Introdução: Esclerose múltipla (EM) é uma doença desmielinizante e inflamatória do sistema nervoso central. Seu diagnóstico é clínico, auxiliado pela imagem de ressonância magnética, mas essa imagem não diferencia processos de inflamação e desmielinização. A tomografia por emissão de pósitrons (PET), usando radiofármacos específicos, pode ser uma ferramenta para diferenciar esses processos. O radiofármaco [11C]PK11195 se liga na proteína translocadora 18 kDa (TSPO) presente nas mitocôndrias das células gliais. O radiofármaco [11C]PIB é utilizado para detecção de placa Beta-amiloide, mas tem sido utilizado também na análise do conteúdo de mielina. Esta nova aplicação foi fundamentada na captação deste radiofármaco em substância branca. A utilização em conjunto destes dois radiofármacos pode diferenciar processos de neuroinflamação, desmielinização e remielização através da imagem PET. Objetivo: O objetivo deste trabalho é validar o uso dos radiofármacos [11C]PK11195 e [11C]PIB para estudo pré-clínico para a quantificação de neuroinflamação e quantidade de mielina, respectivamente, na progressão da doença de modelos animais de esclerose múltipla, modelo de roedores, e em seguida realizar análise de lesões em substância cinzenta e substância branca em modelo de primatas não humanos. Material e Métodos Projeto aprovado pelo comitê de ética (UNIFESP 2628300415 e FMUSP 25/15 e 0556/15). O modelo de lisolecitina em ratos (Wistar, machos) foi induzido pela injeção estereotáxica de lisolecitina 1% em dois locais do estriado direito (2 + 2 microL) e no corpo caloso (3 microL). As imagens de PET com [11C]PK11195 e [11C]PIB foram adquiridas nos tempos basal, 3 dias, 1 semana e 4 semanas após a administração estereotáxica. O modelo de encefalomielite autoimune experimental (EAE) em saguis foi induzido por injeção de glicoproteína da mielina do oligodendrócito (MOG) emulsionada em Adjuvante Incompleto de Freund (IFA) ou em Adjuvante Completo de Freund (CFA). As imagens de PET foram adquiridas antes da imunização (basal) e ± 100 dias após a imunização (final). O tecido cerebral foi utilizado para análise imuno-histológica. Resultados: No modelo de lisolecitina em rato foi observado um aumento na captação de [11C]PK11145 no corpo caloso, 25 % (P = 0,002) e no estriado, 24 % (P < 0,05) uma semana após a imunização comparando com a imagem basal. Com o [11C]PIB não foram observadas diferenças significativas. No modelo de EAE em saguis, induzido com MOG/IFA, foi possível observar uma redução significativa da captação de [11C]PIB nas regiões do esplênio do corpo caloso direito de 38,17 % (P = 0,0365), globo pálido direito, 22,75 %, (P = 0,0355), núcleo caudado direito, 29,36 % (P = 0,0284) e córtex cingulado, 18,99 % (P = 0,0453), enquanto para o grupo MOG/CFA foi observada uma redução significativa para a região do córtex motor esquerdo, 9,51 % (P = 0,0083). Com o [11C]PK11195 foi observada uma redução significativa na captação do radiofármacos na imagem intermediária do grupo MOG/IFA comparada com a captação basal nas regiões do córtex somatossensorial direito, 22,8 % (P = 0,0041), córtex de associação direito, 18,98 % (P = 0,0228), córtex subpial direito, 23,37 % (P = 0,0006) e região do núcleo caudado inferior esquerdo, 18,97 % (P = 0,0233). Nos ensaios post mortem realizados com os ratos foi possível observar na imuno-histoquímica uma correlação, entre micróglia ativada (Iba-1) e [11C]PK11195, tanto no corpo caloso como no estriado. Para os saguis foi observado correlação entre [11C]PK11195 e Iba-1 e esta não foi observada para o [11C]PK11195 e GFAP. Na histologia, foi observada uma correlação entre os dados da imagem de [11C]PIB e a técnica de luxol fast blue. Conclusão: A imagem PET com [11C]PK11195 e [11C]PIB foi eficiente para as quantificações de neuroinflamação e mielina, respectivamente, na progressão da doença dos modelos animais (roedor e primata não humano) da EM / Introduction: Multiple sclerosis (MS) is a demyelinating and inflammatory disease of the central nervous system. Its diagnosis is clinical, helped by magnetic resonance imaging, but this image modality does not differentiate between inflammation and demyelination. Positron Emission Tomography (PET), using specific radiopharmaceuticals, can be a tool to differentiate these processes. The radiopharmaceutical [11C]PK11195 binds to the translocator protein 18 kDa (TSPO) present in the mitochondria of glial cells. [11C]PIB is a radiopharmaceutical used for detection of Beta-amyloid plaques, but has also been used in the analysis of myelin content. This new application was based on the white matter uptake of this radiopharmaceutical. The use of these two radiopharmaceuticals together can differentiate processes of neuroinflammation, demyelination and remyelination by the PET imaging. Objective: The objective of this work is to validate the use of tracers [11C]PK11195 and [11C]PIB for preclinical study for the qualification of neuroinflammation and amount of myelin, respectively, in the disease progression of animal models of multiple sclerosis, rodent model, and then perform analysis of grey matter and white matter lesions in non-human primate model. Material and Methods: Project approved by the ethics committee (UNIFESP 2628300415 and FMUSP 25/15 and 0556/15). The rat lysolecithin model (Wistar, male) was induced by stereotactic injection of lysolecithin 1% at two sites of the right striatum (2 + 2 microL) and in the corpus callosum (3 microL). PET images with [11C]PK11195 and [11C]PIB were acquired at baseline, 3 days, 1 week and 4 weeks after stereotactic injection. The experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) model in marmosets was induced by injection of myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG) emulsified in Incomplete Freund\'s Adjuvant (IFA) or Complete Freund\'s Adjuvant (CFA). PET images were acquired prior to immunization (baseline) and ± 100 days after immunization (end of experiment). Brain tissue was used for immunohistochemical analysis. Results: In the rat lysolecithin model, an increase in [11C]PK11145 uptake of 25% (P = 0.002) was observed in the corpus callosum and 24% (P < 0.05) in the striatum, one week after immunization compared to the baseline image. The IFA/MOG and CFA/MOG groups showed clinical signs in 100% of the animals. The comparison between baseline and symptoms time points showed in the CFA/MOG group a significant 11C-PIB uptake reduction only in the left motor cortex, 9.5 % (P = 0.0083). For the IFA/MOG group, a significant decrease in 11C-PIB uptake was observed in the splenium of corpus callosum, 38.4 % (P = 0.0365), globus pallidus, 22.9 % (P = 0.0355) and tail of caudate nucleus, 28.9 % (P = 0.0284), being these 3 regions in the right brain hemisphere, and also in the cingulate cortex (midline above corpus callosum), 19.5 % (P = 0.0453). 11C-PK11195 uptake was significantly decreased in IFA/MOG group in the intermediary time point in the right somatosensorial cortex, 22.08 % (P = 0.0041), right association cortex, 18.98 % (P = 0.0228), right subpial cortex, 23.37 % (P = 0.0006) and left tail of caudate nucleus, 18.97 % (P = 0.0233). In the post mortem analysis performed with rat tissue, a weak correlation between activated microglia (Iba-1) and [11C]PK11195 uptake was observed both in the corpus callosum and in the striatum. For the marmosets we observed correlation between [11C]PK11195 and Iba-1 but we didn\'t observed between [11C]PK11195 and GFAP. In histology, we observed correlation between [11C]PIB and luxol fast blue. Conclusion: The PET images with [11C]PK11195 and [11C]PIB were efficient for quantifying neuroinflammation and myelin content, respectively, in the disease progression of animal models (rodent and nonhuman primate) of MS

A Esclerose Múltipla (EM) é uma doença autoimune, degenerativa, desmielinizante e inflamatória que afeta o Sistema Nervoso Central. Devido ao grande número de sítios possíveis de lesões, podem incluir, entre outras, desordens motoras, cognitivas e comportamentais. Disfunções do eixo HPA vem sendo associadas com o desencadeamento ou exacerbação dos sintomas da EM. Este estudo objetivou avaliar funções motoras, comportamentais, os aspectos de habilidade de planejamento e velocidade de processamento, e a relação com o estresse através da medida de cortisol em pacientes com Esclerose Múltipla. Trata-se de uma pesquisa do tipo transversal, analítica, descritiva com abordagem quantitativa, realizada no Ambulatório de Neuroimunologia do Hospital São Lucas da PUC-RS, localizado no município de Porto Alegre – RS. A amostra foi do tipo não probabilística por acessibilidade composta por 40 voluntários com diagnóstico clínico de EM alocados nos subgrupos EM1 com EDSS ≤ 3 (n = 23) e EM2 com EDSS entre 3,5 e 6 (n = 17) e 37 adultos saudáveis. As avaliações incluíram: Ficha de Avaliação Clínica, Mini-Exame do Estado Mental, Escala de Depressão e Ansiedade de Hamilton, Multiple Sclerosis Funcional Composite Measure, Expanded Disability Status Scale, Escala de Equilíbrio de Berg, Escala de Estresse Percebido, Tarefa do Mapa do Zoológico e uma amostra capilar para análise de cortisol referente ao último mês. Os resultados mostraram que não há diferenças estatísticas dos níveis de cortisol capilar entre os grupos. Todos os grupos apresentaram algum grau de sintomas depressivos e de ansiedade, além de níveis consideráveis de estresse percebido. O grupo EM apresentou déficits de marcha, equilíbrio, habilidade manual e velocidade de processamento, com pior desempenho do subgrupo EM2, quando comparados aos controles (p<0,001). O grupo controle apresentou menor tempo de planejamento (F=6,552; p=0,014) no ZooMap1, e os indivíduos com EM apresentaram maior número de erros (2,22±0,27) na execução. Houve uma fraca correlação entre o cortisol e a marcha (r= -0,488; p = 0,047) e cortisol e o tempo de execução do ZooMap1 (r = 0,438; p = 0,036). Os resultados do presente estudo sugerem que o cortisol capilar não parece estar alterado durante fases inativas da doença. Entretanto, estudos futuros devem ser realizados para melhor compreensão do perfil do cortisol basal capilar na EM e sua relação com sintomas. / Multiple Sclerosis (MS) is an autoimmune, degenerative, demyelinating, and inflammatory disease that affects the Central Nervous System. Due to the large number of possible injury sites, they may include motor, cognitive and behavioral disorders among others. HPA axis dysfunctions have been associated with the triggering or exacerbation of MS symptoms. This study aimed to evaluate motor, behavioral, planning ability and processing speed aspects, and the relationship with stress through the measurement of cortisol in patients with Multiple Sclerosis. This is a cross-sectional, analytical, descriptive, quantitative approach, performed at the Neuroimmunology Ambulatory of the São Lucas Hospital of PUC-RS, located in the city of Porto Alegre, RS. The sample was of the non-probabilistic type by accessibility composed of 40 volunteers with clinical diagnosis of MS allocated in the following subgroups: MS1 with EDSS ≤ 3 (n = 23) and MS2 with EDSS between 3.5 and 6 (n = 17) and 37 healthy adults. Evaluations included: Clinical Assessment Sheet, Mental State Mini-Exam, Hamilton Depression and Anxiety Scale, Functional Multiple Sclerosis Composite Measure, Expanded Disability Status Scale, Berg Balance Scale, Perceived Stress Scale, Zoo Map Task and a hair sample for cortisol analysis referring to the last month. The results showed that there are no statistical differences in capillary cortisol levels between groups. All groups presented some degree of depressive symptoms and anxiety, in addition to considerable levels of perceived stress. The MS group presented gait, balance, manual ability and processing speed deficits, with a worse performance of the EM2 subgroup when compared to controls (p < 0.001). The control group had a shorter time of planning (F = 6.552, p = 0.014) in ZooMap1, and, MS individuals had a greater number of errors (2.22 ± 0.27) in the execution. There was a weak correlation between cortisol and gait (r = -0.488; p = 0.047) and cortisol and ZooMap1 execution time (r = 0.438; p = 0.036). The results of the present study suggest that capillary cortisol does not appear to be altered during inactive phases of the disease. However, future studies should be performed to better understand the profile of basal capillary cortisol in MS and its relation with the symptoms.

O complexo da esclerose tuberosa (TSC) é um transtorno genético, sistêmico, com expressividade variável e herança autossômica dominante. Clinicamente manifesta-se devido ao desenvolvimento de hamartomas e hamártias em diferentes tecidos, principalmente no cérebro, rins, coração, pele e pulmões, podendo causar disfunção do órgão. Mutação em um de dois genes supressores tumorais, TSC1 ou TSC2, são responsáveis pelo TSC. Os genes TSC1 e TSC2 codificam para hamartina e tuberina, respectivamente. Ambas as proteínas interagem fisicamente formando um complexo citosólico que inibe mTOR (mammalian target of rapamycin). Testes moleculares para TSC1 e TSC2 são úteis para auxiliar no diagnóstico de casos clínicos difíceis, em aconselhamento genético e estudos de associação genótipo-fenotípica, além de permitirem a caracterização molecular de mecanismos patogenéticos da formação dos hamartomas e análises funcionais de seus produtos gênicos. Apesar de o diagnóstico de TSC ser basicamente clínico, a partir da revisão de seus critérios em 2012 por um grupo de especialistas, o achado de uma mutação em TSC1 ou TSC2 passou a ser considerado suficiente para o diagnóstico definitivo da doença. O estudo apresentado aqui é parte de um projeto em andamento para estabelecer condições ao desenvolvimento de análise de mutações causadoras de TSC nos genes TSC1 e TSC2. Nosso objetivo neste trabalho foi avaliar por sequenciamento de Sanger o DNA genômico de 28 pacientes brasileiros com diagnóstico definitivo de TSC, procedentes dos estados de São Paulo ou Paraná, tendo como alvo a sequência codificadora do gene TSC1, parte de seus segmentos intrônicos, o promotor basal, bem como o segmento imediatamente a 5\' deste. Sete pacientes (25%) apresentaram mutações de sentido trocado (nonsense) ou com deslocamento da leitura à tradução (frameshift) no gene TSC1. Entre 31 outras variantes de DNA encontradas, 23 são polimorfismos conhecidos e oito apresentaram frequência inferior a 1%, como verificado in silico entre mais de mil sequências de genomas humanos. Entre essas oito variantes de DNA novas ou raras, quatro foram detectadas em pacientes para os quais uma mutação patogênica havia sido identificada e, por isso, foram reclassificadas como polimorfismos. Duas e uma variantes de DNA do mesmo paciente flanqueavam um sítio de ligação em potencial para um fator de transcrição específico, a 5\' do promotor basal de TSC1. Por fim, uma nova variante de DNA na região não codificadora do éxon 2 do gene TSC1 foi predita com potencial para alterar um elemento candidato a acentuador de splicing. Em resumo, como observado em estudos anteriores, descrevemos aqui 25% dos pacientes com TSC apresentando mutações patogênicas na sequência codificadora do gene TSC1. Nossos dados mostraram quatro novas variantes de DNA em regiões potencialmente reguladoras da expressão do gene TSC1, que podem revelar-se como mutações patogênicas e, portanto, necessitam ser testadas experimentalmente / Tuberous sclerosis complex (TSC) is a multisystem disorder, with variable expression and autosomal dominant inheritance. Clinically it is due to hamartia and hamartoma development in different tissues, notably in the brain, kidneys, heart, skin and lungs, causing organ dysfunction. Mutations in either tumor suppressor gene, TSC1 or TSC2, are responsible for TSC. TSC1 and TSC2 genes code for hamartin and tuberin, respectively. Both proteins physically interact forming a cytosolic complex that inhibits the mammalian target of rapamycin (mTOR). TSC1 and TSC2 molecular testing has been useful in diagnosing clinically challenging cases, in genetic counseling and genotype/phenotype association studies, besides evaluation of the molecular basis of hamartoma formation and functional analyses of both gene products. Although TSC diagnosis is basically clinical, since the 2012 specialist panel review the finding of a TSC1 or TSC2 mutation has been considered sufficient for the definite diagnosis of the disease. The results presented here are part of an ongoing project to establish conditions for TSC1 and TSC2 mutation studies. Our first aim is to evaluate by Sanger sequencing TSC1 coding sequence, and an average of 132 base pairs of intronic regions next to exon boundaries from TSC patients, in addition to the gene core promoter. We present preliminary results of a sample of 28 patients with definite TSC diagnosis, from São Paulo and Paraná states. Seven patients (25%) displayed TSC1 nonsense or frameshift mutations. Among 31 other DNA variants identified, 23 were known polymorphisms, and eight had frequencies below 1% as verified in silico among more than a thousand human genomes. Out of eight novel or rare DNA variants, four were detected in patients for whom a pathogenic mutation had been found. Two and one additional DNA point variants from the same patient flanked a putative transcription factor binding site. Finally, a novel DNA variant residing in the TSC1 noncoding exon 2 was predicted to change the sequence potential to behave as a splicing enhancer. In summary, similar to previous studies, we describe 25% of TSC patients with mutations in the TSC1 coding sequence. Differently from other reports, our data disclose four novel DNA variants in TSC1 potentially regulatory regions that are likely to unravel novel pathogenic mutations, and thus need to be experimentally tested

O complexo da esclerose tuberosa (TSC) é uma doença genética que pode afetar órgãos específicos de qualquer sistema do organismo humano. Em geral, as lesões surgem pela inativação bialélica de um dos genes supressores tumorais Tuberous Sclerosis Complex 1 (TSC1) ou 2 (TSC2). Por outro lado, nas regiões corticais e subcorticais do cérebro, as lesões decorrentes de falhas de migração neuronal e sua arborização podem ser explicadas pela haploinsuficiência de TSC1 ou TSC2. As lesões do córtex cerebral apresentam-se comumente com epilepsia refratária, a qual, por sua vez, pode se associar a deficiência intelectual e transtornos do comportamento. Estes quadros clínicos podem estar presentes em pacientes com TSC sem lesão anatômica detectável à ressonância nuclear magnética do crânio. As proteínas hamartina ou tuberina, conhecidas também como TSC1 e TSC2, são codificadas respectivamente pelos genes TSC1 e TSC2. Elas agem juntas em um complexo molecular citosólico que inativa a pequena GTPase Rheb, a qual tem ação ativadora da cinase alvo da rapamicina em mamíferos (mTOR), regulando diversos processos celulares, como proliferação, diferenciação, crescimento, migração e metabolismo. Com a hipótese de que a quantidade de TSC1 ou TSC2 no neurônio pode alterar suas funções de forma dependente do estado metabólico, tivemos, neste trabalho, o objetivo geral de caracterizar os padrões de expressão e atividade de TSC1 e TSC2 em dois modelos de neurodegeneração induzida no camundongo adulto e verificar se a redução de quantidade de TSC1 tem efeito sobre a extensão da lesão de neurônios dopaminérgicos em modelo de hemiparkinsonismo. No primeiro modelo empregado, cinco estruturas encefálicas de camundongos submetidos a dieta hiperlipídica mostraram alteração da quantidade de RNAm de Tsc1 e/ou Tsc2 ou sinais de estresse oxidativo. A redução de transcritos de Tsc1 e Tsc2 no córtex cerebral foi dependente de jejum realizado imediatamente antes da eutanásia. No córtex cingulado, houve evidência de estresse oxidativo. O aumento específico de RNAm foi observado no hipocampo (Tsc1 e Tsc2) e no estriado e hipotálamo (Tsc1), embora de forma independente do jejum, sugerindo se tratar de alterações relacionadas à dieta hiperlipídica. No modelo de hemiparkinsonismo, camundongos adultos submetidos a injeção intracerebral de 6-hidroxidopamina apresentaram redução da quantidade total de proteína S6 no lado encefálico tratado quando comparado ao segmento contralateral (p =0,004, r=0,8795; teste de Pearson, IC: 95%), sem alteração de TSC1 ou TSC2. Em análises de imunoperoxidase do encéfalo, descrevemos, de forma independente da lesão, a expressão de TSC1 no estriado, núcleos entopeduncular e arqueado e de TSC2 no tálamo e hipotálamo. Com o objetivo de obter um modelo de camundongo sem expressão pós-natal de Tsc1 em várias regiões encefálicas, de forma independente do tipo celular, realizamos cruzamentos entre uma linhagem de camundongo transgênico em que o gene Tsc1 contém sequências lox nos íntrons 16 e 18 e outra linhagem com Tsc1 tipo-selvagem (WT) em homozigose e o transgene para expressão da recombinase Cre em fusão ao domínio de ligação ao ligante do receptor de estrógeno humano (ESR1) sob o controle de expressão do promotor de ubiquitina C (UBC). Em F1, obtivemos camundongos portadores do transgene UBC-CreESR1 e heterozigotos para Tsc1 (Tsc1WT/Flox). Em F2, entre os animais homozigotos Tsc1Flox/Flox (N = 153) gerados por retrocruzamento, nenhum era portador do transgene (Nesperado = 85; Nobservado = 0; X2 = 348,185; p < 0,0001) É possível que o segmento genômico em que houve inserção do vetor lentiviral que carrega o transgene UBC-CreESR1 esteja ligado ao loco de Tsc1 no cromossomo 2 do camundongo, segregando juntos. O tratamento com 4-hidroxitamoxifeno de animais heterozigotos e portadores do transgene aumentou a quantidade de TSC1 no estriado (p < 0,05) e o cerebelo não apresentou alteração. É possível que mecanismos transcricionais ou traducionais, funcionais no estriado, tenham favorecido o aumento de TSC1 de forma dependente de 4-hidroxitamoxifeno / Tuberous sclerosis complex (TSC) is a genetic disorder that can affect any specific organs. In general, lesions are caused by biallelic inactivation of the tumor suppressor genes Tuberous Sclerosis Complex 1 (TSC1) or 2 (TSC2). On the other hand, in cortical and subcortical brain regions, lesions associated with neuronal migration and arborization failures can be explained by TSC1 or TSC2 haploinsufficiency. Brain cortical lesions commonly cause refractory epilepsy, which, in turn, may be associated with intellectual disabilities and behavioral disorders. These medical conditions may be present in TSC patients without detectable anatomic lesion on magnetic resonance images. TSC1 and TSC2 genes encode hamartin and tuberin, also known as TSC1 and TSC2, respectively. They act together in a cytosolic molecular complex that inactivates small GTPase Rheb, which is a mammalian target of rapamycin (mTOR) activator, regulating diverse cellular processes such as proliferation, differentiation, growth, migration and metabolism. With the hypothesis that the amount of TSC1 or TSC2 in the neuron can change its function depending on the metabolic state, the overall objective of this study was to characterize TSC1 and TSC2 expression patterns and activity in two mice models of induced neurodegeneration; and check whether TSC1 reduction changes dopaminergic neurons damage extent in a hemiparkinsonins model. For the first model, five brain structures from mice fed with high fat diet showed alterations in Tsc1 and/or Tsc2 mRNA, or oxidative stress signals. Reduction of Tsc1 and Tsc2 transcripts in the cerebral cortex was dependent on fasting performed immediately prior to euthanasiaThere was evidence of oxidative stress in the cingulate cortex. Increase in mRNA was observed in the hippocampus (Tsc1 and Tsc2) and striatum and hypothalamus (Tsc1), although independent of the fasting, suggesting that this effect is related to the high fat diet. In hemiparkinsonism model, adult mice subjected to intracerebral injection of 6-hydroxydopamine had decreased levels of S6 in the brain treated side compared to the contralateral segment (p = 0.004, r = 0.8795; Pearson test, CI: 95 %), without alterations in TSC1 nor TSC2. Using imunoperoxidase analysis, we described TSC1 expression in the striatum, entopeduncular and arcuate nuclei, and TSC2 in the thalamus and hypothalamus, independently from the 6-OHDA lesion. To obtain a mouse model without TSC1 postnatal expression in different brain regions, independently of the cell type, we performed crosses between transgenic mouse strain in which the Tsc1 gene contains lox sequences in introns 16 and 18 and strain with Tsc1 wild-type (WT) and the transgene for expression of Cre recombinase fused to the binding domain of the human estrogen receptor (ESR1) ligand, controlled by ubiquitin C (UBC) promoter expression. In F1, we obtained mice carrying the transgene UBC-CreESR1 and heterozygous for Tsc1 (Tsc1WT/flox). In F2, among animals homozygous Tsc1Flox/Flox (N=153) generated by backcrossing, none was carrying the transgene (Nexpected = 85; Nobserved = 0; X2= 348.185, p <0.0001) It is possible that the genomic segment containing the lentiviral vector insertion bearing UBC-CreESR1 transgene is linked to the TSC1 region on mouse chromosome 2, and they segregate together. Treatment with 4-hydroxytamoxifen in animals heterozygous and positive for the transgene showed increased TSC1 in the striatum (p <0.05), while there was no change in the cerebellum. It is possible that transcriptional or translational functional striatum mechanisms favored TSC1 increasing, in a 4-hydroxytamoxifen-dependent manner

Introdução: Os processos degenerativos vêm sendo considerados determinantes da progressão do déficit neurológico na esclerose múltipla (EM) e são associados sobretudo à perda neuronal e axonal. A patologia na substância branca (SB) manifesta-se pela quebra de membranas e perda da complexidade microestrutural dos tratos cerebrais, o que pode ser estudado indiretamente pelas alterações nos índices de fração de anisotropia (FA) e difusividade média (DM), obtidos por meio das análises das imagens por tensores de difusão (diffusion tensor imaging - DTI). Essa técnica oferece outros dois índices mais específicos, a difusividade axial () e difusividade radial (), que são associados aos processos de perda axonal e desmielinização, respectivamente. A perda neuronal na substância cinzenta (SC) pode ser avaliada pelo grau de atrofia do córtex cerebral. Este estudo tem como objetivos mensurar os índices de DTI na maior comissura cerebral, o corpo caloso (CC), e o grau e distribuição da atrofia cortical em indivíduos com EM remitente-recorrente (EMRR) e baixos escores de incapacidade funcional, correlacionando essas alterações com o volume de lesões macroscópicas e os principais parâmetros clínicos. Método: 31 indivíduos (22 mulheres, idade média 30,5 anos ± 8,7) com EMRR e um grupo controle (GC) composto por 34 indivíduos saudáveis (27 mulheres, idade média 32,3 anos ± 7,8) realizaram exames de crânio em aparelho de ressonância magnética de 3 Tesla (3T), sendo adquiridas imagens de DTI com 32 direções de gradiente, obtendo-se os índices de FA, DM, e de cinco segmentos na secção sagital do corpo caloso (CC). Através da segmentação de imagens volumétricas ponderadas em T1 foram obtidas as espessuras corticais regionais nos grupos. Esses resultados foram correlacionados com os volumes lesionais de imagens ponderadas em T1 e T2/FLAIR e os escores da escala expandida do estado de incapacidade (Expanded Disability Status Scale - EDSS), considerando-se significativos resultados com p< 0,05. Resultados: Os índices de FA, DM e do CC estavam difusamente alterados no grupo EMRR e a , alterada significativamente no esplênio, tronco médio anterior e tronco médio posterior do CC. Observou-se atrofia cortical significativa no terço anterior dos lobos temporais, bilateralmente, e nas regiões parietal inferior, insular e fronto-orbitária direitas, com uma tendência à atrofia no giro frontal superior esquerdo. As FA, DM e correlacionaram-se com os volumes lesionais T1 e, mais significativamente, com os volumes lesionais T2/FLAIR, porém não houve correlação entre os volumes lesionais e a . A espessura cortical no grupo EMRR apresentou correlações com ambos os volumes lesionais, mais significativamente com as lesões em T1. O escore médio da EDSS era 1,1 ± 0,9 (variando de 0-3), apresentando correlações com a DM e a no esplênio, tronco médio anterior e posterior do CC, com uma correlação com a no tronco médio posterior. O EDSS correlacionou-se com a espessura cortical na topografia do giro frontal superior esquerdo. Discussão e conclusão: Houve alteração difusa nos índices de FA, DM e nos segmentos do CC, com acometimento mais localizado, predominantemente médio posterior, da , o que pode sugerir desmielinização difusa do CC, porém axonopatia ou degeneração mais acentuada em algumas regiões da SB. A atrofia cortical também apresentou uma distribuição regional característica, afetando sobretudo as regiões temporais, bilateralmente, parietal inferior, insular e fronto-orbitária direitas. As correlações encontradas entre os índices de DTI e a espessura cortical e os volumes lesionais demonstraram que, ao menos em parte, as degenerações das SB e SC podem ser relacionadas à degeneração Walleriana, secundária ao acúmulo de placas lesionais. As correlações entre a DM, de alguns segmentos do CC e a espessura cortical do giro frontal superior com os escores da EDSS favoreceram à hipótese de que a degeneração tecidual na EM foi um fator preponderante na progressão do déficit neurológico na EMRR / Introduction: The degenerative processes are gaining attention as predictors of the neurological deficit in multiple sclerosis (MS), being reflected by the degree of axon loss and central nervous system atrophy. The white matter pathology (WM) is characterized by cellular membranes disruption and loss of the microstructural complexity, which can be accessed by the diffusion tensor imaging (DTI) indices of fractional anisotropy (FA) and mean diffusivity (MD). This imaging technique also offers two more specific indices: the axial diffusivity () and radial diffusivity (), which are useful to differentiate between axon loss and demyelination, respectively. The gray matter (GM) neuronal loss can be accessed by the degree of cortical atrophy. The aim of this study is to measure the DTI indices in the greatest WM commisure, the corpus callosum (CC), and the degree and distribution of cortical atrophy in patients with relapsing remitting MS (RRMS) and low disability scores, correlating them to the macroscopic lesion load and the main clinical scores. Method: 31 RRMS patients (22 women, mean age 30.5 years ± 8.7) and 34 healthy control (HC) subjects (27 women, mean age 32.3 years ± 7.8) were submitted to brain examinations in a 3T magnetic resonance image scanner. From DTI with 32 gradient encoding directions were extracted the indices of FA, MD, and , which were measured in 5 segments of the mid-sagital section of the corpus callosum (CC). The cortical thickness was obtained from the segmentation of volumetric T1 images. These results were correlated with the macroscopic lesion loads in the T1 and T2/FLAIR images and the scores in the Expanded Disability Status Scale EDSS, considering significant the results with p< 0.05. Results: The FA, MD and were diffusively abnormal in all 5 segments of the CC in the RRMS group and the was abnormal only in the splenium, anterior midbody and posterior mid-body. The anterior area of the both temporal lobes and right inferior parietal, some orbital-frontal and insular regions showed significant atrophy, with a tendency of atrophy in the superior frontal gyrus. The FA, MD and correlated with the T1 lesion load and, more significantly, with the T2/FLAIR lesion load. The cortical thickness correlated with T1 and T2/FLAIR lesion loads, more significantly with the T1 lesion load. The mean EDSS in the RRMS group was 1.1 ± 0.9 (range 0-3), correlating with the MD and of the splenium, anterior and posterior mid-body of the CC. The EDSS correlated to cortical thickness in the topography of the superior frontal gyrus. Discussion and conclusion: The FA, MD and are diffusively abnormal in the CC, with abnormalities in the , restricted to the medial and posterior segments. These results can be interpreted as signs of diffuse demyelination in the CC and a predominance of axonopathy or more advanced degeneration in some segments. The cortical atrophy also followed a characteristic regional distribution, affecting predominantly the bilateral temporal lobes, and inferior parietal, orbital-frontal and insular regions, in the right hemisphere. The correlations found between the DTI indices and the cortical thickness and the macroscopic lesion loads show that, at least partially, the WM and GM degeneration can be related to Wallerian degeneration secondary to macroscopic lesion accumulation. The correlations between the DM, , in some of the CC segments, and cortical thickness, in the superior frontal gyrus, and the EDSS scores reinforces the hypothesis that the degenerative processes in MS can play a role in the disability status of the patients

Introdução: A lateralização atípica de linguagem (LAL) é mais frequentemente observada em indivíduos com epilepsia no hemisfério esquerdo. Pacientes com epilepsia secundária a esclerose mesial temporal (EMT) apresentam alta frequência de LAL. A presença de EMTE, diretamente ou por efeitos à distância, perturbaria a determinação típica de lateralidade de linguagem (LL). Estudos de LL com RMf, em populações homogêneas de pacientes com EMT são escassos. Os padrões regionais de reorganização, nesta população, assim como os fatores clínicos e funcionais associados à LAL são pouco conhecidos. Os objetivos deste estudo foram (1) Validar paradigma de linguagem em RMf capaz de ativar áreas frontais e temporais de linguagem (2) Avaliar LL regional, em população homogênea de pacientes com EMT e verificar o papel de variáveis clínicas e da atividade epileptiforme na determinação de LAL. Foram avaliados 46 pacientes com EMT unilateral (24 EMTE e 22 EMTD) e 24 controles saudáveis, destros. Todos os participantes foram submetidos a RMf de linguagem com paradigma de nomeação responsiva à leitura (NRL) desenvolvido em língua portuguesa. O paradigma foi eficaz em ativar áreas de linguagem. A correlação entre IL-RMf e IL-Wada foi estatisticamente significativa no GFM (0,387; p < 0,01); GFI (0,594, p < 0,001); GTS (0,357, p < 0,05); GTM (0,509, p < 0,001) e GTI (0,489, p < 0,001). Os pacientes foram classificados em discordantes e concordantes (EEG/RM), após monitorização prolongada por vídeo-EEG. As classificações individuais de LL do teste de Wada e RMf foram concordantes em 84%(GFM), 86% (GFI), 74%(GTS), 83%(GTM) e 86%(GTI) dos casos. A frequência de LAL variou de 17 a 33%, para EMTE; 14 a 17%, para EMTD e de 0 a 10%, no grupo controle. Os grupos EMTEc e EMTEd apresentaram menores valores de IL-RMf, em relação ao grupo controle no GFM e GFI (p <= 0.05). Adicionalmente, o grupo EMTEd apresentou menor IL-RMf no GTM (p <= 0.01) e GTI (p <= 0.05). O grupo EMTDd apresentou menor IL-RMf no GFM; GFI; GTM e GTI (p <= 0.05). A ocorrência de mais de 5 descargas/hora no período interictal associou-se a LAL no GFM (p <= 0.01). Início da epilepsia, maior tempo de epilepsia e presença de IPI não foram associadas a LAL. Concluiu-se que a presença de EMT associou-se a LAL nas regiões frontais e temporais, sugerindo reorganização de linguagem envolvendo amplas regiões cerebrais, distantes da zona epileptogênica. O achado de LAL observada no grupo EMTDd sugere que a atividade epileptiforme temporal esquerda pode influenciar a reorganização de linguagem, independentemente da presença de lesão estrutural à esquerda. A maior frequência de descargas à esquerda associou-se a LAL / Atypical language lateralization (ALL) is associated with left hemisphere epilepsy, especially in epilepsy secondary to left mesial temporal sclerosis (MTS). Recent findings indicate that MTS, directly or by an at-distance effect may disrupt typical language lateralization (LL). Language-fMRI investigations in homogeneous MTS populations are scarce. Frontal and temporal language reorganization patterns in this population remain incompletely understood, as well as clinical factors associated with ALL. Our objectives were (1) To validate an fMRI paradigm effective to activate frontal and temporal language areas (2) To evaluate regional LL patterns in a homogeneous population of MTS patients and to investigate clinical factors associated with ALL. We studied forty-six right-handed patients (24 left MTS and 22 right MTS) and 24 controls. Patients and controls were similar in age and gender. Left and right MTS groups were comparable in terms of clinical variables. All participants underwent a language fMRI with reading response-naming paradigm (RRN) task developed in Brazilian Portuguese. The task effectively activated frontal and temporal language areas, with a high concordance with the Wada test. All patients were classified as concordant and discordant after video-EEG monitoring. Correlation between Wada test and fMRI LIs was significant in MFG (0.387; p < 0.01); IFG (0.594, p < 0.001); STG (0.357, p < 0.05); MTG (0.509, p < 0.001) e ITG (0.489, p < 0.001). Individual LI classifications with Wada test and fMRI were concordant in 84%(MFG), 86% (IFG), 74%(STG), 83%(MTG) e 86%(ITG). The frequency of ALL was 17-33%, in left MTS; 14-17%, in right MTS and 0-10%, in controls. Both concordant and discordant-left MTS patients presented lower LI than controls in MFG and IFG (p<=0.05). Additionally, discordant left MTS group presented lower LI in MTG (p<=0.01) and ITG (p<=0.05). Discordant right MTS group presented lower LI in MFG; IFG; MTG and ITG (p <= 0.05). Interictal left-sided spike frequency (< 5/h) was associated with lower LI (p <= 0.01) in MTG. In conclusion, MTS was associated with frontal and temporal language reorganization. Presence of ALL in discordant RMTS group suggests that left temporal epileptic activity may influence language reorganization, even in the absence of a left structural lesion. Higher left-sided spike frequency in MTS was associated with a left-right shift of speech representation

INTRODUÇÃO: As alterações do equilíbrio postural e da marcha são frequentes em pacientes com diagnóstico de esclerose múltipla (EM) e podem estar presentes tanto em indivíduos com incapacidades mínimas ou sem sinais clínicos de comprometimento, tornando-se mais pronunciados naqueles com progressão significativa da doença. No entanto, pouco se sabe sobre o declínio do controle do equilíbrio em pacientes com incapacidade leve. A posturografia é considerada uma ferramenta objetiva padrão ouro para medir o equilíbrio postural na EM. Portanto, nosso objetivo foi verificar se a posturografia dinâmica detecta as alterações do equilíbrio postural longitudinalmente, caracterizando o declínio funcional de pacientes com EM e leve incapacidade. METÓDOS: Foram avaliados pacientes com EM remitente-recorrente com baixa incapacidade de acordo com a Escala expandida do estado de incapacidade (EDSS 0 - 3,5). Após 18 meses, os pacientes foram reconvocados para a avaliação final. Avaliamos o controle do equilíbrio postural através do Teste de organização sensorial modificado (TOSm), da Posturografia dinâmica, e o tempo de marcha através do Teste de caminhada cronometrado dos 25 pés (T25FW). Todos os pacientes foram devidamente avaliados por neurologistas especialistas em EM nos dois momentos de análise do estudo. Nós comparamos todas as medidas considerando o desempenho basal e após 18 meses para cada paciente e analisamos as mudanças no controle postural ao longo da evolução da doença, de acordo com subgrupos de EDSS. RESULTADOS: 89 pacientes foram incluídos na avaliação inicial e 79 completaram o estudo. 40 sujeitos saudáveis foram incluídos no grupo controle. Não observamos diferenças significativas de idade e gênero entre os grupos. O tempo médio de doença foi de 4,9 anos (DP ±3), o escore médio do EDSS inicial de todo o grupo de pacientes com EM foi de 1,21 (DP ±0,93). Observamos diferenças significativas entre os momentos basal e 18 meses considerando as seguintes variáveis: pacientes que tiveram surtos durante o estudo ou trocaram a medicação, aumentaram o EDSS em 0,34 pontos (p=0,016) e o tempo de marcha em 0,34 segundos (p=0,012); pacientes que apresentaram novas lesões gadolínio positivas antes da reavaliação aumentaram o EDSS em 0,94 pontos (p=0,001), aumentaram o tempo de marcha em 0,99 segundos (p < 0,001), pioraram o controle do equilíbrio estático e dinâmico no TOSm (p < 0,001). Nós também observamos fortes correlações entre o aumento do EDSS e aumento do tempo de marcha (rho 0,760, p=0,001), piora do controle do equilíbrio estático (rho= -0,536, p=0,032) e piora do controle do equilíbrio dinâmico (rho= -0,660, p=0,005). Nós verificamos que à medida que o grau de incapacidade aumenta (EDSS), o desempenho em todos os testes de equilíbrio e marcha pioram (0 < 0,001). CONCLUSÕES: O desempenho de pacientes com EM na Posturografia e tempo de marcha piora à medida que a doença evolui, mesmo em pacientes com incapacidade leve. Essas alterações caracterizam o declínio funcional e estão relacionados à atividade da doença. As avaliações utilizadas no nosso estudo podem ser complementares para caracterizar o acúmulo de incapacidades em estágios iniciais. Por essa razão, a avaliação através da Posturografia e o tempo de marcha podem ser considerados marcadores de declínio funcional em pacientes com esclerose múltipla / BACKGROUND: Balance and gait disorders are common in people with multiple sclerosis (MS) and appears even in MS individuals with minimal impairment or without clinical signs, becoming more pronounced in those with significant disease progression. However, little is known about the decline in balance control in patients with mild disability. Posturography is the gold standard objective measure of postural balance in MS, being able to detect even minimal impairments. Therefore, our aim was to examine if dynamic posturography detect longitudinal postural balance decline. METHODS: We evaluated relapsing-remitting MS patients with mild disability, according to Expanded disability status scale (EDSS 0-3,5). After 18 months, all patients was contacted to return to the final evaluation. Postural balance control was evaluated through the Modified Sensorial Organization Test (mSOT), at Dynamic Posturography and the walking time was measured by Timed 25 foot walk test (T25FW). All patients were properly evaluated by MS neurologists at both moments of study analysis. We compared all measures at the baseline and after 18 months, individually. We also analyzed the postural control changes according to the EDSS subgroups. RESULTS: 89 MS patients was evaluated at baseline and 79 completed the study. 40 healthy subjects was included in control group. We did not find differences between age and sex in both groups. Median time of the disease was 4.9 years (SD±3) and the median score of EDSS was 1,21 (SD±0,93). We found significant differences between baseline and after 18 months considering some variables: patients that had relapse during the period or changed the medication worsened the EDSS score in 0.34 points (p= 0.006), increased the walking time in 0.34 seconds (p=0,012); patients with new positive gadolinium lesions between sessions increased EDSS score in 0.94 points (p=0.001), increased the walking time in 0.99 seconds (p < 0.001) and worsened static and dynamic balance control mSOT (p < 0,001). We also observed strong correlations between increased EDSS and increased gait time (rho 0.760, p=0.001), worse static balance control (rho= -0,536, p=0,032) and worse dynamic balance control (rho= - 0.660, p=0.005). As the degree of disability increases (EDSS), performance in all balance and gait tests worsens (0 < 0.001). CONCLUSIONS: MS patient\'s performance at Posturography and gait tests worsened as the disease progresses, even patients with mild disability. These changes characterize functional decline and are related to disease activity. The evaluations used in our study may be complementary to characterize the accumulation of disabilities in the early stages of the disease. For this reason, Posturography evaluation and gait timed tests may be considered markers of functional decline in patients with multiple sclerosis

Introdução: A imunização de coelhos saudáveis com colágeno do tipo V (COLV) reproduz as principais manifestações da esclerose sistêmica (ES), incluindo fibrose, vasculopatia e produção de autoanticorpos específicos da doença. Estudos preliminares mostraram que, tanto na derme de animais imunizados com COLV (COLV-IM), como na derme de pacientes com ES, observa-se deposição aumentada de COLV anômalo, mas não se sabe qual a relevância clínica deste achado. O remodelamento da matriz extracelular é precoce nos animais COLV-IM, ocorrendo já no sétimo dia após a imunização, o que sugere que o COLV esteja relacionado com a injúria endotelial, evento primário envolvido na patogênese da ES. Desta forma, os objetivos do presente estudo foram avaliar a expressão de COLV na derme de controles saudáveis e de pacientes com ES e sua correlação com espessamento cutâneo, atividade e duração da doença; assim como pesquisar uma possível associação entre a deposição deste colágeno na derme com a expressão de marcadores de apoptose e de ativação endotelial em pacientes e no modelo animal induzido pela imunização com COLV. Pacientes e Métodos: Biópsias de pele de pacientes com ES (N=18, 6 com doença precoce e 12 com doença tardia) e de controles (N=10) pareados por idade e sexo, assim como biópsias de pele de coelhos imunizados com COLV + adjuvante de Freund (COV-IM, N=6) ou adjuvante de Freund (N=6) foram avaliadas. Nos pacientes com ES, o espessamento cutâneo foi avaliado por meio do escore de Rodnan Modificado (MRSS) e a atividade da doença foi calculada pelo índice de atividade de Valentini. Para realizar a quantificação por histomorfometria, o COLV na derme foi identificado por imunofluorescência. Caspase-3, endotelina-1, CTGF, TGF e VEGF nas células endoteliais dérmicas foram marcados por imunohistoquímica. Nos pacientes e nos controles, o COLV proveniente da cultura de fibroblastos dérmicos foi quantificado por PCR RT em tempo real e caracterizado por eletroforese, imunoblotting e reconstrução tridimensional, por meio da microscopia confocal. Resultados: O depósito de COLV foi maior na derme de pacientes com doença precoce, quando comparados aos controles e aos pacientes com doença tardia. A atividade e a duração da ES estiveram associadas com o depósito de COLV. A expressão de RNA mensageiro das cadeias COLV1 COLV2 foi aumentada em relação aos controles e a reconstrução tridimensional confirmou a presença de fibras anômalas de COLV. Observou-se maior expressão de caspase-3, endotelina-1, CTGF, TGF e VEGF nas células endoteliais dos pacientes com ES, quando comparados aos controles. Houve correlação positiva entre o depósito de COLV e a expressão de caspase-3, endotelina-1 e CTGF. Ao comparar-se os coelhos COLV-IM com os controles, observou-se aumento significativo da expressão de COLV aos 7 dias e de endotelina-1 aos 210 dias após a imunização. Embora de maneira não significativa, verificou-se maior expressão de caspase-3, CTGF e VEGF nos animais COLV-IM e, quando os animais foram comparados ao longo do tempo, percebeu-se maior expressão de COLV no sétimo dia após a imunização na derme dos animais COLV-IM, diminuindo no trigésimo dia e voltando a subir aos 75 dias e aos 210 dias. A caspase-3 e a endotelina-1 comportaram-se de maneira semelhante. Conclusão: Estes resultados sugerem que o COLV possa agir como um possível gatilho envolvido na patogênese da ES, agindo como um indutor de ativação e de apoptose endotelial, que por sua vez poderia resultar em maior expressão de COLV, perpetuando o processo de remodelamento observado na pele dos pacientes com ES / Introduction: The immunization of healthy rabbits with type V collagen (COLV) reproduces the main characteristics of systemic sclerosis (SSc), such as fibrosis, vasculopathy and specific auto-antibodies. Preliminary studies demonstrated that both COLV-immunized rabbits (COLV-IM) and SSc patients exhibit increased expression of abnormal COLV in the dermis, but the clinical relevance of this finding is unknown. The remodeling of the extracellular matrix is an early event in COLV-IM rabbits that can be detected by the seventh day after immunization; this observation suggests that COLV is involved in endothelial injury, one of the first manifestations of the disease. Thus, the objectives of this study were to evaluate COLV expression in the dermis of healthy controls and SSc patients and to determine the correlation of this expression with skin thickness, disease activity and duration and search for a possible association between this collagen with apoptosis and activation of endothelial cells markers in patients and in animal model induced by immunization with COLV. Patients and Methods: Skin biopsies from 18 patients (6 early-stage and 12 late-stage) and 10 healthy controls as well as skin biopsies from rabbits immunized with COLV (COLV-IM) and Freund adjuvant (N=6) or Freund adjuvant alone (N=6) were evaluated. Skin thickening assessment was performed with the Modified Rodnan Skin Score (MRSS), and activity was calculated using the Valentini Disease Activity Index. To perform quantification by histomorphometry, COLV was identified by immunofluorescence, and caspase-3, endothelin-1, CTGF, TGF and VEGF in dermal endothelial cells were labeled by immunohistochemistry. In SSc patients and healthy controls, COLV from dermal fibroblast culture was quantified by real-time RT-PCR and characterized by electrophoresis, immunoblotting and tridimensional reconstruction by confocal microscopy. Results: COLV deposition was increased in the dermis of the patients with early disease compared with the healthy controls and the patients with late disease. SSc activity and disease duration were associated with dermal COLV deposition. COLV1 and COLV2 mRNA expression levels were higher in SSc, and a tridimensional reconstruction of SSc dermal heterotypic fibers confirmed the presence of abnormal COLV. The dermal endothelial cell expression of caspase-3, endothelin-1, CTGF, TGF and VEGF was higher in the SSc patients than in the controls. There was a positive correlation between COLV deposition and caspase-3, endothelin-1 and CTGF expression. When the COLV-IM rabbits were compared with the controls, there was a significant increase in the expression of COLV 7 days after the immunization and a significant increase in the expression of endothelin-1 210 days after the immunization. The expression of caspase-3, CTGF and VEGF was higher in the COLV-IM animals than in the control rabbits, although not significantly, and when the rabbits were compared over time, the expression of COLV was higher in the dermis of the COLV-IM animals 7 days after immunization, decreasing at 30 days and increasing again at 75 and 210 days. Caspase-3 and endothelin-1 exhibited similar behavior. Conclusion: these results suggest that COLV can be a possible trigger involved in the pathogenesis of SSc, acting as an inducer of endothelial apoptosis and activation that could result in higher expression of COLV, perpetuating the remodeling process observed in SSc skin

O complexo da esclerose tuberosa (TSC) é um transtorno clínico, com expressividade variável, caracterizado por hamartomas que podem ocorrer em diferentes órgãos. Tem herança autossômica dominante e é devido a mutações em um de dois genes supressores de tumor, TSC1 ou TSC2. Estes codificam para as proteínas hamartina e tuberina, respectivamente, que se associam formando um complexo macromolecular que regula funções como proliferação, diferenciação, crescimento e migração celular. As lesões cerebrais podem ser muito graves em pacientes com TSC e caracterizam-se por nódulos subependimários (SEN), astrocitomas subependimários de células gigantes (SEGA), tuberosidades corticais e heterotopias neuronais, podendo relacionar-se clinicamente à epilepsia refratária à terapia medicamentosa, deficiência intelectual, desordens do comportamento e hidrocefalia. O potencial de crescimento de SEGA até os 21 anos de idade dos pacientes exige acompanhamento periódico por exame de imagem e condutas clínicas ou cirúrgicas, conforme indicação médica. As lesões subependimárias têm sido explicadas por déficits de controle da proliferação, crescimento e diferenciação de precursores neuro-gliais na zona subventricular telencefálica. Embora a capacidade da tuberina em inibir a proliferação celular pela repressão do alvo da rapamicina em mamíferos (mTOR) esteja bem documentada, outros aspectos celulares do desenvolvimento de SEGA ainda não foram examinados. Assim, é importante estabelecer um sistema in vitro para o estudo de células da zona subventricular e testá-lo na análise das proteínas hamartina e tuberina. Neste sentido, o cultivo de neuroesferas em suspensão é muito apropriado. Neste estudo, buscamos relacionar a expressão e distribuição subcelular da hamartina e tuberina à capacidade proliferativa e de diferenciação das células de neuroesferas cultivadas in vitro a partir da dissociação da vesícula telencefálica de embriões de ratos normais. Analisamos a expressão e distribuição subcelular da hamartina e tuberina por imunofluorescência indireta em células entre a primeira e a quarta passagens das neuroesferas, sincronizadas nas fases G1 ou S do ciclo celular e após a reentrada no ciclo celular, através da incorporação de 5-bromo-2\'-desoxiuridina (BrdU) e imunofluorescência com anticorpo anti-BrdU. Em geral, células de neuroesferas apresentaram baixa colocalização entre hamartina e tuberina in vitro. A expressão da tuberina foi elevada em basicamente todas as células das esferas e fases do ciclo celular; ao contrário, a hamartina apresentou-se principalmente nas células da periferia das esferas. A colocalização entre hamartina e tuberina foi observada em células mais periféricas das esferas, sobretudo no citoplasma e, em G1, no núcleo celular. A proteína rheb, que conhecidamente interage diretamente com a tuberina, apresentou distribuição subcelular muito semelhante à desta. Ao carenciamento das células visando à parada do ciclo celular na transição G1/S, tuberina distribuiu-se ao núcleo celular em quase todas as células avaliadas e, de forma menos frequente, a hamartina também. À reentrada no ciclo celular pelo reacréscimo dos fatores de crescimento, avaliaram-se células com incorporação de BrdU ao seu núcleo celular, após 72 e 96 horas. Nestas, tuberina mostrou-se novamente no citoplasma de forma preponderante e hamartina manteve-se citoplasmática, em geral subjacente à membrana plasmática, em níveis mais baixos. Os grupos cujas células reciclaram por 72 ou 96 horas diferiram quanto ao aumento significativo da expressão da hamartina em células proliferativas no último. À diferenciação neuronal, aumentaram-se os níveis de expressão de hamartina observáveis à imunofluorescência indireta, tornando-se equivalentes àqueles da tuberina. Concluímos que as células de neuroesferas cultivadas em suspensão apresentam-se como um sistema apropriado ao estudo da distribuição das proteínas hamartina e tuberina e sua relação com o ciclo celular / The tuberous sclerosis complex (TSC) is a clinical disorder with variable expressivity, characterized by hamartomas that can occur in different organs. It has autosomal dominant inheritance and is due to mutations in one of two tumor suppressor genes, TSC1 or TSC2. These encode for the proteins hamartin and tuberin, respectively, which are associated in a macromolecular complex which functions as a regulator of cell proliferation, differentiation, growth and migration. TSC brain lesions may be severe and are characterized by subependymal nodules (SEN), subependymal giant cell astrocytomas (SEGA), neuronal heterotopias and cortical tubers, and may be clinically related to refractory epilepsy, intellectual disability, behavioral disorders and hydrocephaly. The growth potential of SEGA up to 21 years of age in TSC patients requires regular monitoring by imaging. Clinical and surgical interventions may be medically indicated. Subependymal lesions have been explained by deficient control of proliferation, growth and differentiation of neuro-glial progenitors from the telencephalic subventricular zone. While tuberin ability to inhibit cell proliferation by repressing the mammalian target of rapamycin (mTOR) has been well documented, other cell aspects of SEGA development have not been thoroughly examined. Therefore, it is important to establish conditions for an in vitro system to study the cells from the subventricular zone and to test its suitability for the study of the TSC proteins. In this regard, the neurosphere suspension culture is very appropriate. We evaluated the expression and subcellular distribution of hamartin and tuberin in relation to the proliferation and differentiation capability of neurosphere cells derived in vitro from the dissociation of the telencephalic vesicle of normal E14 rat embryos. These analyses were performed by indirect immunofluorescence in cells from first through fourth passages of neurospheres, synchronized in G1 or S phases of the cell cycle, and after reentry into the cell cycle by the addition of 5-brome-2\'-desoxyuridine (BrdU) and immunolabeling with anti-BrdU antibody. In general, neurosphere cells presented low colocalization between hamartin and tuberin in vitro. Tuberin expression was relatively high in basically all neurosphere cells and cell cycle phases, whereas hamartin distributed mainly to cells from the periphery of the spheres. In these cells, hamartin and tuberin colocalization was evident mostly in the cytoplasm and, in G1, also in the cell nucleus. Rheb, which is known to interact directly with tuberin, had subcellular distribution very similar to tuberin. Cell starvation indicating cell cycle arrest at G1/S redistributed tuberin to the cell nucleus in virtually all cells examined, what was accompanied by nuclear location of hamartin in a small subset of cells. When cells were allowed to reenter cell cycle by adding growth factors, we evaluated BrdU-labeled nuclei 72 and 96 hours later. In the two groups, tuberin was shown to move back to the cytoplasm as well as hamartin, which apparently maintained its lower expression levels distribution underneath the plasma membrane. Group of cells that recycled for 96 hours had significantly more expression of hamartin than those cells that cycled for only 72 hours. After neuronal differentiation, hamartin expression levels observed by immunofluorescence were similar to those of tuberin. We conclude that neurosphere cells cultured in suspension showed to be an appropriate cell system to study hamartin and tuberin distribution in respect to the cell cycle

INTRODUÇÃO: Aproximadamente 20 a 30% dos casos novos de epilepsia se tornam refratários ao tratamento medicamentoso ao longo do tempo e a maioria destes casos está relacionada à esclerose mesial temporal (EMT). Disfunção metabólica tem sido relacionada à EMT por diferentes métodos, como tomografia de emissão de pósitrons, tomografia computadorizada por emissão de fóton único, espectroscopia de próton e fósforo (31P-ERM) por ressonância magnética. A caracterização das alterações metabólicas relacionadas à EMT pode auxiliar na melhor compreensão da epileptogênese, da refratariedade clínica comumente encontrada nestes pacientes e na busca de novas possibilidades terapêuticas. OBJETIVOS: Avaliar pela 31P-ERM o perfil metabólico dos pacientes com EMT e comparar com os dados de controles saudáveis. Verificar a existência de correlação entre o tempo de epilepsia, frequência de crises com os resultados da 31P-ERM nas regiões hipocampais. MÉTODOS: 33 pacientes com EMT unilateral e 31 controles foram estudados pela 31P-ERM, tridimensional em aparelho de 3,0 Tesla. Os voxels selecionados para análise foram os localizados na região hipocampal (RH), região insulonuclear anterior (RINA), região insulonuclear posterior (RINP) e na região frontal (RF). Estes voxels foram considerados ipsilaterais ou contralaterais à EMT, diagnosticada pela ressonância magnética convencional. Os metabólitos estudados foram: fosfodiésteres (PDE), fosfomonoésteres (PME), fosfato inorgânico (Pi), fosfocreatina (PCr) , adenosina trifosfato total (ATPt) compostos pela soma dos ?-, ?- e ?-ATP. Foram ainda avaliadas as razões PCr/ATPt, PCr/?-ATP, PCr/Pi e PME/PDE bem como o pH e magnésio. RESULTADOS: Na RH contralateral, aumento de ?-ATP e redução de PCr/ ?-ATP foram significativos. Na RINA ipsilateral, redução de Pi e PCr/ ?-ATP foram detectados. Na RINA contralateral, houve redução de Pi e aumento de ATPT. Na RINP ipsilateral, foram detectados redução de Pi, PCr/?-ATP e aumento de ?-ATP. Na RF contralateral houve redução de Pi. Não houve diferença entre nenhum dos metabólitos ou razões estudados na RH ipsilateral, RINP contralateral, RF ipsilateral em comparação aos controles. Não houve correlação dos resultados da 31P-ERM com o tempo de epilepsia na RH. Em relação à frequência de crises, houve correlação com ATPT, PME, PDE, PME/PDE na RH ipsilateral e de ?-ATP, ATPT, PCr/ ?-ATP e PCr/ATPT na RH contralateral. Análises adicionais foram feitas com os resultados na RH, separando os pacientes de acordo com a frequência de crises e tempo de epilepsia. No grupo de pacientes com frequência igual ou maior que 10 crises por mês, o PME foi menor na RH ipsilateral enquanto que o ?-ATP foi maior e o PCr/?-ATP menor na RH contralateral. No grupo de pacientes com tempo de epilepsia igual ou maior que 20 anos, o ?-ATP foi maior na RH contralateral. Nos grupos de pacientes com frequência de crises menor que 10 por mês ou tempo de epilepsia menor que 20 anos, nenhuma diferença foi detectada. Dados interpolados nas RH foram avaliados, notando-se redução de PME na RH ipsilateral e tendência a significância de diferenças de ?-ATP e PCr/?-ATP na RH contralateral. CONCLUSÕES: Há alterações energéticas difusas nas regiões não epileptogênicas de pacientes com EMT que podem estar relacionadas à disfunção mitocondrial. Na RH ipsilateral, detectou-se redução de PME na análise de voxels interpolados e no grupo de pacientes com frequência maior que 10 crises por mês, indicando alteração de composição de membrana, provavelmente relacionado à gliose e perda neuronal / INTRODUCTION: Around 20-30% of new cases of epilepsy become drug resistant over time and most of these cases are related to mesial temporal sclerosis (MTS). Metabolic dysfunction has been related to MTS by different methods such as positron emission tomography, single photon emission computed tomography, proton and phosphorus (31P-MRS) magnetic resonance imaging spectroscopy. Characterization of metabolic changes related to MTS can improve the understanding of epileptogenesis and drug resistance commonly found in these patients and in the search of new therapeutic possibilities. OBJETIVES: Evaluate by 31P-MRS the metabolic profile of patients with MTS and compare with data from healthy controls. Check the correlation between time of epilepsy, seizure frequency with the results of 31P-MRS in the hippocampal regions. METHODS: 33 unilateral MTS patients and 31 controls were studied by three-dimensional 31P-MRS in 3.0 Tesla equipment. The voxels selected for analysis were located in the hippocampal region (HR), anterior insulonuclear region (RINA), posterior insulonuclear region (RINP) and frontal region (RF). These voxels were considered ipsilateral or contralateral to MTS, diagnosed by conventional MRI. Analised metabolites were: phosphodiesthers (PDE), phosphomonoesthers (PME), inorganic phosphate (Pi), phosphocreatine (PCr) , total adenosine triphosphate ( ATPt) sum of ?- + ?- + ?-ATP and ?-ATP. We also evaluate PCr/ATPt , PCr/?-ATP, PCr/Pi and PME/PDE ratios as well as pH and magnesium. RESULTS: In the contralateral HR, increase of ?-ATP and decrease of PCr / ?-ATP were significant. In the ipsilateral RINA, reductions of Pi and PCr / ?-ATP were detected. In the contralateral RINA, there were reduction of Pi and increased ATPT. In the ipsilateral RINP, reduction of Pi and PCr / ?-ATP and increased ?-ATP were detected. In the contralateral RF, decreased Pi was found. There was no difference between any of the studied metabolites or ratios in the ipsilateral HR, contralateral RINP, ipsilateral RF compared to controls. There was no correlation between the results of 31P-ERM and time of epilepsy in HR. The following metabolites showed correlation with the seizure frequency in the ipsilateral HR: ATPT, PME, PDE, PME/PDE. The seizure frequency was correlated to ?-ATP, ATPT, PCr/ ?-ATP, PCr/ATPT in the contralateral HR. Aditional analysis was made with the results from HR, dividing the patients according to seizure frequency and time of epilepsy. Patients with 10 or more seizures per month showed reduction of PME in the ipsilateral HR; increase of ?-ATP and decrease of PCr/?- ATP in the contralateral HR. Patients with time of epilepsy of 20 years or more showed increase of ?-ATP in the contralateral HR. Patients with less than 10 seizures per month or time of epilepsy lower than 20 years did not demonstrate any difference. Reduction of PME in the ipsilateral HR and tendency to significant differences in ?-ATP and PCr/?-ATP in the contralateral HR were detected from interpolated data. CONCLUSIONS: There are diffuse energetic changes in non epileptogenic regions of patients with MTS that could be related to mitochondrial dysfunction. In the ipsilateral HR, reduction of PME was found from interpolated data and in the group of patients with 10 or more seizures per month, suggesting changes in membrane composition, probably related to gliosis and neuronal loss