Plaquetas apresentam um papel importante no desenvolvimento de metastases tumorais. Os eventos que levam à ativação plaquetária, como agragação e secreção de proteínas, podem significar etapas importantes neste papel. O agonista plaquetário trombospondina está envolvido no processo de agragação plaquetária. Com o intuito de clonar o receptor de trombospondina GpIIIb, produziu-se um soro policlonal contra uma banda eluída de SDS PAGE de extrato proteico de plaquetas, que apresentava peso molecular igual ao de GpIIIb (denominada banda 80kD). Uma biblioteca de cDNA de endotélio de cordão umbilical humano construída em lambda gt11 foi varrida com este soro anti-80kD. Dois clones diferentes foram isolados, seus insertos foram subclonados no vetor pGEM-3Z e sequenciados. Através de consulta ao Genbank observou-se que um dos clones não apresentou homologia significativa com nenhuma proteína até então clonada. O outro clone, por sua vez, apresentou 100% de homologia com a proteína 80K-H, substrato de proteína quinase C. Levando em consideração o fato de que as vias detransdução de sinal que utilizam PKC apresentam extrema importância nos processos de ativação plaquetária decidiu-se prosseguir com a caracterização de 80K-H. Para isto foi produzido um soro policlonal contra a proteína de fusão 80K-H, que foi utilizado em ensaios bioquímicos e imunoquímicos que permitiram caracterizar a proteína 80K-H quanto a alguns aspectos como distribuição em diferentes tipos celulares, localização celular e fosforilação. Além de estar presente em plaquetas, a proteína 80K-H foi encontrada em todas as linhagens celulares testadas, parecendo portanto ser uma proteína ubíqua. Os dados obtidos indicaram que, apesar de apresentar uma sequência N-terminal que é clivada \"in vivo\" muito semelhante a um peptídeo sinal, 80K-H não é secretada nem é de membrana plasmática, mas sim citoplasmática. Em ensaios de fosforilação \"in vivo\" não se detectou fosforilação de 80K-H. Portanto, apesar de 80K-H ser um bom substrato para PKC \"in vitro\", ela não o é \"in vivo\", ao menos nas células analisadas, ou é fosforilada de uma forma extremamente rápida e transiente. / Abstract not available.

CAPES / Polissacarídeos são muito estudados e aplicados a processos industriais e biotecnológicos, devido à grande variedade e versatilidade. As β-glucanas, polissacarídeos à base de glicose, por sua vez podem apresentar diversas aplicações biológicas interessantes tais como, atividade antitumoral, antioxidante e imonomoduladora e têm sido obtidas em vários estudos, por meio de fungos na forma de exopolissacarídeos. Todavia algumas β-glucanas fúngicas apresentam limitações nas aplicações biológicas devido à baixa solubilidade em água. Para melhorar este aspecto e ainda possibilitar aumento das atividades biológicas são sugeridas derivatizações químicas, a exemplo da fosforilação, que possibilitam obtenção de materiais mais solúveis em água e com aumento das atividades e do potencial tecnológico. Assim, este trabalho teve como objetivo a obtenção e caracterização de derivados fosforilados da (1→6)-β-D-glucana (lasiodiplodana) produzida pelo fungo Lasiodiplodia theobromae MMPI, visando macromoléculas mais solúveis em relação à lasiodiplodana nativa e ainda apontar outras modificações passíveis de ampliação de potenciais tecnológicos. A determinação da modificação estrutural por fosforilação foi obtida por meio das técnicas espectroscópicas FTIR e RMN (¹³C e ³¹P) sobretudo ³¹P RMN que possibilitou identificar sinais atribuídos a ésteres de fosfato. As amostras fosforiladas apresentaram DS baixos entre 0,0251 e 0,0499, com indicação de relação inversa entre DS e concentração dos derivatizantes TMFS e TPFS utilizados para fosforilação. Com processo de fosforilação foram alcançados aumentos na solubilidade em água para todas amostras em relação a lasiodiplodana nativa. Também foram alcançados maiores valores de potencial zeta relacionados ao caráter mais aniônico dos derivados fosforilados, bem como redução dos tamanhos médios de partícula, de 1002 para até 252,5 nm. Os padrões de difração das amostras de lasiodiplodana nativa e das fosforiladas evidenciaram característica de materiais parcialmente cristalinos. A macroestrutura das amostras fosforiladas, apresentou formações de fibrilas como resultado da inserção dos grupamentos fosfato. Tanto a lasiodiplodana nativa, quanto as amostras fosforiladas, apresentaram boa estabilidade térmica, com etapas de perda de massa associadas à perda de água, degradação térmica e carbonização, com pequenas diferenças entre as amostras. De acordo com os resultados, a fosforilação da lasiodiplodana contribuiu para ampliação dos potenciais de aplicação biológica e tecnológica. / Polysaccharides have been extensively studied and applied to industrial and biotechnological processes, due to the great variety and versatility. β-glucans, glucose-based polysaccharides, in turn may present several interesting biological applications such as antitumor, antioxidant and imonomodulatory activity and have been obtained in several studies, through fungi in the form of exopolysaccharides. However, some fungal β-glucans have limitations in biological applications due to the low solubility in water. In order to improve this aspect and to increase the biological activities, chemical derivations are suggested, such as phosphorylation, which make it possible to obtain more soluble materials in water and with increased activities and technological potential. Thus, this work had the objective of obtaining and characterizing phosphorylated derivatives of (1→6)-β-D-glucan (lasiodiplodan) produced by the fungus Lasiodiplodia theobromae MMPI, aiming at more soluble macromolecules in relation to the native lasiodiplodana and to point out other modifications technological potential. The determination of the structural modification by phosphorylation was obtained by FTIR and RMN (¹³C and ³¹P) spectroscopic techniques, especially ³¹P RMN, which enabled the identification of signals attributed to phosphate esters. Phosphorylated samples showed low DS between 0.0251 and 0.0499, indicating the inverse relationship between DS and concentration of the derivatives TMFS and TPFS used for phosphorylation. Phosphorylation process increased the water solubility for all samples compared to native lasiodiplodana. Higher zeta potential values related to the more anionic character of the phosphorylated derivatives were also achieved, as well as reduction of the average particle sizes from 1002 to 252,8 nm. The diffraction patterns of native and phosphorylated lasiodiplodana samples showed the characteristic of partially crystalline materials. The macrostructure of the phosphorylated samples presented fibril formations as a result of the insertion of the phosphate groups. Both the native lasiodiplodana and the phosphorylated samples presented good thermal stability, with mass loss stages associated with loss of water, thermal degradation and carbonization, with small differences between the samples. According to the results, the phosphorylation of lasiodiplodana contributed to the amplification of biological and technological application potentials.

CAPES / Polissacarídeos são muito estudados e aplicados a processos industriais e biotecnológicos, devido à grande variedade e versatilidade. As β-glucanas, polissacarídeos à base de glicose, por sua vez podem apresentar diversas aplicações biológicas interessantes tais como, atividade antitumoral, antioxidante e imonomoduladora e têm sido obtidas em vários estudos, por meio de fungos na forma de exopolissacarídeos. Todavia algumas β-glucanas fúngicas apresentam limitações nas aplicações biológicas devido à baixa solubilidade em água. Para melhorar este aspecto e ainda possibilitar aumento das atividades biológicas são sugeridas derivatizações químicas, a exemplo da fosforilação, que possibilitam obtenção de materiais mais solúveis em água e com aumento das atividades e do potencial tecnológico. Assim, este trabalho teve como objetivo a obtenção e caracterização de derivados fosforilados da (1→6)-β-D-glucana (lasiodiplodana) produzida pelo fungo Lasiodiplodia theobromae MMPI, visando macromoléculas mais solúveis em relação à lasiodiplodana nativa e ainda apontar outras modificações passíveis de ampliação de potenciais tecnológicos. A determinação da modificação estrutural por fosforilação foi obtida por meio das técnicas espectroscópicas FTIR e RMN (¹³C e ³¹P) sobretudo ³¹P RMN que possibilitou identificar sinais atribuídos a ésteres de fosfato. As amostras fosforiladas apresentaram DS baixos entre 0,0251 e 0,0499, com indicação de relação inversa entre DS e concentração dos derivatizantes TMFS e TPFS utilizados para fosforilação. Com processo de fosforilação foram alcançados aumentos na solubilidade em água para todas amostras em relação a lasiodiplodana nativa. Também foram alcançados maiores valores de potencial zeta relacionados ao caráter mais aniônico dos derivados fosforilados, bem como redução dos tamanhos médios de partícula, de 1002 para até 252,5 nm. Os padrões de difração das amostras de lasiodiplodana nativa e das fosforiladas evidenciaram característica de materiais parcialmente cristalinos. A macroestrutura das amostras fosforiladas, apresentou formações de fibrilas como resultado da inserção dos grupamentos fosfato. Tanto a lasiodiplodana nativa, quanto as amostras fosforiladas, apresentaram boa estabilidade térmica, com etapas de perda de massa associadas à perda de água, degradação térmica e carbonização, com pequenas diferenças entre as amostras. De acordo com os resultados, a fosforilação da lasiodiplodana contribuiu para ampliação dos potenciais de aplicação biológica e tecnológica. / Polysaccharides have been extensively studied and applied to industrial and biotechnological processes, due to the great variety and versatility. β-glucans, glucose-based polysaccharides, in turn may present several interesting biological applications such as antitumor, antioxidant and imonomodulatory activity and have been obtained in several studies, through fungi in the form of exopolysaccharides. However, some fungal β-glucans have limitations in biological applications due to the low solubility in water. In order to improve this aspect and to increase the biological activities, chemical derivations are suggested, such as phosphorylation, which make it possible to obtain more soluble materials in water and with increased activities and technological potential. Thus, this work had the objective of obtaining and characterizing phosphorylated derivatives of (1→6)-β-D-glucan (lasiodiplodan) produced by the fungus Lasiodiplodia theobromae MMPI, aiming at more soluble macromolecules in relation to the native lasiodiplodana and to point out other modifications technological potential. The determination of the structural modification by phosphorylation was obtained by FTIR and RMN (¹³C and ³¹P) spectroscopic techniques, especially ³¹P RMN, which enabled the identification of signals attributed to phosphate esters. Phosphorylated samples showed low DS between 0.0251 and 0.0499, indicating the inverse relationship between DS and concentration of the derivatives TMFS and TPFS used for phosphorylation. Phosphorylation process increased the water solubility for all samples compared to native lasiodiplodana. Higher zeta potential values related to the more anionic character of the phosphorylated derivatives were also achieved, as well as reduction of the average particle sizes from 1002 to 252,8 nm. The diffraction patterns of native and phosphorylated lasiodiplodana samples showed the characteristic of partially crystalline materials. The macrostructure of the phosphorylated samples presented fibril formations as a result of the insertion of the phosphate groups. Both the native lasiodiplodana and the phosphorylated samples presented good thermal stability, with mass loss stages associated with loss of water, thermal degradation and carbonization, with small differences between the samples. According to the results, the phosphorylation of lasiodiplodana contributed to the amplification of biological and technological application potentials.

Enquanto as raízes laterais (RL) se desenvolvem a partir da raiz primária, as raízes adventícias (RA) são geralmente formadas em órgãos da parte aérea da planta. As RA podem ser formadas como uma resposta adaptativa a estresses, como ferimentos ou alagamentos e a sua formação também é importante para a propagação vegetativa de espécies economicamente relevantes, que frequentemente dependem da propagação clonal de genótipos elite. A aplicação de hormônios pode estimular o desenvolvimento das RA (DRA), e as auxinas são consideradas os principais hormônios envolvidos nesse processo. Neste estudo, o sistema de plântulas estioladas foi usado em Arabidopsis thaliana para analisar diversos aspectos do DRA. Diferentes tipos de auxinas, naturais ou sintéticas, foram testadas e verificou-se que AIA causou um aumento no número de raízes sem afetar seu comprimento, ANA foi efetivo para o DRA, mas as raízes ficaram pequenas, e altas concentrações de 2,4-D causaram a formação de calos. Através de imunolocalização, um nível elevado de AIA foi detectado nos tecidos do hipocótilo que deram origem ao primórdio radicular. O padrão de expressão de genes potencialmente envolvidos com o enraizamento adventício foi testado por PCR em Tempo Real. O DRA foi marcado essencialmente por aumento na expressão de PIN1, SUR2, GH3.3, GH3.6, ARF8 e IAA28. A expressão dos genes induzidos foi mais estimulada por ANA, seguida de AIA. A expressão de IAA28 aumentou com o DRA, diferente do que foi observado no desenvolvimento de RL. Os receptores de auxinas TIR1/AFB e ABP1 iniciam a sinalização de auxinas na célula pelo controle da expressão gênica, proteólise seletiva e afrouxamento da parede celular. Verificou-se que TIR1 e as proteínas AFBs são importantes para o DRA, mas que estes receptores devem estar exercendo funções redundantes no processo e que ABP1 pode agir complementando a sua ação. Durante a organogênese das RA, TIR1 e AFB2 parecem exercer uma maior influência. As auxinas são transportadas de maneira polar, célula a célula e geralmente dependem de transportadores. Analisamos o DRA em diferentes mutantes deficientes no transporte de influxo e efluxo de auxinas juntamente com construções com genes repórteres, na presença ou ausência de auxina exógena. Uma função essencial foi estabelecida para AUX1 no enraizamento adventício e, embora LAX3 per se não tenha sido chave no processo, este parece agir em conjunto com AUX1. Também observamos que a formação eficiente de RA depende dos transportadores de efluxo PIN, principalmente PIN1, 3 e 7. A adequada fosforilação dos PINs pelas quinases PID, WAG1 e WAG2 e, consequentemente, a direção do transporte, foi igualmente essencial para o estabelecimento das RA. / Lateral roots (LR) develop from the primary root, whereas adventitious roots (AR) are generally formed from above-ground organs. AR can be formed as an adaptive response to stresses, like wounding or flooding, and their formation is also important for efficient vegetative propagation of economically relevant species, which often depend on clonal propagation of elite genotypes. Hormonal application can stimulate AR development (ARD) and auxins are recognized as major hormones involved in this process. Here, the etiolated seedlings system was used in Arabidopsis thaliana to study several aspects of ARD. Different auxin types, natural or synthetic, were tested and it was found that IAA caused an increase in root number without affecting root length, NAA was effective for ARD, but roots remained short and higher levels of 2,4-D caused callus formation. Through immunolocalization, a higher level of IAA was detected in hypocotyl tissues from which the root primordia differentiated. The expression pattern of genes potentially involved in adventitious rooting was tested by Real-Time PCR. ARD was essentially marked by increased expression of PIN1, SUR2, GH3.3, GH3.6, ARF8 and IAA28. The magnitude of expression of induced genes was much stimulated by NAA, followed by IAA. IAA28 expression increased with ARD, differently from what is known for lateral root development. The auxin receptors TIR1/AFB and ABP1 initiate auxin signaling in the cell through changes in gene expression, selective proteolysis and cell wall loosening. We observed that TIR1/AFB are important in ARD but might be playing redundant roles in the process, whereas ABP1 could be complementing their action. During AR organogenesis, TIR1 and AFB2 seemed to exert greater influence. Auxins are transported in a polar, cell to cell way and depend on several transporters. We analyzed ARD in different mutants affected in auxin influx and efflux transporters, coupled with reporter gene constructs, in presence or absence of exogenous auxin. An essential role was established for AUX1 in AR. Although LAX3 per se was not a key player in the process, it seemed to act in conjunction with AUX1. We also observed that efficient formation of AR depends on the PIN efflux transporters, mainly PIN1, 3 and 7. The proper phosphorylation of PINs by the kinases PID, WAG1 and WAG2, and hence the direction of auxin transport, was equally essential for AR establishment.

A doença de Chagas foi incialmente descrita em 1090 e após mais de 100 anos de investigações sobre essa doença, ainda pouco se sabe sobre os mecanismos ativados no parasita durante sua adesão e invasão à célula hospedeira. Glicoproteínas de massa molecular de 85kDa localizadas na membrana do parasita foram identificadas como principais elementos responsáveis pela interação com o hospedeiro. Essas proteínas também são capazes de se ligar a elementos da matriz extracelular (ECM) da célula hospedeira e esse evento parece ser crucial para modulação da adesão e invasão do parasita e consequente avanço da infecção. Embora diferentes elementos tenham sido identificados no hospedeiro como componentes da via de resposta a adesão ao parasita, as modificações induzidas pela sua ligação ao hospedeiro é ainda pouco conhecida. Modificações pós-traducionais de proteínas, incluindo a fosforilação, têm sido utilizadas por diferentes organismos na transdução de sinais extracelulares. Dessa forma, a identificação de proteínas diferencialmente fosforiladas durante a adesão de tripomastigotas de T. cruzi a ECM, fibronectina e laminina foi o objetivo dessa tese. Tripomastigotas foram incubados com ECM, fibronectina-, laminina- ou BSA- previamente aderidos em placas de cultura de células. Em seguida, os parasitas foram coletados e suas proteínas extraídas e separadas por 2D-PAGE. Os géis de eletroforese foram corados com Pro-Q Diamond (para identifiicação de proteínas fosforiladas) e posteriormente com coomassie colloidal (identificação de proteínas totais). Os spots com diferença significativa na coloração com Pro-Q Diamond (p< 0,05) foram identificados por LC-MS/MS. 54 spots foram diferencialmente fosforilados durante a adesão dos parasitas a ECM, dos quais 39 sofreram um aumento da intensidade de fosforilação e 15 uma redução. Já dos 43 spots diferencialmente fosforilados durante incubação com laminina, 16 aumentaram a fosforilação enquanto 27 sofreram redução da intensidade de fosforilação. Por fim, após incubação com fibronectina, dos 50 spots selecionados, 15 spots sofreram aumento da intensidade de fosforilação e 35 sofreram redução. Após identificação dos spots, as modificações por fosforilação/desfosforilação de proteínas de função desconhecida (hypothetical proteins), proteínas do citoesqueleto, proteínas do choque térmico (HSPs) e proteínas componentes do proteassomo do parasita foram as mais evidentes. A validação por immonoblotting de algumas proteínas identificadas indicou que a desfosforilação de proteínas do citoesqueleto junto com a fosforilação de proteínas do choque térmico são os principais eventos durante a resposta do parasita a adesão a ECM e a seus elementos. Além disso, a desfosforilação de ERK 1/2 observada indicou uma inativação dessa proteína em parasitas aderidos a fibronectina e laminina. Os resultados obtidos nessa tese sugerem uma provável relação entre modificações de proteínas do citoesqueleto e HSPs com a capacidade de internalização dos parasitas na célula hospedeira. / The Chagas disease was firstly described in 1909. After more than 100 years of investigation about this sickness much less is known about the mechanism triggered in the parasite during the adhesion and invasion to the host cell. 85kDa glycoproteins were identified as the major element responsible for the attachment to the host. In addition, these proteins are able to binding to extracellular matrix elements and host cytoskeletal proteins and it event appears to be an essential step in host cell invasion by T. cruzi. Although downstream signal modifications have been studied in host cells upon parasite binding, the molecular changes induced on the parasite by ligand binding are largely unknown. Since post-translational modification of proteins by phosphorylation is one of the most important mechanisms employed by organisms to transduce external signals, identification of proteins modified upon adhesion of T. cruzi trypomastigotes to ECM, laminin and fibronectin of the host cell was pursued. Trypomastigotes (Y strain) were incubated with ECM, laminin-, fibronectin- or BSA-coated surfaces, followed by 2D-PAGE stained with Pro-Q Diamond (phosphorylated protein detection) followed by colloidal coomassie stain (total protein identification). Proteins with significant differences in Pro-Q Diamond stain (p<0.05) were identified by LC-MS/MS. 54 spots were differentially phosphorylated during parasite adhesion to ECM, in which 39 spots have increased their phosphorylation level and 15 have decreased their phosphorylation. From the 43 spots presenting modification to the phosphorylation on incubation with laminin, 16 corresponded to cases of increase of phosphorylation and 27 to cases of dephosphorylation. After incubation with fibronectin: from the 50 spots selected, 15 corresponded to increase of phosphorylation and 35 to dephosphorylation. The results show phosphorylation/dephosphorylation modifications of unknown proteins, parasite cytoskeletal proteins (alpha and beta tubulin and paraflagellar-rod proteins), heat shock proteins and proteasome proteins. The validation by immunoblotting of proteins and their phosphorylation intensities indicates that cytoskeletal protein dephosphorylation in addition to heat shock proteins phosphorylation are the most important event during the trypomastigotes adhesion to the ECM. Looking for downstream signaling, dephosphorylation of ERK1/2 was also shown in trypomastigotes adhered to fibronectin or laminin, suggesting its inactivation. Thereby, those results suggest a possible correlation between cytoskeletal proteins and HSPs modification and the ability of parasite to internalize into host cells

Enquanto as raízes laterais (RL) se desenvolvem a partir da raiz primária, as raízes adventícias (RA) são geralmente formadas em órgãos da parte aérea da planta. As RA podem ser formadas como uma resposta adaptativa a estresses, como ferimentos ou alagamentos e a sua formação também é importante para a propagação vegetativa de espécies economicamente relevantes, que frequentemente dependem da propagação clonal de genótipos elite. A aplicação de hormônios pode estimular o desenvolvimento das RA (DRA), e as auxinas são consideradas os principais hormônios envolvidos nesse processo. Neste estudo, o sistema de plântulas estioladas foi usado em Arabidopsis thaliana para analisar diversos aspectos do DRA. Diferentes tipos de auxinas, naturais ou sintéticas, foram testadas e verificou-se que AIA causou um aumento no número de raízes sem afetar seu comprimento, ANA foi efetivo para o DRA, mas as raízes ficaram pequenas, e altas concentrações de 2,4-D causaram a formação de calos. Através de imunolocalização, um nível elevado de AIA foi detectado nos tecidos do hipocótilo que deram origem ao primórdio radicular. O padrão de expressão de genes potencialmente envolvidos com o enraizamento adventício foi testado por PCR em Tempo Real. O DRA foi marcado essencialmente por aumento na expressão de PIN1, SUR2, GH3.3, GH3.6, ARF8 e IAA28. A expressão dos genes induzidos foi mais estimulada por ANA, seguida de AIA. A expressão de IAA28 aumentou com o DRA, diferente do que foi observado no desenvolvimento de RL. Os receptores de auxinas TIR1/AFB e ABP1 iniciam a sinalização de auxinas na célula pelo controle da expressão gênica, proteólise seletiva e afrouxamento da parede celular. Verificou-se que TIR1 e as proteínas AFBs são importantes para o DRA, mas que estes receptores devem estar exercendo funções redundantes no processo e que ABP1 pode agir complementando a sua ação. Durante a organogênese das RA, TIR1 e AFB2 parecem exercer uma maior influência. As auxinas são transportadas de maneira polar, célula a célula e geralmente dependem de transportadores. Analisamos o DRA em diferentes mutantes deficientes no transporte de influxo e efluxo de auxinas juntamente com construções com genes repórteres, na presença ou ausência de auxina exógena. Uma função essencial foi estabelecida para AUX1 no enraizamento adventício e, embora LAX3 per se não tenha sido chave no processo, este parece agir em conjunto com AUX1. Também observamos que a formação eficiente de RA depende dos transportadores de efluxo PIN, principalmente PIN1, 3 e 7. A adequada fosforilação dos PINs pelas quinases PID, WAG1 e WAG2 e, consequentemente, a direção do transporte, foi igualmente essencial para o estabelecimento das RA. / Lateral roots (LR) develop from the primary root, whereas adventitious roots (AR) are generally formed from above-ground organs. AR can be formed as an adaptive response to stresses, like wounding or flooding, and their formation is also important for efficient vegetative propagation of economically relevant species, which often depend on clonal propagation of elite genotypes. Hormonal application can stimulate AR development (ARD) and auxins are recognized as major hormones involved in this process. Here, the etiolated seedlings system was used in Arabidopsis thaliana to study several aspects of ARD. Different auxin types, natural or synthetic, were tested and it was found that IAA caused an increase in root number without affecting root length, NAA was effective for ARD, but roots remained short and higher levels of 2,4-D caused callus formation. Through immunolocalization, a higher level of IAA was detected in hypocotyl tissues from which the root primordia differentiated. The expression pattern of genes potentially involved in adventitious rooting was tested by Real-Time PCR. ARD was essentially marked by increased expression of PIN1, SUR2, GH3.3, GH3.6, ARF8 and IAA28. The magnitude of expression of induced genes was much stimulated by NAA, followed by IAA. IAA28 expression increased with ARD, differently from what is known for lateral root development. The auxin receptors TIR1/AFB and ABP1 initiate auxin signaling in the cell through changes in gene expression, selective proteolysis and cell wall loosening. We observed that TIR1/AFB are important in ARD but might be playing redundant roles in the process, whereas ABP1 could be complementing their action. During AR organogenesis, TIR1 and AFB2 seemed to exert greater influence. Auxins are transported in a polar, cell to cell way and depend on several transporters. We analyzed ARD in different mutants affected in auxin influx and efflux transporters, coupled with reporter gene constructs, in presence or absence of exogenous auxin. An essential role was established for AUX1 in AR. Although LAX3 per se was not a key player in the process, it seemed to act in conjunction with AUX1. We also observed that efficient formation of AR depends on the PIN efflux transporters, mainly PIN1, 3 and 7. The proper phosphorylation of PINs by the kinases PID, WAG1 and WAG2, and hence the direction of auxin transport, was equally essential for AR establishment.

Submitted by Caroline Falcao (caroline.rfalcao@ufpe.br) on 2017-04-10T16:16:48Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) 2012-Dissertação-LarissaNascimento.pdf: 5009861 bytes, checksum: e41e4e6a4cc83034688c263b000766c1 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-04-10T16:16:48Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) 2012-Dissertação-LarissaNascimento.pdf: 5009861 bytes, checksum: e41e4e6a4cc83034688c263b000766c1 (MD5) Previous issue date: 2012-03-13 / O gênero Leishmania compreende 30 espécies de protozoários flagelados pertencentes a famíla Trypanosomatidae, donde 20 são patogênicas ao homem. Esses organismos apresentam ciclos de vida complexos e peculiaridades moleculares frente à maioria dos eucariontes, como a ausência de regulação transcricional. Desse modo, a regulação da expressão gênica nesses parasitas é efetuada em etapas pós-transcricionais, dentre essas a mais importante é o processo de iniciação da tradução dos mRNAs, onde diferentes fatores denominados eIFs (eukariotic initiation factors) estão envolvidos. Dentre esses fatores se destaca o complexo eIF4F com função de promover o reconhecimento e ligação de RNAs maduros aos ribossomos. Tal complexo é composto de três sub-unidades: eIF4A (RNA helicase); eIF4E (proteína de ligação ao cap); e eIF4G (proteína multidomínio estruturadora do complexo eIF4F). Em tripanossomatídeos se sabe da existência de cinco homólogos da sub-unidade eIF4G distintos (EIF4G1 ao G5), contudo, pouco se sabe sobre a ocorrência e funções celulares desses homólogos. Portanto o objetio do presente trabalho foi avaliar a expressão dos diferentes homólogos do eIF4G durante o ciclo de vida de Leishmania amazonensis, caracterizando as possíveis modificações pós-traducionais por fosforilação que possam estar agindo sobre tais fatores, uma vez que em eucariotos superiores mecanismos de regulação global da tradução por fosforilação dos eIFs via MAP quinases já são conhecidos. Para tal, foram realizadas culturas de L. amazonensis nas formas promastigota e amastigota-axênicas, e os extratos protéicos provenientes de diferentes fases do crescimento foram analisados através de Western blot. Foi observado que os homólogos de eIF4G estão presentes durante todo o ciclo de vida de L. amazonensis. Podendo ser observado que os EIF4G1, G4 e G5 apresentaram mais de uma isoforma proteica sugestiva de possíveis modificações pós-traducionais desses homólogos. Em conseguinte, a expressão de EIF4G3 e EIF4G4 foi analisada em condições especiais de cultivo na presença de seis inibidores diferentes, contudo nenhuma dessas condições alterou a expressão desses fatores, revelando que essas proteínas são bastante estáveis e possuem tempo de meia-vida prolongado. Posteriormente, o mapeamento in silico de sítios de fosforilação por MAP quinases nos EIF4Gs de Leishmania spp. demonstra a existência de sítios de fosforilação específicos em todos os homólogos E a purificação de fosfoproteínas confirma a existência de mecanismos de fosforilação agindo nos EIF4G3 e EIF4G4. Esses resultados auxiliam no esclarecimento dos mecanismos moleculares, até então obscuros, envolvidos na regulação da expressão gênica pós-transcricional característica desses organismos. / The genus Leishmania comprises 30 species of flagellated protozoa from the family Tripanosomatidae, of which 20 are pathogenic to humans. These organisms have complex life cycles and molecular particularities not observed in most eukaryotes, like absence of transcriptional regulation. Thus, the regulation of gene expression occurs in post-transcriptional steps, with the initiation of mRNA translation representing the most important event. Different factors called eIFs (eukariotic initiation factors) are involved, with emphasis in eIF4Fcomplex, which promotes mRNA recognition and its ribosome interaction. This eIF4F complex consists of three subunits: eIF4A (RNA helicase), eIF4E (cap binding protein) and eIF4G (scaffold protein, for eIF4F complex maintenance). In trypanosomatids, five eIF4G homologous (EIF4G1 to G5) was described, however, little is known about the specific cellular functions of these homologous. In this manner, we evaluated the expression and characterized post-translational modifications of the eIF4G homologous during the Leishmania amazonensis life cycle, especially phosphorylation, considering the translational regulation by phosphorylation of eIF ́s via MAP kinases observed in higher eukaryote. For this reason, cultures were performed with the L. amazonensis promastigote and amastigote axenic forms, and the protein extract, collected from different growth phases, were analyzed by Western blotting. These results demonstrated the detection of all eIF4G homologues during the life cycle of L. amazonensis, while more than one protein isoform were observed for the EIF4G1, G4 and G5 homologues, suggesting possible post-translational modifications. Posteriorly, the EIF4G3 and EIF4G4 gene expression were investigated under differential growth conditions using six distinct inhibitors, however no change was observed in the expression pattern, which suggests that these proteins are quite stable and have long half-life extending. Finally, In silico analysis shows specifics MAP kinase-dependent phosphorylation sites presents in all eIFG homologues and further analysis with EIF4G3 and EIF4G4 confirmed the existence of phosphorylation mechanisms acting on these factors.These present data help to clarify the molecular mechanisms involved in post-transcriptional regulation of gene expression characteristic of these organisms.

Há muito tempo os venenos de abelhas se tornaram objeto de interesse de muitos cientistas, principalmente os venenos daquelas linhagens do gênero Apis, chamadas abelhas europeias e as conhecidas abelhas africanizadas. O foco no desenvolvimento de terapias eficazes que pudessem prevenir ou frear as reações desencadeadas pelas toxinas dos venenos desses insetos foi o principal estimulador do surgimento dessa grande área da pesquisa, uma vez que esses animais causam um grande número de acidentes em animais e seres humanos e os acidentes podem desencadear graves consequências, inclusive óbito. Sendo assim, desenvolvemos o presente trabalho baseado na caracterização da composição proteica dos venenos de abelhas europeias e africanizadas, na análise quantitativa diferencial entre os venenos e, na investigação de fosforilações e a possível relação das mesmas com as funções biológicas. Reunindo todos os elementos que estavam ao nosso alcance para compor o melhor conjunto de etapas para a realização do estudo proteômico de venenos de abelhas, nós atingimos todos os objetivos propostos. Utilizando uma abordagem baseada em espectrometria de massas, consistindo de análise shotgun seguida de LC-MS/MS realizada em um dos mais modernos espectrômetros de massas, nós fomos capazes de obter resultados extremamente confiáveis e interessantes. Comparando-se o efeito da extensão do gradiente de separação na cromatografia líquida, nós fomos capazes de atingir uma maior cobertura da amostra, uma vez que identificamos um maior número de proteínas após a utilização do gradiente mais longo. A identificação de fosforilações foi favorecida pela combinação de fragmentação por \"Colisão Induzida por Dissociação\" e medidas de massa de alta acurácia realizadas no instrumento LTQ-Orbitrap-Velos. Enquanto apenas 29 proteínas foram identificadas após 120 minutos de separação cromatográfica, um total de 51 proteínas foram identificadas aplicando-se gradiente mais longo. Dentre as 51 proteínas totais, 42 são comuns aos venenos das três abelhas. A comparação em pares mostrou que os venenos das abelhas europeias compartilham 44 proteínas e os venenos das abelhas africanizadas compartilham 43 proteínas tanto com o veneno de A. m. carnica quanto com o de A. m. ligustica. Além disso, nós revelamos que existem diferenças quantitativas entre algumas das proteínas dos venenos, sendo muitas dessas proteínas diferenciais toxinas com funções conhecidamente relevantes. A investigação de fosforilação mostrou que duas toxinas apresentam-se na forma fosforilada: melitina e icarapina. Melitina é considerada a principal toxina de venenos de abelhas, sendo bem conhecida por sua ação altamente tóxica e alergenicidade. Este peptídeo foi identificado com fosforilação ocorrendo no sítio Ser18 em todas as amostras de venenos, enquanto somente no veneno da abelha africanizada foi também identificado com sítio de fosforilação no resíduo de Thr10. Icarapina, também já descrita como um alérgeno do veneno, apresentou sítio de fosforilação no resíduo Ser205. Por fim, nós demonstramos o efeito da fosforilação presente em melitina (Ser18) realizando ensaios de atividade biológica do peptídeo fosforilado e nativo, como: hemólise, lise celular e desgranulação de mastócitos e atividade quimiotáctica. Foi observado que a toxicidade do peptídeo fosforilado é reduzida em comparação ao do peptídeo nativo. Sendo assim, nós podemos concluir que a combinação de metodologias eficientes e a utilização de moderna instrumentação nos levou a resultados surpreendentes, os quais se somam a todo o conhecimento já existente acerca de venenos de abelhas / Honeybee venom toxins disturb the activity of critical cellular processes, triggering immunological, physiological, and neurological responses within victims. Studies on venom toxins have provided invaluable knowledge towards elucidating the molecular and functional details of their biological targets, yet there has been no report of a full proteome/phosphoproteome profile of honeybee venom. In this study, we focused on Apis mellifera honeybee venom characterization, including proteins identification, label-free quantitative analysis and phosphorylation identification. Making use of a MS-based proteomic approach, consisting on in-solution digestion followed by LC-MS/MS analysis, we were able to compare the effect of the liquid chromatography gradient length on the sample coverage, consequently, to identify a higher number of proteins using longer separation gradient of the tryptic peptides. Favorable identification of phosphorylations was achieved by the application of a long separation gradient combined with CID fragmentation and high accuracy mass measurement using an LTQ Orbitrap Velos. Here we report on the comparative shotgun proteomics study of the venoms of two Apis mellifera subspecies, A. m. carnica and A. m. ligustica, and the hybrid known as Africanized honey bee (AHB). We identified 51 proteins in total, with 42 of them being common among the three venoms, including many previously unidentified entries. Performing label-free quantification, we observed that few proteins were found with different relative amounts. Additionally, we revealed the phosphorylation of two proteins in all the samples, with two of them being HBV toxins/allergens: melittin and icarapin. Icarapin was identified as phosphorylated at 205Ser. Melittin was identified as phosphorylated at the 18Ser and 10Thr positions in all venoms, as well. Given these novel findings, we then chose to compare the toxicity of the phosphorylated/unphosphorylated forms of the major venom toxin, melittin, considering the most prominent phosphorylation event, the phosphorylated 18Ser position. We showed that the toxicity is in fact decreased when the peptide is phosphorylated. Based on a combination of efficient methodology and state-of-the-art instrumentation, delineated by our Shotgun-NanoESI-Long Gradient-LTQ Orbitrap Velos analysis, we achieved proteomic coverage far surpassing any previous report. Together, these discoveries pave the way for future phosphovenomic studies

Quinases dependentes de ciclinas (CDKs) compreendem uma família de proteínas que podem ser subdivididas em dois grupos funcionais majoritários baseados na sua função no ciclo celular e/ou controle transcricional. Já foram identificadas mais de 30 CDKs humanas. A CDK10 é uma proteína quinase dependente de ciclina pertencente ao grupo de quinases relacionadas à Cdc2. CDK10 é essencial na fase G2/M do ciclo celular, possivelmente no progresso dessa fase, monitorando a replicação completa do DNA e permitindo que as células passem desse ponto de restrição. Essa proteína é um importante determinante de resistência à terapia endócrina para câncer de mama. Portanto, é um alvo potencial para o desenvolvimento de inibidores, uma vez que está presente em células cancerosas. O estudo da estrutura e função da CDK10 deverá ser realizado após sua clonagem, expressão e purificação. O cDNA da CDK10 foi amplificado por reação em cadeia da polimerase (PCR), e posteriormente, o produto foi aplicado em gel de agarose para análise e purificação. O vetor de clonagem recombinante foi obtido, o qual foi clonado em células competentes e sequenciado. A obtenção do plasmídeo recombinante para expressão deu-se pela inserção do DNA nos vetores de expressão pET28a(+) e pET23a(+) (Novagen). A proteína foi expressa em células competentes e analisada por eletroforese em gel de poliacrilamida. Em seguida, a proteína obtida foi purificada em coluna de afinidade por níquel e em coluna de afinidade por ATP. Com a otimização dos resultados obtidos, será possível, futuramente, caracterizar bioquimicamente a CDK10 e elucidar suas estruturas secundária e terciária. O estudo da CDK10 irá contribuir para o entendimento da sua relação estrutura-função e sua relação com oncogenes e supressores de tumor, e o estudo estrutural para o desenvolvimento de inibidores químicos de baixo peso molecular que possa inibir especificamente a CDK10. / Cyclin-dependent kinases (CDKs) comprise a family of proteins that can be subdivided into two major groups based on their functional role in cell cycle and / or transcriptional control. Over 30 human CDKs have been identifies. CDK10 is a cyclin-dependent kinase protein that belongs to the cdc2-related kinases group. CDK10 is essential in phase G2 / M of the cell cycle, possibly in the progress of this phase, monitoring the complete DNA replication and allowing the cells to pass through this restriction point. This protein is an important determinant of resistance to endocrine therapy for breast cancer. Therefore, it is a potential target for the development of inhibitors, since it is present in cancerous cells. The study of the structure and function of CDK10 must be performed after its cloning, expression and purification. cDNA of CDK10 was amplified by polymerase chain reaction (PCR) and then the product was applied into agarose gel for analysis and purification The cloning vector was obtained, which was cloned into competent cells and sequenced. The obtaining of the recombinant plasmid for expression was due to the insertion of DNA into expression vectors pET28a(+) and pET23a(+) (Novagen). The protein was expressed in competent cells and analyzed by electrophoresis on polyacrylamide gel. Then, the obtained protein was purified by nickel affinity column and ATP affinity column. With the optimization of the results obtained, it will be possible, in the future, to biochemically characterize CDK10 and elucidate its secondary and tertiary structures. The study of CDK10 will contribute to the understanding of its structure-function relationship and its relationship with oncogenes and tumor suppressors, and the structural study for the development of low molecular weight chemical inhibitors that can specifically inhibit CDK10. The structural studies will contribute to the development of chemical inhibitors of low molecular weight that may this and other CDKs.

O objetivo deste estudo foi avaliar as alterações morfo-funcionais do sêmen bovino submetido à sexagem através da técnica de citometria de fluxo e comparar com o sêmen convencional e a diferença entre as subespécies. O sêmen foi obtido de seis touros, sendo três taurinos (Holandês preto e branco) e três zebuínos (Gir leiteiro), com quatro ejaculados de cada animal (n = 24). Cinco tratamentos foram realizados: sêmen convencional com diluidor L (Lagoa); sêmen convencional com diluidor S (Sexing) e sêmen sexado (nos tempos de zero, três e seis horas após a ejaculação para avaliar se existem alterações de membranas ao longo do tempo). Foram avaliados pela citometria de fluxo quanto à integridade de membrana plasmática e reação acrossomal (PI/FITC-PSA); peroxidação lipídica (C11-BODIPY581/591) e capacitação espermática através de análises da fosforilação da tirosina e aumento da fluidez e desorganização da membrana plasmática (Merocianina 540 e Yo-Pro1). Os efeitos de tratamentos foram avaliados por análises de variância (ANOVA), empregando-se o programa estatístico Stat-View&reg; (SAS Institute, Inc. 1998, Cary, NC, USA). Foram considerados significativos os valores com P<0,05 e com tendência a significância (P<0,10). O sêmen proveniente da subespécie taurina teve um efeito negativo mais significante do que a zebuína na qualidade do sêmen. O sêmen sexado apresentou maior peroxidação lipídica nos espermatozóides com membrana íntegra e a presença de proteínas fosforiladas na superfície da membrana plasmática, fatores que são indicativos de capacitação espermática. Porém, ao contrário do esperado, este aumento não foi acompanhado pela quantidade de células classificadas como capacitadas pela análise de associação de sondas Yo-Pro-1 e Merocianina 540, pois o sêmen convencional apresentou maior população espermática com membrana plasmática íntegra desorganizada (P<0,05). Não houve piora na qualidade do sêmen sexado devido ao tempo de espera do ejaculado (P<0,05). / The objective of this study was to evaluate the morpho-functions alterations in bovine semen submitted on sorting through flow cytometry technology and compare with conventional semen and the difference between the subspecies. Semen was obtained from six bulls, that three were taurine (Holstein Black and White) and three were zebuine (Dairy Gir) with four ejaculates from each animal (n = 24). Five treatments were performed: conventional semen with L (Lagoa) media; conventional semen with S (Sexing) media and sexed semen (zero, three and six hours after ejaculation to evaluate if there were membrane alterations over the time). The treatments were analyzed with flow cytometry as for plasmatic membrane integrity and acrosome reaction (PI/FITC-PSA); lipid peroxidation (C11-BODIPY581/591) and sperm capacitation through protein tyrosine phosphorylation and the increase in plasma membrane fluidity and disorganization (Merocyanine 540 and Yo-Pro-1). The treatments effects were evaluated by analysis of variance (ANOVA) (Stat-View&reg; SAS Institute, Inc. 1998, Cary, NC, USA). Effects were considered significant if the values were P<0.05 and with significant tendency (P<0.10). Semen from the taurine subspecie had a more significant negative effect than zebuine on semen quality. Sexed semen showed more lipid peroxidation in sperm with membrane integrity and the presence of phosphorylated proteins in plasma membrane surface that seemed to be sperm capacitation. However, in the contrary of expected, this increase did not accompany with quantity of cells classified as capacitated by the association probes Yo-Pro-1 e Merocyanine 540 analyse because the conventional semen showed more sperm population with plasma membrane integrity disorganized (P<0.05). There was not worsening in sexed semen quality over the time ejaculate waiting (P<0.05).