Made available in DSpace on 2015-03-26T13:46:42Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 113788 bytes, checksum: 1929349f4645b01bcad721a3e55a32ba (MD5) Previous issue date: 2004-12-21 / Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de Minas Gerais / The purpose of this work was to evaluate the effects of rbST on the gestation rate and in the endogenous progesterone concentrations in embryo recipient heifers. Fifty two recipients were selected randomly and allocated in two treatments: (i) The first (T1) - 22 heifers with no application of rbST (Control treatment); (ii) and the second one with 30 heifers, were treated with a single subcutaneous injection of 250 mg rbST (rbST treatment), applied at detected estrus. Heifers from both treatments received fresh embryos, on day six or eight from the detected estrus. At the same time, blood samples were collected from the coccygeal vein or artery so as to perform the progesterone analysis using the radioimmunoassay technique. Twenty eight days after detected estrus, heifers were ultrasonically scanned per rectum to determine the pregnancy rate. No significant difference (P>0.05) was observed in the pregnancy rate between control (50%) and rbST (46.6%) treated heifers, or in the progesterone concentration, with mean values of 1.71 ± 0.74 ng/mL, and by 1.48 ± 0.72 ng/mL for control and rbST treated animals, respectively. In conclusion, the application of 250 mg rbST, at detected estrus in heifers, was not effective to increases pregnancy rate and progesterone concentration. / O objetivo deste trabalho foi avaliar a taxa de gestação e concentração sérica de progesterona, em novilhas receptoras de embrião, tratadas com dose única de rbST. Foram selecionadas 52 novilhas como receptoras, distribuídas aleatoriamente em dois tratamentos (T1 e T2), onde T1 corresponde a 22 novilhas que não receberam rbST (controle), e T2 a 30 novilhas que receberam 250 mg de rbST por via subcutânea, na fossa ísqueo-retal, durante o estro. As novilhas de ambos tratamentos foram inovuladas com embriões recém coletados entre o sexto e oitavo dia do ciclo estral. No momento da transferência dos embriões, coletou-se sangue da veia ou artéria coccígea para análise da concentração sérica de progesterona pela técnica de radioimunoensaio. A taxa de gestação foi determinada por ultra-som, 28 dias após a detecção do estro das receptoras. Observou-se um total de 14 novilhas gestantes (46,6%) nos animais do tratamento 2 e 11 novilhas gestantes nos animais do tratamento 1. Nenhum efeito (P>0,05) foi evidenciado com o uso da rbST sobre a taxa de gestação. A concentração média de progesterona no dia da inovulação dos embriões foi de 1,71 ± 0,74 ng/mL para o grupo de animais do T1 (Controle) e de 1,48 ± 0,72 ng/mL para o grupo de animais do T2 (rbST), não sendo observado diferença (P<0,05). Concluiu-se que a aplicação de 250 mg de rbST, em novilhas receptoras de embrião na detecção de estro, não afetou a concentração sérica de progesterona, nem tampouco a taxa de gestação.

Made available in DSpace on 2016-12-08T16:24:20Z (GMT). No. of bitstreams: 1 PGCA15MA161.pdf: 119035 bytes, checksum: a5dfaf04161545272882e1423c258dc0 (MD5) Previous issue date: 2015-02-27 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The in vitro embryo production has a strong commercial and preservationist impact in Brazil. However, there are still barriers to be overcome, since the in vitro maturation does not mimic the in vivo maturation. The maturation optimization increases the embryo competence and quality, making them more cryotolerants. The meiotic blockage, after oocytes removal from their follicular environment, may be a good alternative. Three experiments (n = 2848) evaluated the Cordicepim as a meiotic blocker in bovine oocytes in different culture media, and its influence on embryonic development. Follicles 3-8 mm diameter, were punctured from abattoir ovaries and allocated into 4 groups: Control (TCM-199 + pyruvate, FSH, LH and SFB); MIVCord (TCM-199 + Pyruvate, FH, LH, FCS, Cordicepim); TCMCor (TCM-199 + Cordicepim) and TCMCont (TCM-199), followed by standard maturation (IVM) for 20 or 24 h. The effect of meiosis blockage in embryo production was assessed by cleavage and blastocyst rate, and total number of cells assessed. To evaluate the stage of maturation, oocytes were stained with Hoechst and evaluated by microscopy. Quantitative data were analyzed by ANOVA and Tukey test and the qualitative data by chi-square, with 5% significance. Cordicepim did not affect cleavage (60.7 vs. 56.4%) and blastocysts (30.7 vs. 24.8%) rates when added to supplemented medium (MIVCord). However, there was a reduction in cleavage (42%) and blastocysts (12.1%) rates when added to a medium without supplements (TCMCord). On the kinetics of maturation after 6 hours of pre culture, only TCMCord group maintained most oocytes blocked. Cell density of the produced embryos (26 h maturation) in MIVcont groups (189.2 ± 11.4), MIVCord (187.1 ± 12.1) and TCMCont (171.2 ± 10.4) did not differ and were higher than TCMCord group (119.7 ± 11.4). Already, with 30 h maturation cell density was similar between embryos from control group (224.2 ± 17.5) and TCMCord group (240.1 ± 10.4). However, even with 30 h maturation, only 64.8% of the oocytes completed maturation in TCMCord group, while 100% maturated in Control group. We conclude that 6 h of culture in cordicepim in the absence of gonadotropins, partially inhibits the meiosis in oocytes, and this inhibition is not successfully reversed even after 24 hours of maturation pattern in the absence of cordicepim. The cordicepim reduces embryo production when in vitro maturation is performed for 26 h. However, within 30 h maturation time, the Cordicepim does not affect embryo production rate. Yet, the cordicepim prevents the cumulus cells expansion in an irreversible manner / A produção in vitro de embriões tem um forte impacto comercial e preservacionista no Brasil. Entretanto ainda existem barreiras a serem superadas, já que a maturação in vivo não é totalmente mimetizada pela maturação in vitro. A otimização da maturação pode aumentar a competência e a qualidade embrionária, tornando-os mais criotolerantes. Uma boa alternativa pode ser o bloqueio meiótico reversível. Três experimentos (n = 2848) avaliaram o Cordicepim como bloqueador meiótico para oócitos bovinos, em diferentes meios de cultivo e sua influência no desenvolvimento embrionário. Folículos de 3-8 mm, obtidos por aspiração de ovários de frigorífico foram distribuídos em 4 grupos: Controle (TCM-199 + piruvato, FSH, LH e SFB) MIVCord (TCM-199 +Piruvato, FH, LH, SFB, Cordicepim) TCMCor (TCM-199 + Cordicepim) e TCMCont (TCM-199), seguido de maturação padrão (MIV) por 20 ou 24 horas. O efeito do bloqueio meiótico na produção de embriões foi avaliado pela taxa de clivagem, blastocisto e número total de células. Para avaliação do estágio de maturação, os oócitos foram corados com Hoechst e avaliados por microscopia. Os dados quantitativos foram submetidos à ANOVA e teste de Tukey e os qualitativos ao qui-quadrado, com 5% de significância. O Cordicepim não influenciou as taxas de clivagem (60,7 vs 56,4%) e blastocistos (30,7 vs 24,8%), quando empregado em meio suplementado (MIVCord). Porém, houve uma redução na taxa de clivagem (42%) e blastocistos (12,1%), quando empregado em meio sem suplementos (TCMCord). Na cinética de maturação nuclear após 6 horas de pré-maturação, apenas o grupo TCMCord manteve a maioria dos oócitos bloqueados (67%). A densidade celular dos embriões produzidos (26 h maturação) nos grupos controle (189,2 ± 11,4), MIVCord (187,1 ± 12,1) e TCMCont (171,2 ± 10,4) não diferiram entre si e foram superiores ao grupo TCMCord (119,7 ± 11,4). Já com 30 h de maturação a densidade celular dos embriões foi semelhante entre os grupos controle 30 (224,2 ± 17,5) e TCMCord 30 (240,1 ± 10,4). Porém, mesmo com 24 h de maturação padrão, apenas 64,8% dos oócitos do grupo TCMCord 30 completaram a maturação, enquanto no grupo controle 100% maturaram. Conclui-se que 6 h de pré-maturação em cordicepim, na ausência de suplementos, inibe parcialmente a meiose em oócitos bovinos, porém esta inibição não é revertida com êxito mesmo após 24 horas de maturação padrão na ausência de cordicepim. O cordicepim reduz a produção de embriões in vitro com 26 h de maturação. Já com 30 h de maturação, o Cordicepim não influencia a taxa de produção embrionária. Ainda, o cordicepim impede de forma irreversível a expansão das células do cumulus

The conservation of the coconut palm has been investigated in recent years by research organizations, public and private. These studies have concentrated on obtaining conservation protocols in vitro using slow growth and cryopreservation. Storage as a means of maintaining the viability of pollen, it is important for the preservation of genetic variability, facilitates the exchange of germplasm and contributes greatly to the generation of variability obtained from artificial crosses increasing the efficiency of breeding programs. The objective of this work was to study the effect of mannitol and abscisic acid (ABA) on growth of seedlings of coconut dwarf accessions for conservation purposes, and in vivo studies of the viability and storage conditions of pollen grains. For the study of conservation by slow growth were used mature zygotic embryos of Gramame Red Dwarf (AVG) and Malayan Yellow Dwarf (AAM). The coconut embryos were inoculated in culture medium Y3 (Eeuwens, 1976) supplemented with 30 g L-1 sucrose, gelled with 0.7% agar in presence of 2.5 g L-1 of activated charcoal. Were tested the following concentrations of mannitol: 0; 0.1; 0.2, 0.3 and 0.4 M. In other experiment was tested the following ABA concentrations: 0, 10, 20, 30 and 40 mM. The 0.1 and 0.2 M mannitol reduced the plantlets length of AAM and AVG accessions, respectively at 180 and 270 days of cultivation. Concentrations above 20 &#956;M ABA were viable to inhibit the plantlets growth to 180 and 270 days. The ABA concentrations tested not inhibit the access AVG growth. For the study of determining the culture medium in germination of pollen grains, it was evaluated four culture media: Brewbaker and Kwack (1983) modified by Sousa et al. (2010); Lora et al. (2006); Sousa et al. (1998) and Sousa et al. (1998) modified by the author, in different times: 0, 24, 48 and 72 hours. The Lora culture medium promoted the major in vitro germination of AVeJBr pollen grains. Pollen grains of AVeJBr access showed viability up to 72 hours (3 days). The condition of storage at -20°C and -80°C promotes more viable pollen germination of AVC access up to 60 days. The condition of storage at -196°C promotes greater availability of pollen germination by AVeJBr access up to 60 days. / A conservação do coqueiro tem sido alvo de estudos nos últimos anos por organizações de pesquisa pública e privada. Essas pesquisas têm se concentrado na obtenção de protocolos por crescimento lento ou criopreservação. O armazenamento, como meio de manutenção da viabilidade do pólen, é importante para a preservação da variabilidade genética, facilita o intercâmbio de germoplasma e contribui muito na geração de variabilidade obtida através de cruzamentos artificiais aumentando a eficiência dos programas de melhoramento genético. O objetivo do trabalho foi de estudar o efeito do manitol e do ácido abscísico (ABA) no crescimento de plântulas de acessos de coqueiro anão para fins de conservação, além de estudos da viabilidade in vivo e condições de armazenamento de grãos de pólen. Para o estudo de conservação por crescimento lento foram utilizados embriões zigóticos maduros de acessos de coqueiro anão vermelho de Gramame (AVG) e anão amarelo da Malásia (AAM) e para estudos da viabilidade in vivo e condições de armazenamento de grãos de pólen o acesso anão verde de Jiqui do Brasil (AVeJBr). Os embriões foram inoculados em meio de cultura Y3 com 30 g L-1 de sacarose, geleificado com 0,7% de ágar na presença de 2,5 g L-1 de carvão ativado. Foram testadas as seguintes concentrações de manitol: 0; 0,1; 0,2; 0,3 e 0,4 M. Em outro ensaio o ABA foi adicionado ao meio de cultura nas concentrações de 0; 10; 20; 30 e 40 &#956;M. As concentrações de 0,1 e 0,2 M de manitol reduziram o comprimento da parte aérea para os acessos AAM e AVG, respectivamente aos 180 e 270 dias de cultivo. Concentrações acima de 20&#956;M do ABA foram viáveis para inibir o crescimento de plântulas aos 180 e 270 dias. O acesso AVG não sofreu inibição do comprimento da parte aérea, quando concentrações de ABA foram adicionadas ao meio de cultura. Foram avaliados quatro meios de cultura para germinação in vitro do acesso AVeJBr: Brewbaker & Kwack (1983) modificado por Sousa et al. (2010); Lora et al. (2006); Sousa et al. (1998) e Sousa et al. (1998) modificado pelo autor, em diferentes tempos: 0, 24, 48 e 72 horas. O meio de cultura de Lora promoveu a maior germinação de grãos de pólen do acesso AVeJBr. Grãos de pólen de coqueiro AVeJBr apresentaram viabilidade média, sob temperatura ambiente, até 72 horas (3 dias). A condição de armazenamento a -20°C e -80°C promove maior viabilidade de grãos de pólen por germinação do acesso AVC até os 60 dias. A condição de armazenamento a -196°C promove maior viabilidade de grãos de pólen por germinação do acesso AVeJBr até os 60 dias.

Orientador: Paulo Henrique Franceschini / Banca: Antônio Cláudio Tedesco / Banca: Francisco Guilherme Leite / Resumo: Os objetivos do estudo foram: avaliar o efeito antioxidante do Trolox® 1) no meio de manutenção de embriões sobre as taxas de concepção (25 e 46 dias) e a perda gestacional de receptoras bovinas Holandesas repetidoras de serviço, em dois períodos (abril-junho/setembro-novembro) e 2) no meio de transporte de oócitos bovinos aspirados de ovários de abatedouro sobre as taxas de clivagem, blastocisto e eclosão in vitro. No Experimento 1, doadoras de embriões foram superovuladas e submetidas à lavagem uterina. Os embriões colhidos foram divididos em dois grupos, deixados em meio com ou sem antioxidante, por 2 a 6h. No Experimento 2, folículos foram aspirados e os complexos cumulus-oócito grau I e II foram divididos em quatro grupos: Controle 8h, Antioxidante 8h, Controle 20h e Antioxidante 20h. Então, foram mantidos em uma transportadora de oócitos (37ºC) por 8 ou 20 horas. Após a maturação, fecundação e cultivo in vitro, as taxas de clivagem (D3), blastocisto (D6, 7 e 9) e eclosão (D11) foram avaliadas. Alíquotas de 200 μL do meio de transporte foram retiradas em cada momento experimental (0, 8 e 20h) para realização dos testes de capacidade antioxidante total (CAT). No Experimento 1, não houve efeito de tratamento sobre as variáveis avaliadas. Foi verificado efeito de período experimental (P=0,001), categoria da doadora (P<0,05), qualidade embrionária (P=0,049) e intervalo Divisão dos Grupos-Inovulação (P<0,0001). No Experimento 2, não houve efeito de tratamento sobre as taxas analisadas. No entanto, houve redução das taxas de clivagem e blastocisto (D7 e 9) nos grupos 20 horas. Ainda, no D6 foram obtidas taxas de blastocisto semelhantes nos grupos Antioxidante 8 e 20h. A análise da CAT evidenciou que o Trolox® auxiliou o combate às ROS. / Abstract: The objectives of the present study were to evaluate the effect of the addition of an antioxidant (Trolox®) 1) to a holding media for bovine in vivo produced embryos, on conception rates 25 and 46 days of pregnancy and pregnancy loss, in Holstein bovine recipients at 4th or more service, during two periods of the year (April-June/September-November) and 2) to a transport media for bovine oocytes aspirated from slaughter house ovaries, on in vitro cleavage, blastocyst and hatching rates. In Experiment 1, donor cows were superovulated and submitted to uterine flushings. The recovered embryos were divided into two groups, kept in holding media with or without antioxidant, for 2-6h. In Experiment 2, follicles were aspirated and cumulus-oocyte complexes grade I and II were divided into four groups: Control 8h, Antioxidant 8h, Control 20h and Antioxidant 20h. Oocytes were kept in a transportable machine (37ºC) for 8 or 20 hours. After in vitro maturation, fertilization and culture, cleavage (D3), blastocyst (D6, 7 and 9) and hatching rates (D11) were evaluated. Samples (200 μL) of the transport media were collected in each experimental moment (0, 8 e 20h) for total antioxidant capacity assay (TACA). In Experiment 1, no effect of treatment was observed. Effects of experimental period (P=0.001), donor category (P<0.05), embryo quality (P=0.049) and interval Group division-embryo transfer (P<0.0001) were detected. In Experiment 2, no effect of treatment was found on the analyzed rates. However, reduction on cleavage and blastocyst (D7 e 9) rates was detected on Groups 20h. Also, on D6 similar blastocyst rates were observed in Groups Antioxidant 8 and 20h. The analysis of TACA evidenced that Trolox® collaborated with the combat against the ROS. / Mestre

The conservation of the coconut palm has been investigated in recent years by research organizations, public and private. These studies have concentrated on obtaining conservation protocols in vitro using slow growth and cryopreservation. Storage as a means of maintaining the viability of pollen, it is important for the preservation of genetic variability, facilitates the exchange of germplasm and contributes greatly to the generation of variability obtained from artificial crosses increasing the efficiency of breeding programs. The objective of this work was to study the effect of mannitol and abscisic acid (ABA) on growth of seedlings of coconut dwarf accessions for conservation purposes, and in vivo studies of the viability and storage conditions of pollen grains. For the study of conservation by slow growth were used mature zygotic embryos of Gramame Red Dwarf (AVG) and Malayan Yellow Dwarf (AAM). The coconut embryos were inoculated in culture medium Y3 (Eeuwens, 1976) supplemented with 30 g L-1 sucrose, gelled with 0.7% agar in presence of 2.5 g L-1 of activated charcoal. Were tested the following concentrations of mannitol: 0; 0.1; 0.2, 0.3 and 0.4 M. In other experiment was tested the following ABA concentrations: 0, 10, 20, 30 and 40 mM. The 0.1 and 0.2 M mannitol reduced the plantlets length of AAM and AVG accessions, respectively at 180 and 270 days of cultivation. Concentrations above 20 μM ABA were viable to inhibit the plantlets growth to 180 and 270 days. The ABA concentrations tested not inhibit the access AVG growth. For the study of determining the culture medium in germination of pollen grains, it was evaluated four culture media: Brewbaker and Kwack (1983) modified by Sousa et al. (2010); Lora et al. (2006); Sousa et al. (1998) and Sousa et al. (1998) modified by the author, in different times: 0, 24, 48 and 72 hours. The Lora culture medium promoted the major in vitro germination of AVeJBr pollen grains. Pollen grains of AVeJBr access showed viability up to 72 hours (3 days). The condition of storage at -20°C and -80°C promotes more viable pollen germination of AVC access up to 60 days. The condition of storage at -196°C promotes greater availability of pollen germination by AVeJBr access up to 60 days. / A conservação do coqueiro tem sido alvo de estudos nos últimos anos por organizações de pesquisa pública e privada. Essas pesquisas têm se concentrado na obtenção de protocolos por crescimento lento ou criopreservação. O armazenamento, como meio de manutenção da viabilidade do pólen, é importante para a preservação da variabilidade genética, facilita o intercâmbio de germoplasma e contribui muito na geração de variabilidade obtida através de cruzamentos artificiais aumentando a eficiência dos programas de melhoramento genético. O objetivo do trabalho foi de estudar o efeito do manitol e do ácido abscísico (ABA) no crescimento de plântulas de acessos de coqueiro anão para fins de conservação, além de estudos da viabilidade in vivo e condições de armazenamento de grãos de pólen. Para o estudo de conservação por crescimento lento foram utilizados embriões zigóticos maduros de acessos de coqueiro anão vermelho de Gramame (AVG) e anão amarelo da Malásia (AAM) e para estudos da viabilidade in vivo e condições de armazenamento de grãos de pólen o acesso anão verde de Jiqui do Brasil (AVeJBr). Os embriões foram inoculados em meio de cultura Y3 com 30 g L-1 de sacarose, geleificado com 0,7% de ágar na presença de 2,5 g L-1 de carvão ativado. Foram testadas as seguintes concentrações de manitol: 0; 0,1; 0,2; 0,3 e 0,4 M. Em outro ensaio o ABA foi adicionado ao meio de cultura nas concentrações de 0; 10; 20; 30 e 40 μM. As concentrações de 0,1 e 0,2 M de manitol reduziram o comprimento da parte aérea para os acessos AAM e AVG, respectivamente aos 180 e 270 dias de cultivo. Concentrações acima de 20μM do ABA foram viáveis para inibir o crescimento de plântulas aos 180 e 270 dias. O acesso AVG não sofreu inibição do comprimento da parte aérea, quando concentrações de ABA foram adicionadas ao meio de cultura. Foram avaliados quatro meios de cultura para germinação in vitro do acesso AVeJBr: Brewbaker & Kwack (1983) modificado por Sousa et al. (2010); Lora et al. (2006); Sousa et al. (1998) e Sousa et al. (1998) modificado pelo autor, em diferentes tempos: 0, 24, 48 e 72 horas. O meio de cultura de Lora promoveu a maior germinação de grãos de pólen do acesso AVeJBr. Grãos de pólen de coqueiro AVeJBr apresentaram viabilidade média, sob temperatura ambiente, até 72 horas (3 dias). A condição de armazenamento a -20°C e -80°C promove maior viabilidade de grãos de pólen por germinação do acesso AVC até os 60 dias. A condição de armazenamento a -196°C promove maior viabilidade de grãos de pólen por germinação do acesso AVeJBr até os 60 dias.

Submitted by Geandra Rodrigues (geandrar@gmail.com) on 2018-01-08T14:33:50Z No. of bitstreams: 1 gustavotorresdesouza.pdf: 5085443 bytes, checksum: eada917698a8738ea1947743e940692c (MD5) / Approved for entry into archive by Adriana Oliveira (adriana.oliveira@ufjf.edu.br) on 2018-01-23T11:05:29Z (GMT) No. of bitstreams: 1 gustavotorresdesouza.pdf: 5085443 bytes, checksum: eada917698a8738ea1947743e940692c (MD5) / Made available in DSpace on 2018-01-23T11:05:29Z (GMT). No. of bitstreams: 1 gustavotorresdesouza.pdf: 5085443 bytes, checksum: eada917698a8738ea1947743e940692c (MD5) Previous issue date: 2017-08-08 / CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / O advento sistema CRISPR/Cas9 tornou o processo de edição gênica consideravelmente mais fácil e direto, uma vez que retirou empecilhos técnicos relacionados aos sistemas já disponíveis. Desta forma, foram permitidos diversos avanços no entendimento da função de elementos genômicos, assim como a produção de embriões geneticamente modificados com diversas finalidades. O atual trabalho objetivou a edição gênica no gene da beta-lactoglobulina em células somáticas bovinas objetivando a produção futura de embriões da espécie geneticamente modificados. Considerando-se que a hipersensibilidade a essa proteína responde pela maior parte das alergias ao leite bovino, a produção de animais cujo leite não contenha essa molécula é de grande interesse para a indústria de laticínios. Durante os experimentos, foi possível obter uma linhagem de células bovinas MDBK expressando a enzima Cas9 (MDBK-Cas). Usando células MDBK e as células MBDK-Cas foi possível se obter com sucesso edições gênicas no locus beta-lactoglobulina utilizando-se os componentes do sistema CRISPR/Cas9 na forma de mRNA da proteína Cas9 e sgRNAs. Conclui-se que o sistema CRISPR/Cas9 pode ser usado com os sgRNA desenhados neste estudo para editar o gene da betalactoglobulina em células MDBK. Assim, células MDBK podem ser utilizadas como alvo o locus em estudo. Modelos de estudos para edição do genoma bovino. Em vista da escassa literatura constando de trabalhos em que tenha sido feita a edição gênica em embriões bovinos, os dados gerados por esse trabalho colaborarão para o avanço do estado da arte no que diz respeito a engenharia gênica de bovinos e no conhecimento do funcionamento do sistema CRISPR/Cas9. / The advent of the CRISPR / Cas9 system made the process of gene editing considerably easier and more straightforward, since it removed technical impediments related to the systems already available. In this way, several advances were made in the understanding of the function of genomic elements, as well as the production of genetically modified embryos for various purposes. The present work aimed at the genetic editing of the beta-lactoglobulin gene in bovine somatic cells aiming at the future production of genetically modified embryos of the species. Considering that hypersensitivity to this protein accounts for most of the allergies to bovine milk, the production of animals whose milk does not contain this molecule is of great interest to the dairy industry. During the experiments, it was possible to obtain a lineage of bovine MDBK cells expressing the Cas9 enzyme (MDBK-Cas). Using MDBK cells and MBDKCas cells it was possible to successfully obtain gene editions at the beta-lactoglobulin locus using the components of the CRISPR / Cas9 system as mRNA of the Cas9 protein and sgRNAs. It is concluded that the CRISPR / Cas9 system can be used with the sgRNAs designed in this study to edit the beta-lactoglobulin gene in MDBK cells. Thus, MDBK cells can be targeted as the locus under study. Models of studies for editing the bovine genome. In view of the scarce literature consisting of studies in which bovine embryos have been genetically engineered, the data generated by this work will contribute to the advancement of the state of the art regarding the genetic engineering of cattle and the knowledge of the functioning of the system CRISPR / Cas9.

Submitted by Cláudia Bueno (claudiamoura18@gmail.com) on 2016-04-25T17:01:02Z No. of bitstreams: 2 Tese - Thaisa Campos Marques - 2016.pdf: 2492479 bytes, checksum: b5a2ef86d3f378ebc4e6976e2ca80765 (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2016-04-26T10:50:25Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Tese - Thaisa Campos Marques - 2016.pdf: 2492479 bytes, checksum: b5a2ef86d3f378ebc4e6976e2ca80765 (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-04-26T10:50:25Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Tese - Thaisa Campos Marques - 2016.pdf: 2492479 bytes, checksum: b5a2ef86d3f378ebc4e6976e2ca80765 (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) Previous issue date: 2016-02-23 / Melatonin treatment and blastocoel collapse had been suggested to be potent options to enhance embryo development and viability after cryopreservation of bovine embryos. The present study tested these alternatives with the aim to improve cryotolerance of bovine embryos produced in vitro. First, the effects of melatonin (MEL) were evaluated at three concentrations in Maturation Media (IVM) and/or Culture Media (IVC) (0, 10-7, 10-9, 10-11 M). The results showed that MEL10-9 in IVM could improve slightly the cleavage rate. However, when applied during IVC, MEL10-9 resulted in improved blastocysts rates and reduced numbers of apoptotic cells (NAC), a higher expression of antioxidative genes without changing the expression metabolism-related, placentation and anti-apoptotic genes. After, the MEL treatment giving the best result in first experiment (MEL 10-9 M in IVC) was combined with blastocoel collapse (BC) immediatly before vitrification. The survival and embryo quality were investigated. This experiment confirmed that independent of BC, MEL supplementation in IVC enhanced re-expansion and hatching rates of vitrified embryos. However, embryos cultured without MEL required more time during re-culture for all expansion. Embryos produced with MEL had similar NAC irrespective of vitrification and BC. BC did not affect embryo quality, in terms of the expression of genes involved in metabolism, oxidative stress, cell repair, placentation and implantation. Therefore, this research concluded that: (i) at 10-9 M concentration, MEL used during IVC improved embryo quality and development, and it minimized the oxidative stress and apoptosis in cells; (ii) embryos cultured with melatonin, vitrified and re-cultured can be transfered in less time; (iii) the blastocoel collapse benefited hatching when embryos were cultured with MEL in IVC; (iv) embryos cultured in IVC with MEL showed better quality and viability, and independently of BC. This information has a potential value for researchs on embryo cryotolerance. / O tratamento com melatonina e a retirada do fluido da blastocele de blastocistos tem sido sugeridos como potentes opções para melhorar o desenvolvimento e a viabilidade embrionária após a criopreservação de embriões de bovinos. O presente estudo testou essas alternativas com o objetivo de melhorar a criotolerância de embriões bovinos produzidos in vitro. Em primeiro lugar, os efeitos da melatonina (MEL) foram avaliados em três concentrações no meio de maturação (MIV) e/ou meio de cultivo (CIV) (0, 10-7, 10-9, 10-11 M). Os resultados mostraram que MEL10-9 no MIV pode melhorar significativamente a taxa de clivagem. No entanto, quando aplicado durante o CIV, MEL10-9 resultou em melhores taxas de blastocistos, reduzido número de células apoptóticas (NCA), maior expressão de genes antioxidantes sem alterar a expressão de genes anti-apoptóticos e relacionados ao metabolismo e placentação. Depois, o tratamento de MEL com melhor resultado no primeiro experimento (MEL 10-9 M no CIV) foi combinado com a retirada do fluido da blastocele (RFB) imediatamente antes da vitrificação. Foram investigadas a qualidade e sobrevivência de embriões. Este estudo confirmou que independente da RFB, a suplementação MEL no CIV melhorou a re-expansão e eclosão dos embriões vitrificados. No entanto, embriões cultivados sem MEL necessitou de maior período de recultivo para sua total re-expansão. Embriões produzidos com MEL tiveram similar NCA, independentemente da vitrificação e RFB. A RFB não afetou a qualidade do embrião em termos de expressão de genes envolvidos no metabolismo, estresse oxidativo, reparo celular, placentação e implantação. Portanto, esta investigação conclui que: (i) na concentração de 10-9 M, MEL utilizada no CIV melhorou a qualidade e desenvolvimento do embrião e, minimizou o estresse oxidativo e a apoptose celular; (ii) os embriões cultivados com MEL, vitrificados e re-cultivados podem ser transferidos em menor tempo; (iii) a RFB beneficiou a eclosão quando os embriões foram cultivados com MEL no CIV; (iv) embriões produzidos com MEL no CIV apresentaram melhor qualidade e viabilidade, independentemente da RFB. Esta informação tem um valor potencial para pesquisas sobre criotolerância embrionária.

Apesar da melhoria no sistema de produção e cultivo dos embriões in vitro, cerca de 60% dos oócitos que entram no sistema, não atingem o estágio de blastocisto e a qualidade dos embriões obtidos é bastante variável quando comparadas com embriões produzidos in vivo. Este bloqueio pode ser afetado por íons inorgânicos, tampões, aminoácidos e composição da atmosfera gasosa. Partindo-se da premissa que há influência da mitocôndria sobre a ativação da morte celular programada levou-nos a formular a hipótese que ausência de fragmentação nuclear nos embriões antes das 72 hpi está relacionada com a ausência do potencial de membrana mitocondrial e a inibição da OXPHOS pela utilização de bloqueadores leva a manutenção de baixos níveis de potencial de membrana mitocondrial e baixas taxas de fragmentação nuclear nos embriões. Embriões foram produzidos in vitro mediante maturação durante 22 horas, fecundação e cultivo 18 horas após a inseminação (hpi). Decorridas 24hpi realizou-se o cultivo com 0% de oxigênio, a fim de bloquear o processo de OXPHOS. Após 48 hpi realizou-se o feeding do meio de cultivo (SOF) com inibidores da OXPHOS (antimicina A e/ou oligomicina, cianeto de potássio) em diferentes doses. O número de embriões 8 células foi determinado às 80 hpi, mesmo momento em que foram realizadas as técnicas de JC-1 e TUNEL. Verificou-se as 168 hpi o efeito dos tratamentos no desenvolvimento embrionário. Os resultados obtidos com a inibição da OXPHOS após 48 hpi com oligomicina e/ou antimicina A nas doses utilizadas não alterou a capacidade do embrião atingir o estádio de 8 células. Entretanto, esta inibição inviabilizou o desenvolvimento até o estádio de blastocisto. O tratamento com KCN permitiu o desenvolvimento até o estádio de 8 células e a blastocisto em taxas semelhantes ao controle. A inibição do cultivo na ausência do O2 inviabilizou o processo de cultivo. Já os resultados obtidos quanto ao &#936;mm e TUNEL evidenciam que os tratamentos dos embriões antimicina e/ou oligomicina levaram a um aumento do &#936;mm e fragmentação nuclear na maioria dos embriões testados. Portanto, não foi possível testar a hipótese de que o &#936;mm é necessário para o estabelecimento da MCP, todavia, foi observada uma correlação positiva entre &#936;mm e fragmentação nuclear. / Although in vitro embryo production has been improved in the last 2 decades, about 60% of the oocytes do not reach the blastocyst stage and embryo quality is very variable when compared with in vivo produced embryo. This developmental block can be affected by inorganic ions, buffers, aminoacids and gaseous atmosphere composition. The knowledge that there influence of mitochondria on the activation of the programmed cellular death led to formulate the hypothesis that nuclear fragmentation absence in embryos before 72 post insemination is related with absence of mitochondrial membrane potential and OXPHOS blockage by inhibiting agents, would cause the maintenance of low levels of mitochondrial membrane potential and low rates of embryo nuclear fragmentation. Embryos were cultured in vitro for 18 hours post insemination (hpi) and after 24 hpi, they were submitted to 0% oxygen culture, in order to block the OXPHOS process. At 48 hpi, feeding was performed with SOF medium containing OXPHOS inhibitors (antimycin A and/or oligomycin, potassium cyanide) in different concetrations. The numbers of 8 cell embryos were estimated at 80 hpi, the same moment that they were submitted to JC-1 probes and TUNEL for mitochondrial membrane potential and DNA damages evaluation, respectively. At 168 hpi the effect of the treatments was verified on embryonic development. The results obtained with the OXPHOS inhibition after 48 after hpi using oligomycin and/or antimycin A did not modify embryo capacity to reach 8 cell stage. However, this inhibition prevented development to the blastocyst stage. KCN treatment allowed development up to the 8 cell stage and blastocyst similar to controls. The absence of O2 prevented embryo development. The &#936;mm and TUNEL results showed that antimycin and/or oligomycin treatment increased &#936;mm and nuclear fragmentation in the majority of the embryos tested. In conclusion, it was not possible to test the hypothesis that &#936;mm is necessary to the establishment of MCP, but a positive correlation between &#936;mm and nuclear fragmentation was observed.

O desenvolvimento embrionário é o resultado de uma sequência controlada de eventos modulados por sinais ambientais e mecanismos intracelulares. Em Hymenoptera, esse processo tem um caráter especial devido ao sistema de determinação do sexo (Haplodiploide). Neste sistema, os ovos fecundados se desenvolvem em fêmeas (diploides) e os ovos não fecundados em machos (haploides). Assim, eventos importantes, como a ativação do ovo e transição materno-zigótica, eventos iniciais da embriogênese, são elementos-chave para compreender o desenvolvimento de ambos os tipos de embriões. Ativação do ovo é um evento complexo acionado em resposta a estímulos externos, necessários para o início da embriogênese. Em abelhas a ativação ovo ocorre independentemente da fecundação e parece ser desencadeado durante a passagem pelo trato reprodutivo da mãe. Além disso, se o ovócito não for fecundado ele irá se desenvolver em um organismo haploide. No entanto, se o ovo recebe o espermatozóide até 30 minutos depois da ativação, o ovo se desenvolve em um organismo diploide. Em Drosophila, a ativação do ovo é também idependente da fecundação. O estímulo inicial que desencadeia o desenvolvimento é devido tensões mecânicas sofridas pelo ovócito durante a ovulação pela passagem através do trato reprodutivo. Neste modelo, o primeiro sinal de ativação inclui a ativação da via dependente de cálcio. Moléculas maternas que são incorporados no ovócito durante ovogênese, atuam durante a ativação do ovo, bem como no início da embriogênese. Os eventos iniciais da embriogênese também são caracterizados pela ausência de altos níveis de transcrição zigótica. As moléculas depositadas atuam na ativação do ovo, quebrando a dormência da divisão celular permitindo a ocorrência do início do desenvolvimento embrionário. Mas, o embrião em desenvolvimento gradualmente degrada e substitui essas moléculas herdadas da mãe, em um processo conhecido como transição materno-zigótica. Nosso principal objetivo foi o entendimento da comunicação entre as moléculas herdadas e as recém produzidas durante os primeiros passos do desenvolvimento de Apis mellifera. Para alcançar nosso objetivo, 16 bibliotecas de RNAseq (mRNA e miRNA) foram construídas utilizando amostras de RNA total de embriões diploides e haploides de diferentes idades e ovócitos maduros. A análise do transcriptoma mostrou que existem genes diferencialmente expressos entre os dois tipos de embriões já em 1 h de desenvolvimento. Além disso, nossa análise permitiu a identificação de mRNAs e miRNAs maternos e zigóticos, além de processos com que estas moléculas se relacionam. As análises mostraram também que um mesmo miRNA pode atingir diferentes mRNAs em cada tipo de embrião, na mesma fase de desenvolvimento. Além disso, um mesmo gene pode ser diferentemente regulado nos dois tipos de embriões. Por exemplo, broad/GB48272, que é classificado como materno em embriões dipoides é regulado por quatro miRNAs diferentes e em embriões haploides é classificado como zigótico, regulado por apenas um miRNA. Análise das bibliotecas de RNAseq e hibridação in situ mostrou o padrão de expressão de zelda em embriões jovens de abelhas. Zelda é um ativador chave do genoma zigótico em Drosophila e regula eventos importantes na embriogênese se ligando a um motivo conservado, TAGteam. Em A. mellifera, encontramos um motivo TAGteam putativo que tem sido relacionado à transcrição zigótica precoce. Além disso, a hibridização in situ e PCR mostraram três primiRNAs (ame-mir-375-3p, ame-mir-34-5p e ame-mir-263b-5p) que se expressam durante a clivagem. A presença de pri-miRNAs evidenciou a início da transcrição zigótica durante a clivagem. Em suma, podemos dizer que este é o primeiro trabalho em Apis mellifera a descrever os eventos de iniciais do desenvolvimento embrionário comparando embriões haploides e diploides usando os recentes protocolos de bioinformática e os avanços da biologia molecular. / Embryonic development is the result of a precisely controlled sequence of events modulated by environmental signals and intracellular mechanisms. In Hymenoptera, this process takes a special character due the sex-determination system (haplodiploidy). In this system, fertilized eggs develop in females (diploid) and unfertilized eggs in males (haploid). Thus, important events such as egg activation and maternal-zygotic transition, events of the early embryogenesis are key elements to understand the development of both types of embryos. Egg activation is a complex event triggered in response to external stimuli and necessary for the onset of embryogenesis. In honeybees egg activation occurs independently of fertilization and seems to be triggered during the passage through mother\'s reproductive tract. Furthermore, if the egg is not fertilized it will develop into haploid organism. However, if the egg receives the sperm up to 30min after activation, this egg develops into a diploid organism. In Drosophila, the egg activation is also fertilization independent. Initial stimulus that triggers the development is due mechanical stresses suffered by the egg during ovulation and passage through the reproductive tract. In this model, the first activation signal includes activation of calciumdependent pathway. Maternal molecules that are incorporated into the oocyte during ovogenesis, act during egg activation, as well as in early embryogenesis. Early embryogenesis events are also characterized by absence of high levels of zygotic transcription. The deposited molecules drive egg activation, breaking cell division dormancy permitting the beginning of embryonic development. But, the developing embryo gradually degrades and substitutes these mother-inherited molecules, in a process known as mother-to-zygote transition. Our main objective was the understanding of the deep crosstalk among the inherited molecules and the newly ones produced during the first steps of Apis mellifera embryogenesis. To achieve our objective 16 deep sequenced RNA (mRNA, miRNA) libraries were constructed using different age diploid and haploid embryos, and mature oocytes. Genome-wide transcriptome analysis was performed and interactive regulatory networks were constructed. Our analysis permitted the identification of maternal and zygotic mRNAs and miRNAs and related processes. Based on expression profiles of mRNAs and miRNAs in mature oocytes and haploid and diploid embryos of 2, 6 and 18-24 h of development, we constructed integrative regulatory networks (miRNA:mRNA) showing that the same miRNA could target different mRNAs in each type of embryo, in the same phase of development. As example we cite broad/GB48272, which is classified as maternal in diploid embryos and regulated by four different miRNAs. However, in haploid embryos it is zygotic and regulated by only one miRNA. Analysis of RNAseq and in situ hybridization showed the expression pattern of zelda in early honeybee embryos. Zelda is a key activator of Drosophila early zygotic genome and regulates important events in early embryogenesis binding to TAGteam motif. In A. mellifera, we found a putative TAGteam motif that has been implicated in early zygotic transcription. Moreover, in situ hybridization and PCR assay showed three pri-miRNAs (ame-mir-375-3p, ame-mir-34-5p and ame-mir-263b-5p) expressed during cleavage. The presence of pri-miRNAs is the first evidence of early zygotic transcription during cleavage. In short, we could say that this is the first work on Apis mellifera describing the early embryonic developmental events comparing haploid and diploid embryos using modern bioinformatics tools and advanced molecular analysis.

O desenvolvimento dos sistemas de produção de embriões por fecundação in vitro (FIV) ou transferência nuclear com células somáticas (TNCS) em diversas espécies animais, em especial a bovina, acarretou na manifestação de anormalidades de desenvolvimento in vivo, com a placenta sendo considerada o fator determinante no aparecimento destes distúrbios durante a gestação. A hipótese geral deste trabalho é de que alterações na formação da placenta, decorrentes das manipulações embrionárias in vitro, resultam em elevadas perdas no terço inicial e em anormalidades fetais e placentárias no terço final da gestação, incluindo um crescimento compensatório dos fetos por uma perda da capacidade de regulação da restrição placentária, elevando o fluxo total de nutrientes no sentido materno-fetal. Sendo assim, este estudo foi dividido em Capítulos, buscando-se avaliar os efeitos de algumas variáveis biológicas e técnicas na produção de embriões in vitro por TNCS, e de comparar o desenvolvimento de prenhezes estabelecidas com embriões produzidos in vivo (Controle), in vitro por fecundação (FIV) e in vitro por transferência nuclear (TNCS), pela avaliação de dados morfométricos, morfológicos e bioquímicos coletados em distintos momentos da gestação. No Capítulo 1, o desenvolvimento in vitro de embriões clonados foi comparado entre células somáticas de duas fêmeas geneticamente distintas (Nelore vs. Crioula Lageana), e entre três intervalos de confluência celular, estabelecidos previamente ao procedimento de clonagem, do mesmo animal. As melhores taxas foram obtidas com a utilização de células da fêmea Nelore, e da utilização de células com elevada confluência em cultivo. No Capítulo 2, comparou-se o efeito de dois intervalos de fusão-ativação e da agregação ou não de embriões no momento do cultivo, no desenvolvimento in vitro e in vivo destes embriões clonados. A agregação dos embriões e um maior intervalo entre fusão-ativação promoveram um incremento na produção de blastocistos. Contudo, estes não se apresentaram mais desenvolvidos ou com melhor qualidade, e também não influenciaram nas taxas de prenhez ou de manutenção das mesmas. No Capítulo 3, prenhezes dos grupos Controle, FIV e TNCS foram comparadas pela avaliação de dados morfométricos e bioquímicos coletados em distintos momentos da gestação. Este experimento demonstrou que as diferenças entre os grupos experimentais ocorreram desde as análises iniciais, com os grupos in vitro apresentando menores taxas de prenhez, e com o grupo TNCS tendo as maiores perdas gestacionais. As imagens obtidas por ultrasonografia aos 51 dias revelaram conceptos in vitro retardados em seu desenvolvimento, mas com um crescimento compensatório posterior, já que as prenhezes produzidas in vitro, e especialmente as do grupo TNCS, sustentaram não só maiores conceptos e com maiores anormalidades aos 225 dias de gestação, como também apresentaram um maior acúmulo de substratos energéticos no sistema fetal, particularmente de frutose no alantóide. No Capítulo 4, foram comparados os resultados de produção de embriões clonados e do estabelecimento de prenhezes em um período de produção de 28 meses, divididos em três momentos. A compilação dos períodos de rotinas de trabalho em clonagem bovina demonstrou o efeito da experiência e da aquisição de competência técnica sobre os resultados de produção in vitro de embriões por TNCS, com repercussão direta no desenvolvimento in vivo posterior. / The in vitro production (IVP) of embryos by in vitro fertilization (IVF) or somatic cell nuclear transfer (SCNT) in many species, especially in cattle, is usually associated with abnormalities during in vivo development, with the placenta being implicated as the determining factor in the appearance of the disturbances during gestation. The general hypothesis of this study is that alterations in placenta formation, as a consequence of early in vitro embryo manipulations, results in high gestation losses during the first trimester and fetal and placental abnormalities in the last trimester of gestation, including the occurrence of a compensatory fetal growth due to a reduced placental-fetal growth-restricting effect, which increases the total materno-fetal nutrient flux in late pregnancy. This study aimed to evaluate some of the biological and technical effects on the IVP of embryos by SCNT, and also to compare the development of pregnancies established with embryos produced either in vivo (Control), or in vitro by in vitro fertilization (IVF) or by nuclear transfer (SCNT), by the evaluation of morphometric, morphologic and biochemical data collected at distinct time points in gestation. In Chapter 1, the in vitro development of cloned embryos was compared between somatic cells of two genetically different females (Nelore vs. Crioula Lageana), and between three cell confluence intervals, established prior to the cloning procedure of the same animal. The best results were achieved using cells from the Nelore female and also with cells on the highest confluence level on culture. In Chapter 2, the effects of two fusion-activation intervals and the use or not of embryo aggregation during in vitro culture were compared by evaluating the in vitro and in vivo developmental potential of resulting embryos. The embryo aggregation and a higher fusion-activation interval promoted an improvement in blastocyst yield. However, those embryos were neither more advanced in development nor better in morphological quality, having no influence on subsequent pregnancy rates or pregnancy losses. In Chapter 3, Control, IVF and SCNT pregnancies were compared by the evaluation of morphometric and biochemical data collected at distinct moments in gestation. This experiment demonstrated that differences occurred between the three groups of embryos from the beginning of the analyses; the in vitro-produced groups had lower pregnancy rates, with the SCNT group showing the highest pregnancy losses. The analyses of the sonograms on Day 51 of pregnancy revealed a growth retardation pattern for the in vitro concepti, having a compensatory development up to late pregnancy, as in vitro-derived pregnancies, special in the SCNT group, sustained heavier concepti with a wider spectrum of abnormalities on day 225 of gestation. In addition, the SCNT pregnancies demonstrated a greater accumulation of substrates in the fetal system, particularly fructose on the allantoic fluid. Finally, in Chapter 4, results obtained from a retrospective analysis of bovine embryo production by cloning and subsequent pregnancy rates were compared between three equal periods within a range of 28 months. The comparison of the bovine cloning procedures during the three time periods demonstrated the impact of the technical skills and competence on the overall efficiency of in vitro embryo production by SCNT, and subsequent in vivo development.