Enterobactérias como Klebsiella pneumoniae e Enterobacter spp. estão entre as principais causas de infecções hospitalares e estão frequentemente associadas à produção da enzima Klebsiella pneumoniae carbapenemase (KPC). A emergência de isolados produtores desta e de outras carbapenemases é um grave problema de saúde pública uma vez que as opções terapêuticas tornam-se extremamente limitadas. As polimixinas frequentemente constituem uma das poucas opções disponíveis, porém têm sido associadas a menor eficácia clínica, maior mortalidade e toxicidade. Além disso, há descrição in vitro da emergência de subpopulações heterorresistentes de isolados expostos a esta droga. Neste contexto, muitos estudos têm avaliado a terapia combinada como alternativa e a utilização das polimixinas com outras classes de antimicrobianos tem mostrado resultados mais eficazes em comparação às monoterapias no tratamento de infecções causadas por bactérias multirresistentes, como aquelas produtoras KPC. Assim, o objetivo deste estudo foi avaliar o desempenho de combinações entre polimixina B (PMB) com a tigeciclina (TGC) e com os carbapenêmicos imipenem (IPM) e meropenem (MEM) contra enterobactérias produtoras de KPC-2 pelo método de Time Kill Curves - TKC (Curva de Tempo-Morte). Os isolados foram previamente caracterizados como produtores de KPC-2 e incluíram seis clones de três espécies distintas, sendo dois isolados de K. pneumoniae (KP), dois de Enterobacter cloacae (EC) e dois de Serratia marcescens (SM), provenientes de banco de amostras. A PMB foi testada em concentrações de 0,5, 1,0 e 2,0 μg/mL, enquanto os carbapenêmicos e TGC foram testados a uma concentração fixa de 4,0 e 1,0 μg/mL, respectivamente. Os tubos contendo o inóculo e antibióticos foram incubados a 35 °C e uma alíquota foi semeada em placa de ágar sangue nos tempos: 0, 0,25, 1, 2, 4, 8, 12 e 24 horas, para a contagem das colônias. Os resultados foram interpretados conforme as seguintes definições: i) atividade bactericida = redução ≥ 3 log10 na contagem total de unidades formadoras de colônia (UFC)/mL comparado ao inóculo inicial; ii) atividade bacteriostática = manutenção ou redução < 3 log10 na contagem total de UFC/mL comparado ao inóculo original; iii) sinergismo = diminuição ≥ 2 log10 na contagem total de UFC/mL entre a combinação de antimicrobianos e o agente mais ativo, após 24 horas de incubação. De acordo com nossos resultados, IPM, MEM e TGC não apresentaram efeito bacteriostático ou bactericida quando testados como única droga contra todos os isolados produtores de KPC-2. Todas as combinações de antibióticos mostraram sinergismo com atividade bactericida ou, pelo menos, um efeito bacteriostático para todos os isolados testados, sendo as combinações mais efetivas aquelas onde a de PMB foi usada nas concentrações de 1,0 e 2,0 μg/mL e combinada aos carbapenêmicos. Embora tenham sido observadas concentrações inibitórias mínimas elevadas para PMB contra os isolados de SM, para ambas as cepas houve sinergismo quando a PMB foi combinada a IPM e MEM. Nossos resultados confirmam a superioridade das combinações de antimicrobianos em comparação às monoterapias e sugerem que, a PMB combinada com carbapenêmicos ou TCG pode ser uma opção terapêutica eficaz para o tratamento de infecções causadas por isolados de enterobactérias produtores de KPC-2. / Enterobacteria such as Klebsiella pneumoniae and Enterobacter spp. are among the leading causes of nosocomial infections and are often associated with Klebsiella pneumoniae carbapenemase (KPC) production. The emergence of KPC and other carbapenemases is a serious public health problem due to the limited therapeutic. Polymyxins often constitute one of the few options available, but it have been associated with lower clinical efficacy, toxicity and increased mortality. Moreover, several studies have demonstrated the emergence of heteroresistant subpopulations when isolates are exposed to this drug. In this context, some authors have evaluated the combined therapy as an alternative and the use of polymyxins with other classes of antibiotics have shown to be more effective compared to the monotherapies for the treatment of infections caused by multiresistant bacteria. Therefore, the aim of this study was to evaluate the performance of polymyxin B (PMB) with carbapenems imipenem (IPM) and meropenem (MEM) and tigecycline (TGC) combinations against KPC-2 producing Enterobacteriaceae by Time Kill Curves method. Isolates were previously characterized as KPC-2 producing comprising six distinct clones that included: two K. pneumoniae (KP), two Enterobacter cloacae (EC) and two Serratia marcescens (SM). PMB was tested at concentrations 0,5, 1,0 and 2,0 μg/mL, whereas carbapenems and TGC were tested at a fixed concentration of 4.0 and 1.0 μg/mL, respectively. Tubes with inoculum and antibiotics were incubated at 35 °C and an aliquot was plated on blood agar plates at times: 0, 0.25, 1, 2, 4, 8, 12 and 24 hours for counting colonies. The results were interpreted according to the following definitions: i) bactericidal activity = ≥ 3 log10 reduction in total count of colony forming units (CFU)/mL compared to the initial inoculum; ii) bacteriostatic activity = maintenance or reduction < 3 log10 in total count of CFU/mL compared to the original inoculum; iii) synergism = ≥ 2 log10 decrease in total count of CFU/ml between the combination and the most active antimicrobial agent after 24 hours of incubation. According to our results, IPM, MEM and TGC showed no bacteriostatic or bactericidal effects when tested as a single drug against all KPC-2-producing isolates. All combinations of antibiotics showed synergism with bactericidal activity or at least, a bacteriostatic effect for all the six isolates. The more effective combinations were those that PMB was used at 1,0 and 2,0 μg/mL, combined with carbapenems. Although high minimum inhibitory concentrations were observed for PMB against isolates of SM, for both strains, synergism was observed when PMB was combined with IPM and MEM. Our results confirm the superiority of antimicrobial combinations compared to monotherapies and suggest that PMB combined with carbapenem or TCG can be an effective therapeutic option for the treatment of infections caused by KPC-2-producing Enterobacteriaceae.

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Another important characteristic is its capacity to regulate or to acquire antibiotic resistance, specifically through oxacilinases, encoded by the gene OXA, that presents potent hydrolytic activity against penicilinase-resistant penicillins. Until the moment, 250 types of OXA were already described. The expression of OXA genes can be increased in the presence of the insertion element ISAba1, which when located upstream of the gene, confer a selective advantage for the isolate when this depends on the efficient expression of a variety of resistance genes. In its absence, the resistance is usually expressed in the presence of two or more OXA genes. The capacity of biofilm formation and the presence of the genes blaPER-1, OXA-23, OXA-40, OXA- 51, OXA-58 and ISAba1 were investigated among 84 isolates from 64 patients of the Intensive Care Units of Goiânia. It was observed that 78.5% of the isolates formed biofilm, of which 23% presented the gene blaPER-1. The presence of OXA-51 gene was detected in all isolates, whereas 64.3% of the isolates had the OXA-23 gene and 24.0% of the isolates had the OXA-58 gene. The ISAba1 gene was detected upstream of the OXA-51, OXA-23 and OXA-58 genes in 33.3% (28/84), 92.6% (50/54) and 10.0% (2/20) of the isolates, respectively. None of the isolates studied presented the gene OXA-40. Of the 62 isolates resistant to imipenem and meropenem, 76.0% possessed the OXA-23 gene while 24.2% of the isolates possessed the OXA-58 gene. Of these isolates, 79.0% (49/62) presented the gene ISAba1. In the present study, the blaPER-1 gene presence was not associated with the biofilm formation, while the presence of OXA genes was related to resistance in Acinetobacter baumannii. / A espécie Acinetobacter baumannii é a representante mais importante do gênero, sendo considerado o patógeno de maior relevância, dentro do complexo A. baumannii – A. calcoaceticus, para as instituições de saúde mundialmente. Sua importância clínica tem aumentado nos últimos anos em parte devido a sua notável capacidade de aderência a superfícies devido a presença de estruturas como pili, produção de EPS (exopolissacarídeo) e presença de genes que favorecem a formação de biofilme, proporcionando maior adesão entre as células e consequente resistência aos antimicrobianos. Outro destaque é sua capacidade de regular ou adquirir resistência, em particular por meio das oxacilinases, codificadas pelo gene OXA, que apresentam atividade hidrolítica potente contra penicilinas resistentes às penicilinases. Até o momento, 250 tipos de OXA já foram descritas. A expressão de genes OXA pode ser aumentada na presença do elemento de inserção ISAba1, localizado à montante do gene, conferindo uma vantagem seletiva para o isolado quando este depende da expressão eficiente de uma variedade de genes de resistência a antibióticos. Na sua ausência, a resistência geralmente é expressa na presença de dois ou mais genes OXA. A capacidade de formar biofilme e a presença dos genes blaPER-1, OXA-23, OXA-40, OXA-51, OXA-58 e ISAba1 foram investigados em 84 isolados provenientes de 64 pacientes de UTIs de Goiânia. Observou-se que 78,5% dos isolados formaram biofilme, dos quais 23% apresentaram o gene blaPER-1. A presença do gene OXA-51 foi detectada em todos os isolados, enquanto que 64,3% dos isolados apresentavam o gene OXA-23, e em 24% dos isolados foi encontrado o gene OXA-58. O gene ISAba1 foi detectado à montante dos genes OXA-51, OXA-23 e OXA-58, em 33,3% (28/84), 92,6% (50/54) e 10% (2/20) dos isolados, respectivamente. Nenhum isolado estudado apresentou o gene OXA-40. Dos 62 isolados resistentes ao imipenem e meropenem, 76% dos isolados possuíam o gene OXA-23 enquanto que 24,2% possuíam o gene OXA-58. Dentre estes isolados, 79% (49/62) apresentaram a sequência de inserção ISAba1. No presente estudo, a presença do gene blaPER-1 não foi associada com a formação de biofilmes, enquanto que a presença de genes OXA estava relacionada à resistência em Acinetobacter baumannii.

Introdução: O complexo Acinetobacter baumannii-calcoaceticus (ACB) inclui as espécies: A. baumannii, A. calcoaceticus, A. pittii e A. nosocomialis. As infecções causadas pelas diferentes espécies do ACB, principalmente A. baumannii tornam-se cada vez mais graves com a emergência de cepas resistentes a quase todos os antimicrobianos incluindo os carbapenêmicos, principalmente devido à produção de oxacilinases. O objetivo desse estudo foi identificar as diferentes espécies do complexo Acinetobacter baumanniicalcoaceticus (ACB) e determinar a prevalência de oxacilinases em isolados resistentes aos carbapenêmicos obtidos de quatro estados brasileiros. Materiais e métodos: No período de abril a outubro de 2013, avaliamos 92 isolados identificados previamente como ACB complexo, resistente aos carbapenêmicos de quatros estados brasileiros: Paraná, Rio de Janeiro, Rio Grande do Sul e São Paulo. Os isolados foram submetidos a identificação utilizando o equipamento MALDI-TOF MS (Bruker Daltonics®, Bremen, Germany) e após, comparados com o sequenciamento do gene gyrB. Uma amostra de conveniência de 11 isolados não-A. baumannii também foram submetidas à identificação no sistema MALDI-TOF e ao sequenciamento. A avaliação da suscetibilidade foi determinada pelo método de disco difusão para os antimicrobianos: amicacina, ampicillina-sulbactam, cefepime, ceftazidima, gentamicina, piperacilina-tazobactam e para polimixina por microdiluição em caldo. Foi realizado ensaio de PCR multiplex para avaliação de genes de resistência: OXA-23-like, OXA-24-like, OXA-51-like, OXA-58-like e OXA-143. Resultados: Oitenta e nove (97%) isolados clínicos foram identificados como A. baumannii pelo sistema MALDI-TOF e confirmados pelo sequenciamento do gene gyrB. O sistema MALDI-TOF identificou corretamente 8/11 (72,7%) das espécies não-A. baumannii. Em relação a polimixina B, a maioria do isolados (96,7%) foram sensíveis (CIM ≤ 2 μg/mL) sendo que apenas 3 (3,3%) isolados apresentaram CIM ≥ 4 μg/mL para esse antimicrobiano. Quanto a presença das oxacilinases, 80 (87%) dos isolados apresentaram OXA-23-like e esses foram procedentes dos 4 estados avaliados. No entanto, foram identificados 12 (13%) isolados produtores de OXA-24-like sendo todos procedentes do Rio Grande do Sul, Paraná e São Paulo. Conclusão: Neste estudo foi possível constatar que o sistema MALDI-TOF identifica corretamente a espécie de A. baumannii mas apresentou limitações para identificação das espécies de A. nosocomialis e A. pittii. Observamos elevadas taxas de resistência aos antimicrobianos e a disseminação de OXA-23 em todos os estados avaliados. Além disso, Identificamos pela primeira vez a presença da enzima OXA-24-like em isolados de A. baumannii no sul do Brasil. / Introduction: The Acinetobacter calcoaceticus-baumannii complex (ACB) includes species: A. baumannii, A. calcoaceticus, A. pittii and A. nosocomialis. Infections caused by different species of the ACB, especially A. baumannii became increasingly severe, with the emergence of strains resistant to almost all antibiotics including carbapenems, primarily due to the production of oxacilinases. The aim of this study was to identify the different species of Acinetobacter calcoaceticus-baumannii complex (ACB) and to determine the prevalence of oxacilinases in isolates resistant to carbapenems obtained from four Brazilian states. Material and Method: Between April to October 2013, we analized 92 strains previously identified as ACB complex, resistant to carbapenems from four Brazilian states: Paraná, Rio de Janeiro, Rio Grande do Sul and São Paulo. The isolates were subjected to identification using MALDITOF MS System (Bruker Daltonics®, Bremen, Germany) and to sequencing of the gyrB gene. A convenience sample comprising 11 isolates of non-A. baumannii were also submitted to identification in MALDI-TOF system, and sequencing. The evaluation of the susceptibility was determined by disk diffusion method for the following antimicrobials: amikacin, ampicillin-sulbactam, cefepime, ceftazidime, gentamycin, piperacillin-tazobactam; for polymyxin we used the broth microdilution method. A multiplex PCR assay was performed to evaluate the resistance genes: OXA-23-like, OXA-24-like, OXA-51-like, OXA- 58-like and OXA-143. Results: Eighty-nine (97%) clinical isolates were identified as A. baumannii by MALDI-TOF system, and confirmed by sequencing of the gyrB gene. The MALDI-TOF system correctly identified only 8/11 (72.7%) of non-A. baumannii isolates. In relation to polymyxin B, the majority of isolates (96.7%) were susceptible (MIC ≤ 2 μg/mL) and only 3 (3.3%) of the isolates showed MIC ≥ 4 μg/mL for this antimicrobial. Regarding the presence of oxacilinases, 80 (87%) isolates presented OXA-23-like and these were obtained from the 4 states evaluated. Furthermore, 12 (13%) isolates producing OXA-24-like were identified, all from Rio Grande do Sul, Paraná and São Paulo. Conclusion: In the present study, we were able to determine that the MALDI TOF System correctly identifies the species of A. baumannii and has limitations for identification of A. nosocomialis and A. pittii. We notice high rates of antimicrobial resistance and the spread of OXA-23 in all states evaluated. Moreover, for the first time we identified the presence of the enzyme OXA-24- like in isolates of A. baumannii in southern Brazil.

Introduction: The carbapenem resistance among bacteria of the family Enterobacteriaceae, particularly Klebsiella pneumoniae, is becoming a serious problem in hospitals through different mechanisms that may act alone or combined, such as changes in outer membrane permeability with the porin loss associated with the overproduction of &#946;-lactamases ESBL and AmpC or the specific production of KPC. These infections by Klebsiella pneumoniae resistant to carbapenems (CRKP) are associated with high morbidity, mortality, and costs. Objectives: In our study, we describe the epidemiology and clinical outcomes associated with CRKP infections as well as the risk factors associated with 30 days hospital mortality among these patients and characterize resistance mechanisms: AmpC, ESBL, MBL and KPC. Methods: Case study (patients with infections CRKP) vs. control (uninfected by KPRC) at a ratio of 1:2, detected by laboratory surveillance and collecting demographics dates, co-morbidities, use of invasive procedures and antimicrobial use and patient outcome by checking medical records, between November / 2007 to May/2011. Characterization of phenotypic AmpC, KPC and ESBL performed with the test boronic acid as neutralizing enzyme test and synergism with imipenem-EDTA for MBL. The presence of genotype blaKPC was performed by PCR. Results: In total, 63 patients were included, with 22 patients infected by CRKP in different anatomical sites, predominantly bloodstream infections (40%). Resistance to ertapenem, meropenem and imipenem was 100%, 68.2% and 45.4%, respectively. Statistical analysis by logistic regression of risk factors for infection by CRKP showed the following as independent variables: malignancy (P = 0.025, OR = 63.74, 95% CI 1.69 to 2409.05), Charlson co-morbidity index &#8805; 3 (P = 0.033, OR = 7.90, 95% CI, 1.18 to 52.80) and use of fluoroquinolones (P = 0.005, OR = 18.92, 95% CI, 2.42 - 147.81). The ESBL phenotype was most frequent (90.9%), followed by AmpC (63.6%) and blaKPC (14%), and usually combined. The presence of co morbidities &#8805; 3 (P = 0.027, OR = 7.65 95% CI, 1.26 to 46.53) and KPRC infection (P = 0.026, OR = 4.91 95% CI, 1, 21 to 20.05) were associated with 30-day hospital mortality, and there was significant mortality in infected patients 54.5% (P = 0.026, OR = 3.72, 95% CI, 1.24 to 11.19) with an attributed mortality rate of 25.2%. Conclusion: The mortality rate associated with CRKP infection and the limited antimicrobial options for treatment highlight the need for improved laboratory detection, mainly KPC producing isolates, points out that it s crucial to implement efficient infection control measures to limit the spread of these pathogens in hospitals from countries with limited resources as Brazil. / Introdução: A resistência aos carbapenêmicos entre as amostras de Enterobacteriaceae, especialmente Klebsiella pneumoniae, está se tornando um grave problema nos hospitais e pode resultar da aquisição de diferentes mecanismos que atuam isolados ou combinados, destacando-se diminuição na permeabilidade da membrana externa pela perda de porina associada com hiperprodução de &#946;-lactamases ESBL, AmpC ou produção específica de carbapenemases. As infecções por Klebsiella pneumoniae resistente aos carbapenêmicos (KPRC) estão associadas com altas taxas de morbidade, mortalidade e custos. Objetivos: No nosso estudo, descrevemos a epidemiologia e a evolução clínica associadas com a infecção por KPRC, bem como os fatores de risco associados com a mortalidade hospitalar no prazo de 30 dias entre estes pacientes e caracterizamos os mecanismos de resistência: AmpC, ESBL, MBL e KPC. Métodos: Estudo modelo caso (pacientes com infecções por KPRC) vs. controle (pacientes não infectados por KPRC) na proporção de 1:2, detectados por vigilância laboratorial e coleta de dados demográficos, das co-morbidades, dos procedimentos invasivos e uso de antimicrobianos, bem como evolução nos respectivos prontuários, realizado entre novembro/2007 e maio/2011. A caracterização fenotípica de AmpC, ESBL e KPC foi realizada pelo teste do ácido borônico como neutralizante de enzima e o de sinergismo com imipenem-EDTA para MBL. A pesquisa de presença de genótipo blaKPC foi realizada pela reação de PCR. Resultados: No total, foram incluídos 63 pacientes, com 22 pacientes infectados por KPRC em diferentes sítios anatômicos, com predomínio de corrente sangüínea (40%). A resistência ao ertapenem, meropenem e imipenem foi de 100%, 68,2% e 45,4%, respectivamente. A análise estatística dos fatores de risco para infecção por KPRC por regressão logística mostrou as seguintes variáveis como independentes: neoplasia (P=0,025; OR=63,74, 95% IC, 1,69-2409,05), índice de co-morbidade Charlson &#8805; 3 (P=0,033; OR=7,90, 95% IC, 1,18-52,80) e uso da fluorquinolona (P=0,005; OR=18,92, 95% IC, 2,42-147,81). O fenótipo de resistência mais freqüente foi o ESBL (90,9%), seguido de AmpC (63,6%) e blaKPC (14%), usualmente combinados. A presença de &#8805; 3 co-morbidades (P=0,027; OR=7,65 95% IC, 1,26-46,53) e infecção por KPRC (P=0,026; OR=4,91 95% IC, 1,21-20,05) foram associadas à mortalidade total hospitalar no prazo de trinta dias, esta foi significativa nos pacientes infectados 54,5% (P=0,026; OR=3,72, 95% IC, 1,24-11,19) e com freqüência de mortalidade atribuída de 25,2%. Conclusão: A taxa de mortalidade associada com infecção por KPRC e a limitação das opções terapêuticas enfatizam a necessidade da melhoria na detecção laboratorial, principalmente dos produtores de KPC, assim como implementar medidas de controle de infecção eficientes para limitar a disseminação desses patógenos em hospitais de países com recursos limitados como o Brasil. / Mestre em Ciências da Saúde

Orientador: Carlos Magno Castelo Branco Fortaleza / Resumo: A resistência microbiana causa grande número de mortes todos os anos. Sua emergência e disseminação são fenômenos complexos, que devem ser compreendidos no contexto de redes de assistência. Entre os microrganismos multidroga-resistentes (MDR), causam especial preocupação os bacilos Gram-negativos, especialmente Acinetobacter baumannii e Enterobactérias (Escherichia coli, Klebsiella spp e Enterobacter spp) resistentes aos carbapenêmicos (CRAB e CRE, respectivamente). Nós realizamos dois estudos com o objetivo de descrever o comportamento espaço-temporal de CRAB e CRE. O primeiro deles teve delineamento ecológico e se baseou em notificações de agentes de infecção da corrente sanguínea em Unidades de Terapia Intensiva do Estado de São Paulo. O segundo foi uma revisão sistemática de literatura científica e “literatura cinzenta” para identificar relatos de ocorrência de infecções por CRAB e CRE no Brasil. Nossos resultados no Estado de São Paulo demonstraram tendências temporais opostas para CRAB (redução) e CRE (crescimento). Em ambos os casos a incidência é maior nas Regiões Metropolitanas de São Paulo e Campinas, a partir de onde os microrganismos parecem espalhar-se para outras áreas. Infecções foram mais frequentes em hospitais públicos e naqueles com menor proporção de leitos de UTI. Fatores socio-econômicos e demográficos apresentaram associações variáveis, porém plausíveis, com a incidência dos microrganismos de interesse. Os resultados da revisão sistemática apontam para ... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Antimicrobial resistance causes great numbers of deaths every year. Its emergence and dissemination are complex phenomena, which must be understood in the context of healthcare networks. Among multidrug-resistant microorganisms (MDR), carbapenem-resistant Gram-negative bacilli, especially Acinetobacter baumannii (CRAB) and Enterobacteriaceae (Escherichia coli, Klebsiella spp and Enterobacter spp; CRE) are of special concern. We performed two studies with the objective of describing the space-time behavior of CRAB and CRE. The first study had an ecological design and was based on reports of microorganisms causing bloodstream infections in Intensive Care Units in the São Paulo State, Brazil. The second was a systematic review of scientific literature and "gray literature" to identify reports of CRAB and CRE infections in Brazil. Our results in the State of São Paulo showed opposite temporal trends for CRAB (reduction) and CRE (growth). In both cases the incidence is higher in the Metropolitan Regions of São Paulo and Campinas, from where the microorganisms seem to spread to other areas. Infections were more frequent in public hospitals and in those with a lower proportion of ICU beds. Socio-economic and demographic factors presented variable but plausible associations with the incidence of microorganisms of interest. Results of the systematic review point to an initial concentration of CRAB and CRE reports in the Brazilian Southeast, followed by a dispersion in the country. The... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

A infecção de corrente sanguínea (ICS) causada por bactérias multirresistentes tem alta mortalidade em pacientes receptores de transplante de células-tronco hematopoiéticas (TCTH). A Pseudomonas aeruginosa é um dos agentes mais frequentes e de difícil tratamento nessa população de pacientes. Objetivos: Avaliar características clínicas, microbiológicas e moleculares de 30 isolados de P. aeruginosa resistente à carbapenêmicos (PARC) em ICS de pacientes submetidos a TCTH e a presença de sinergismo antimicrobiano in vitro. Métodos: Os dados clínicos foram obtidos retrospectivamente de prontuários médicos e registrados em banco de dados. Análises bivariadas e multivariadas foram realizadas para avaliar determinantes de desfechos clínicos e uma curva de sobrevida foi construída. Determinou-se a concentração inibitória mínima (CIM) dos antimicrobianos por meio de microdiluição, foram realizados ensaios de sinergismo por método de checkerboard e time-kill, avaliação da clonalidade por eletroforese em campo pulsado e detecção de genes codificadores de mecanismos de resistência e virulência por reação em cadeia de polimerase. O sequenciamento do genoma completo (WGS) dos principais clones foi realizado por Nextera XT, utilizando a tecnologia Illumina MiSeq. Resultados: A maioria dos pacientes era do gênero feminino, com mediana de idade de 48 anos. Neutropenia foi presente em 93% dos pacientes e colonização prévia por PARC em 32%. A mortalidade em 14 dias foi 68%; a maioria dos pacientes que morreram foram transplantados alogênicos (79% vs. 17% entre receptores de transplante autólogo; p=0,012). Pacientes tratados com duas ou três drogas não apresentaram diferença estatisticamente significante na mortalidade até 14 dias após a ICS. Foram avaliados 30 isolados bacterianos. Todos apresentaram alto nível de resistência ao meropenem (MERO): CIM90 > 512 ug/mL; dois terços eram resistentes à amicacina (AMK) (CIM 2-512 ug/mL) e todos mantinham sensibilidade à colistina (COL). Muitos isolados (17/30) alcançaram efeito sinérgico in vitro pelo método time-kill com a combinação MERO mais COL, mas não com AMK. Nenhum antagonismo foi observado. Houve menor mortalidade em pacientes cujo isolado apresentou sinergismo entre COL e MERO quando comparados a pacientes portadores de isolados sem sinergismo, sem significância estatística. O gene de carbapenamase mais identificado foi blaSPM e 6 isolados apresentaram blaSPM e blaKPC. Os isolados apresentaram genes relacionados com virulência, tais como toxA, exoS e lasB; pacientes com ICS causada por P. aeruginosa que abrigava o gene lasB apresentaram maior risco de evoluir para o óbito. O WGS mostrou que os clones abrigavam SPM-1, Tn4371, mutações em porinas, em partes das bombas de efluxo, nas proteínas ligadores de penicilina (PBP) e pertenciam a ST277. Conclusão: As ICS por PARC cursaram com alta mortalidade em pacientes submetidos à TCTH. Houve uma grande proporção de resultados positivos para sinergismo entre os antimicrobianos in vitro, mas não foi possível demonstrar benefício estatisticamente significante no uso da terapia combinada com três drogas. Os clones carreavam SPM-1, Tn4371 e pertenciam a ST277 / Bloodstream infection (BSI) has high mortality in hematopoietic stem cell transplant (HSCT) recipients and Pseudomonas aeruginosa is an important and challenging organism. Objectives: To evaluate clinical, microbiological and molecular features of carbapenem-resistant P. aeruginosa (CRPA) isolates from BSI identified among HSCT patients and address in vitro synergy of antibiotic combination. Methods: Patient medical records were retrospectively reviewed and registered in a database. We used bivariate and multivariate analyzes to investigate determinants of clinical outcomes, and demonstrated overall mortality using a survival curve. We determined minimal inhibitory concentrations (MIC) for antimicrobials and in vitro synergies using checkerboard and time-kill assays, pulsed-field electrophoresis (PFGE) for clonality assessment and polymerase chain reaction (PCR) to detect carbapenamases and virulence genes were performed for all isolates. Whole genome sequence (WGS) of main clones was performed by Nextera XT, using Illumina MiSeq technology. Results: Most patients were female, median age was 48 years old. Main baseline disease was acute leukemia and 68% received allogeneic HSCT. 93% of patients had neutropenia and 32% had prior CRPA gut colonization.14-day mortality was 68%; mortality was higher among allogeneic HSCT recipients compared to autologous HSCT recipients (79% vs. 17% p = 0,012). Patients treated with two or three drugs did not present a statistically significant difference in 14-day mortality after BSI. In total, 30 bacterial isolates were analyzed; all presented a high resistance level to meropenem (MERO): MIC90 > 512ug/mL; two thirds were also resistant to amikacin (AMK) (MIC 2-512 ug/mL) and all were susceptible to colistin (COL). Many (17/30) isolates achieved in vitro synergistic effect in time-kill assay with the association of MERO and COL, but synergistic effect was not observed with AMK, by time-kill. No antagonistic effect was observed. There was a tendency towards better survival in patients whose CRPA isolate had in vitro synergy between COL and MERO without statistical significance. The most frequent carbapenamase gene identified was blaSPM, and six co-harboured both blaKPC and blaSPM. Isolates presented genes related to virulence factors such as toxA, exoS and more patients with BSI caused by P. aeruginosa harbouring gene lasB evolved to death. WGS analysis showed that clones harboured SPM-1, Tn4371 and belonged to ST277. They also presented mutations in genes related with porins and efflux pumps, as well in penicillin binding proteins (PBPs). Conclusion: CRPA BSI as associated with high mortality in HSCT recipients. A large proportion of isolates had in vitro synergy; however, we could not demonstrate statistically significant benefit in the use of combination therapy. Clones carried SPM-1, Tn4371 and belonged to ST277

Acinetobacter baumannii é um importante agente de infecções relacionadas à assistência à saúde, principalmente nas unidades de terapia intensiva no Brasil, sua resistência a antimicrobianos vem aumentando nas últimas décadas e as opções para o tratamento são restritas. Em 2011, no HC-FMUSP, ocorreu um surto de infecção por A. baumannii resistente a todos os antibióticos e desde então isolados resistentes a todas as classes de antibióticos vêm sendo identificados no hospital. O estudo investigou o efeito de combinações antimicrobianas contra 20 isolados clínicos de A. baumannii, sendo sete isolados resistentes (2011 a 2012) e treze sensíveis a colistina (2002 a 2004), obtidas do banco de cepas do LIM-54 com diferentes mecanismos de resistência. Foram realizados, concentração inibitória mínima dos antibióticos, avaliação da clonalidade por Pulsedfield gel electrophoresis, detecção de mecanismos de resistência por reação de amplificação em cadeia da polimerase, análise de proteínas da membrana externa e baseado na clonalidade e o sequenciamento total do genoma de quinze isolados. Sinergismo foi investigado usando os métodos de checkerboard e time-kill. Para monitorização da expressão do sistema regulatório PmrCAB e dos genes responsáveis pela biossíntese do lipopolissacarídeo, foi realizada reação em cadeia da polimerase quantitativa. Todos os isolados foram resistentes ao meropenem e a rifampicina. OXA- 23 e OXA-143 foram as carbapenemases mais frequentes. Quatro isolados mostraram perda de uma proteína de membrana externa denominada OMP 43kDa. Os isolados sensíveis a colistina pertenciam a diferentes clones e Multilocus Sequence Types, também apresentaram o maior efeito sinérgico com fosfomicina-amicacina. A resistência a colistina foi associada com a superexpressão do gene pmrA. Seis isolados resistentes a colistina, pertenciam ao Complexo Clonal 113 e o maior efeito sinérgico foi observado com combinações de colistina-rifampicina seguido de colistina-vancomicina. Foram encontrados diferentes genes de virulência envolvidos com formação de biofilme, aderência, produção de enzimas e captação de ferro / Acinetobacter baumannii is an important agent of infections related to health care, especially in intensive care units in Brazil, its antimicrobial resistance has increased in recent decades and the options for treatment are restricted. In 2011, in the HC-FMUSP, there was an outbreak of A. baumannii infection resistant to all antibiotics and since then isolates resistant to all classes of antibiotics have been identified in the hospital. The study investigated the effect of antimicrobial combinations against 20 clinical isolates of A. baumannii, seven isolates colistin resistant (2011-2012) and thirteen colistin sensitive (2002-2004) from LIM-54 strains bench with different resistance mechanisms. Minimum inhibitory concentration of antibiotics, clonality evaluation by pulsed-field gel electrophoresis and detection of resistance mechanisms by polymerase chain reaction, outer membrane protein analysis and based on clonality, the whole genome sequencing of fifteen isolates were performed. Synergism was determined using checkerboard and time-kill methods. For expression monitoring of the regulatory system PmrCAB and the genes responsible for the biosynthesis of lipopolysaccharide, it was performed quantitative polymerase chain reaction. All isolates were resistant to meropenem and rifampicin. OXA-23 and OXA-143 were the most frequent carbapenems. Four isolates showed loss of one outer membrane protein called OMP 43kDa. Colistin susceptible isolates belonged to different clones and Multilocus Sequence Types; it also showed the greatest synergistic effect with fosfomycin-amikacin. The colistin resistance was involved in overexpression of the pmrA gene. Six colistin-resistant isolates belonged to Clonal Complex 113 and higher synergistic effect were observed with colistin-rifampicin followed by colistin-vancomycin combinations for these isolates. We found different virulence genes involved in biofilm formation, adhesion, enzyme production and iron uptake

Acinetobacter baumannii é um importante agente de infecções relacionadas à assistência à saúde, principalmente nas unidades de terapia intensiva no Brasil, sua resistência a antimicrobianos vem aumentando nas últimas décadas e as opções para o tratamento são restritas. Em 2011, no HC-FMUSP, ocorreu um surto de infecção por A. baumannii resistente a todos os antibióticos e desde então isolados resistentes a todas as classes de antibióticos vêm sendo identificados no hospital. O estudo investigou o efeito de combinações antimicrobianas contra 20 isolados clínicos de A. baumannii, sendo sete isolados resistentes (2011 a 2012) e treze sensíveis a colistina (2002 a 2004), obtidas do banco de cepas do LIM-54 com diferentes mecanismos de resistência. Foram realizados, concentração inibitória mínima dos antibióticos, avaliação da clonalidade por Pulsedfield gel electrophoresis, detecção de mecanismos de resistência por reação de amplificação em cadeia da polimerase, análise de proteínas da membrana externa e baseado na clonalidade e o sequenciamento total do genoma de quinze isolados. Sinergismo foi investigado usando os métodos de checkerboard e time-kill. Para monitorização da expressão do sistema regulatório PmrCAB e dos genes responsáveis pela biossíntese do lipopolissacarídeo, foi realizada reação em cadeia da polimerase quantitativa. Todos os isolados foram resistentes ao meropenem e a rifampicina. OXA- 23 e OXA-143 foram as carbapenemases mais frequentes. Quatro isolados mostraram perda de uma proteína de membrana externa denominada OMP 43kDa. Os isolados sensíveis a colistina pertenciam a diferentes clones e Multilocus Sequence Types, também apresentaram o maior efeito sinérgico com fosfomicina-amicacina. A resistência a colistina foi associada com a superexpressão do gene pmrA. Seis isolados resistentes a colistina, pertenciam ao Complexo Clonal 113 e o maior efeito sinérgico foi observado com combinações de colistina-rifampicina seguido de colistina-vancomicina. Foram encontrados diferentes genes de virulência envolvidos com formação de biofilme, aderência, produção de enzimas e captação de ferro / Acinetobacter baumannii is an important agent of infections related to health care, especially in intensive care units in Brazil, its antimicrobial resistance has increased in recent decades and the options for treatment are restricted. In 2011, in the HC-FMUSP, there was an outbreak of A. baumannii infection resistant to all antibiotics and since then isolates resistant to all classes of antibiotics have been identified in the hospital. The study investigated the effect of antimicrobial combinations against 20 clinical isolates of A. baumannii, seven isolates colistin resistant (2011-2012) and thirteen colistin sensitive (2002-2004) from LIM-54 strains bench with different resistance mechanisms. Minimum inhibitory concentration of antibiotics, clonality evaluation by pulsed-field gel electrophoresis and detection of resistance mechanisms by polymerase chain reaction, outer membrane protein analysis and based on clonality, the whole genome sequencing of fifteen isolates were performed. Synergism was determined using checkerboard and time-kill methods. For expression monitoring of the regulatory system PmrCAB and the genes responsible for the biosynthesis of lipopolysaccharide, it was performed quantitative polymerase chain reaction. All isolates were resistant to meropenem and rifampicin. OXA-23 and OXA-143 were the most frequent carbapenems. Four isolates showed loss of one outer membrane protein called OMP 43kDa. Colistin susceptible isolates belonged to different clones and Multilocus Sequence Types; it also showed the greatest synergistic effect with fosfomycin-amikacin. The colistin resistance was involved in overexpression of the pmrA gene. Six colistin-resistant isolates belonged to Clonal Complex 113 and higher synergistic effect were observed with colistin-rifampicin followed by colistin-vancomycin combinations for these isolates. We found different virulence genes involved in biofilm formation, adhesion, enzyme production and iron uptake

O doripenem é um antibiótico carbapenêmico de amplo espectro e aprovado pelo Food and Drug administration (FDA) em 2007. Devido a sua recente comercialização, não está presente em códigos oficiais. Desta forma, esta dissertação teve como objetivo validar um método analítico para quantificação do Doripenem utilizando a eletroforese capilar (EC) como ferramenta analítica alternativa à Cromatografia Liquida de Alta Eficiência (CLAE), além de desenvolver métodos físico-químicos para caracterizar a matéria prima e estudar a cinética de degradação do fármaco frente à temperatura e radiação por luz UVC. Diante dos resultados obtidos, verificou-se que métodos de caracterização como a cromatografia em camada delgada, espectrofotometria de infravermelho e ultravioleta e espectroscopia de Ressonância Magnética Nuclear demonstraram ser satisfatórios para caracterização do fármaco, já os métodos como DSC e faixa de fusão não foram adequados. Para fins de comparação com a EC, realizou -se a covalidação do método de CLAE reportado na literatura, tendo sido obtido um fator de correlação de 0,9950, teor médio de I 00,09 % e recuperação de I OI , 19 %. Para o desenvolvimento do método por EC foi utilizado capilar de sílica fundida de 40 em efetivo com 50 11m de diâmetro interno, eletrólito tampão barato de sódio I 00 mM em pH 8,0, tensão aplicada de 15 kV a 25 ºC, comprimento de onda de 298 nm e, procainamida como padrão interno. O comprimento de onda 214 nm foi monitorado a presença de produtos de degradação. O método demonstrou ser específico, linear entre 25-250 11g/ml (r=0,9995) , preciso (I OI ,33 %), exato (I OI ,86 %) e robusto. Conforme os resultados obtidos, os métodos por CLAE e EC demonstraram ser intercambiáveis, contudo, a EC apresenta vantagens como menor tempo de análise e pequena quantidade de resíduo gerado. Para o estudo da cinética de degradação por EC e ensaio microbiológico (EM) , as condições verificadas foram temperatura (45 ºC, por 24 horas) e luz UVC (por 12 horas). O teor final de doripenem obtido pela EC foi de 70,74 e 64,18 % para temperatura e UVC, respectivamente. Já a potência verificada pelo ensaio microbiológico foi de 42,77 e 21 ,95 % para temperatura e UVC, respectivamente. / Doripenem is a carbapenemic antibiotic with a broad spectrum of action launched in 2005. Due to its recent commercialization, doripenem is not in official codes. So this dissertation aims to validate an analytical method to doripenem quantification using capillary electrophoresis (CE) as an alternative method to High Performance Liquid Chromatography (HPLC), besides to develop physic-chemical methods to characterize the material and to study the degradation kinetics of doripenem in UVC light and temperature (45 ºC). The characterization methods as thin layer chromatography, infrared and ultraviolet spectroscopy and spectroscopy Nuclear Magnetic Resonance proved to be satisfactory. Melting point range and DSC were not adequate to identify doripenem. To compare HPLC and EC, HPLC method was covalidate according literature. The method demonstrated a correlation factor 0.9950, average content 100.09 % and recovery 101.19 %. For the development of CE method was employed 40 em fused silica capillary in 50 11m inner, electrolyte 100 mM buffer sodium borate at pH 8.0, applied voltage 15 kV at 25 ºC, wavelength 298 nm, and procainamide as internai standard. The method demonstrated to be linear between 25-250 IJQ/ml (r=0.9995), precise (1 01.33 %), accurate (1 01.86 %) and robust. Based on these results, the HPLC and CE methods are interchangeable. However, EC presents advantages such as reduced analysis time and small residue generated. To kinetic degradation study by CE and microbiological assay (MS) conditions as temperature (45 ºC for 24 hours) and UVC light (12 hours) were tested. The final residual content for doripenem by EC was 70.74 % and 64.18 to UVC and temperature, respectively. The antimicrobial power checked by MS was 42.77 and 21 .95% for temperature and UVC, respectively.

A terapia renal substitutiva contínua (TRSC) é amplamente utilizada em pacientes criticamente enfermos com insuficiência renal aguda (IRA). O meropenem é um carbapenêmico usado em pacientes críticos que tem uma atividade antibacteriana dependente do tempo. O objetivo do estudo foi avaliar a farmacocinética do meropenem infundido em três horas em pacientes submetidos à TRSC. Estudamos as concentrações plasmáticas e de efluente em cinco pacientes submetidos à TRSC. As amostras foram coletadas em momentos 0, 30 min, e 1, 2, 4, 6 e 8 horas após o início de uma infusão de 3 horas. As determinações de meropenem foram feitas por cromatografia líquida de alta eficiência. Quatro pacientes do sexo masculino e um feminino, idade de 53,0 ± 19,7 (23 a 80 anos), 62,1 ± 10,6 kg, foram estudados. Parâmetros farmacocinéticos apresentados em mediana (amplitude): concentrações plasmáticas, 34.86mg / L (10,08-139,27); tempo de meia vida (t ½), 1,8 h (1,4-3,0); volume de distribuição (Vd), 8,29 L (5,8-15,3); depuração total (Dept ) 3,98 L / h (2,51-4,35); concentração máxima (Cmax) 48,5 mg/L (37,0-105,8); concentração mínima (Cmin) 20,1 mg / L (14,0-16,6); constante de eliminação (Kel), 0,38 (0,34-0,43); área sob a curva de concentração versus tempo (AUC 0 a 8 h), 251,1 mg / Lh (229,7-398,4); (AUC de 0a∞), 275,1 mg /Lh (263,8-453,6).A depuração total pela TRSC variou de 8,46 a 18,33 ml/min. No efluente as concentrações máximas foram 24,35 e 74,81 mg /L. A eliminação de meropenem por TRSC é semelhante ao que é relatado pelo rim normal, quando é infundido por 3 horas a cada 8 h. Os níveis plasmáticos foram sempre acima do MIC necessário. Podemos concluir que não houve necessidade de ajuste de dose do meropenem com a dose de TRSC prescrita. / Continuous renal replacement therapy (CRRT) is widely used in critically ill patients with acute kidney injury (AKI). Meropenem is a carbapenem used in critically ill patients, which has a time dependent antibacterial activity. The aim of the study was to assess the pharmacokinetics of meropenem on a 3-hour infusion in patients undergoing CRRT due to AKI. We studied the plasmatic and effluent concentrations in five patients undergoing CRRT. The samples were collected at moments 0, 30 minutes, and 1, 2, 4, 6 and 8 hours after the beginning of the 3-hour infusion. The meropenem determinations were made through high performace efficiency liquid chromatography (HPLC). Four male patients and one female patient, with a mean age of 53,0 ± 19,7 (23 to 80 years), weighing 62,1 ± 10,6 kgs were studied. Pharmacokinetic parameters presented in medians (range): plasmatic concentrations, 34.86mg / L (10,08-139,27); half-life (t ½), 1,8 h (1,4-3,0); volume of distribution (Vd), 8,29 L (5,8-15,3); total clearance (CLT) 3,98 L / h (2,51-4,35); (Cmax) (maximum plasma concentration), 48,5 mg / L (37,0-105,8); Cmin (minimum plasma concentration)20,1 mg / L (14,0-16,6); elimination constant (Kel), 0,38 (0,34-0,43); area under the concentration versus time curve (AUC 0 a 8 h), 251,1 mg / Lh (229,7-398,4); (AUC 0 a ∞) 275,1 mg / Lh (263,8-453,6). In the effluent, the maximum concentrations varied from 24,35 to 74,81 mg/L, and the clearance from the therapy varied from 8,46 to 18,33 ml/min. The elimination of meropenem through CRRT is similar to that of a normal kidney, given a 3-hour infusion every 8 hours. Plasmatic levels were always above the necessary MICs. We can conclude there was no need for dose adjustment of meropenem with the prescribed CRRT dose.