A Imunodeficiência de Variável Comum (ICV) é caracterizada por baixos níveis de imunoglobulinas com susceptibilidade a. Analisamos a distribuição de linfócitos, apoptose espontânea e a expressão gênica de receptores de morte, ligantes, adaptadores, moléculas reguladoras, inibidoras e anti-apotóticas em células CD4+ e CD8+ de 19 pacientes ICV e 19 controles. Pacientes com ICV apresentam diminuição na frequência de linfócitos TCD4+ e CD4+CD45RA+ e menor relação CD4/CD8 que indivíduos saudáveis. O grupo de pacientes mostrou maior frequência de apoptose espontânea em linfócitos totais e CD4+. Células CD4+ dos indivíduos afetados apresentaram menor expressão gênica de TRAIL-R, BCL-2, FLIPL e FADD; células CD8+ apresentaram diminuição da expressão gênica de TRAIL, FADD, BCL-2, BCL -xL e um aumento de FLIPs. Os resultados sugerem um desequilíbrio nos mecanismos que controlam a apoptose de linfócitos nestes pacientes, o que pode ajudar a elucidar as alterações observadas no compartimento de células T dos pacientes com ICV. / Common Variable Immunodeficiency (CVID) is is characterized by low immunoglobulins levels with susceptibility to infections. We have analyzed T cell distribution and spontaneous apoptosis in peripheral blood of CVID, as well as gene expression of several molecules involved in apoptosis, including death receptors, ligands, adapters, regulatory and anti-apototic molecules in CD4+ and CD8+ cells of 19 CVID patients and 19 healthy subjects. CVID subjects present decreased frequency of TCD4+ and CD4+ CD45RA+ cells and lower CD4/CD8 ratio than healthy controls. CVID group also presented higher frequency of spontaneous apoptosis in lymphocytes and CD4+ cells. CD4+ showed lower expression of TRAIL-R, BCL-2, FLIPL and FADD; CD8+ cells presented lower expression of TRAIL, FADD, BCL-2, BCL-xL and a augment of FLIP. Results suggest an imbalance in mechanisms controlling cell death of those patients lymphocytes, which might help to elucidate the changes observed in T cell compartment of CVID patients.

Neste estudo avaliamos a ativação de macrófagos por: (i) neutrófilos e (ii) melatonina e seus produtos de oxidação N1-acetil-N2-formil-5-metoxiquinuramina (AFMK) e N1-acetil-5-metoxiquinuramina (AMK). Para estudarmos o papel dos neutrófilos na ativação de macrófagos utilizamos um modelo experimental onde camundongos C57BL/6 receberam anticorpo anti-granulócitos (i.v.) e após 36 horas receberam o mitógeno Con A. Verificamos que a depleção dos neutrófilos diminuiu a atividade do sistema NADPH oxidase e a capacidade fagocítica e microbicida dos macrófagos, entretanto não comprometeu a atividade das enzimas mieloperoxidase (MPO) e óxido nítrico sintase (iNOS). Para estudarmos o efeito de melatonina, AFMK e AMK sobre a ativação de macrófagos, avaliamos a produção de citocinas e a atividade microbicida destas células. Primeiramente, acompanhamos a liberação de citocinas em cultura de células mononucleares humanas. Melatonina, AFMK e AMK inibiram a liberação de TNF-α, IL-12 e IFN-γ, mas não afetaram a liberação de IL-10. Num estudo posterior, macrófagos murino ativados com IFN-γ e infectados com T. cruzi foram incubados com melatonina, AFMK e AMK. Esta incubação resultou na diminuição de NO e aumento da replicação intracelular do parasita T. cruzi. Em conclusão, mostramos duas maneiras nas quais a ativação de macrófagos pode ser modulada. A primeira mostra que a interação de neutrófilos com macrófagos, no foco inflamatório parece ser um fator determinante para a atividade microbicida de macrófagos. E a segunda mostra que a interação da melatonina e seus produtos de oxidação com macrófagos contribui para a desativação do processo inflamatório, ampliando o conhecimento sobre o papel imunomodulador descrito para melatonina. / This study we evaluate macrophage activation by (i) neutrophils and (ii) melatonin and its oxidation products N1-acetyl-N2-formyl-5-methoxykynuramine (AFMK) and N1-acetyl-5-methoxykynuramine (AMK). Neutrophils role in macrophage activation was studied by an experimental model when mice C57BL/6 was injected with antigranulocyte antibody and 36 hours later they received the mitogenic ConA. We verified that neutrophil depletion decreased NADPH oxidase system activity, macrophage phagocytic and microbicide capacity. However, mieloperoxidase (MPO) and nitric oxide sintase (iNOS) activity was not compromised. Melatonin, AFMK and AMK effect in macrophage activation was evaluated by the cytokines production and microbicide activity of theses cells. We verified cytokines release in human mononuclear cells culture. Melatonin, AFMK and AMK inhibited TNF-α, IL-12 and IFN-γ release, but IL-10 was not affected. After that, IFN-γ-activated murine macrophage was infected with T. cruzi and incubated with melatonin, AFMK and AMK. We verify NO decrease and that intracellular replication of the parasite T. cruzi increased. In conclusion, we showed that there is two modulation ways for macrophage activation. First, neutrophil -macrophage interaction in inflammatory site seems to be a determinant factor to macrophage microbicide activity. And second, macrophage interaction with melatonin hormone and its oxidation products leads to deactivation of the inflammatory process, raising knowledge of immunomodulatory role described to melatonin.

Neste estudo são comparados os níveis de citocinas plasmáticas circulantes e as populações periféricas de células Treg CD4+CD25+, com base na expressão de FOXP3 e CTLA-4, e de células dendríticas (DCs) em indivíduos infectados por P. falciparum, P.vivax ou co-infectados por ambas as espécies e em controles saudáveis, porém expostos à malária, provenientes de uma área de transmissão instável na Amazônia brasileira. Amostras sangüineas de 76 pacientes infectados e de 18 controles expostos foram coletadas e processadas para a obtenção de células mononucleares. As populações celulares foram avaliadas por citometria de fluxo e os níveis de citocinas circulantes, pela técnica de ELISA de captura. A infecção aguda induziu aumento no percentual de células CD4+CD25+FOXP3+CTLA-4+ (p=0,0029; teste de Kruskal-Wallis) e redução no número absoluto de DCs (p=0,0008; teste de Kruskal-Wallis); mas esses efeitos ocorreram independente da espécie do parasito infectante. Entre os pacientes com malária vivax, 35-40% apresentaram baixa proporção de DCs que expressam a molécula co-estimulatória CD86. A única variável associada à baixa proporção de DCs CD86+ foi a proporção de células CD4+CD25+FOXP3+ que expressam CTLA-4. Em relação aos níveis de citocinas circulantes observou-se aumento nos níveis de IFN-<font face=\"Symbol\">&#947 na infecção por P. falciparum (p=0,0050; teste de Kruskal-Wallis). Apesar da concentração de IL-10 estar elevada em todos os indivíduos infectados em relação aos controles expostos (p<0,0001; teste de Kruskal-Wallis) esses níveis foram bem mais expressivos em indivíduos com malária vivax. Plasmodium falciparum e P. vivax parecem estimular diferentes padrões de resposta imune no hospedeiro, mesmo quando a comparação envolve somente indivíduos com malária não-complicada expostos a níveis semelhantes de transmissão de malária. / This study compares levels of circulating cytokines and peripheral-blood populations of CD4+CD25+ Treg cells, based on the expression of FOXP3 and CTLA-4, and dendritic cells (DCs) in individuals infected with P. falciparum, P. vivax or co-infected with both species and in healthy controls living in an area of unstable transmission of malaria in the Brazilian Amazon. Blood samples from 76 malaria patients and 18 malaria-exposed but non-infected controls were collected and processed to obtain mononuclear cells. Cell populations were characterized by flow cytometry and levels of circulating cytokines were measured by capture ELISA. Acute infection induced an increase in the proportion of CD4+CD25+FOXP3+CTLA-4+ cells (p= 0.0029, Kruskal-Wallis) and a decrease in the absolute number of DCs (p= 0.0008, Kruskal-Wallis), being both effects independent of the infecting parasite species. 35-40% of the P. vivax-infected subjects (but none in the other groups of subjects) had few circulating DCs expressing the co-stimulatory molecule CD86, a putative marker of DC activation. The only variable associated with a low proportion of CD86+ DCs was the proportion of CD4+CD25+FOXP3+ expressing CTLA-4. Analysis of circulating cytokine levels revealed increased levels of IFN- <font face=\"Symbol\">&#947 in P. falciparum infection (p= 0.0050, Kruskal-Wallis); although IL-10 levels were high in all infected individuals, compared with exposed controls (p<0.0001, Kruskal-Wallis), the increase was much more pronounced in vivax malaria. Plasmodium falciparum and P. vivax</i. appear to stimulate different patterns of immune response in humans, even when comparisons are limited to individuals with uncomplicated malaria exposed to similar levels of malaria transmission.

Acredita-se que as células dendríticas (DCs) sejam as mais eficientes na ativação de linfócitos T (LT) naive. Com a possibilidade de geração in vitro de DCs, muitos protocolos explorando este potencial vêm sendo desenvolvidos, principalmente em abordagens imunoterapêuticas para o câncer. Todavia, em situações fisiológicas a apresentação antigênica dificilmente ocorre por um tipo celular único. Deste modo, este trabalho investigou os padrões de reposta de LT induzidos por DCs maduras (mDCs) em combinação com diferentes APCs, incluindo linfócitos B, monócitos, macrófagos e DCs imaturas. Os padrões de resposta gerados pelos LT foram analisados por citometria de fluxo, ELISA e BIOPLEX. A estimulação dos LT pelas mDCs isoladas apresentaram o maior poder de estimulação, seguidas pelas outras APCs. Todas as combinações diminuiram a resposta induzida pelas mDCs, principalmente de LT CD4+. Deste modo, os dados confirmam o efeito das interações de APCs na estimulação de LT provendo ferramentas para o refinamento de abordagens imunoterapêuticas. / Dendritic cells (DC) are the main APC able to activate T cells (TC). Since they may be generated in vitro, many protocols based on their immunostimulatory potential are currently underway, mainly in immunotherapeutic approaches for cancer. In physiological conditions, however, other APC may participate in antigen presentation, thus influencing the immune response pattern developed. Therefore, the aim of this study was to evaluate the TC response patterns induced in vitro by mature DC (mDC) combined with different APC, including B cells, monocytes, macrophages and immature DC. The response patterns were analyzed flow cytometry, ELISA and Multiplex flow immunoassay. The TC stimulation by isolated mDC presented the highest capacity of stimulation, followed by the other APC. All combinations decreased the response induced by mDC, mainly CD4+ T cells. These data confirm the effects of APC interactions upon TC stimulation and may provide a tool for fine-tuning of immune response induction in immunotherapeutic approaches.

O desenvolvimento da imunoterapia do câncer baseada em células dendríticas (DCs) é alvo de vários estudos. Para tumores sólidos, a abordagem baseada no uso de DCs alogenêicas fundidas com células tumorais tem se mostrado relativamente eficaz. Por outro lado, esta estratégia necessita uma massa tumoral considerável de cada paciente para a geração das células híbridas. Para contornar este problema o uso de DCs transfectadas com mRNA tumoral, o qual pode ser amplificado in vitro a partir de uma pequena amostra inicial do tumor, tem sido investigado. Para isto, uma transfecção eficiente e tradução correta do mRNA tumoral nas DCs são etapas críticas. Sabendo-se que as DCs de pacientes com câncer possuem atividade aloestimuladora defeituosa, DCs derivadas de doadores saudáveis poderiam ser uma alternativa para induzir uma resposta imune mais eficiente. Assim, este trabalho pretendeu aprimorar a metodologia de transfecção de DCs alogenêicas, derivadas de monócitos de doadores saudáveis, com mRNA de antígenos tumorais (survivina e RPSA) super-expressos na leucemia linfóide crônica (LLC) e avaliar sua capacidade em estimular a resposta linfocitária. Ao mesmo tempo, foram estabelecidas as metodologias para amplificação e síntese do RNA destes antígenos tumorais específicos, assim como do RNA mensageiro total, contidos nas células tumorais de pacientes com LLC. Os resultados mostraram ser possível a amplificação do mRNA total extraído das células leucêmicas com manutenção da expressão dos antígenos tumorais. Ainda, várias condições de transfecção com mRNA da survivina, transcrito in vitro, foram testadas, encontrando-se na lipofecção, a melhor maneira de transfectar as DCs. A lipofecção mostrou-se com baixa toxicidade quando comparada à técnica de eletroporação. Observou-se uma eficiência em torno de 40% de células transfectadas num intervalo de tempo entre 12 e 48 horas. Estas células foram usadas como estimuladoras em ensaios de proliferação usando-se linfócitos T alogenêicos como células respondedoras. As células transfectadas com mRNA da survivina foram capazes de estimular resposta linfoproliferativa com maior produção de IFN-gama, avaliado por ELISA. Além disso, a transfecção não alterou o padrão de expressão dos marcadores de superfície característicos das DCs. Estes dados mostram que a transfecção das DCs com mRNA pode afetar a resposta imune induzida por estas APCs. Nossos resultados suportam o uso de DCs transfectadas com mRNA para produção de vacinas anti-tumorais e mostram a survivina como um potente antígeno indutor da resposta linfocitária. / The development of dendritic cell (DC)-based cancer immunotherapy has been the target of many studies. For solid tumors, a promising approach based in allogeneic DCs fused to tumor cells has been relatively effective. On the other hand, this approach needs large tumor samples to generate enough DC-tumor cell hybrids. To overcome this problem, tumor mRNA-transfected DCs can be used, since mRNA can be amplified in vitro and allow unlimited vaccine production. For this, efficient transfection and optimal translation of tumor mRNA in DCs are critical. Moreover, DC derived from cancer patients has defective alostimulatory activity. In this case, DC derived from healthy donors may be an alternative to induce immune response more efficiently. Here, we established the methodology of allogeneic DC transfection with mRNA for tumor antigens (survivin and RPSA) overexpressed in chronic lymphocytic leukemia (CLL), and evaluated their ability for T cell stimulation. At the same time, we established mRNA amplification and mRNA in vitro transcription methodology for specific tumor antigens and total messenger RNA, present in CLL tumor cells. Our results showed it to be possible to amplify total mRNA derived from leukemic cells maintaining tumor antigen expression. Moreover, several transfection conditions using survivin mRNA obtained from in vitro transcript reactions were evaluated, defining lipofection as the better way to transfect DC. We obtained nearly 40% of transfected DCs between 12 and 48 hours. Transfected DCs were used as stimulator cells in proliferation assays using allogeneic T cells as responder cells. Survivin mRNA transfected DCs were able to stimulate T cell proliferation with increased IFN-gama production, measured by ELISA. Furthermore, the transfection did not change the pattern of surface molecules expression characteristic of DC. These data show that mRNA DC transfection can affect immune responses induced by these APCs. These findings support the use of tumor mRNA transfected DCs for anti-cancer vaccine production and show survivin as a potent antigen to induce T cell responses.

Os glicocorticóides endógenos (GCen) são moduladores importantes das reações inflamatórias, com papel em diferentes aspectos do processos. Neste contexto, tem sido demonstrado que os GCen controlam a migração de leucócitos para os focos de lesões, e um dos mecanismos propostos tem sido o efeito inibitório sobre os fenômenos de interação leucócito-endotélio. Uma vez que as moléculas de adesão medeiam os processos de interação celular, tem sido evidenciado que os GCen controlam, direta ou indiretamente, a expressão destes receptores nas membranas celulares na vigência de estresse de diferentes origens. No entanto, a literatura ainda é fragmentária e controversa quanto aos mecanismos exatos desta interferência. Desta forma, este trabalho tem por objetivo investigar o papel dos GCen sobre a expressão de moléculas de adesão envolvidas na interação leucócito-endotélio, e os possíveis mecanismos intracelulares responsáveis pelos efeitos. A deficiência de GCen foi induzida em ratos Wistar machos, adultos por adrenalectomia bilateral. A participação de receptores de glicocorticoides (GC) foi avaliada em ratos normais tratados com o antagonista RU 38486. Animais falso-operados (FO), ou normais (N) foram empregados como controles. A deficiência hormonal foi constatada pela dosagem de corticosterona plasmática por radioimunoensaio e demonstraram valores significativamente baixos em animais adrenalectomizados (ADR). Ensaios de microscopia intravital mostraram que aumento exacerbado de leucócitos em comportamento \"rolling\" em vênulas pós-capilares de animais adrenalectomizados (ADR) não reflete alterações hemodinâmicas, uma vez que a deficiência hormonal não provocou modificações no diâmetro ou fluxo sangüíneo de vasos da microcirculação do músculo cremaster. No entanto, a determinação da expressão de moléculas de adesão em leucócitos circulantes por citometria de fluxo mostrou que neutrófilos de animais ADR apresentaram maior expressão de L-selectina que células de animais controles. Por outro lado, a expressão de L-selectina em granulócitos maduros presentes na medula óssea de animais ADR estava diminuída em comparação com células de animais controles. Este efeito pode estar envolvido com a maturação acelerada destas células na medula e com a neutrofilia detectada em animais ADR. É importante salientar que a estimulação de polimorfonucleares (PMN), coletados tanto do sangue como da medula, com fMLP mostrou que estas células estavam aptas a aumentar a expressão da molécula, indicando que as alterações nas suas expressões em animais ADR não são dependentes de modificações na capacidade de síntese. Adicionalmente, a ação dos GCen sobre a expressão de L-selectina parece não depender do GC, já que animais normais tratados com RU 38486 não apresentaram o mesmo padrão de alteração observada em animais ADR. Com o intuito de identificar os efeitos dos GCen sobre a capacidade individual de aderência do endotélio e do neutrófilo, ensaio de aderência in vitro foram realizados com cultura primária de célula endotelial (CE) obtida do músculo cremaster e com neutrófilos coletados da aorta abdominal. Os dados obtidos mostraram que menor número de PMN provenientes de animais ADR aderiram à CE de animal normal, mas por outro lado, a maior número de PMN de animais controles aderiram à CE de animais ADR. Em conjunto, estes dados indicam um controle diferente dos GCen sobre as células envolvidas no processo: facilitam a aderência de PMN e diminuem a aderência da CE. A investigação do papel dos GCen sobre a expressão de moléculas de adesão envolvidas no processo mostrou que os hormônios não interferem com a expressão basal de &#946;2 integrina nos leucócitos, tanto nos circulantes quanto nos da medula. Adicionalmente, os dados de imunohistoquímica indicaram que os GCen modulam a expressão de moléculas responsáveis pela aderência. A expressão de ICAM-1 e PECAM-1 é significativamente maior no endotélio de vênulas de animais ADR que de animais controles. Associados, os dados aqui obtidos em animais ADR indicam um papel diferente dos CCen sobre a interação leucócito-endotélio. A modulação sobre a expressão de L-selectina pode estar envolvida na mobilização de neutrófilos para circulação e no comportamento rolling destas células. A subseqüente aderência dos leucócitos ao endotélio parece ser dependente de ações sobre a célula endotelial, através da modulação da expressão de moléculas da superfamília das imunoglobulinas. / The endogenous glucocorticoids (GCen) are important modulators of inflammatory reactions, acting in different aspects of the processes. In this context, it has been shown that GCen control leukocyte migration into focus of injuries, and one proposed mechanism of action is the modulation on leukocyte-endothelium interactions. Since adhesion molecules mediate cellular interactions, it has been evidenced that GCen control, direct or indirectly, the expression of these receptors on the cellular membranes during different stress conditions. However, data described in the literature are fragmentary and controversial. Then, the aim of this work was to investigate the role of the GCen on expressions of adhesion molecules involved in leukocyte-endothelium interactions and the possible intracellular mechanisms responsible for the effects. Adult male Wistar rats were submitted to bilateral adrenalectomy to induce adrenal hormone deficiency. The participation of glucocorticoid cytosolic receptor (GC) on the effects was evaluated in rats pre-treated with the glucocorticoid receptor antagonist RU 38 486. Sham-operated or normal rats were used as control. The hormone deficiency was assessed by quantification the plasmatic corticosterone by radioimmunoassay. Data showed marked lower values in adrenalectomized (ADR) than control rats. Intravital microscopy assays showed that the higher number of roller leukocytes in the postcapillary venules from cremaster muscle from ADR animals does not reflect hemodynamic alterations, given that hormonal deficiency did not modify the diameter or blood flow of microcirculation vessels. However, the determination of adhesion molecule expressions on circulating leukocytes by flow cytometry assay showed that neutrophils from ADR animals presented higher expression of L-selectin than cells from control animals. On the other hand, the expression of L-selectin on membranes of mature granulocytes in the bone marrow was decreased on cells from ADR rats. Together, these data suggest that modulation on L-selectin expression may be important target point of GE control and it may participate of the accelerated maturation of segmented cells in bone marrow, neutrophilia and in the elevated number of rolling leukocytes detected in ADR animals. It is important to emphasize that alterations on L-selectin expression on cells from ADR rats seem do not reflect an inability of its synthesis, since its expression after in vitro fMLP (formyl-Met-Leu-Phe) stimulation was not modified by hormonal deficiency. Additionally, the effect on L-selectin expression on circulating neutrophils may not be depend on the GC, since normal animal treated with RU 38486 presented expressions of L-selectin equivalent to those found in cells from control rats. To identify the effects of hormonal deficiency on individual ability of endothelium or neutrophils adherence, in vitro adherence assay was performed using both primary cultured endothelium from cremaster muscle and neutrophils collected from abdominal aorta. The results demonstrated that lesser number of PMN collected from ADR animals adhered to normal endothelium, while higher number of normal neutrophils adhered to endothelium from ADR rats. These latter results were corroborated by quantification of adhesion molecules expressions involved on adherence process by blood flow cytometer or by immunohistochemistry. The hormonal deficiency did not modify the &#946;2 integrin expression on leukocytes, but enhanced the ICAM-1 and PECAM-1 expression on endothelium membrane of cremaster muscle venules from ADR animals. Together data obtained in ADR animals may indicate a different role of the GE on cells during the leukocyte-endothelium interaction. The modulation on L-selectin may be involved on neutrophil delivery into circulation and on the rolling of circulating neutrophils. The subsequent adherence of leukocytes to endothelium seems to be dependent on actions on endothelial cells, through modulation of expressions of immunoglobulins superfamily molecules.

Uma fração considerável de pacientes com doença de Chagas, decorrente da infecção pelo protozoário Trypanosoma cruzi, desenvolve a cardiopatia crônica, que pode levar a morte. A regulação da resposta imune específica contra o parasita é essencial para controlar a atividade efetora excessiva anti-T. cruzi. Na falta dessa regulação, a resposta imune acaba por induzir lesão dos tecidos. Uma vez que, em hipótese, componentes autoimune participam da cardiopatia chagásica, a regulação da resposta poderia ser necessária para controlar a reatividade contra o próprio. Nesta tese, nós avaliamos o envolvimento das células T reguladoras (TREG) em modelo murino de doença crônica de Chagas. Na fase aguda, período em que ocorre uma forte ativação policlonal de linfócitos, observa-se um pequeno aumento no número de células esplênicas CD4+CD25+FoxP3+ TREG, no entanto, um aumento de maior magnitude ocorre nas células efetoras CD4+CD25+FoxP3-. O tratamento de camundongos na fase aguda da infecção com MoAb anti-CD25 (PC61) resulta em discreta redução no número de células TREG, mas essa não afeta os níveis de parasitemia ou patologia do coração na fase aguda. Na fase crônica, os números de células TREG dos animais crônicos retornam aos mesmos níveis dos observados nos animais não infectados, no entanto, o número de esplenócitos CD4+ está discretamente aumentado. O tratamento de camundongos crônicos com PC61 resulta em uma redução no número de células TCD4+CD25+ e uma tendência à redução no número de células CD4+FoxP3+. Mais importante, a resposta imune anti- T. cruzi, carga parasitária sistêmica e patologia cardíaca não foram consistentemente alteradas nos grupos tratados com PC61 em comparação aos tratados com o controle isotípico ou IgG de rato. O fato do tratamento com MoAb PC61 não modificar a patologia do coração de camundongos crônicos pode ser devido a depleção incompleta das células TREG, ou a um pequeno envolvimento das TREG no controle dos mecanismos efetores anti- T. cruzi. / A large fraction of patients with Chagas disease, an illness due to infection by protozoan Trypanosoma cruzi, develops chronic myocardiopathy that often leads to death. Regulation of parasite-specific immune responses is essential to control excessive anti-T. cruzi effector activity that may result in tissue damage. Moreover, because autoimmunity has been hypothesized to contribute to Chagas myocardiopathy, regulation could be also necessary to control anti-self reactivity. In this paper we evaluated the involvement of TREG in a murine model of chronic T. cruzi infection. In the acute phase, a period when there is strong polyclonal lymphocyte activation, a small increase in the number of CD4+CD25+FoxP3+ spleen cells (TREG) cells is observed, albeit of considerably lower magnitude than that of CD4+CD25+FoxP3- effector cells. Treatment of acutely-infected mice with anti-CD25 (PC61) mAb results in discrete reduction of TREG cell numbers, but it does not affect parasitaemia levels or acute phase heart pathology. At the chronic phase, TREG cells numbers return to numbers of non-infected mice, in spite that the total number of CD4+ splenocytes is discretely increased in chronic mice. Treatment of chronic mice with PC61 results in a reduction in TCD4+CD25+ cell numbers, but in a small, non significant reduction in total CD4+FoxP3+ cells. More important, the anti-T. cruzi immune response, systemic parasite load and heart pathology were not consistently altered in PC61-treated chronic mice compared to mice treated with isotypic control antibodies or normal rat IgG. Failure to modify heart pathology in PC61-treated chronic mice could be due to incomplete TREG depletion or to discrete involvement of TREG in control of the anti-T. cruzi effector mechanisms.

O desenvolvimento da imunoterapia do câncer baseada em células dendríticas (DCs) é alvo de vários estudos. Para tumores sólidos, a abordagem baseada no uso de DCs alogenêicas fundidas com células tumorais tem se mostrado relativamente eficaz. Por outro lado, esta estratégia necessita uma massa tumoral considerável de cada paciente para a geração das células híbridas. Para contornar este problema o uso de DCs transfectadas com mRNA tumoral, o qual pode ser amplificado in vitro a partir de uma pequena amostra inicial do tumor, tem sido investigado. Para isto, uma transfecção eficiente e tradução correta do mRNA tumoral nas DCs são etapas críticas. Sabendo-se que as DCs de pacientes com câncer possuem atividade aloestimuladora defeituosa, DCs derivadas de doadores saudáveis poderiam ser uma alternativa para induzir uma resposta imune mais eficiente. Assim, este trabalho pretendeu aprimorar a metodologia de transfecção de DCs alogenêicas, derivadas de monócitos de doadores saudáveis, com mRNA de antígenos tumorais (survivina e RPSA) super-expressos na leucemia linfóide crônica (LLC) e avaliar sua capacidade em estimular a resposta linfocitária. Ao mesmo tempo, foram estabelecidas as metodologias para amplificação e síntese do RNA destes antígenos tumorais específicos, assim como do RNA mensageiro total, contidos nas células tumorais de pacientes com LLC. Os resultados mostraram ser possível a amplificação do mRNA total extraído das células leucêmicas com manutenção da expressão dos antígenos tumorais. Ainda, várias condições de transfecção com mRNA da survivina, transcrito in vitro, foram testadas, encontrando-se na lipofecção, a melhor maneira de transfectar as DCs. A lipofecção mostrou-se com baixa toxicidade quando comparada à técnica de eletroporação. Observou-se uma eficiência em torno de 40% de células transfectadas num intervalo de tempo entre 12 e 48 horas. Estas células foram usadas como estimuladoras em ensaios de proliferação usando-se linfócitos T alogenêicos como células respondedoras. As células transfectadas com mRNA da survivina foram capazes de estimular resposta linfoproliferativa com maior produção de IFN-gama, avaliado por ELISA. Além disso, a transfecção não alterou o padrão de expressão dos marcadores de superfície característicos das DCs. Estes dados mostram que a transfecção das DCs com mRNA pode afetar a resposta imune induzida por estas APCs. Nossos resultados suportam o uso de DCs transfectadas com mRNA para produção de vacinas anti-tumorais e mostram a survivina como um potente antígeno indutor da resposta linfocitária. / The development of dendritic cell (DC)-based cancer immunotherapy has been the target of many studies. For solid tumors, a promising approach based in allogeneic DCs fused to tumor cells has been relatively effective. On the other hand, this approach needs large tumor samples to generate enough DC-tumor cell hybrids. To overcome this problem, tumor mRNA-transfected DCs can be used, since mRNA can be amplified in vitro and allow unlimited vaccine production. For this, efficient transfection and optimal translation of tumor mRNA in DCs are critical. Moreover, DC derived from cancer patients has defective alostimulatory activity. In this case, DC derived from healthy donors may be an alternative to induce immune response more efficiently. Here, we established the methodology of allogeneic DC transfection with mRNA for tumor antigens (survivin and RPSA) overexpressed in chronic lymphocytic leukemia (CLL), and evaluated their ability for T cell stimulation. At the same time, we established mRNA amplification and mRNA in vitro transcription methodology for specific tumor antigens and total messenger RNA, present in CLL tumor cells. Our results showed it to be possible to amplify total mRNA derived from leukemic cells maintaining tumor antigen expression. Moreover, several transfection conditions using survivin mRNA obtained from in vitro transcript reactions were evaluated, defining lipofection as the better way to transfect DC. We obtained nearly 40% of transfected DCs between 12 and 48 hours. Transfected DCs were used as stimulator cells in proliferation assays using allogeneic T cells as responder cells. Survivin mRNA transfected DCs were able to stimulate T cell proliferation with increased IFN-gama production, measured by ELISA. Furthermore, the transfection did not change the pattern of surface molecules expression characteristic of DC. These data show that mRNA DC transfection can affect immune responses induced by these APCs. These findings support the use of tumor mRNA transfected DCs for anti-cancer vaccine production and show survivin as a potent antigen to induce T cell responses.

A Imunodeficiência de Variável Comum (ICV) é caracterizada por baixos níveis de imunoglobulinas com susceptibilidade a. Analisamos a distribuição de linfócitos, apoptose espontânea e a expressão gênica de receptores de morte, ligantes, adaptadores, moléculas reguladoras, inibidoras e anti-apotóticas em células CD4+ e CD8+ de 19 pacientes ICV e 19 controles. Pacientes com ICV apresentam diminuição na frequência de linfócitos TCD4+ e CD4+CD45RA+ e menor relação CD4/CD8 que indivíduos saudáveis. O grupo de pacientes mostrou maior frequência de apoptose espontânea em linfócitos totais e CD4+. Células CD4+ dos indivíduos afetados apresentaram menor expressão gênica de TRAIL-R, BCL-2, FLIPL e FADD; células CD8+ apresentaram diminuição da expressão gênica de TRAIL, FADD, BCL-2, BCL -xL e um aumento de FLIPs. Os resultados sugerem um desequilíbrio nos mecanismos que controlam a apoptose de linfócitos nestes pacientes, o que pode ajudar a elucidar as alterações observadas no compartimento de células T dos pacientes com ICV. / Common Variable Immunodeficiency (CVID) is is characterized by low immunoglobulins levels with susceptibility to infections. We have analyzed T cell distribution and spontaneous apoptosis in peripheral blood of CVID, as well as gene expression of several molecules involved in apoptosis, including death receptors, ligands, adapters, regulatory and anti-apototic molecules in CD4+ and CD8+ cells of 19 CVID patients and 19 healthy subjects. CVID subjects present decreased frequency of TCD4+ and CD4+ CD45RA+ cells and lower CD4/CD8 ratio than healthy controls. CVID group also presented higher frequency of spontaneous apoptosis in lymphocytes and CD4+ cells. CD4+ showed lower expression of TRAIL-R, BCL-2, FLIPL and FADD; CD8+ cells presented lower expression of TRAIL, FADD, BCL-2, BCL-xL and a augment of FLIP. Results suggest an imbalance in mechanisms controlling cell death of those patients lymphocytes, which might help to elucidate the changes observed in T cell compartment of CVID patients.

Os glicocorticóides endógenos (GCen) são moduladores importantes das reações inflamatórias, com papel em diferentes aspectos do processos. Neste contexto, tem sido demonstrado que os GCen controlam a migração de leucócitos para os focos de lesões, e um dos mecanismos propostos tem sido o efeito inibitório sobre os fenômenos de interação leucócito-endotélio. Uma vez que as moléculas de adesão medeiam os processos de interação celular, tem sido evidenciado que os GCen controlam, direta ou indiretamente, a expressão destes receptores nas membranas celulares na vigência de estresse de diferentes origens. No entanto, a literatura ainda é fragmentária e controversa quanto aos mecanismos exatos desta interferência. Desta forma, este trabalho tem por objetivo investigar o papel dos GCen sobre a expressão de moléculas de adesão envolvidas na interação leucócito-endotélio, e os possíveis mecanismos intracelulares responsáveis pelos efeitos. A deficiência de GCen foi induzida em ratos Wistar machos, adultos por adrenalectomia bilateral. A participação de receptores de glicocorticoides (GC) foi avaliada em ratos normais tratados com o antagonista RU 38486. Animais falso-operados (FO), ou normais (N) foram empregados como controles. A deficiência hormonal foi constatada pela dosagem de corticosterona plasmática por radioimunoensaio e demonstraram valores significativamente baixos em animais adrenalectomizados (ADR). Ensaios de microscopia intravital mostraram que aumento exacerbado de leucócitos em comportamento \"rolling\" em vênulas pós-capilares de animais adrenalectomizados (ADR) não reflete alterações hemodinâmicas, uma vez que a deficiência hormonal não provocou modificações no diâmetro ou fluxo sangüíneo de vasos da microcirculação do músculo cremaster. No entanto, a determinação da expressão de moléculas de adesão em leucócitos circulantes por citometria de fluxo mostrou que neutrófilos de animais ADR apresentaram maior expressão de L-selectina que células de animais controles. Por outro lado, a expressão de L-selectina em granulócitos maduros presentes na medula óssea de animais ADR estava diminuída em comparação com células de animais controles. Este efeito pode estar envolvido com a maturação acelerada destas células na medula e com a neutrofilia detectada em animais ADR. É importante salientar que a estimulação de polimorfonucleares (PMN), coletados tanto do sangue como da medula, com fMLP mostrou que estas células estavam aptas a aumentar a expressão da molécula, indicando que as alterações nas suas expressões em animais ADR não são dependentes de modificações na capacidade de síntese. Adicionalmente, a ação dos GCen sobre a expressão de L-selectina parece não depender do GC, já que animais normais tratados com RU 38486 não apresentaram o mesmo padrão de alteração observada em animais ADR. Com o intuito de identificar os efeitos dos GCen sobre a capacidade individual de aderência do endotélio e do neutrófilo, ensaio de aderência in vitro foram realizados com cultura primária de célula endotelial (CE) obtida do músculo cremaster e com neutrófilos coletados da aorta abdominal. Os dados obtidos mostraram que menor número de PMN provenientes de animais ADR aderiram à CE de animal normal, mas por outro lado, a maior número de PMN de animais controles aderiram à CE de animais ADR. Em conjunto, estes dados indicam um controle diferente dos GCen sobre as células envolvidas no processo: facilitam a aderência de PMN e diminuem a aderência da CE. A investigação do papel dos GCen sobre a expressão de moléculas de adesão envolvidas no processo mostrou que os hormônios não interferem com a expressão basal de &#946;2 integrina nos leucócitos, tanto nos circulantes quanto nos da medula. Adicionalmente, os dados de imunohistoquímica indicaram que os GCen modulam a expressão de moléculas responsáveis pela aderência. A expressão de ICAM-1 e PECAM-1 é significativamente maior no endotélio de vênulas de animais ADR que de animais controles. Associados, os dados aqui obtidos em animais ADR indicam um papel diferente dos CCen sobre a interação leucócito-endotélio. A modulação sobre a expressão de L-selectina pode estar envolvida na mobilização de neutrófilos para circulação e no comportamento rolling destas células. A subseqüente aderência dos leucócitos ao endotélio parece ser dependente de ações sobre a célula endotelial, através da modulação da expressão de moléculas da superfamília das imunoglobulinas. / The endogenous glucocorticoids (GCen) are important modulators of inflammatory reactions, acting in different aspects of the processes. In this context, it has been shown that GCen control leukocyte migration into focus of injuries, and one proposed mechanism of action is the modulation on leukocyte-endothelium interactions. Since adhesion molecules mediate cellular interactions, it has been evidenced that GCen control, direct or indirectly, the expression of these receptors on the cellular membranes during different stress conditions. However, data described in the literature are fragmentary and controversial. Then, the aim of this work was to investigate the role of the GCen on expressions of adhesion molecules involved in leukocyte-endothelium interactions and the possible intracellular mechanisms responsible for the effects. Adult male Wistar rats were submitted to bilateral adrenalectomy to induce adrenal hormone deficiency. The participation of glucocorticoid cytosolic receptor (GC) on the effects was evaluated in rats pre-treated with the glucocorticoid receptor antagonist RU 38 486. Sham-operated or normal rats were used as control. The hormone deficiency was assessed by quantification the plasmatic corticosterone by radioimmunoassay. Data showed marked lower values in adrenalectomized (ADR) than control rats. Intravital microscopy assays showed that the higher number of roller leukocytes in the postcapillary venules from cremaster muscle from ADR animals does not reflect hemodynamic alterations, given that hormonal deficiency did not modify the diameter or blood flow of microcirculation vessels. However, the determination of adhesion molecule expressions on circulating leukocytes by flow cytometry assay showed that neutrophils from ADR animals presented higher expression of L-selectin than cells from control animals. On the other hand, the expression of L-selectin on membranes of mature granulocytes in the bone marrow was decreased on cells from ADR rats. Together, these data suggest that modulation on L-selectin expression may be important target point of GE control and it may participate of the accelerated maturation of segmented cells in bone marrow, neutrophilia and in the elevated number of rolling leukocytes detected in ADR animals. It is important to emphasize that alterations on L-selectin expression on cells from ADR rats seem do not reflect an inability of its synthesis, since its expression after in vitro fMLP (formyl-Met-Leu-Phe) stimulation was not modified by hormonal deficiency. Additionally, the effect on L-selectin expression on circulating neutrophils may not be depend on the GC, since normal animal treated with RU 38486 presented expressions of L-selectin equivalent to those found in cells from control rats. To identify the effects of hormonal deficiency on individual ability of endothelium or neutrophils adherence, in vitro adherence assay was performed using both primary cultured endothelium from cremaster muscle and neutrophils collected from abdominal aorta. The results demonstrated that lesser number of PMN collected from ADR animals adhered to normal endothelium, while higher number of normal neutrophils adhered to endothelium from ADR rats. These latter results were corroborated by quantification of adhesion molecules expressions involved on adherence process by blood flow cytometer or by immunohistochemistry. The hormonal deficiency did not modify the &#946;2 integrin expression on leukocytes, but enhanced the ICAM-1 and PECAM-1 expression on endothelium membrane of cremaster muscle venules from ADR animals. Together data obtained in ADR animals may indicate a different role of the GE on cells during the leukocyte-endothelium interaction. The modulation on L-selectin may be involved on neutrophil delivery into circulation and on the rolling of circulating neutrophils. The subsequent adherence of leukocytes to endothelium seems to be dependent on actions on endothelial cells, through modulation of expressions of immunoglobulins superfamily molecules.