As lacases (EC 1.10.3.2) são fenol-oxidases associadas à habilidade de degradar a lignina e outros compostos recalcitrantes, como xenobióticos e vários tipos de corantes sintéticos. Lacases catalisam a oxidação de vários compostos aromáticos com concomitante redução do oxigênio a água. Neste trabalho são apresentados os resultados de imobilização do extrato de lacases de Pleurotus sajor-caju PS2001 em filmes poliméricos de poliamida 6,6 (PA) e polissulfona (PSU), utilizando glutaraldeído como agente de ligação. A solução enzimática de lacases foi obtida em meio sólido contendo serragem de Pinus spp cultivado com P. sajor-caju. As proteínas da solução enzimática foram imobilizadas em filmes de PA e PSU. O processo de imobilização foi estudado quanto ao pH ótimo, sendo os filmes caracterizados quanto à quantidade de proteínas imobilizadas e atividade de lacases. As membranas de PA apresentaram maior atividade de lacases quando comparadas com as de PSU. Observou-se uma redução do pH ótimo para atividade de lacases imobilizadas, utilizando-se o tampão acetato e um aumento em tampão Mcllvaine. A maior atividade de lacases foi obtida após 6 h de imobilização, em reação a 30°C, com agitação constante, tanto para os filmes de PA quanto para os de PSU. Verificou-se descoloração de aproximadamente 90% da solução 25 mg/L do corante Reactive Blue 220, após 24 horas de reação, utilizando membranas de PA com a enzima imobilizada. Aproximadamente 50% da descoloração obtida deve-se a adsorção do corante pela membrana. Resultados semelhantes foram obtidos com a utilização do corante Remazol Brilliant Blue R (RBBR), com adição de Reactive Blue 220. Não foi observada descoloração sem adição do Reactive Blue, sugerindo uma ação semelhante a um mediador, proporcionando a descoloração do RBBR. Apesar de serem observadas atividades de lacases imobilizadas nas membranas de PSU, utilizando-se ABTS como substrato, não foi observada descoloração dos corantes analisados. / Submitted by Marcelo Teixeira (mvteixeira@ucs.br) on 2014-05-14T18:02:47Z No. of bitstreams: 1 Dissertacao Katia Rasera.pdf: 933755 bytes, checksum: fadf6b200d674217ac06cf5b50743776 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-05-14T18:02:47Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertacao Katia Rasera.pdf: 933755 bytes, checksum: fadf6b200d674217ac06cf5b50743776 (MD5) / Laccases (EC 1.10.3.2) are phenol-oxidase enzymes associated to the degradation of lignin and a wide variety of recalcitrant compounds, such as xenobiotics and different types of dyes. Laccases catalyze the oxidation of various aromatic compounds with the concomitant reduction of oxygen to water. In this work, the results of immobilization of Pleurotus sajor-caju PS 2001 laccases in polyamide 6,6 (PA) and polysulfone (PSU) films, using glutaraldehyde as linking agent, are presented. The enzymatic solution containing laccases was obtained from solid medium with Pinus spp sawdust cultivated with P. sajor-caju. The proteins present in this solution were immobilized in PA and PSU films The immobilization process was studied with respect to the optimum pH, and the films were evaluated to determine the protein content and laccase activity. PA membranes showed higher laccase activity than PSU ones. With immobilized enzymes, a reduction of the optimum pH for laccase activity was observed, using acetate buffer and a increase using Mcllvaine buffer. The higher laccase activity was achieved after 6 h of immobilization, at a reaction temperature of 30°C, under agitation, for both PA and PSU films. Discolouration of approximately 90% of solution 25 mg.L-1 of the dye Reactive Blue 220 was verified, after 24 hours of reaction, using membranes of PA with the immobilized enzyme. Approximately 50% of the discolouration would be attributed from the adsortion process of the dye for the PA membrane. Similar results had been gotten with the use of the dye Remazol Brilliant Blue R (RBBR), with addition of Reactive Blue 220. Discolouration without addition of the Reactive Blue was not observed, suggesting a similar action to a mediator, providing the discolouration of the RBBR. Although to be observed immobilized activities of lacases in the membranes of PSU, using ABTS as substratum, discolouration of the analyzed corantes was not observed.

Made available in DSpace on 2014-12-17T14:03:26Z (GMT). No. of bitstreams: 1 LissandraSQ.pdf: 1069993 bytes, checksum: 556a7ed5b99d34531ce7aab70a3ea3cf (MD5) Previous issue date: 2008-06-27 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Cient?fico e Tecnol?gico / The mushrooms have been object of intense research in view of its potential raising of application in different sectors of the pharmacology and alimentary industry. Among diverse bioactive composites of polyssacharides nature that exist in the fungus the glucans are much searched. These are polymers of glucose and classified as the type of glicosidic linking [&#945;, &#946;]. Peroxisome proliferator-activated receptors (PPARs), ranscription factors belonging to the family of nuclear receptors that bind themselves o specific agonists, have shown their importance in controlling the inflammatory process. The aim of this study was to perform a chemical characterization of extract rom the mushroom Caripia montagnei, assess its antiinflammatory and antibacterial effect and determine if this effect occurs via PPAR. This mushroom is composed of carbohydrates (63.3?4.1%), lipids (21.4l?0.9%) and proteins (2.2? 0.3%). The aqueous solution resulting from the fractionation contained carbohydrates (98.7?3.3%) and protein (1.3?0.25%). Analyses of infrared spectrophotometry and of nuclear magnetic esonance demonstrated that the extract of mushroom C. montagnei is rich in &#946;-glucans. In hioglycolate-induced peritonitis, the C. montagnei glucans (50 mg/kg) educed the inflammatory process in 65.5?5.2% and agonists, pharmacological igands, for PPAR: Wy-14643 (49.3?6.1%), PFOA (48.9?3.8%) and clofibrate in 45.2?3.2%. Sodium diclofenac showed a reduction of 81.65?0.6%. In the plantar edema, the glucans from C. montagnei (50 mg/kg) and L-NAME reduced the edema to a similar degree 91.4?0.3% and 92.8?0,5 %, respectively. In all the groups tested, nitric oxide (NO), an inflammation mediator, showed a significant reduction in the nitrate/nitrite levels when compared to the positive control (P<0.001). The C. montagnei glucans did not show cytotoxicity in the concentrations tested (2.5, 5.0, 10.0, 20.0 and 40.0 ?g/100 ?L). Antibacterial activity demonstrated that, unlike total extract, there was no inhibition of bacterial growth. The C. montagnei glucans show great potential for antiinflammatory applications. This effect suggests that it is mediated by PPAR activation and by COX and iNOS inhibition / Os fungos tem sido objeto de intensa pesquisa, tendo em vista seu elevado potencial de aplica??o em diferentes setores da ind?stria farmacol?gica e alimentar. Dentre os diversos compostos bioativos de natureza polissacar?dica presentes nos fungos as glucanas est?o entre os mais pesquisados. Estes s?o pol?meros de glucose amplamente distribu?dos na natureza e classificadas conforme o tipo de liga??o glicos?dica [&#945;, &#946;]. Os Receptores Ativados por Proliferadores de Peroxissoma (PPARs) s?o fatores de transcri??o, pertencentes ? fam?lia de receptores nucleares que se ligam a agonistas espec?ficos e possuem grande import?ncia no controle do processo inflamat?rio. O objetivo deste trabalho foi realizar a caracteriza??o qu?mica do extrato do fungo Caripia montagnei, avaliar seu efeito antiinflamat?rio e antibacteriano, al?m de verificar se este efeito acontece via PPAR. C.montagnei ? constitu?do de carboidratos (63.3 ? 0.73%), lip?deos (21.4? 0.9%) e prote?nas (2.2?0.4%). O extrato aquoso resultante do fracionamento desse fungo mostrou ser constitu?do por carboidratos (98.7?0.9%) e prote?na (1.3?0.8%). As an?lises de espectrofotometria de infravermelho e de resson?ncia magn?tica nuclear (NMR) demonstraram que o extrato do fungo C. montagnei ? rico em &#946;-glucanas. Na peritonite induzida por tioglicolato, o extrato de Caripia montagnei (50 mg/Kg) conseguiu reduzir o processo inflamat?rio em 65.5? 0.9%, este valor ? superior a Wy-14643 (49.3?0.65%), PFOA (48.9?0,69%) e clofibrato (35.2?0,95%), que s?o agonistas de PPAR-&#945;, e semelhante ao diclofenaco (81.6? 0,79). No edema plantar as glucanas de C. montagnei (50 mg/Kg) e o L-NAME apresentaram redu??o do edema de forma semelhante, 91.4?1.1% e 92,8?0.9%, respectivamente. O ?xido n?trico (NO), mediadores da inflama??o mostrou que em todos os grupos testados houve redu??o significativa (P<0.001) dos n?veis de nitrato/nitrito quando comparados ao controle positivo. No ensaio de citotoxicidade as glucanas de C. montagnei n?o apresentaram toxicidade nas concentra??es testadas (2.5, 5.0, 10.0, 20.0 e 40.0 ug/100uL) no per?odo de 4 horas. A atividade antibacteriana (30, 90 e 150 mg/mL) revelou que n?o houve inibi??o do crescimento bacteriano. Os resultados obtidos neste trabalho indicam que as glucanas de Caripia montagnei possuem um grande potencial de aplica??o como antiinflamat?rio. Este efeito ? mediado parcialmente por ativa??o dos PPARs e por inibi??o da COX e iNOS

Orientador: Antonio Batista Filho / Banca: Carlos Frederico Wilcken / Banca: Edson Luiz Furtado / Banca: José Eduardo Marcondes Almeida / Banca: Luis Garrigos Leite / Resumo: Com o objetivo de determinar a patogenicidade de diferentes isolados do fungo Metarhizium anisopliae sobre ninfas de Mahanarva fimbriolata foi testada, em laboratório, a patogenicidade de 79 isolados, provenientes de diferentes hospedeiros e regiões do país. Inicialmente, foi realizado um bioensaio para estabelecimento da concentração a ser utilizada nos experimentos de seleção, adotando-se, como padrão, o isolado IBCB 348 de M. anisopliae. Através da Análise de Probit, foi calculada a CL50 obtendo uma concentração de 1,2 x 108 conídios/mL, decorridos 4 dias da pulverização. As avaliações foram realizadas diariamente, observando-se os níveis de mortalidade acumulada (total, confirmada e corrigida) de cada tratamento. Os melhores isolados testados foram IBCB 348; IBCB 351; IBCB 363; IBCB 408; IBCB 410; IBCB 418; IBCB 425 e IBCB 482, os quais apresentaram uma eficiência igual ou superior a 70% de mortalidade confirmada, aos seis dias da pulverização. Os isolados IBCB 348; IBCB 408; IBCB 410 e IBCB 425 foram os que mais produziram conídios em arroz com 2,08 x 108, 1,75 x 108, 2,22 x 108 e 2,30 x 108 conídios/g de arroz pré-cozido, respectivamente, pelo método de bandeja. Foi pulverizado 2kg/ha de arroz+fungo, contendo 1,5 x 1012 conídios/ha, destacando-se os isolados IBCB 348 e IBCB 408 que causaram mortalidade, para ninfas de 100%, respectivamente, aos 15 dias da pulverização. Decorridos 30 dias da pulverização, os isolados IBCB 408 e IBCB 425 apresentaram eficiência de controle de 63 e 62%, respectivamente, para as ninfas e para os adultos foi de 100%, respectivamente. Aos 60 dias da aplicação, o isolado IBCB 425 foi o mais eficiente para controlar as ninfas (48,4%) e para os adultos de M. fimbriolata, os isolados não foram eficientes. Nas avaliações realizadas aos 90 e 120 dias, a população de cigarrinha manteve-se acima do nível de dano econômico... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo). / Abstract: This work was carried out evaluate the pathogenicity of different isolates of the fungus Metarhizium anisopliae against nymphs of Mahanarva fimbriolata. The pathogenicity of 79 isolates, provenients from differents hosts and regions of the country, were tested in the laboratory. First, it was performed a bioassay to determine the concentration to be used in the selection experiments, the IBCB 348 isolate of M. anisopliae was used as standard. Evaluations were done daily, observing the levels of mortality (total, confirmed and corrected) of each treatment. The best isolates were IBCB 348; IBCB 351; IBCB 363; IBCB 408; IBCB 410; IBCB 418; IBCB 425 and IBCB 482, which showed an efficiency equal or higher than 70% six days after the pulverization. The isolates IBCB 348; IBCB 408; IBCB 410 and IBCB 425 produced the largest number of conidia with 2,08 x 108; 1,75 x 108; 2,22 x 108 and 2,30 x 108 conidia/g of rice, respectively by the tray method. Was pulverized 2kg/ha de rice+fungus, with 1,5 x 1012 conidia/ha, showing off the isolates IBCB 348 and IBCB 408 that caused a mortality for nymphs of 100%, respectively, 15 days after the pulverization. After 30 days of the pulverization, the isolates IBCB 408 and IBCB 425 showed control efficiency of 63 and 62%, respectively, for the nymphs and for adults the efficiency was 100%, respectively. Sixty day after the application, the isolate IBCB 425 were the most efficients for control nymphs (48%) and for adults of M. fimbriolata the isolates weren't efficients. In the evaluation realized at 90 and 120 days, the speatlebug population was kept above the economic threshold level. The efficiency of the isolates was null for adults and for nymphs, the isolate IBCB 408 showed efficiency of 31%, after ninety days of the pulverization. At 120 days, the efficiency of the isolates was null for nymphs and for adults the maxim efficiency (63%) was... (Complete abstract, click electronic address below). / Doutor

Orientador: Antônio Carlos Monteiro / Banca: Marcelo Augusto Boechat Morandi / Banca: Kátia Cristina Kupper / Resumo: O conhecimento das condições adequadas de cultivo e a busca por meios de cultura e métodos de produção que favoreçam o crescimento e a esporulação de fungos e, principalmente, viabilizem economicamente o processo de produção são aspectos importantes a serem considerados na produção massal de um agente de biocontrole. O objetivo deste trabalho foi avaliar o crescimento, a esporulação e a viabilidade de B. euphorbiae sob o efeito de diferentes valores de pH inicial do meio de cultivo, da temperatura e do regime de iluminação além de analisar a tolerância dos conídios à luz solar e a radiação ultravioleta e selecionar meios de cultura de baixo custo e fácil obtenção para produção do fungo. O fungo foi cultivado em meios de cultura com vários valores de pH (4, 5, 6, 7, 8, 9 e 10), exposto a diversas temperaturas (13, 16, 19, 22, 25, 28, 31 e 34°C) e distintos fotoperíodos (0, 12 e 24 hs). Conídios do fungo foram submetidos ao efeito da luz emitida por simulador solar e radiação ultravioleta germicida, e avaliou-se, em ensaios distintos, a produção de B. euphorbiae em diferentes concentrações de meios líquidos obtidos de resíduos e subprodutos agroindustriais (vinhaça, melaço de cana-de-açúcar, leite de levedura, soro de queijo, água da prensa da mandioca e milhocina®), em misturas de substratos sólidos obtidos de grãos e derivados (sorgo em grão com casca de soja e quirela de trigo e casca de soja com quirela de trigo) e, posteriormente, a combinação dos meios líquidos e sólidos que proporcionaram melhores resultados em um sistema bifásico de cultivo. Nos ensaios dos fatores ambientais, a avaliação do desempenho do fungo foi baseada no crescimento radial das colônias, na produção de conídios por unidade de área de colônia e na viabilidade dos conídios em lâminas de microscopia. A determinação dos meios líquidos mais eficientes... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The knowledge of adequate cultivate conditions, search for culture media and production methods that favor the growth and sporulation of fungi and, mainly, gain economical viability in the production process, are important aspects that must be considered in the massal production of an biocontrol agent. The objective of this work was to evaluate the growth, sporulation and viability of Bipolaris euphorbiae under the effects of different cultivation medium initial pH values, temperature and photoperiod, and also to analyze the tolerance of conidia to light emitted by solar and ultraviolet radiation and select media of low cost and easy purchase for the fungus production. The fungus was cultivated in media with several pH values (4, 5, 6, 7, 8, 9 and 10) and exposed do different temperatures (13, 16, 19, 22, 25, 28, 31 and 34°C) and photoperiods (0, 12, 24 hours). Conidia of the fungus were submitted to light effect, emitted by solar simulator and germicidal ultraviolet radiation. In a different experiment was evaluated the production of B. euphorbiae in different liquid media concentrations, obtained of agroindustrial residuals and byproducts (vinasse, sugar cane molasses, yeast cream, cheese whey, water of cassava bran and milhocina®) in combined mixtures of solid substracts obtained from different grains and derivates (sorghum grains with soybean hulls and cracked wheat and soybean hulls with cracked wheat) and, posteriorly, in combination of the liquid and solid media that demonstrated the best results in a two-phase cultivate system. In the experiments of environmental factors the fungus performance was based on the radial growth of the colonies, conidia production per colony area unit and viability of conidia in microscopic slide. The determination of the most efficient liquid media for the production of B. euphorbiae was based on the evaluation of production and viability of conidia... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Orientador: Antonio Batista Filho / Banca: Carlos Frederico Wilcken / Banca: Antonio Carlos Monteiro / Banca: Jose Eduardo Marcondes Almeida / Banca: Luis Garrigos Leite / Resumo: Este trabalho teve como objetivo avaliar a patogenicidade do isolado JAB 02 de Lecanicillium lecanii (Zimm.) Zare & Gams ao ácaro rajado Tetranychus urticae e a sua compatibilidade com agrotóxicos, nematóides entomopatogênicos e ácaros predadores. Os conídios do fungo, produzidos em arroz, foram avaliados nas concentrações de 5 x 106, 1 x 107, 5 x 107, 1 x 108 e 5 x 108 conídios/mL. A partir das porcentagens de mortalidade de T. urticae, que variaram entre 49 e 90% no décimo dia de avaliação, foi determinada a CL50 de 5,25 x 106 con./mL. A compatibilidade em laboratório foi verificada misturando-se os agrotóxicos em meio de cultura BDA e os parâmetros utilizados para a avaliação foram crescimento vegetativo, esporulação e viabilidade do entomopatógeno. Em condições de estufa, as suspensões dos produtos químicos e, posteriormente, a do fungo foram pulverizadas em plantas de crisântemo. Após a aplicação, quatro folhas foram coletadas e lavadas obtendo-se uma suspensão que foi plaqueada em BDA, sendo então avaliado o crescimento das colônias do fungo. Verificou-se, em laboratório, que a maioria dos inseticidas e os acaricidas foram compatíveis ao fungo, com exceção do inseticida Thiodan® classificado como muito tóxico. Todos os fungicidas testados foram classificados como tóxico e muito tóxico. Em condições de estufa, no tratamento com o fungicida Rovral® foi observado um número de colônias fúngicas formadas compatível com a testemunha. Essa compatibilidade repetiu-se para os produtos Alto 100® e Thiodan® em alguns dos tempos avaliados. No teste de patogenicidade, os conídios produzidos em meio de cultura com inseticidas e acaricidas, a partir da compatibilidade em laboratório, não tiveram sua viabilidade afetada e foram patogênicos ao ácaro rajado Tetranychus urticae. Além disso, foram realizados...(Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The objective of this study was to evaluate the pathogenicity of Lecanicillium lecanii (Zare & Gams), isolate JAB 02, to the two-spotted mite Tetranychus urticae (Koch), its compatibility with agrochemical products and its selectivity to entomopathogenic nematodes and predatory mites. The pathogenicity of the fungus produced in rice to T. urticae was evaluated at the concentrations of 5 x 106, 1 x 107, 5 x107, 1 x 108 and 5 x 108 conidia/mL. The mortality rates of T. urticae ranged from 49 and 90 % in the tenth evaluation day and the LC50 was 5,25 x 106 conidia/mL. The compatibility in laboratory was verified by adding chemical products to the PDA media and the evaluated parameters were the vegetative growth, sporulation and viability of the entomopathogen. In greenhouse, L. lecanii were sprayed on chrysanthemum plants after the pulverization of the chemical products; subsequently, four leaves of each treatment were collected and washed to obtain a suspension that were transferred to PDA medium to evaluate the growth of the fungus colonies in laboratory conditions. The acaricides and the most of insecticides were compatible to the isolate JAB 02, except the insecticide Thiodan®, which was classified as very toxic. All the evaluated fungicides were classified as toxic or very toxic. In greenhouse assays, the fungicide Rovral® produced a number of grown colonies similar to those of the control and this compatibility was also showed by the products Alto 100® and Thiodan® in some of the evaluated periods. In another pathogenicity test, when L. lecanii were grown in culture media containing the insecticides, the conidia viability were not affected and the fungus were pathogenic to T. urticae, with mortality rates superior to the control in some cases. Also, compatibility bioassays involving L. lecanii at 5 x 106, 1 x 107 and 5 x 107 con./mL and the entomopathogenic nematodes Steinernema sp. (CB n6) and Heterorhabditis indica (CB n5) were conducted. / Doutor

A proteína de choque térmico Hsp90 é uma chaperone molecular encontrada no citosol. O cDNA incompleto desta proteína foi isolado de uma biblioteca construída a partir de mRNA de células de esporulação de B. emersonii submetidas a choque térmico. Um clone genômico contendo a seqüência completa do gene hsp90 também foi isolado, seqüenciado e caracterizado. A região codificadora do gene hsp90 é interrompida por um único íntron de 184 nucleotídeos. A seqüência de aminoácidos deduzida indicou uma proteína de 71 O resíduos, com massa molecular calculada de 80.792 Da e um pl médio de 4,85. Experimentos de extensão de oligonucleotídeo e RACE-PCR demonstraram um sítio único de início de transcrição localizado a -65 e -70 nucleotídeos do ATG da metionina iniciadora, respectivamente. Motivos similares ao consenso do elemento de choque térmico eucariótico (HSE) e do elemento responsivo a estresse (STRE) foram encontrados na região promotora do gene a -395 e -98 nucleotídeos do ATG, respectivamente. Experimentos de \"Northern blot\" revelaram que o mRNA para a Hsp90 apresenta níveis máximos aos 90 minutos da fase de esporulação do fungo. Análise por \"western blot\" mostrou que a proteína Hsp90 está presente durante todo o ciclo de vida do fungo e os níveis máximos de acúmulo foram observados aos 90 minutos da esporulação, indicando um controle transcricional do gene. Tanto a proteína quanto o mRNA são altamente induzidos quando as células são submetidas a choque térmico e a cádmio. As proteínas Hsp60 e Hsp10 são chaperones moleculares mitocondriais (chaperoninas). Os cDNAs completos destas proteínas foram isolados e totalmente seqüenciados. A seqüência de aminoácidos deduzida da Hsp60 corresponde a uma proteína de 559 resíduos, com massa molecular calculada em 58.741 Da e um pl médio de 8, 7. Experimentos de \"Northern blot\" revelaram que o mRNA para Hsp60 tem níveis máximos de expressão aos 90 minutos da esporulação. Análise por \"western blot\" mostrou que a Hsp60 está presente durante todo o ciclo de vida do fungo, com níveis máximos da proteína 90 minutos após a indução da esporulação. Tanto a proteína quanto o mRNA são bastante induzidos quando as células são submetidas ao choque térmico. A seqüência de aminoácidos deduzida da Hsp10 corresponde um polipeptídeo de 101 resíduos com massa molecular calculada em 10.688 Da e um pl médio de 6,25. Experimentos de \"Northern blot\" revelaram que o mRNA para Hsp10 tem níveis máximos de expressão aos 120 minutos da germinação e é bastante induzido quando as células são submetidas ao choque térmico. / The heat shock protein 90 (Hsp90) is a cytosolic molecular chaperone. The incomplete cDNA of this protein was isolated by immunoblot screening of a heat shock cDNA expression library. The complete genomic clone was also isolated and completely sequenced and characterized. The coding sequence is interrupted by a single intron with 184 nucleotides. The deduced amino acid sequence corresponds to a 710-residue polypeptide with a calculated molecular mass of 80,792 Da and an average pl of 4.85. Primer extension and RACE-PCR experiments demonstrated a single transcription start site localized -65 and -70 nucleotides from de ATG of the initiator methionine, respectively. Sequence motifs resembling the standard eukaryotic heat shock element (HSE) and the stress responsive element (STRE) were evident in the regulatory region -395 and -98 nucleotides from de ATG, respectively. Northern blot analysis revealed that the Hsp90 mRNA presents maximum levels by 90 minutes of the sporulation stage. Immunoblot analysis indicated that the Hsp90 is present during the entire life cycle of the fungus and maximum levels were observed 90 minutes after the induction of sporulation, indicating a transcriptional control. During heat shock both the mRNA and the Hsp90 protein are highly induced. Proteins Hsp60 and Hsp10, are mitochondrial molecular chaperones (chaperonines). The complete cDNAs encoding these proteins were and completely sequenced. The deduced amino acid sequence for Hsp60 corresponds to a 559-residue polypeptide with a calculated molecular mass of 58,741 Da and an average pl of 8.7. Immunoblot analysis showed that Hsp60 is present during the entire life cycle of the fungus and presents maximum levels by 90 minutes of the sporulation. Northern blot analysis indicated maximum levels of the Hsp60 mRNA by 90 minutes of sporulation too. Both mRNA and the protein are highly induced during heat shock. The deduced amino acid sequence for Hsp10 corresponds to a 101-residue polypeptide with a calculated molecular mass of 10,688 Da and an average pl of 6.25. Northern blot analysis indicated maximum mRNA levels by 120 minutes of germination and high levels of expression when the cells are exposed to heat shock.

Made available in DSpace on 2016-12-23T14:37:30Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Leandro Pin Dalvi.pdf: 1271308 bytes, checksum: 029f08fb27575fe178e1d7fbfa5e6720 (MD5) Previous issue date: 2008-02-23 / A cafeicultura é a maior geradora de empregos e renda para as famílias do Espírito Santo. Dentre os problemas que esta atividade enfrenta, destaca-se a broca-do-café Hypothenemus hampei, uma praga que causa prejuízos em todos os estágios de maturação dos frutos, assim como no pós-colheita. O objetivo do presente trabalho foi coletar, caracterizar molecularmente e selecionar isolados do fungo entomopatogênico Beauveria bassiana com potencial para utilização em programas de manejo fitossanitário da broca-do-café. O trabalho foi realizado no Setor de Entomologia e Fitopatologia NUDEMAFI, localizado no Centro de Ciências Agrárias da Universidade Federal do Espírito Santo (CCA-UFES), e nos laboratórios de Entomologia e Biotecnologia da Embrapa-Soja localizados em Londrina, Paraná. As coletas resultaram em 28 isolados classificados como B. bassiana, tendo sido um dos isolados descartado dos testes por apresentar baixo crescimento. As amplificações utilizando 12 primers (iniciadores) deram origem a 82 bandas. O coeficiente de similaridade Dice variou de 93 a 51%. Foi evidente, salvo algumas exceções, que o local de coleta foi peça chave na formação de grupos muito relacionados. Ocorreu grande amplitude na virulência. Foram pré-selecionados os isolados CCA-UFES/Bb4, CCA-UFES/Bb11, CCA-UFES/Bb15, CCA-UFES/Bb18 que produziram mortalidade confirmada acima de 60%. Posteriormente, o isolado CCA-UFES/Bb15 apresentou melhor resposta, diferenciando-se do isolado utilizados como padrão - ESALQ-447 - cujos CL50 foram de 4,0 x 104 e 11,85 x 104 conídios/mL, respectivamente. Para todos os isolados selecionados, assim como para o padrão, o aumento na concentração representou aumento na mortalidade. A conidiogênese sobre os cadáveres da broca-do-café foi inversamente proporcional à virulência dos isolados, sendo ambas as características importantes para o sucesso de um programa de Manejo Integrado de Pragas (MIP). Os resultados obtidos são promissores, dando subsídio a novas pesquisas preferencialmente a campo / The coffee plantation is the largest source of jobs and familiar income of the State of Espírito Santo (Brazil). The coffee berry borer, Hypothenemus hampei, is widely considered one of the most important coffee pests because the losses in all stages of coffee grain as well as in post-harvest in this activity. The objective of this study was the collect, molecular characterization and the select of entomopathogenic fungus Beauveria bassiana strains, with potential use in integrated pest management in coffe plantations. The work was carried out at NUDEMAFI, located in the Centro de Ciências Agrárias da Universidade Federal do Espírito Santo, in municipality of Alegre, Brazil and the Biotechnology and Biological laboratories in the Embrapa Soja, in municipality of Londrina, State of Paraná, Brazil. A collection of 28 B. bassiana strains,isolated from different geographic regions were established. Only one Bassiana bassiana strain was discarded for low growth in laboratory. The amplifications using 12 "primers" (initiators) led to 82 bands. Dices coefficient ranged from 51 to. 93% with few exceptions Groups of B. bassiana strains related were forming due to the place colleted and high levels of virulence was observed. The Beauveria bassiana strains CCA-UFES/Bb4, CCA-UFES/Bb11, CCA-UFES/Bb15, CCA-UFES/Bb18 were pre-selected which showed confirmed mortality higher than 60Only The LC50, of the CCA-UFES/Bb15 strains was better response with significant difference between the standard, with 4.0 x 104 in 11.85 x 104 conidia / ml, respectively,. All isolates selected, as well as for the standard, the increase in the concentration resulted an increase of mortality of H. hampei. The conidiogenesis on coffee berry borers cadavers was inversely proportional to the virulence of the B. bassiana strains, and both this characteristics are important to the success of a program of Integrated Pest Management (IPM)

As lacases (EC 1.10.3.2) são fenol-oxidases associadas à habilidade de degradar a lignina e outros compostos recalcitrantes, como xenobióticos e vários tipos de corantes sintéticos. Lacases catalisam a oxidação de vários compostos aromáticos com concomitante redução do oxigênio a água. Neste trabalho são apresentados os resultados de imobilização do extrato de lacases de Pleurotus sajor-caju PS2001 em filmes poliméricos de poliamida 6,6 (PA) e polissulfona (PSU), utilizando glutaraldeído como agente de ligação. A solução enzimática de lacases foi obtida em meio sólido contendo serragem de Pinus spp cultivado com P. sajor-caju. As proteínas da solução enzimática foram imobilizadas em filmes de PA e PSU. O processo de imobilização foi estudado quanto ao pH ótimo, sendo os filmes caracterizados quanto à quantidade de proteínas imobilizadas e atividade de lacases. As membranas de PA apresentaram maior atividade de lacases quando comparadas com as de PSU. Observou-se uma redução do pH ótimo para atividade de lacases imobilizadas, utilizando-se o tampão acetato e um aumento em tampão Mcllvaine. A maior atividade de lacases foi obtida após 6 h de imobilização, em reação a 30°C, com agitação constante, tanto para os filmes de PA quanto para os de PSU. Verificou-se descoloração de aproximadamente 90% da solução 25 mg/L do corante Reactive Blue 220, após 24 horas de reação, utilizando membranas de PA com a enzima imobilizada. Aproximadamente 50% da descoloração obtida deve-se a adsorção do corante pela membrana. Resultados semelhantes foram obtidos com a utilização do corante Remazol Brilliant Blue R (RBBR), com adição de Reactive Blue 220. Não foi observada descoloração sem adição do Reactive Blue, sugerindo uma ação semelhante a um mediador, proporcionando a descoloração do RBBR. Apesar de serem observadas atividades de lacases imobilizadas nas membranas de PSU, utilizando-se ABTS como substrato, não foi observada descoloração dos corantes analisados. / Laccases (EC 1.10.3.2) are phenol-oxidase enzymes associated to the degradation of lignin and a wide variety of recalcitrant compounds, such as xenobiotics and different types of dyes. Laccases catalyze the oxidation of various aromatic compounds with the concomitant reduction of oxygen to water. In this work, the results of immobilization of Pleurotus sajor-caju PS 2001 laccases in polyamide 6,6 (PA) and polysulfone (PSU) films, using glutaraldehyde as linking agent, are presented. The enzymatic solution containing laccases was obtained from solid medium with Pinus spp sawdust cultivated with P. sajor-caju. The proteins present in this solution were immobilized in PA and PSU films The immobilization process was studied with respect to the optimum pH, and the films were evaluated to determine the protein content and laccase activity. PA membranes showed higher laccase activity than PSU ones. With immobilized enzymes, a reduction of the optimum pH for laccase activity was observed, using acetate buffer and a increase using Mcllvaine buffer. The higher laccase activity was achieved after 6 h of immobilization, at a reaction temperature of 30°C, under agitation, for both PA and PSU films. Discolouration of approximately 90% of solution 25 mg.L-1 of the dye Reactive Blue 220 was verified, after 24 hours of reaction, using membranes of PA with the immobilized enzyme. Approximately 50% of the discolouration would be attributed from the adsortion process of the dye for the PA membrane. Similar results had been gotten with the use of the dye Remazol Brilliant Blue R (RBBR), with addition of Reactive Blue 220. Discolouration without addition of the Reactive Blue was not observed, suggesting a similar action to a mediator, providing the discolouration of the RBBR. Although to be observed immobilized activities of lacases in the membranes of PSU, using ABTS as substratum, discolouration of the analyzed corantes was not observed.

Made available in DSpace on 2014-07-29T15:16:31Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Lucas Breseghelo do Nascimento.pdf: 1084518 bytes, checksum: 405ebc26f906f0428e9438063c66ee44 (MD5) Previous issue date: 2010-08-31 / The fungus Sclerotinia sclerotiorum is among the most successful pathogens, omnivores, and without specific hosts, is considered one of the most important fungal pathogens in the world. Is distributed in all producing regions, temperate, subtropical or tropical. The fungus produces resistant structures called sclerotia on the surface and within tissues colonized, they returned to the soil with crop residues and are responsible for the survival of the fungus in the same area for up to eight years. The objectives of this study were to quantify the variability within and between populations of the fungus S. sclerotiorum in bean and soybean crops in different producing places of those varieties. 46 isolates were collected of S. sclerotiorum in six locals of grain production in different regions of Brazil. The sites chosen were Monte Carmelo-MG, Formosa-GO, Lucas do Rio Verde-MT, Montividiu-GO, Londrina, PR and Santo Antonio de Goiás-GO. All areas of the original host of the gathering was the bean with the exception of Londrina-PR in which the host was soybeans. A population study of the fungus through RAPD markers using 13 primers was carried out for the analysis of genetic variability of the fungus. In parallel, tests were also made for the the Mycelial compatibility groups among isolates and test production of hydrolytic enzymes. The statistical analysis was performed using the Arlequin software, which indicated variability among populations of 16.94% and 83.06% within populations. Were found 10 mycelial compatibility groups without specific populations .Enzyme activities performed indicated significant differences within the populations of all enzymes, a comparison between populations also showed significant differences among populations in polygalacturonases, 1,3-&#946;-glucanase and xylanase. The results indicate a high level of variability within populations and low variability among populations / O fungo Sclerotinia sclerotiorum está entre os fitopatógenos mais bem sucedidos, onívoros e sem hospedeiros definido, é considerado um dos patógenos fúngicos mais importantes no mundo. Está distribuído em todas as regiões produtoras, sejam elas temperadas, subtropicais ou tropicais. O fungo produz estruturas de resistência denominadas escleródios, na superfície e no interior dos tecidos colonizados. Estes retornam ao solo com os resíduos da cultura e são responsáveis pela sobrevivência do fungo na mesma área por até 8 anos. Os objetivos desse trabalho foram quantificar a variabilidade intra e inter populacional do fungo S. sclerotiorum em culturas de feijão e soja de diferentes localidades produtoras dessas espécies. Para isso foram coletados 46 isolados de S. sclerotiorum de seis locais de produção de grãos em diferentes regiões do Brasil. Os locais escolhidos foram Monte Carmelo-MG, Formosa-GO, Lucas do Rio Verde-MT, Montividiu-GO, Londrina-PR e Santo Antonio de Goiás-GO em todas as áreas o hospedeiro de origem da coleta foi o feijoeiro, com exceção de Londrina-PR, na qual o hospedeiro foi soja. Foi feito um estudo populacional do fungo através de marcadores do tipo RAPD com a utilização de 13 primers para a análise da variabilidade genética do fungo. Paralelamente também foram feitos testes para a formação de grupo de compatibilidade micelial entre os isolados e testes de produção de enzimas hidrolíticas. A análise estatística dos dados se deu através do programa Arlequin, o qual indicou variabilidade de 16,94% entre populações e 83,06% dentro de populações. Foram formados 10 grupos de compatibilidade micelial sem especificidade de populações. As atividades enzimáticas realizadas indicaram diferenças significativas dentro de populações de todas as enzimas. A comparação entre populações também indicou diferenças significativas entre populações nas enzimas poligalacturonases, 1,3-&#946;-glucanase e xilanase. Os resultados indicaram baixo nível de variabilidade entre populações e alta variabilidade dentre as populações.

Neste trabalho realizamos a análise das variações na expressão gênica global durante a fase de esporulação do fungo aquático Blastocladiella emersonii utilizando a tecnologia dos microarranjos de cDNA em lâminas contendo 3.773 genes distintos. Ao todo 615 genes foram classificados como induzidos enquanto 645 foram classificados como reprimidos ao longo da esporulação. As categorias funcionais mais representadas entre os genes induzidos foram: microtúbulo e citoesqueleto, transmissão de sinal, atividade de ligação ao íon Ca2+, proteólise (apenas no início da esporulação) e biogênese e organização do cromossomo (apenas no final da esporulação). Dentre os genes reprimidos, as categorias funcionais mais representadas foram: biossíntese de proteína, transporte de carboidratos e metabolismo energético. A comparação dos dados de expressão gênica da esporulação com aqueles obtidos recentemente em nosso laboratório para a germinação mostrou um grande número de genes regulados inversamente ao longo das duas fases de diferenciação do ciclo de vida de B. emersonii. Muitos genes induzidos na esporulação são reprimidos na germinação e vice versa. Analisamos também o efeito de glicose e triptofano sobre a expressão gênica durante a formação dos zoósporos, tendo em vista que tais nutrientes são capazes de inibir a esporulação de B. emersonii. Nossos resultados mostraram que na presença de glicose (1%) genes envolvidos na composição e atividade do citoesqueleto foram superexpressos, enquanto na presença do aminoácido triptofano houve um aumento na expressão de genes envolvidos no processo de enovelamento de proteínas e proteólise, e na resposta ao estresse oxidativo. Além disso, genes envolvidos no processo de esporulação propriamente dito foram reprimidos durante o tratamento com triptofano. Investigamos também a via de sinalização por GMP cíclico (cGMP), cujos níveis aumentam consideravelmente durante a esporulação de B. emersonii. Iniciamos o estudo com uma busca no banco de ESTs de B. emersonii (http://blasto.iq.usp.br) por seqüências que codificassem enzimas envolvidas na síntese e degradação de cGMP. Foram encontradas três ESTs que codificam domínios catalíticos que parecem pertencer a três diferentes guanilato ciclases e uma EST codificando uma fosfodiesterase com alta similaridade com fosfodiesterases que possuem alta afinidade por cGMP. Experimentos de microarranjos de cDNA validados por RT-PCR quantitativo em tempo real mostraram que os quatro transcritos são expressos durante esporulação, com picos de indução durante a fase tardia da esporulação, momento em que ocorre a biogênese dos zoósporos. Além disso, dados obtidos a partir de experimentos in vivo e in vitro utilizando inibidores das enzimas guanilato ciclase e óxido nítrico sintase, sugeriram a participação do íon Ca2+ e do radical livre óxido nítrico (&#8226;NO) na atividade de guanilato ciclase, em uma via do tipo Ca2+-&#8226;NO-cGMP. / In the present work, we analyzed global gene expression changes during the sporulation phase of the aquatic fungus Blastocladiella emersonii using cDNA microarray technology with chips containing 3773 distinct genes. A total of 615 genes were upregulated and 645 were down-regulated along the sporulation of the fungus. The overrepresented functional categories among the induced genes were: microtubule and cytoskeleton, signal transduction, Ca2+ binding activity, proteolysis (only at the beginning of sporulation), and chromosome biogenesis and organization (only at the end of sporulation). Among the down-regulated genes, the over-represented functional categories were: protein biosynthesis, carbohydrate transport, and energetic metabolism. Sporulation gene expression data were compared with those obtained recently in our laboratory for the germination phase, showing that a great number of genes are inversely regulated along the two differentiation stages of B. emersonii life cycle. We also analyzed the effects of glucose and tryptophan on gene expression during biogenesis of the zoospores, as such nutrients are able to inhibit B. emersonii sporulation. Our results showed that in the presence of glucose (1%) genes related to activity and composition of cytoskeleton were over-expressed, while in the presence of tryptophan genes involved in protein folding, proteolysis and oxidative stress were induced. In addition, genes involved in the sporulation process per se were downregulated by tryptophan treatment. We also investigated the cyclic GMP signaling pathway, as the levels of this cyclic nucleotide increase considerably during B. emersonii sporulation. Firstly, we searched for sequences encoding enzymes involved in cGMP synthesis and degradation using the B. emersonii EST databank (http://blasto.iq.usp.br). Three sequences were found encoding distinct guanylate cyclase catalytic domains, and one showed high similarity with phosphodiesterases that exhibit high affinity for cGMP. Microarray experiments, validated by real time quantitative RT-PCR, showed that the four transcripts are induced during sporulation, reaching maximum levels at the late stages of sporulation, when zoospore biogenesis occurs. In addition, data obtained from in vivo and in vitro experiments using inhibitors for the enzymes guanylate cyclase and nitric oxide synthase indicated the involvement of the ion Ca2+ and the free radical nitric oxide (&#8226;NO) in guanylate cyclase activity, suggesting the existence of a Ca2+-&#8226; NO-cGMP signaling pathway.