Introdução: Durante as últimas décadas, a utilização de métodos moleculares como Hibridizacão in situ por fluorescência (FISH) e Hibridização Genômica Comparativa (array-CGH) mudou dramaticamente a perspectiva em relação à detecção de rearranjos genômicos submicroscópicos. O número de doenças identificadas como causada por microdeleções/microduplicações cromossômicas aumentou rapidamente, trazendo um papel crucial para a citogenética no diagnóstico destas condições. Objetivo: O objetivo deste estudo foi identificar e caracterizar microdeleções cromossômicas associadas a síndromes de malformações em um laboratório de citogenética de referência de um hospital público do sul do Brasil. Métodos: Estudo retrospectivo e prospectivo, em uma série consecutiva de amostras. O estudo foi baseado em registros hospitalares e laboratoriais de amostras de uma coorte de pacientes com suspeita clínica de microdeleção cromossômica. Foram selecionadas amostras de indivíduos em que o diagnóstico clínico proposto incluia uma suspeita de rearranjo nos cromossomos 4p16.3, 5p15.2, 5q35, 7q11.23, 8q24.12, 15q11-q12, 16p13.3, 17p13.3, 17p11. 2,2 e 22q11 que foram analisados por hibridização in situ por fluorescência (FISH). Em 11 amostras com microdeleções, hibridização genômica comparativa (array-CGH) foi realizada. Resultados: Um total de 504 amostras foram avaliadas, sendo as suspeitas mais comuns a deleção 22q11.2 (29,5%), a síndrome de Prader-Willi (21,6%), a síndrome de Williams-Beuren (15%) e da síndrome de Angelman (13 %). Em 120 deles (23,8%) desequilíbrios cromossómicas relacionadas com o diagnóstico clínico foram encontrados. A del7q11.23 foi a alteração mais frequente (8,5%) detectada, seguida por del22q11.2 (5,3%) e del15q11-q12 (4,5%). Conclusões: Nossos achados reforçam à estratégia de que um teste de citogenética molecular sensível associada com uma avaliação clínico qualificado são cruciais para a detecção e caracterização precisa de deleções cromossômicas submicroscópicas. Além disso, nosso estudo enfatiza a necessidade de educação continuada para o desenvolvimento e utilização de novas tecnologias para o diagnóstico citogenético, as quais, em nossa experiência, puderam ser introduzidas com sucesso em um hospital público do sul do Brasil. / Background: During the past decades, the widespread use of FISH and microarray-based technologies dramatically changed our perspective regarding detection of submicroscopic genomic rearrangements. The number of diseases identified as caused by chromosomal microdeletions/microduplications increased quickly, bringing a new and crucial role for cytogenetics in the diagnosis of these conditions. Objective: The purpose of this study was to identify and chraracterize chromosomal microdeletions associated with malformation syndromes in a reference cytogenetics laboratory from a public hospital of Southern Brazil. Methods: Using retrospective and prospective approaches, we evaluated a consecutive series of samples. The study was based in hospital and laboratorial records of samples from a cohort of subjects with clinical suspicion of a chromosomal microdeletion. We selected samples from subjects in whom a clinical diagnosis was proposed, which included deletion of chromosomes 4p16.3, 5p15.2, 5q35, 7q11.23, 8q24.12, 15q11-q12, 16p13.3, 17p13.3, 17p11.2,2 and 22q11 identified by fluorescence in situ hybridization (FISH) analysis. In 11 samples with microdeletions, array-based comparative genomic hybridization (array-CGH) was performed. Results: A total of 504 samples were evaluated, being the most common suspicions the 22q11.2 deletion (29.5%), the Prader-Willi syndrome (21.6%), the Williams-Beuren syndrome (15%) and the Angelman syndrome (13%). In 120 of them (23.8%) chromosomal imbalances related to the clinical diagnosis were found. The deletion 7q11.23 was the most frequently finding (8.5%), followed by del22q11.2 (5.3%) and del15q11-q12 (4.5%). Conclusions: Our findings provide support to the idea that a sensitive molecular cytogenetic test associated with a qualified clinical evaluation are crucial for the detection and precise characterization of submiscroscopic chromosome deletions. Additionally, our study emphasizes the need of continuing 6 education for the improvement of the cytogenetic diagnosis technology, which was successfully introduced in a public hospital of Southern Brazil.

Em 1978, o trabalho realizado por Stephenson e Zamecnik demonstrou a capacidade de um oligonucleotídeo de impedir a expressão de uma proteína específica. Atualmente, duas tecnologias são mais utilizadas para este propósito: os oligodeoxiribonucleotídeos antisense e o RNA de interferência (siRNA), que se aproveitam da capacidade de anelação entre as fitas complementares. A maior diferença entre as duas técnicas é a maquinaria proteica recrutada, isso é, o complexo RISC atua no funcionamento do siRNA, e a protease RNase H atua na clivagem da fita de RNA quando hibridizada com DNA. Apesar da grande aplicabilidade destas tecnologias, tanto para doenças metabólicas quanto para canceres, o veículo de entrega e proteção dessas sequências é de fundamental importância, visto que a aplicação desses oligonucleotídeos livres está sujeita à rápida degradação e ineficiência. A modificação das bases é uma das estratégias para conferir maior estabilidade às sequências, porém estas tem sido relacionadas a um aumento da toxicidade. Nessa dissertação, a quitosana, um polissacarídeo catiônico é utilizado para síntese de nanopartículas e encapsulamento dos oligodeoxiribonucleotídeos antisense (ASO). Para isso, foram realizadas modificações na quitosana comercial como despolimerização, trimetilação ou conjugação com PEG, seguida da síntese das nanopartículas com a adição de tripolifosfato de sódio (TPP) pelo método de gelatinização ionotrópica. A estabilidade das nanopartículas foi medida em função do tempo, da variação de temperatura e da diferença de pH. Além disso, a toxicidade dessas nanopartículas foi analisada através da viabilidade celular em diferentes linhagens, NB-4, HepaRG, HTC e BHK-570. A expressão da proteína verde fluorescente (GFP) na célula NB-4 foi utilizada para avaliar a entrega do ASO desenhado, sendo sua fluorescência monitorada por microscopia confocal. Os resultados demonstram que as nanopartículas se mantiveram estáveis durante o período de tempo analisado, assim como com a temperatura variando de 22 a 45°C e em pH ácido. Cada linhagem celular respondeu de forma diferente ao tratamento com as nanopartículas sem ASO, sendo a linhagem saudável BHK-570 com a maior resistência. Ademais, todas as células apresentaram viabilidade reduzida quando tratadas com concentrações na ordem de 1011 nanopartículas/mL a base de quitosana trimetilada. A fluorescência das células NB-4 quando tratada com as nanopartículas com ASO diminuiu consideravelmente nas 18 primeiras horas, seguida de um aumento após 42 horas. Dessa forma, pode-se concluir que as nanopartículas de quitosana propostas nessa dissertação apresentaram uma excelente alternativa para a entrega de material genético, principalmente para o trato gastro-intestinal, devido à sua estabilidade em pH ácido. / The property of an oligonucleotide to interfere in the expression of a protein was observed in 1978 by Stephenson and Zamecnik. To perform such interference, there are today, two main techniques being explored: antisense oligodeoxyribonucleotides and interference RNA. In both cases, the particularity of their chemical structure is taken into account as soon as they can bind in a complementary manner to the messenger RNA and inhibit its translation. The great difference between these techniques is related to the proteases involved in the process, while for interference RNA the RISC machinery acts, for antisense oligodeoxyribonucleotides RNase H cleaves the RNA in the duplex DNA-RNA. Although these tools to edit the translation process are relevant to the treatment and even cure of metabolic disorders and cancers, it is still not effective when employed without a coating to protect the sequences before it reaches the destiny in vivo. Efforts have been made in developing modified bases to be more stable, but they show some toxicity. In this dissertation, chitosan, a natural cationic polyssacharide, is used to produce nanoparticles to protect the antisense oligodeoxyribonucleotide (ASO). For this reason, the commercial chitosan was modified, depolymerized, trimetilated or PEGlated and the nanoparticles were synthesized with sodium tripolyphosphate (TPP) by ionotropic gelation method. The stability along time, in different pHs and temperatures was assessed. The toxicity of nanoparticles without ASO was quantified by MTT tests in NB-4, HepaRG, HTC and BHK-570 cell lines. A green fluorescent protein (GFP) expressed by NB-4 cells was the target to evaluate the delivery efficiency of the ASO, and its fluorescence was measured by confocal microscopy. Results showed that nanoparticles were stable over time as well as in temperatures ranging from 22 to 45°C and in acidic pH. Each cell line responded in a different manner to the treatment, with the health cell BHK-570 showing higher resistance. Furthermore, all of them presented lower viability when treated with trimetilated chitosan nanoparticles in the highest concentrations (ca 1011 nanoparticles/mL). NB-4 cells presented a decrease in fluorescence in 18 hours of treatment followed by an increase after 42 hours. We conclude that chitosan nanoparticles are a good alternative to the delivery of genetic material even more in the gastro intestinal tract due to its great stability in acid pH values.

Orientadores: Eliane Maria Ingrid Amstalden, Jose Vasallo / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-10T14:26:55Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Lima_FranciscoPignataro_D.pdf: 4114475 bytes, checksum: 852f416deccb941fe4dc3e63c2553510 (MD5) Previous issue date: 2008 / Resumo: Cerca de 20% a 40% dos linfomas não-Hodgkin (LNH) B são extranodais e caracterizam-se por comportamento biológico distinto, de acordo com o seu sítio de origem e variante histológica. Linfoma ósseo primário (LOP), uma forma extranodal rara, apresenta-se na maior parte dos casos como LNH B de alto grau e evolui com bom prognóstico. Os estudos sobre o LOP são escassos e suas características imunofenotípicas e citogenéticas ainda não estão bem definidas. Neste trabalho, foram analisados três grupos de linfomas difusos de grandes células B (LDGCB): a) ósseos primários, B) nodais e c) metastáticos (com envolvimento ósseo secundário). Foram investigados, nesses grupos, dados clínicos e de sobrevida, aspectos morfológicos, imunofenotípicos e citogenéticos. Na análise imunoistoquímica, foi verificado o estudo das moléculas envolvidas na apoptose e regulação do ciclo celular (Bcl-2, Bax, p53, Bcl-6, p21, pRB) moléculas envolvidas na adesão celular (CD29, CD62L, CD44, CD51) índice de proliferação celular (Ki-67) e expressão das subpopulações de células infiltrantes do sistema imune (CD3, CD4, CD5, CD8, CD57, CD68, Foxp3) com objetivo de melhor caracterizar o LOP. Foram selecionados no total 138 casos de LDGCB, provenientes dos departamentos de Anatomia Patológica FCM-UNICAMP, Hospital AC.-Camargo - Fundação Antônio Prudente, Instituto de Traumatologia e Ortopedia da USP e Centre Hospitalier Universitarie (CHU Purpan). Do total de 138, 76 casos eram linfomas ósseos primários, 46 casos linfomas nodais e 16 casos linfomas com envolvimento ósseo secundário. Nossos resultados demonstraram que o LOP possui características evolutivas que diferem dos demais LDGCB extranodais. Observamos que a maioria dos LDGCB ósseos primários (66%) pertenceram ao imunofenótipo centro germinativo (CG) e não exibiram diferenciação plasmacítica. Os três grupos de LDGCB analisados exibiram forte imunoexpressão das proteínas relacionadas à apoptose e ao ciclo celular enquanto que a imunoexpressão de moléculas de adesão foi fraca ou ausente, na maioria dos casos. O estudo da sobrevida, envolvendo a ausência da imunoexpressão das moléculas de adesão CD29, CD62L e CD51, nos três grupos, revelou-se significativamente associada com melhor sobrevida. O significado biológico deste achado ainda está para ser esclarecido. O CD44 foi o mais fortemente expresso nas células tumorais. As moléculas envolvidas na apoptose Bax e p53 foram relacionadas à pior evolução e o pRB à evolução favorável nos LOP. As proteínas Bcl-2 e Bcl-6 foram expressas nos três grupos de linfomas. Com a análise em 32 casos de LOP das principais translocações em LNH (MYC, BCL2/IGH, BCL6, ALK, IGH/CCND1 e PAX5), conseguimos caracterizar melhor esta entidade. Rearranjos, envolvendo o BCL2 e MYC foram encontrados, entretanto não ocorreram rearranjos do BCL6. Os demais genes não demonstraram translocações. Estes achados indicam que o LOP deve ser considerado uma categoria distinta de LDGCB extranodal, com aspectos genéticos e moleculares mais próximos dos nodais / Abstract: The incidence of extranodal lymphomas is increasing in the last decades. Around 20 to 40% of B-cell non-Hodgkin lymphomas (NHL) arise outside the lymph nodes and may present distinct biological behavior, as compared to the corresponding nodal counterpart of similar histological grade. The heterogeneity of large B-cell lymphomas (LBCL) has been matter of various studies, although morphology alone may be insufficient to separate groups of clinical relevance, immunophenotyping and molecular techniques have demonstrated that different variants of LBCL may present diverse clinical and prognostic features. Primary bone lymphoma (PBL) is rare form of extra nodal NHL, which generally presents a more favorable prognosis than the nodal counterpart. The reason for this is unclear. We selected a large series (n=138) of nodal NHL (N=46), primary (n=76) and metastatic (n=16) bone diffuse large cell lymphomas collected in tissue micro-arrays from several centers in France and Brazil. We investigated to be comparing clinical, morphological and immunophenotypic features. Immunohistochemical detection of proliferation markers, apoptosis related proteins and adhesion molecules was be marked. Our results demonstrated that primary bone LDGCB possesses peculiar clinical characteristics that you differ of the other extranodal LDGCB as the longest evolution and smaller recurrence tax. The three groups of LDGCB exhibited strong immunoexpression of the related proteins the apoptosis and cellular cycle while the immunoexpression of adhesion molecules was weak or absentee in most of the cases. These cases were classified according to the expression of antigens with germinal center (GC) (n=37/62) or non germinal center (non-GC) (n=26/62) stages of B-cell differentiation. The study of the survival involving the absence of the imunoexpressão of the adhesion molecules CD29, CD62L and CD51 in the three groups was revealed significantly associated with better outcome. The biological meaning of this discovery is still to be explained. CD44 was it more strongly expressed in the tumor cells and it demonstrated relationship away with inferior survival without statistical significance. The molecules involved in the apoptosis Bax and p53 were related the worst evolution and the pRB the favorable evolution in PBL. The proteins Bcl-2 and Bcl-6 were expressed in the three lymphomas groups and associated the worst evolution, however without significance. By fluorescence in situ hybridization, we found a substantial number of cases with a rearrangement of BCL2 (n=9/32) and MYC (n= 3/32) whereas PAX5, BCL6, BCL-1/Cyclin D1 and ALK genes were in germ line configuration. Interestingly, one case, with GC phenotype, showed a dual BCL2 and MYC rearrangement. We observed that the majority of the cases with rearrangements were of GC phenotype. These results, associated with the lack of BCL6 rearrangement, suggest that bone DLBCL represents a specific group within extranodal B-cell lymphomas. Keywords: diffuse large cell lymphoma, adhesion molecules, apoptosis, fluorescent in situ hybridization / Doutorado / Anatomia Patologica / Doutor em Ciências Médicas

Submitted by isabela.moljf@hotmail.com (isabela.moljf@hotmail.com) on 2017-08-18T11:32:50Z No. of bitstreams: 1 camilasiqueiraneves.pdf: 1794675 bytes, checksum: f6798de20bc50ab506f3f25f990c23c2 (MD5) / Rejected by Adriana Oliveira (adriana.oliveira@ufjf.edu.br), reason: on 2017-08-24T11:25:19Z (GMT) / Submitted by isabela.moljf@hotmail.com (isabela.moljf@hotmail.com) on 2017-08-24T15:09:20Z No. of bitstreams: 0 / Approved for entry into archive by Adriana Oliveira (adriana.oliveira@ufjf.edu.br) on 2017-08-30T14:20:42Z (GMT) No. of bitstreams: 0 / Made available in DSpace on 2017-08-30T14:20:42Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2017-03-24 / A indução de poliploidia é uma ferramenta muito empregada em programas de melhoramento de plantas, mas geralmente resulta em baixa eficiência e elevada taxa de indivíduos mixoploides ou aneuploides. Poliploides artificiais podem ser obtidos pela utilização de antimitóticos, que interferem na formação do fuso durante a divisão celular. Dentre eles, a colchicina é o mais empregado em estudos de poliploidia. No entanto, os mecanismos responsáveis por sua ação sobre as células ainda não foram totalmente elucidados. Solanum melongena L. (berinjela) apresenta tecidos com elevado potencial de regeneração in vitro, característica interessante para o desenvolvimento de estudos básicos e biotecnológicos. O presente trabalho teve como objetivo utilizar a berinjela como modelo para o estudo do processo de duplicação cromossômica em plantas. Foram empregadas técnicas de citogenética, citometria de fluxo e indução de poliploidia in vitro. O capítulo I destinou-se à caracterização citogenética da cultivar Embu de berinjela, que foi empregada em todos os experimentos. Esta cultivar apresentou 24 cromossomos, com tamanho variando entre 1,77 e 2,63 μm. O caritóripo mostrou-se simétrico e foram observadas duas constrições secundárias. Através do bandeamento com fluorocromos CMA3 e DAPI, foram observadas quatro bandas CMA positivas. A técnica de FISH permitiu a visualização de um par de sinais para a sonda DNAr 5S e dois pares para a sonda DNAr 45S. O capítulo II teve como objetivo avaliar os efeitos da colchicina (0,2% e 0,02%) sobre o ciclo celular de berinjela e a eficiência destas concentrações no processo de indução de poliploidia. De forma pioneira, a hidroxiureia foi utilizada como sincronizador do ciclo celular, com o intuito de aumentar a eficiência da poliploidização. A avaliação do ciclo celular foi conduzida em meristemas radiculares com e sem a sincronização e as análises foram realizadas por microscopia e citometria de fluxo. A indução de poliploides in vitro, por sua vez, foi realizada em sementes e segmentos nodais sincronizados e não sincronizados. Não foram observadas diferenças significativas em relação ao índice mitótico. Maiores percentuais de cmetáfases, metáfases duplicadas e núcleos poliploidizados (2xG2) foram observados em resposta à maior concentração de colchicina (0,2%). Os protocolos de indução de poliploidia testados mostraram-se eficientes, sendo regeneradas plantas poliploides após todos os tratamentos. Dos 480 explantes tratados com colchicina, 342 foram regenerados com sucesso, sendo 45 tetraploides e 90 mixoploides. / Polyploidy induction is an important tool in plant breeding, but usually results in low efficiency and high rates of mixoploid and aneuploid plants. Synthetic polyploids can be obtained by the exposure to antimitotic agents, which interfere with the spindle formation during cell division. Colchicine is the most widely used antimitotic in polyploidy induction studies. However, the underlying mechanisms of its action on cells are not completely clear. Solanum melongena L. (eggplant) has a great in vitro regeneration capacity, an interesting feature to the development of basic and biotechnological studies. This work aimed to use eggplant as a model to study the process of chromosome doubling in plants. Cytogenetic techniques, flow cytometry and in vitro polyploidy induction were performed. Chapter I focused on the cytogenetic characterization of the cultivar Embu of eggplant, which was used in all experiments. This cultivar presented 24 chromosomes with length ranging from 1.77 to 2.63 μm. The karyotype was symmetrical and two secondary constrictions were observed. The CMA3/DAPI banding showed four CMA positive bands. The FISH technique allowed the observation of one pair of sites of 5S rDNA and two pairs of 45S. The objective of chapter II was to evaluate the effects of colchicine (0.2% and 0.02%) on the eggplant cell cycle and the efficiency of these concentrations in the polyploidy induction. Innovatively, hydroxyurea was used as a cell cycle synchronizer, in an attempt to increase the efficiency of polyploidization. The cell cycle evaluation was conducted in root meristems with and without cell synchronization and the analysis were performed by light microscopy and flow cytometry. In vitro induction of polyploidy was performed on synchronized and non-synchronized seeds and nodal segments. No significant differences were detected in the mitotic index. Higher frequencies of c-metaphases, polyploid metaphases and polyploid nuclei (2xG2) were observed after the exposure to the higher treatment with colchicine (0.2%). The polyploidy induction protocols tested were efficient, with the regeneration of polyploid plants after all colchicine treatments. Of the 480 treated explants, 342 were successfully regenerated, being 45 tetraploids and 90 mixoploids.

La présence de Wolbachia dans les ovogonies assure la transmission verticale de la bactérie à la descendance de l'hôte. Cependant, nous montrons que chez l'hôte Armadillidium vulgare, l'efficacité de l'infection des descendants tient à un enrichissement en Wolbachia au cours de la maturation des ovaires et des ovocytes dû à une sélection en faveur des ovocytes infectés et/ou à l'entrée secondaire de Wolbachia dans les ovocytes en cours de maturation via l'infection des tissus somatiques. Dans ces tissus, nous avons précisé la localisation de Wolbachia au niveau cellulaire et révélé des morphotypes typiques de chaque tissu. Nous avons également observé Wolbachia chez des hôtes très inattendus; des nématodes non filaires infectant les cloportes, posant la question d'une transmission horizontale, et les A. vulgare mâles, sans qu'ils soient féminisés. Etonnamment, nous avons observé l'infection des gonades mâles dans des lignées d'hôtes chez lesquelles les femelles sont infectées de manière cryptique mais sans que leurs ovocytes ne soient infectés. Le maintien de l'infection entre les générations d'hôtes pourrait alors être dû à une transmission paternelle, inédite pour Wolbachia, ou à une capacité de transmission horizontale très efficace de la bactérie. Par immersion de tissus directement dans des broyats d'organes infectés nous avons en effet démontré que Wolbachia infecte très rapidement des cellules de novo. Les mécanismes d'entrée de Wolbachia dans les cellules sont inconnus mais en monitorant des voies métaboliques clefs de l'hôte nos résultats montrent que l'infection entraine une réponse globale des tissus et implique notamment un détournement de la voie autophagique chez l'hôte. / Wolbachia presence in oogonia ensures bacteria to be vertically transmitted to host offspring. However, in Armadillidium vulgare, we show that the proportion of infected oocytes increases in the course of both ovary and oocyte maturation to reach the transmission rate at the end of ovary maturation. This enrichment can be explained by a preferential selection of oocytes infected with Wolbachia and/or by a secondary acquisition of the bacteria by oocytes. We suspect an acquisition through infected somatic tissues. We localize Wolbachia at the cell level in these tissues and showed particular morphotypes for each tissue. We also observe Wolbachia in unexpected hosts; non filarial nematodes infecting woodlice (suggesting horizontal transmission), and in A. vulgare males (without a feminizing effect of the bacteria). We also observe lineages in which females are cryptically infected. Surprisingly, we observe infected male gonads in these lineages for which female oocytes are uninfected. The infection maintenance across host generations could be due to a paternal transmission of the bacteria (a transmission never described for Wolbachia), or due to an astonishing ability of horizontal transmission. Nevertheless, immersion of uninfected tissues in a solution of crushed infected tissues proves that Wolbachia can quickly infect new tissues. Cellular mechanisms that allow Wolbachia internalization into the cell are still unknown. Thus, we monitor key host metabolic pathways in ovaries and we denote that infection enhances a global response of the entire tissue. Additionally, Wolbachia infection especially implicates a high-jacking of the autophagic pathway.

Submitted by Renata Lopes (renatasil82@gmail.com) on 2015-12-04T17:56:43Z No. of bitstreams: 1 camilafariacarrada.pdf: 1705454 bytes, checksum: dbf21cbcbbd9768b8a87c74182b60328 (MD5) / Approved for entry into archive by Adriana Oliveira (adriana.oliveira@ufjf.edu.br) on 2015-12-07T03:23:56Z (GMT) No. of bitstreams: 1 camilafariacarrada.pdf: 1705454 bytes, checksum: dbf21cbcbbd9768b8a87c74182b60328 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-12-07T03:23:56Z (GMT). No. of bitstreams: 1 camilafariacarrada.pdf: 1705454 bytes, checksum: dbf21cbcbbd9768b8a87c74182b60328 (MD5) Previous issue date: 2015-04-24 / É de fundamental importância investigar a colonização de periodontopatógenos e seu papel na etiologia da doença periodontal de crianças e adolescentes com síndrome de Down, os quais apresentam alta prevalência da doença. O objetivo deste estudo foi avaliar qualitativa e quantitativamente a presença na saliva de bactérias periodontopatogênicas em crianças e adolescentes com e sem síndrome de Down. Este estudo transversal incluiu uma amostra de trinta crianças e adolescentes com síndrome de Down (grupo SD), com idade entre 3-12 anos, e trinta controles sem a síndrome (grupo ND), com idades entre 4-12 anos. Exame clínico foi realizado para determinar o índice de sangramento à sondagem e o índice de placa em dentes índice. Amostras de saliva não estimuladas foram coletadas de todos os participantes. A técnica de hibridização in situ fluorescente (FISH) identificou a presença e as densidades de oito bactérias periodontopatogênicas na saliva. O teste qui-quadrado foi utilizado para analisar as variáveis categóricas e o teste U de Mann-Whitney foi utilizado para as variáveis numéricas. Adotou-se um nível de significância de 5%. Os registros clínicos mostraram frequência mais alta de crianças e adolescentes com sangramento à sondagem no grupo SD (P = 0,037); nenhuma diferença foi encontrada em relação ao índice de placa entre os grupos (P = 0,516). Crianças e adolescentes com síndrome de Down apresentaram densidades maiores de Campylobacter rectus (P = 0,013), Porphyromonas gingivalis (P = 0,025), Treponema denticola (P = 0,026), Fusobacterium nucleatum (P = 0,013), Prevotella intermedia (P = 0,001) e Prevotella nigrescens (P = 0,008). Nenhuma diferença significativa foi encontrada nas densidades de Aggregatibacter actinomycetemcomitans (P = 0,057) e Tanerella forsythia (P = 0,584). No grupo SD, as densidades das bactérias do complexo laranja foram significativamente maiores nas faixas etárias de 3 a 7 anos para F. nucleatum, P. intermedia e P. nigrescens, e de 8 a 12 anos para C. rectus. Os resultados confirmam que crianças e adolescentes com síndrome de Down apresentam maior suscetibilidade à doença periodontal e maior prevalência e densidade de patógenos periodontais importantes para o estabelecimento e agravamento da doença periodontal. / It is of particular importance to investigate the colonization of periodontal pathogens and their role in the etiology of periodontal disease in children and adolescents with Down syndrome, who have a high prevalence of periodontal disease. The aim of this study was to assess qualitative and quantitatively the presence of periodontopathogenic bacteria in saliva in a group of Down and non-Down syndrome children and adolescents. This cross-sectional study included a sample of 30 Down syndrome children and adolescents (group DS), aged 3-12 years, and 30 non-Down syndrome children and adolescents (group ND) aged 4-12 years. Dental examinations were performed to determine the bleeding on probing index and plaque index in index teeth. Unstimulated whole saliva samples were collected from all participants. The fluorescence in situ hybridization (FISH) technique identified the presence and density of eight periodontopathogenic bacteria in saliva. The chisquare test was used to analyze the categorical variables and the Mann-Whitney U test was used for the continuous variables. The significance level was set at 5%. Clinical records showed a higher frequency of children and adolescents with bleeding on probing in DS group (P = 0.037); no significant difference was found in relation to plaque index between the groups (P = 0.516). Down syndrome children showed higher salivary density of Campylobacter rectus (P = 0.013), Porphyromonas gingivalis (P = 0.025), Treponema denticola (P = 0.026), Fusobacterium nucleatum (P = 0.013), Prevotella intermedia (P = 0.001) and Prevotella nigrescens (P = 0.008). No significant difference was found in salivary density of Aggregatibacter actinomycetemcomitans (P = 0.057) and Tanerella forsythia (P = 0.584). In DS group, the densities of bacteria of orange complex were higher in the age groups 3-7 years for F. nucleatum, P. intermedia and P. nigrescens, as well as in age groups 8-12 years for C. rectus. The results confirm that Down syndrome children and adolescents have an increased susceptibility to periodontal disease and higher prevalence and density of important periodontal pathogens for the onset and worsening of the periodontal disease.

Dans ce travail de thèse nous avons étudié les propriétés de fluorescence de films minces d’or dopés avec des molécules organiques Nous avons montré par imagerie électroniques MEB et TEM qu’ils sont structurés en agglomérats de nanocristaux (5 à 10nm) recouverts de molécules formant un gap nanométrique. Dans les spectres d’extinction nous avons observé la présence de la résonance plasmon du métal ainsi que d’une autre résonance à 600nm que nous attribuons au plasmon de gap.Les spectres d’émission et d’excitation de fluorescence ont confirmé que ces films dopés fluorescents avec une composante venant de la fluorescence de l’or, et une autre caractéristique de la présence des molécules fluorescentes. Les décalages spectraux en excitation et en émission à la fois de l’or et des molécules sont les signes d’un couplage fort entre leurs états électroniques, ce qui serait en accord avec la très forte concentration de molécules dans le film (1/100 molaire)L’observation non intuitive de la fluorescence des molécules insérées dans la couche d’or aurait pour origine l’augmentation considérable de leur taux radiatifs qui a été récemment observé dans les nanogaps. / In this thesis work we studied the fluorescence properties of gold thin films doped with organic molecules. We have shown by electronic imaging SEM and TEM that they are structured in agglomerates of nanocrystals (5 to 10 nm) covered with molecules forming a nanometric gap. In the quenching spectra we observed the presence of the plasmon resonance of the metal as well as another resonance at 600nm that we attribute to the gap plasmon.The fluorescence emission and excitation spectra confirmed that these fluorescent doped films with a component coming from the fluorescence of gold, and another characteristic of the presence of fluorescent molecules. The spectral shifts in excitation and in emission of both the gold and the molecules are the signs of a strong coupling between their electronic states, which would be in agreement with the very high concentration of molecules in the film (1/100 molar)The non-intuitive observation of the fluorescence of the molecules inserted into the gold layer is due to the considerable increase in their radiative levels that has recently been observed in nanogaps.

Resumen en inglés This thesis presents the color as a dynamic formal element with the ability to be part of the visual language within a specific context, the pictorial treatment. An investigation into the color and its various contributions to plastic and visual language. On the one hand, a study on the color dynamics which determines the factors of both physical perceptual process, as physiological, researching the development of the dynamic qualities of color that help form a conceptual framework. And on the other side from the practice, which enable testing methods, techniques and concepts that enable the development of the dynamics of color in the visual language, incorporating the movement of color into a pictorial speech and visual communication. It has tried to narrow within a specific research field of color, pictorial support. In it, we have developed three projects in order to control the dynamic color capabilities, testing, replicating experiences and drawing conclusions that help develop methods and concepts applied to the dynamics of color in the painting process. Each of the studies corresponds to different goals but they are complementary in the communication process. In a first study the dynamic possibilities of color are analyzed from its physical dimension, investigating the interaction between light color and color pigment. An approach to activity light and the pigment in different historical moments that have contributed values to the basics of color. In a second study these acquired skills are made available by applying the pictorial language in the environment of artistic creation. a painting project called "Wide spectrum light painting" or "painting WSL. Type of painting based on the interaction of light with matter. The wide spectrum light painting develops images based lighting control and behavior of materials. The interaction between light and pigments propose a research field in the work as communicative process. In a third study, a project serving mainly the perceptual aspect of color dynamics is performed. The design of a perceptual dome which allows the study of aspects such as the relationship between the viewer and the work to perceptual level, development of visual language from the painting WSL exhibition and the use of the dome as a pictorial support. This section has also sought to reflect the importance of designing not only the spatial composition of the work but its temporary composition. The colors become part of the movement so dependent progression, in that order before and after it. Spatiotemporal perception that shapes the performance of color. We have seen the relativity of colors depending on their location, changing its perception as a musical note changes its sense depending on where you are. As timing control allows analysis of the interaction of the colors and the appearance of post-images. From these three projects, the underlying objective has been to facilitate the treatment of the dynamics of color as a formal element in the image composition looking to open new ways in expressive and aesthetic values. / Resumen castellano La presente tesis expone el color como elemento formal dinámico con la capacidad de formar parte del lenguaje visual dentro de un contexto concreto, el tratamiento pictórico. Una investigación sobre el color y sus diferentes aportaciones al lenguaje plástico y visual. Por un lado, un estudio sobre la dinámica del color el cual determina los factores del proceso perceptivo tanto físicos, como fisiológicos, investigando el desarrollo de las cualidades dinámicas del color que ayuden a formar un marco conceptual. Y por otro lado desde la praxis, se presentan ensayos donde habilitar métodos, técnicas y conceptos que permitan el desarrollo de la dinámica del color en el lenguaje plástico, incorporando el movimiento del color al discurso pictórico y a la comunicación visual. Se ha tratado de acotar dentro de un campo de investigación específico del color, el soporte pictórico. En él, hemos desarrollado tres proyectos con la finalidad de controlar las capacidades dinámicas del color, haciendo pruebas, reproduciendo experiencias y extrayendo conclusiones que ayuden a desarrollar métodos y conceptos aplicados a la dinámica del color dentro del proceso pictórico. Cada uno de los estudios corresponde a objetivos diferentes sin embargo son complementarios dentro del proceso comunicativo. En un primer estudio se analizan las posibilidades dinámicas del color desde su dimensión física, investigando la interacción entre el color luz y el color pigmento. Se contextualiza la actividad de la luz y del pigmento en diferentes momentos históricos que han aportado valores a los fundamentos del color. En un segundo estudio estas capacidades adquiridas se ponen a disposición del lenguaje pictórico aplicándolo en el entorno de creación artística. Se desarrolla un proyecto de pintura denominado "Pintura de amplio espectro lumínico" o también "Pintura WSL.1 Tipología de pintura basada en la interacción de la luz con la materia. La pintura de amplio espectro lumínico trata la imagen en función del control de la iluminación y el comportamiento de los materiales. La interacción entre la luz y los pigmentos proponen un campo de investigación en la obra como proceso comunicativo. En un tercer estudio se realiza un proyecto atendiendo principalmente al aspecto perceptivo de la dinámica del color. Se realiza el diseño de una cúpula perceptiva la cual permita el estudio de aspectos como la relación entre el espectador y la obra a nivel perceptivo, el desarrollo del lenguaje visual a partir de la exposición de pintura WSL y la utilización de la cúpula como soporte pictórico. En este apartado se ha buscado también reflejar la importancia de diseñar no solo la composición espacial de la obra sino su composición temporal. Los colores pasan a formar parte del movimiento por lo que dependen de la progresión, en que orden se preceden y suceden. Percepción espacio-temporal que configura la actuación del color. Hemos podido comprobar la relatividad de los colores dependiendo de su ubicación, cambiando su percepción al igual que una nota musical varía su sensación según el lugar donde se encuentre. Por lo que el control temporal permite el análisis de la interacción de los colores y de la formación de post-imágenes. A partir de estos tres proyectos, el objetivo consiguiente ha sido facilitar el tratamiento de la dinámica del color como elemento formal en la composición de la imagen buscando abrir nuevas vías en valores expresivos y estéticos. / Resumen en valenciano La present tesi exposa el color com a element formal dinàmic amb la capacitat de formar part del llenguatge visual dins d'un context concret, el tractament pictòric. Una investigació sobre el color i les seues diferents aportacions al llenguatge plàstic i visual. D'una banda, un estudi sobre la dinàmica del color el qual determina els factors del procés perceptiu tant físics, com fisiològics, investigant el desenvolupament de les qualitats dinàmiques del color que ajuden a formar un marc conceptual. I per un altre costat des de la praxi, es presenten assajos on habilitar mètodes, tècniques i conceptes que permeten el desenrotllament de la dinàmica del color en el llenguatge plàstic, incorporant el moviment del color al discurs pictòric i a la comunicació visual. S'ha tractat de fitar dins d'un camp d'investigació específic del color, el suport pictòric. En ell, hem desenrotllat tres projectes amb la finalitat de controlar les capacitats dinàmiques del color, fent proves, reproduint experiències i extraient conclusions que ajuden a desenrotllar mètodes i conceptes aplicats a la dinàmica del color dins del procés pictòric. Cada un dels estudis correspon a objectius diferents no obstant això són complementaris dins del procés comunicatiu. En un primer estudi s'analitzen les possibilitats dinàmiques del color des de la seua dimensió física, investigant la interacció entre el color llum i el color pigment. Es contextualitza l'activitat de la llum i del pigment en diferents moments històrics que han aportat valors als fonaments del color. En un segon estudi estes capacitats adquirides es posen a disposició del llenguatge pictòric aplicant-ho en l'entorn de creació artística. Es desenrotlla un projecte de pintura denominat "Pintura d'ampli espectre lumínico" o també Pintura WSL1. Tipologia de pintura basada en la interacció de la llum amb la matèria. La pintura d'ampli espectre lumínic tracta la imatge en funció del control de la il·luminació i el comportament dels materials. La interacció entre la llum i els pigments proposen un camp d'investigació en l'obra com a procés comunicatiu. En un tercer estudi es realitza un projecte atenent principalment a l'aspecte perceptiu de la dinàmica del color. Es realitza el disseny d'una cúpula perceptiva la qual permeta l'estudi d'aspectes com la relació entre l'espectador i l'obra a nivell perceptiu, el desenrotllament del llenguatge visual a partir de l'exposició de pintura WSL i la utilització de la cúpula com a suport pictòric. En este apartat s'ha buscat també reflectir la importància de dissenyar no sols la composició espacial de l'obra sinó la seua composició temporal. Els colors passen a formar part del moviment pel que depenen de la progressió, en que orde es precedixen i succeïxen. Percepció espai-temporal que configura l'actuació del color. Hem pogut comprovar la relativitat dels colors depenent de la seua ubicació, canviant la seua percepció igual que una nota musical varia la seua sensació segons el lloc on es trobe. Pel que el control temporal permet l'anàlisi de la interacció dels colors i de la formació de post-imatges. A partir d'estos tres projectes, l'objectiu consegüent ha sigut facilitar el tractament de la dinàmica del color com a element formal en la composició de la imatge buscant obrir noves vies en valors expressius i estètics. / Bellod Ortuño, G. (2017). Dinámica del color en la pintura. Prácticas plásticas y visuales [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/78979

No presente trabalho foram realizados estudos de regiosseletividade das reações de abertura de 2,3-epoxipropanoato de etila (1) utilizando diferentes nucleófilos de selênio e algumas dessas reações foram desenvolvidas com a adição do ácido de Lewis trifluoreto de boro dietil éter (BF3·Et2O). A abertura desse oxirano ao utilizar os nucleófilos MeSeMgCl e MeSeLi-BF3·Et2O ocorreu seletivamente no Carbono C-3 formando o composto de interesse (3-metilseleno 2-hidroxipropanoato de etila), já ao utilizar MeSeLi (em ausência ácido de Lewis) a abertura procedeu-se seletivamente no carbono C-2 formando 2-metilseleno-3-hidroxipropanoato de etila. A reação com o nucleófilo (Na[PhSeB(OEt)3]) levou à mistura desses regioisômeros. O ácido de Lewis BF3·Et2O em presença do selenolato levou a inversão de regiosseletividade da reação de abertura do epóxido 1 e a razão estequiométrica de BF3·Et2O adicionada ao meio reacional correspondeu, proporcionalmente, a porcentagem de obtenção do produto de abertura em C-3 (Tabela 1). Os resultados obtidos sugeriram que BF3·Et2O altera a nucleofilicidade do selenolato (RMN de 77Se) a partir de uma interação selênio-boro. A formação da ligação Se-B pode ocorrer com ou sem a liberação de fluoreto e esse mecanismo foi investigado por meio do emprego de uma sonda fluorescente seletiva desse haleto. O mecanismo dessas reações também foram investigados por cálculos teóricos, os quais mostram-se totalmente coerentes com os resultados experimentais. / In the present work was studied reactions of regioselective opening of 2,3-epoxyester using different selenolatos and some of this reactions were developed by adding Lewis acid BF3·Et2O. The opening reaction of this oxirane using the nucleofilms MeSeMgCl and MeSeLi-BF3·Et2O occurred selectively in carbon C-3 forming the compound of interest (ethyl 3-methylselene 2-hydroxypropanoato of ethyl), already using MeSeLi (in Lewis acid absence) the reaction was selectively on C-2 carbon to form ethyl 2-methylselene-3-hydroxypropanoate. The reaction with the nucleophile (Na[PhSeB(OEt)3]) formed a mixing of these regioisomers. The Lewis acid BF3·Et2O in presence of selenolate reverses the regioselectivity of opening epoxide (1) reaction and the stoichiometric value of BF3·Et2O added in the reaction corresponded proportionally with the percentage of C-3 product (Table 1). The results suggested that BF3·Et2O alters the nucleophilicity of selenolate (77Se NMR) from a selenium-boron interaction. Se-B bond formation may occur with or without fluoride release and this mechanism has been investigated by the use of a selective fluorescent probe of that halide. The mechanism of these reactions was also investigated by theoretical calculations, which are fully consistent with the experimental results.

Devido ao número crescente de surtos de infecção hospitalar, torna-se proeminente o estabelecimento de um programa de sanitização que liste os agentes químicos a serem empregados e o modo de aplicação mais efetivo. Processos de desinfecção também são relevantes em sistemas de tratamento de água (em indústrias farmacêuticas e centros de saúde) para que a qualidade da água seja assegurada e atenda os parâmetros estabelecidos, evitando proliferação microbiana. Validação da eficácia de descontaminação é uma tarefa ao mesmo tempo importante e desafiadora. Indicadores biológicos são sistemas ou moléculas que detectam atividade biológica, permitindo a validação de processos de descontaminação ou desinfecção. O indicador biológico pode ser uma suspensão de microrganismos específicos (sistema biológico) com resistência definida a um determinado processo de descontaminação. Enzimas e proteínas também têm sido empregadas como indicadores biológicos para avaliar a eficácia de processos industriais. A proteína verde fluorescente (GFP) tem sido sugerida como potencial indicador biológico para tratamentos de desinfecção, devido facilidade de sua detecção por espectrofluorimetria ou por inspeção visual. Para estudar e comparar o comportamento dos microrganismos selecionados e da GFP foram realizados ensaios de concentração inibitória mínima (CIM) e tempo de redução decimal (valor D). A CIM capaz de reduzir o bioburden inicial (>8log10) foi: 59 - 156 mg/L- 3250 mg/mL de glutaraldeído, 39 - 246 mg/L de formaldeído, 43750 - 87500 mg/L de álcool etílico 1250 - 6250 mg/L de polivinilpirrolidona iodo, 150 - 4491 mg/L de compostos liberadores de cloro, 469 -2500 mg/L de peróxido de hidrogênio e 2310 - 18500 mg/L de ácido peracético. A. calcoaceticus apresentou resistência à maioria dos agentes químicos testados, seguido de E. cloacae e S. marcescens. No sistema de purificação de água os resultados para Pseudomonas aeruginosa foram: (i) 0,5% de ácido cítrico, D = 3,8 min; (ii) 0,5% de ácido clorídrico, D = 6,9 min; (iii) 70% álcool etílico, D = 9,7 min; (iv) 0,5% bissulfito de sódio, D = 5,3 min; (v) 0,4% de hidróxido de sódio, D = 14,2 min; (vi) 0,5% de hipoclorito de sódio, D = 7,9 min; (vii) mistura de peróxido de hidrogênio (2,2%) e ácido peracético (0,45%), D = 5,5 min. GFP testada frente a soluções cloradas (com diferentes valores de pH e concentração) resultou em diminuição da fluorescência, sendo mais evidente em concentrações de cloro maiores que 150 ppm, com valores D entre 1,3 - 1,7 min. Em soluções de cloro em tampão fosfato (pH=7,15±0,08), a proteína manteve sua estrutura em contato com soluções 52-94 ppm de cloro. Frente a 110 ppm de cloro a estabilidade da proteína foi reduzida 10 vezes. A proteína GFP se mostrou um marcador fluorescente apropriado para monitorar eficácia de desinfecção. Para ser empregada como indicador biológico a proteína deve ser purificada através de um método de fácil ampliação de escala e com boa relação custo benefício, com este intuito o sistema micelar de duas fases aquosas foi estudado, e a proteína GFP foi parcialmente recuperada do homogeneizado celular de E. coli, outros contaminantes presentes no meio foram removidos na mesma etapa. A demonstração de que é possível se extrair uma biomolécula alvo utilizando ligantes de afinidade representa um passo importante no desenvolvimento de um método eficaz de separação que poderá ser utilizado na purificação de outras biomoléculas. / Due to the growing number of outbreaks of infection in hospital and nurseries, it becomes essential to set up a sanitation program that indicates that the appropriate chemical agent was chosen for application in the most effective way. Disinfection processes are also relevant in water purification systems (in pharmaceutical industries and in health environments) to assure water quality, meeting ionic and organic chemical standards, and avoiding microbial proliferation. Validating the effectiveness of decontamination and disinfection is an important and often challenging task. A biological indicator is a system or a molecule that enables the detection of biological activity, and as such, permits the validation of decontamination or disinfection treatments. The biological indicator can be a specific microorganism suspension (microbiological test system) with a defined resistance to a particular decontamination treatment. Enzymes and proteins have also been used as biological indicators to evaluate the immediate efficacy of industrial procedures, such as blanching, pasteurization, and disinfection treatments, as well as to monitor the satisfactory preservation of a product subjected to disinfection or sterilization. Green fluorescent protein (GFP) has been proposed as an ideal choice for a protein-based biological indicator for use in the validation of decontamination or disinfection treatments. In order to study and compare microorganism (in hospital infections outbreaks and isolated from the water purification system) and protein behavior, microorganisms were submitted to minimal inhibitory concentration (CIM) and decimal reduction time determination (D value). The CIM intervals, which reduced bacteria populations over 8log10, were: 59 to 156 mg/L of quaternarium ammonium compounds (QACs); 63 to 10000 mg/L of chlorhexidine; 1375 to 3250 mg/L of glutaraldehyde; 39 to 246 mg/L of formaldehyde; 43750 to 87500 mg/L of ethanol; 1250 to 6250 mg/L of iodine in polyvinyl-pyrolidone complexes, 150 to 4491 mg/L of chlorine-releasing-agents (CRAs); 469 to 2500 mg/L of hydrogen peroxide; and, 2310 to 18500 mg/L of peracetic acid. Chlorhexidine showed non inhibitory activity over germinating spores. A. calcoaceticus showed resistance to the majority of the agents tested, followed by E. cloacae and S. marcescens. In the water purification system the results were for P. aeruginosa into: (i) 0.5% citric acid, D = 3.8 min; (ii) 0.5% hydrochloric acid, D = 6.9 min; (iii) 70% ethanol, D = 9.7 min; (iv) 0.5% sodium bisulfite, D = 5.3 min; (v) 0.4% sodium hydroxide, D = 14.2 min; (vi) 0.5% sodium hypochlorite, D = 7.9 min; (vii) mixture of hydrogen peroxide (2.2%) plus peracetic acid (0.45%), D = 5.5 min. GFP was challenged with chlorine solutions (different pH and chlorine concentrations) and its fluorescence decreased abruptly on contact with chlorine in concentrations greater than 150 ppm, with D-values between 1.3 min (147 ppm chlorine) and 1.7 min (183 ppm chlorine). In phosphate buffered chlorine solutions (pH=7.15±0.08), GFP maintained its structure between 52-94 ppm of chlorine, but protein stability decreased 10-fold when exposed to 110 ppm chlorine. GFP performed as a suitable fluorescent marker for monitoring disinfection effectiveness. To be used as a biological indicator GFP has to be purified through a potentially scalable and cost-effective way to purify the recombinant protein, produced by E. coli. The method studied was two-phase aqueous micellar system, and GFP was partially recovered from a clarified E. coli cell lysate. Other contaminating proteins were simultaneously removed. The demonstration of proof-ofprinciple of the direct affinity-enhanced extraction of CBM9-GFP from the cell lysate represents an important first step towards developing a cost-effective separation method for GFP, and more generally, for other proteins of interest.