tecido, porém de regiões distintas. Nos tecidos dos camundongos obesos a resposta aos agonistas dos receptores B1 e B2, bradicinina e des-Arg9-bradicinina, respectivamente, foi mostrada diminuida. Em fundus de estômago foi observada diminuição significativa na resposta ao agonista BK em animais obesos e tratados com dieta hiperlipídica. Tais efeitos podem ser devido às conseqüências do aumento excessivo de peso, como inflamação crônica apresentada nesses animais, ou mesmo devido a diabetes tipo II, a qual consiste em uma patologia diretamente relacionada à obesidade, sugerida neste trabalho como fator capaz de alterar a ação do sistema calicreína-cininas em determinados tecidos. Conclusão: Análises de expressão gênica mostraram que a obesidade afeta os receptores de cinina em diversos tecidos de camundongo, assim como em humanos. Análises fisiológicas funcionais mostraram diminuição na resposta ao agonista de B1 em animais obesos. Os dados deste trabalho sugerem que a obesidade afeta a modulação do sistema calicreína-cininas em modelo murino e humano. Dessa forma, uma possível interação entre obesidade e sistema calicreína-cininas poderia estar envolvida nesta patologia, assim como ser um fator para desenvolvimento a sindrome metabólica. / Objectives: To study the effect of obesity on the kallikrein-kinin system through the expression of receptors B1 and B2 on humans and mice, and alterations in the synthesis and functionality of the receptor in murine tissues. Methods: white human adipose tissue and different kinds of mice tissues were collected. RNA was extracted and the kinin receptors expression analyzed through a real-time polymerase chain reaction. Tissues and organs such as stomach and aorta were used for protein extraction and physiological studies. By Western Blotting, receptor quantitation was studied. Stomach fungus and abdominal aorta were used to register isometric contractions to determine the potency and effectiveness of the agonists on obese and control mice. Increasing accumulating doses of bradykinin and des-Arg9-bradykinin, B2 and B1 receptors agonists respectively, were applied. Results: In the real-time PCR experiments, the gene expression of the B1 and B2 receptors were altered in some tissues of the animals deficient for leptin, when compared to the control. In the white adipose tissue, aorta, liver, hypothalamus and stomach, the B1 receptor expression was increased, but in cardiac tissues and brown adipose tissue, it was decreased. The expression of B2 receptor was decreased in white adipose tissue and hypothalamus. In the other studied tissues, no changes was detected in the B2 receptor expression. In humans, these receptors were altered in obese individuals. The study was performed in human adipose tissue from two different regions of depots, visceral and subcutaneous. There was a tendency of different expression in the same tissue, but from different areas. In tissues from obese mice the response to the B2 and B1 agonists, bradykinin and des-Arg9-bradykinin, respectively, had a decreasing tendency. A significant decrease was observed in stomach fundus in response to the BK agonist. Such effects can be due to the increased weight and its consequences, such as chronic inflammation or diabetes type II, which is a pathology directly related to obesity. Conclusion: expression and functional analysis show that obesity affects kinin receptors in many different mouse tissues as well as in humans. / TEDE / BV UNIFESP: Teses e dissertações