Memoria para optar al Título Profesional de Ingeniero Agrónomo / Durante la temporada 2008-2009 se evaluaron cinco portainjertos y tres variedades francas de vid ante la presencia de tres especies de nemátodos del género Meloidogyne: M. ethiopica, M. hapla y M. javanica. Los portainjertos y variedades utilizados fueron: 1103 P, 101-14, K 5BB, SO4, 3309 injertados con la variedad Chardonnay y como testigo se usó Chardonnay, Pinot Noir y Thompson Seedless. Los parámetros evaluados fueron: peso radical de cada planta, número de nódulos y huevos por gramo de raíz y número de segundo estados juveniles (J2) en el suelo. Todos los portainjertos se comportaron como resistentes al ataque de las 3 especies de Meloidogyne. De las variedades, Chardonnay mostró una alta susceptibilidad, Pinot Noir se comportó moderadamente susceptible, en tanto que, Thompson Seedless mostró resistencia moderada. M. ethiopica fue la principal especie causante de la infestación en Chardonnay y en Thompson Seedless, en cambio, los mayores daños presentes en Pinot Noir los causó M. hapla. / During 2008-2009 season were evaluated five rootstocks and three grapevine varieties in the presence of three species of nematodes of the genus Meloidogyne: M. ethiopica, M. hapla and M. javanica. Rootstocks and varieties used were: 1103 P, 101-14, K 5BB, SO4, 3309 grafted with variety Chardonnay and as control was used Chardonnay, Pinot Noir and Thompson Seedless. The evaluated parameters were: radical weight of every plant, number of nodules and eggs for gram of root and number of the second juvenile conditions (J2) in the soil. All rootstocks were resistant to attack by three species of Meloidogyne. Of the varieties, Chardonnay showed high susceptibility, Pinot Noir behaved moderality susceptible, while Thompson Seedless showed moderate resistance. M. ethiopica was the main species causing the infestation in Chardonnay and Thompson Seedless, however, the greatest damage presented in Pinot Noir was caused by M. hapla.

Memoria para optar al Título profesional de Ingeniera Agrónoma Mención Sanidad Vegetal / La pudrición ácida, causada por Geotrichum candidum, afecta a carozos en postcosecha. La fuente de inóculo son los frutos podridos en el huerto, que contaminan los materiales de cosecha, aguas de lavado, líneas de selección y embalaje. Los síntomas de la enfermedad se presentan en los mercados de destino y escasamente en almacenamiento o laboratorio, no existiendo una metodología para reproducirla, siendo difícil conocer su epidemiología o el efecto de las medidas de manejo. Investigaciones previas han mostrado que el congelamiento y posterior incubación a temperatura ambiente permiten la detección de poblaciones epífitas del patógeno sobre la fruta. Para inhibir el desarrollo de hongos saprófitos que impiden el recuento de G. candidum en postcosecha, como Penicillium y Rhizopus, se evaluaron las mezclas de fungicidas dicloran + iprodione, dicloran + imazalil, dicloran + pyrimethanil y dicloran + benomyl, asperjándolas sobre duraznos cv. Zee Lady posteriormente congelados y mantenidos en cámara húmeda durante cinco días, comparando los resultados con un tratamiento testigo (sin fungicida). Se determinó el porcentaje de frutos con poblaciones epífitas de cada hongo, resultando efectivas para el recuento de G. candidum todas las mezclas excepto dicloran + imazalil. Para verificar efectos inhibitorios de los fungicidas sobre Geotrichum candidum, duraznos cv. Ross fueron inoculados con el hongo previo al tratamiento con fungicidas y congelación. Todas las mezclas permitieron el recuento del patógeno. Aunque los fungicidas no eliminaron completamente los saprófitos Rhizopus, Cladosporium, Penicillium y Aspergillus, sí impidieron que éstos colonizaran totalmente los frutos, permitiendo el desarrollo y recuento de G. candidum. También se determinó el efecto de los fungicidas sobre el crecimiento miceliar in vitro de dos cepas de G. candidum, comparadas con un testigo sin fungicidas. Dicloran + pyrimethanil y dicloran + benomyl, a la mitad de la dosis, presentaron la menor inhibición del crecimiento miceliar del hongo. Además, se determinó el porcentaje de frutos con poblaciones epífitas de Geotrichum candidum en duraznos cv. Sweet September provenientes de huertos comerciales con y sin historial de pudrición ácida, en tres etapas del proceso de embalaje (bins llegada a la planta, hidrocooler y caja embalada). Se observó que la fruta de los huertos sin historial alcanzó el mismo nivel de inóculo en caja embalada que la de aquellos con historial. Esto se debería a la redistribución del inóculo de G. candidum durante el proceso de selección y embalaje, después del hidrocooler. En ambos casos se determinó que casi la totalidad de los frutos presentaron poblaciones epífitas del hongo una vez embalados. / Sour rot of stone fruit caused by Geotrichum candidum has become an important disease in exported peaches. The inoculum coming from rotten fruits in the orchard contaminates the fruit and picking materials, as well as water tanks and packing lines at the packing facilities. Disease symptoms appear in the export markets, but the incidence is barely observed at the national storage or markets. There is not at the present a methodology to replicate the disease in order to better know the disease and the effectiveness of control practices. Previous work showed that freezing the fruit and incubating at room temperature allowed the detection of the epiphytic populations of the pathogen on the fruit, but the colonies of G. candidum were sometimes overgrowth by other saprophytic fungi, like Penicillium and Rhizopus. To inhibit the saprophytic fungi that prevent G. candidum enumeration, fungicide mixtures of dicloran + iprodione, dicloran + imazalil, dicloran + pyrimethanil and dicloran + benomyl were spray over Zee Lady peaches before freezing for 4 days. To observe the effect of the fungicide combination on G. candidum, inoculated Ross peaches were also treated. The effect of the mixtures of fungicides was also evaluated in vitro for the inhibition of the mycelial growth of the pathogen. Finally, the epiphytic populations of G. candidum on Sweet September peaches, from orchards with or without history of the disease, were determined at the arrival of the fruit at the packing facility, after the hidrocooler and at the end of the packing line. All the fungicide mixtures but dicloran + imazalil effectively reduced the saprophytic growth of Rhizopus, Cladosporium, Penicillium and Aspergillus. All mixtures allowed enumeration of G candidum and although the fungicides did not eliminate saprophytic fungi, they prevented complete fruit colonization, allowing G. candidum growth. Half dose of dicloran + pyrimethanil and dicloran + benomyl had less inhibition of the in vitro miceliar growth of G. candidum. The epiphytic population of G. candidum was lower in fruit coming from the orchards without history of the disease. The population did not increased after the hidrocooler but raised to almost a 100 % at the end of the packing line for both kinds of fruit.

Ingeniera Civil en Biotecnología / En las últimas décadas se han estudiado y utilizado las energías renovables no convencionales como una alternativa a los combustibles fósiles. Dentro de éstas se encuentra el bioetanol de segunda generación, producido a partir de residuos lignocelulósicos, siendo la hidrólisis de celulosa una de las etapas claves en el proceso productivo. Uno de los métodos de hidrólisis, es el uso de enzimas producidas por hongos de pudrición que degradan naturalmente la madera. Bajo este marco se define el objetivo general de este trabajo, que es estudiar la producción de proteínas hidrolíticas para la degradación de lignocelulosa por el hongo de pudrición blanca Trametes versicolor. La metodología se dividió en dos ejes principales: definir las condiciones de cultivo de T. versicolor que induzcan la producción de proteínas hidrolíticas, y caracterizar tales proteínas mediante ensayos de actividad de celulasas y ligninasas, utilizando sustratos puros y paja de trigo. El cultivo del hongo se realizó a 28ºC, 50 rpm de agitación y en oscuridad. El medio elegido fue adaptado del artículo de Suwannarangsee et al. (2012), y contenía además 1% p/v de paja de trigo. Este cultivo se inoculó con el hongo en una preparación líquida, y se incubó por 11 días, alcanzando una actividad celulasa de 0,5 [IU/ml] (promedio de los 6 matraces) al cabo de este periodo. La separación de proteínas obtenidas del cultivo se hizo mediante cromatografía de filtración en gel en columna Sephacryl S-100. En esta etapa se recuperó un 18% de proteínas totales, y se logró un enriquecimiento enzimático de 35,96 [IU/mg proteína], triplicando el valor obtenido por el extracto proteico que fue cargado en la columna. Estas proteínas fraccionadas se sometieron a ensayos de celulasas y ligninasas, en los cuales se obtuvo que los mayores valores de actividad estaban entre las fracciones 23 a 28, coincidentes con el peak de absorbancia a 280 nm. Además, se pudo constatar un alto enriquecimiento de xilanasas con 32,9 [IU/mg prot.], versus el extracto proteico con 3,1 [IU/mg prot.]. Por otro lado, se realizó una hidrólisis con paja de trigo, para comparar la acción enzimática de las fracciones proteicas con respecto a Celluclast. Se pudo concluir que no existe sinergia entre ambos componentes, pero si hay una contribución a la acción de la enzima comercial por parte de las proteínas de T. versicolor. Esto se evidenció principalmente en la medición de xilosa, en la cual hubo un mejoramiento de un 47% en la fracción 27. El rendimiento enzimático fue de 2,11 [mg xilosa/mg proteína], siendo más del doble de lo obtenido por las celulasas comerciales en la hidrólisis de paja de trigo. Finalmente, se concluyó que el sistema de separación es eficiente para tener una primera aproximación de las enzimas buscadas dentro de las fracciones cromatográficas, y enriquecer tales fracciones con las proteínas de interés. También fue posible constatar que existe un gran potencial hidrolítico dado por la batería enzimática del hongo T. versicolor, especialmente por las xilanasas producidas por éste. Esto es muy relevante para la etapa de sacarificación, ya que el xilano como sustrato es el segundo más abundante después de la celulosa, y por ende, con gran potencial fermentativo.

Seminario de Título para optar al Título de Ingeniera en Biotecnología Molecular. / Actualmente, el uso de enzimas celulasas, debido a su capacidad de degradar celulosa, ha crecido enormemente y ha sido reportado en industrias como la alimentaria, cervecera y vitivinícola, en la industria alimentaria animal, industrias textil y de detergentes, papelera, y de biocombustibles. En la naturaleza estas enzimas son producidas por hongos y bacterias, y son principalmente secretadas al medio extracelular. Estas enzimas pertenecen a una familia compuesta de al menos tres grupos: exo-celobiohidrolasas (CBH), endo-β-1,4 glucanasa (EG) y β-glucosidasa (BG), las cuales forman parte de un complejo catalítico que actúa de manera sinérgica, en compañía de otras enzimas, degradadando la biomasa. Debido al requerimiento de degradar celulosa por parte de diferentes industrias y ante las condiciones en las cuales se realiza este proceso, como la alta temperatura, el diseño de nuevas enzimas, realizando modificaciones sobre secuencias de proteínas mesófilas ya existentes sugiere ser una buena alternativa. En un estudio anterior, con el fin de generar un método bioinformático predictivo para termoestabilización de proteínas, se analizó el efecto de la temperatura sobre la estructura de la exo-celobiohidrolasa I Cel7C del hongo Phanerochaete chrysosporium usando métodos de dinámica molecular. Como resultado de esto se propuso la introducción de tres puentes disúlfuro, cada uno para una proteína Cel7CDC mutante diferente, los que deberían aumentar la rigidez de la estructura a altas temperaturas, y por lo tanto, su termoestabilidad. Con el objetivo de corroborar experimentalmente el método de predicción bioinformática utilizado, en este trabajo se implementó uno de los tres puentes disúlfuros propuestos para Cel7CDC. Para esto se realizó mutación sitio dirigida mediante la técnica de PCR con partidores que contenían la mutación en su interior, con objeto de generar dos mutaciones puntuales en el gen codificante. Con esto se reemplazó la fenilalanina 325 y la glicina 379 de la cadena aminoacídica de la proteína madura, por cisteínas. Las variantes del gen generadas fueron clonadas en los vectores pBluescript II SK (+) y fueron perpetuadas en E. coli TOP10, y también en el vector pPIC9k para ser expresadas en P. pastoris KM71. Se realizó la transformación y la selección de las variantes de P. pastoris se llevó a cabo por prototrofía en ausencia de histidina y luego con concentraciones crecientes de G418 según protocolos de selección del vector pPIC9k. La selección fue verificada mediante PCR de colonias y secuenciación. La expresión se llevó a cabo según el manual de expresión en P. pastoris con el vector, y tras ser analizadas mediante ensayos de actividad y zimogramas, no se encontró actividad asociada a ellas.

Los hongos son fuente de alimento y medicina desde tiempos remotos. Por su valor nutracéutico y como fuente de nutricéuticos se han utilizado para mantener y mejorar la salud, preservar la juventud y promover la longevidad. También son fuente de compuestos químicos bioactivos útiles para la preparación de productos farmacéuticos. De las 700 especies de hongos comestibles investigadas, sólo unos 50 hongos tienen valor medicinal y entre ellos Grifola frondosa es uno de los más notables e investigados, especialmente como estimulador del sistema inmune y por sus propiedades antitumorales en la lucha contra el cáncer. En los bosques andino patagónicos de Argentina y Chile existen dos representantes del género Grifola: G. gargal Singer y G. sordulenta (Mont.) Singer, para los cuales no se ha investigado suficientemente sobre su biología y por lo tanto no se ha desarrollado aún una tecnología apropiada para su cultivo, como tampoco se han hecho estudios sobre sus posibles propiedades medicinales y aplicaciones no solo terapéuticas sino también biotecnológicas. Por ello se investigó la factibilidad de cultivarlos en condiciones controladas y a su vez se profundizó en el conocimiento de distintos aspectos biológicos de interés. Por otra parte, la actividad medicinal hallada en políporos y en especial en Grifola frondosa apoya la formulación de la hipótesis que plantea también la presencia de actividad antioxidante y/o antigenotóxica en estas especies. La confirmación de tales propiedades es necesaria para sostener más investigación sobre su uso medicinal y resulta de importancia en la propuesta de posibles variedades de productos a partir de ellos, lo cual otorgaría un plus como valor agregado de estos hongos. Para comprender aún más las condiciones de crecimiento de estas especies se realizaron cuatro campañas recorriendo diferentes bosques de robles del Parque Nacional Lanín. Allí, con la ayuda de residentes del lugar y micólogos, se pudieron recolectar fructificaciones sólo en determinados lugares, así como también se tomaron datos de las colonias en crecimiento y muestras de G. gargal causando podredumbre. Asimismo, se aislaron dos cepas (cepa B y G9) de G. gargal, una proveniente de un árbol en pie y otra tomada de un roble caído que llevaba más de 20 años produciendo fructificaciones. La historia de los bosques de roble, informada por otros autores, revela que durante la última glaciación fueron fragmentados y en consecuencia se desarrollaron procesos de variabilidad genética entre los mismos. Algunas de estas variables son el contenido y calidad de ciertos compuestos polifenólicos los cuales se sabe que son importantes en la biología de los hongos degradadores de la madera. En consecuencia esto indicaría una variabilidad entre cepas de los diferentes bosques de robles para G. gargal. Dos cepas, correspondientes a G. gargal (cepa A) y G. sordulenta, fueron obtenidas del Centro de Investigación y Extensión Forestal Andino Patagónico (CIEFAP). Hallar las condiciones óptimas en la producción de micelio y cuerpos fructíferos es un paso fundamental para la producción optimizada de los compuestos con valor nutricional, y como fuente de nutricéuticos y fármacos hipotéticamente presentes en estos hongos. El análisis del crecimiento micelial de G. gargal y G. sordulenta en agar nutritivo reveló que para ambas especies, las mejores condiciones de cultivo fueron pH 4, 18ºC y medio de cultivo MYPA 16 suplementado con 0,4% de cáscara de girasol en polvo. Así, fue posible disminuir el tiempo para la obtención de inóculo de excelente calidad y el cultivo de las cepas en este medio fue posteriormente utilizado en forma rutinaria para su mantenimiento y para su uso como inóculo. Los resultados presentados fueron analizados por una posible pérdida de vigor (luego de tres años de subcultivos) y se halló que ambas cepas no perdieron vigor y que además hubo una mejora en la velocidad de colonización por G. sordulenta y ello se puede explicar por haber desarrollado una adaptación a los ingredientes del medio, concluyendo que las condiciones de rutina empleadas fueron adecuadas para conservar su vigor por más de 12 subcultivos. El aumento en contenido de polvo de cáscara de girasol no modificó la velocidad de colonización de la cepa A de G. gargal por lo que no se justifica su aumento en el medio de cultivo por encima del 0,4 % para esta especie; no se encontraron diferencias en la velocidad de colonización entre las cepa A, B y G9. Usualmente se observa en el stock de cepas de los laboratorios de micología que algunas cepas producen primordios y/o verdaderos cuerpos fructíferos un tiempo después que son almacenadas. Esto llevó a utilizar este método de cultivo in vitro en condiciones controladas para dilucidar los procesos que subyacen en la morfogénesis fúngica, i.e.: la diferenciación del micelio vegetativo a micelio reproductivo. Las observaciones realizadas con lupa y microscopio a G. frondosa, G. gargal y G. sordulenta, fueron comparadas con las observaciones realizadas por otros autores en la bibliografía hallándose algunas diferencias de importancia taxonómica en cuanto a velocidad de crecimiento, morfología de las colonias, cambios de coloración en el medio de cultivo y tipo de degradación de compuestos fenólicos, estudiada in vitro. El aspecto al microscopio de las hifas generativas, gloeopleuras, esqueletales, presencia de clamidosporas y estructuras cristaloides, también en comparación con las observaciones de otras investigaciones, indicó algunas diferencias que permiten conocer mejor la variabilidad entre cepas de estas especies. El estudio de las formaciones morfogénicas in vitro de G. gargal y G. sordulenta fue útil para detectar cambios producidos en estos cultivos luego de aplicar diferentes condiciones lumínicas. La irradiación con luz blanca durante el crecimiento vegetativo de G. gargal previno una demora significativa del crecimiento de micelio en cajas de Petri causadas por temperaturas desfavorables (c.a. 21ºC). Las diferentes condiciones de luz produjeron cambios en el metabolismo secundario y en la diferenciación morfogénica de los cultivos. La respuesta a estas condiciones lumínicas fue mayor en G. gargal que en G. sordulenta. Los resultados indicaron que ambas especies de Grifola fueron sensibles a la irradiación lumínica, con respuestas morfogénicas de distinto tipo e intensidad, si bien la luz blanca fue más efectiva. En ausencia del estímulo luminoso, ambas especies del género fueron capaces de mostrar eventos morfogénicos. En el caso de G. gargal, en presencia del estímulo luminoso, la cepa A fue más sensible que la B en la presentación de respuestas fotomorfogénicas. Estos resultados registrados para los distintos anchos de banda de irradiación lumínica son sugerentes de la participación de más de una molécula fotorreceptora. Para estimar la capacidad ligninolítica in vitro, se cultivó G. gargal y G. sordulenta en medios diferenciales conteniendo diferentes compuestos fenólicos. Para fines comparativos y para poder extrapolar los resultados al cultivo, resultó útil realizar este estudio en forma simultánea con otras dos especies poliporales que tienen una buena performance en fermentaciones en estado sólido empleando cáscara de girasol como sustrato: G. frondosa y Ganoderma lucidum (dos cepas). El estudio reveló la expresión de enzimas polifenol oxidasas en diferentes momentos del crecimiento y con diferentes patrones. Se sugiere que una de estas sería la enzima lignina peroxidasa (LiP). En otro estudio se verificó la actividad de lacasas. Asimismo, la presencia de la enzima con actividad de Mn-peroxidasa (MnP), fue también detectada, ya que en presencia de 20 ppm de Mn(II) en sustratos a base de cáscara de girasol la velocidad de crecimiento micelial fue mayor; asimismo en el caso de G. sordulenta causó un aumento en la densidad micelial aparente. En otro análisis similar se estudió el crecimiento de estas especies en medios diferenciales conteniendo diferentes fuentes de carbohidratos para determinar la actividad de la enzima celobiosa deshidrogenasa. El crecimiento fue en todos los casos moderado a bajo. Se determinó que G. gargal crece mejor en xilulosa y pectina, lo cual indicaría una preferencia por la fracción hemicelulósica de los sustratos. Grifola sordulenta por su parte, crece bien en celulosa y xilulosa y presentó actividad de la enzima celulosa deshidrogenasa. La velocidad de crecimiento y la densidad de la colonización en los medios de carbohidratos fue mayor en las colonias de G. frondosa y Ganoderma lucidum superando a G. gargal y G. sordulenta que si bien crecieron en todos los medios, mostraron menor habilidad para colonizarlos. Por lo cual ambos estudios en medios diferenciales mostraron una menor performance in vitro, lo cual permitió prever un desempeño regular a bajo al extrapolar estos resultados al cultivo en sustratos basados en cáscara de girasol. En algunas especies el cultivo de micelio en medios líquidos ofrece ciertas ventajas como reducción de las pérdidas por contaminación, utilización de espacios más reducidos, y fácil recolección de la biomasa y de los metabolitos disueltos en el medio. Se realizaron cultivos de G. gargal y G. sordulenta en medio líquido agitado empleando Erlenmeyers de 250 ml y 500 ml, y frascos de 3 l, así como también en medio líquido estacionario empleando fuentes de vidrio de 4 l. Se compararon los diferentes sistemas considerando el trabajo que requiere cada técnica y la cantidad de biomasa que produce. Para G. gargal se encontró favorable el cultivo en frascos de 3 l, y para G. sordulenta en Erlenmeyers de 250 ml, obteniéndose una biomasa de 4 y 18 g/l en 20 días de cultivo, respectivamente. En ambas especies la temperatura óptima para este cultivo fue de c.a. 18ºC. En este trabajo se determinó que la suplementación con diferentes reguladores del crecimiento vegetal y/o vitaminas o aminoácidos, o sólo con bencilaminopurina (0,1-10 mg/l) a los medios de ambas especies no incrementa significativamente la biomasa. Por otra parte, mediante el empleo de inóculo homogeneizado se consiguió disminuir la variabilidad dentro de los tratamientos en comparación con el uso de discos de micelio cultivado en agar como inóculo. Los diferentes protocolos suministraron material micelial con diferentes cualidades para ensayar posteriormente las propiedades antioxidantes de estas especies. El spawn en granos es el material que se emplea para inocular grandes masas de sustrato en el cultivo de hongos. La evaluación del crecimiento de micelio de G. gargal y G. sordulenta mediante el bioensayo de crecimiento lineal de Duncan (1997) reveló que ambas especies pueden ser cultivadas en granos de trigo, girasol, maíz y combinaciones de trigo con mijo y maíz con girasol; se determinó que el mejor crecimiento se logra para ambas especies con el cultivo en granos de trigo en el rango de pH de 5,3 a 6,4. La colonización completa de los granos de trigo, según la técnica de producción habitual en botellas de un litro, se produce más rápidamente a 24ºC, en comparación con el crecimiento del micelio en medios semisólidos y líquidos (c.a. 18ºC). En el cultivo en granos no se hallaron diferencias en el número de botellas que completaron la colonización a los días 25 y 30. Para ambas especies y para todos los tipos de granos, la mayor proporción de botellas colonizadas se observó a los 30 días. Considerando la cantidad de granos por gramo de spawn, el empleo de granos de trigo es el más indicado. Se empleó el test de crecimiento lineal de Duncan para evaluar la velocidad de colonización, la densidad aparente, el incremento del contenido de proteínas y de actividad de lacasas, y la degradación de fibras de G. gargal y de G. sordulenta en 20 formulaciones de sustrato a base de cáscara de girasol. Seguidamente se realizó otro ensayo para estudiar el efecto de ciertos suplementos en la velocidad de colonización y densidad aparente en 10 formulaciones más. Con la información recolectada se puede afirmar que ambas especies pueden crecer en estos sustratos, que la cáscara de girasol no necesita suplementos, como salvado o sustrato gastado de Pleurotus ostreatus, para sostener un buen crecimiento del micelio. Para G. gargal la colonización mejoró con un tratamiento ácido del sustrato, o con el agregado de cofactores enzimáticos (Mn(II) y Zn(II)), o de otras fuentes lignocelulósicas como roble, álamo o paja de trigo; para G. sordulenta se encontró que la colonización mejora sólo en cuanto a la densidad con un tratamiento ácido del sustrato, o con el agregado de cofactores enzimáticos (NH4(I), Mn(II) y Zn(II)). Con el establecimiento de un cultivo axénico de G. gargal y G. sordulenta sobre troncos sintéticos artificiales empleando cáscara de girasol como sustrato, se encontró que ambas especies pueden colonizar bien el sustrato, si bien con un ciclo productivo más extenso y mayor riesgo de contaminación a posteriori que para otras especies cultivadas con la misma técnica. La inducción con choque térmico a 5ºC produjo una sensible inducción de primordios, y se lograron algunas fructificaciones. El intercambio gaseoso es crucial para el desarrollo de los basidiomas, como era esperable según los antecedentes registrados en la literatura sobre la producción de G. frondosa. La secuencia de producción de ambas especies en las diferentes etapas es similar a la de G. frondosa: primordios granulares grises, que luego se diferencian en fructificaciones que se suceden en formas conocidas como cerebro, coliflor y racimo. Las propiedades antioxidantes de extractos metanólicos de cuerpos fructíferos, micelio de cultivo líquido y/o de cultivo de granos de trigo fueron analizadas en cuanto a sus propiedades de extinción de radicales (radical DPPH), y poder reductor, asimismo también se comparó el contenido de compuestos fenólicos y se caracterizaron los extractos metanólicos con la técnica de cromatografía de capa delgada. Los resultados hallados permitieron conocer las propiedades antioxidantes de G. gargal y G. sordulenta. Estas especies resultaron poseer muy buenos atributos antioxidantes, especialmente poder reductor. Las diferentes bioformas de micelio y también las formas de cultivo modifican cuali y cuantitativamente el contenido de antioxidantes causando variaciones en la actividad secuestrante de radicales y en el poder reductor. También se encontró que el micelio puede ser inducido a modificar su contenido en antioxidantes usando reguladores de crecimiento vegetal, y que la variación en el contenido de una propiedad antioxidante es independiente de la producida en otra propiedad antioxidante. La actividad antioxidante se debió en parte a la presencia de compuestos fenólicos pero no fueron los únicos compuestos activos. El análisis de cromatografía de capa delgada reveló además que la mayoría de los compuestos antioxidantes eran de naturaleza polar, en éstos siempre se hallaron las características de revelado correspondientes a compuestos fenólicos, y además en algunas bandas también se reveló la presencia de flavonoides. Por su parte los metabolitos apolares se observaron en todos los cromatogramas de los extractos. En algunos casos podría asociarse a compuestos fenólicos, mientras que en otros podría deberse a metabolitos no fenólicos. En G. sordulenta se halló que la actividad antioxidante estuvo parcialmente asociada a compuestos flavonoides. Las propiedades antigenotóxicas de cuerpos fructíferos y micelio de cultivo líquido de G. gargal; así como las harinas de granos de trigo fermentados con G. gargal, G. sordulenta y/o G. frondosa, fueron estudiadas con el test de mutación y recombinación somática en Drosophila melanogaster. El agente químico utilizando para causar las mutaciones (promutágeno) fue el DMBA (7-12-dimetilbenzo(α)antraceno). Con el estudio de la toxicidad de DMBA en distintos tratamientos pudo observarse un incremento en la mortalidad de las larvas de 9 a 45%, sin embargo cuando se agregaron los extractos fúngicos esta mortalidad disminuyó. La mutación y recombinación se evaluó como el número de spots blancos por cada cien ojos, mostrando un aumento en la frecuencia en aquellos tratamientos que contenían DMBA, y una disminución en los co-tratamientos conteniendo ambos: DMBA, y extractos fúngicos en el siguiente orden: fructificación de G. gargal, las tres harinas de granos colonizados y micelio de cultivo líquido de G. gargal. Se concluyó que el material evaluado resultó no tóxico per se y en combinación con el promutágeno y procancerígeno DMBA pudieron disminuir su mortalidad y la genotoxicidad. La respuesta protectora de los materiales fúngicos activó mecanismos de detoxificación en la larva de D. melanogaster que pueden ser desmutagénicos o bioantimutagénicos, y que fueron causados por ciertos compuestos bioactivos presentes en estos hongos superiores con actividad antigenotóxica como p.e. fenólicos, ácido linoleico, polisacáridos y polipéptidos. Luego de demostrar la ausencia de genotoxicidad, las propiedades antioxidantes y las propiedades antigenotóxicas de G. gargal y G. sordulenta, aun es necesario realizar estudios adicionales sobre la producción de cuerpos fructíferos por medio de la fermentación en estado sólido, y así facilitar su disponibilidad para su consumo como alimento. Hasta entonces una alternativa es la producción de micelio y metabolitos por medio del cultivo líquido. Finalmente, en un apartado final de la tesis se muestra información del contenido mineral y de diferentes nutrientes analizados en muestras de micelio, fructificaciones y granos de trigo colonizados, y como una novedad con potencial biotecnológico se sugiere la obtención de una harina de trigo colonizado por estos hongos para ser empleada como un alimento funcional. / As of ancient times, fungi have been and still are a source of food and medicine. Due to their nutraceutical value, they have been used to maintain and improve health, preserve youth and promote longevity. They are also a source of bioactive chemical compounds, which are, in turn, useful for the preparation of nutriceuttical and pharmaceutical products. Of the 700 edible mushroom species investigated to date, only 50 have medicinal value. Among these 50 is Grifola frondosa which is one of the most thoroughly investigated, particularly as a stimulator of the immune system and for its antitumoral properties. Grifola gargal Singer and G. sordulenta (Mont.) Singer, two representatives of the genus Grifola, in the andean patagonian forest in Argentina and Chile, have not been fully studied to date. Nor have their medicinal properties with their corresponding therapeutic applications been investigated. The purpose of this Ph. D. thesis was therefore to study the possibilities of cultivating G. frondosa under control conditions. On the other hand, the medicinal activity observed in polypores, particularly in G. frondosa, gives support to the hypothesis on the presence of antioxidant and /or antigenotoxic activity in these species. Confirming such properties is absolutely necessary to conduct further research in favor of its medicinal properties and to promote the proposal of possible varieties of products derived from them, which would, in turn increase the value of these fungi. To further learn about the growth conditions of these species four campaigns were done in the oak forests located within Lanín National Park. With the help of mycologists and people living in the area, fruiting bodies were collected. Growth data and samples of rotting G. gargal were also collected. Two new strains (strain B and G9) of G. gargal were isolated, one from a standing tree and another from a fallen oak which had been producing fruits for a period longer than 20 years. Previous research on the history of oak forests reveals that during the last ice age they were fragmented, thus inducing the development of processes of genetic variability. Some of these sources of variability variables are the content and quality of certain polyphenolic compounds which are known to be important in the biology of fungal decomposers of wood. This could therefore be indicative of variability among different strains of oak woodlands to G. gargal. Two strains, corresponding to G. gargal (strain A) and G. sordulenta, were obtained from the Centro de Investigación y Extensión Forestal Andino Patagónico (CIEFAP). Reaching to the optimal conditions for the production of mycelium and fruiting bodies is key to the optimized production of compounds with nutritional, nutraceutical and also as a source for nutriceuticals and pharmaceuticals hypothetically present in these fungi. Analysis of mycelial growth of G. gargal and G. sordulenta on nutrient agar medium revealed that for both species, the best culture conditions were pH 4, 18 ° C and culture medium supplemented with 0.4% MYPA of sunflower husk powder. It thus took shorter time to obtain high quality seed and cultivation of strains in this medium was subsequently used routinely both for its maintenance and use as inoculum. Results were analyzed by a possible loss of vigour (after three years of subcultures) and showed that both strains did not lose vigour and that there was a higher rate of colonization in Grifola sordulenta which could be due to the fact that they adapted to the ingredients of the medium, thus indicating that the routine mycelium growing conditions followed were adequate to maintain its force for more than 12 subcultures. On the other hand, the increase in the content of sunflower husk powder (0.4 %) did not alter the rate of colonization of strain A to G. gargal. This indicated that there is no need in increasing the amount of this supplement in this species. It was also observed that there were no differences in the rate of colonization between strain A, B, and G9. It has been observed that in stock strains of mycology laboratories some strains produce primordia and/or real fruitbodies after they are stored. This led us to use the method of in vitro culture under controlled conditions to deep on the processes underlying fungal morphogenesis, i.e the differentiation of vegetative mycelium to reproductive mycelium in these species. Observations of G. frondosa, G. gargal and G. sordulenta under a magnifying glass and microscope were compared with observations by other researchers. These comparisons revealed some differences in taxonomic significance in terms of growth speed, colony morphology, colour changes in the culture medium and type of degradation studied in vitro. The comparison of the microscopic appearance of generative hyphae, gloeopleuras, skeletal, presence of chlamydospores and crystalloid structures with observations from other researchers showed differences which will contribute to better understanding of the variability among strains of these species. The study of the in vitro morphogenic differentiation of G. gargal and G. sordulenta was useful as it helped detect changes in these crops after applying different light conditions. Irradiation with white light during the vegetative growth of G. gargal prevented a significant delay in growth of mycelium in Petri dishes, originated from unfavourble temperatures (c.a. 21 º C). The different light conditions produced, in fact, changes in secondary metabolism and morphogenic differentiation of cultured mycelia. Compared to findings from a study conducted in colonies grown in Petri dishes which had completed their vegetative growth in darkness and had received a thermal shock, in our study the effect of these environmental conditions was greater on G. gargal and similar on G. sordulenta. This indicates that both species of Grifola are sensitive to light irradiation with different morphogenic response type and intensity while white light is more effective. In the absence of light stimulus, both species of the genus were found to have the ability to show morphogenic events. In the case of G. gargal, strain A was observed to be more sensitive than B in the presentation of photomorphogenic responses. These results reported for different bandwidths of light irradiation are indicative of the involvement of more than one photoreceptor molecule. Grifola gargal and G. sordulenta were cultured in differential media containing different phenolic compounds in order to estimate ligninolytic ability in vitro. For comparative purposes and in order to extrapolate results to their cultivation, this study was carried out simultaneously with two other species of poliporales which exhibit a good performance behave naturally in solid state fermentation when using sunflower husks as main substrate. The study revealed polyphenol oxidase enzyme expression at different times and with different growth patterns. It is suggested that one of these could be the enzyme lignin peroxidase (LiP). It was further verified the activity of laccases. Mn-peroxidase (MnP) activity was presumably present because it was also detected in other strains of G. gargal and because addition of Mn (II) increased the rate of colonization with G. gargal cultivation on sunflower husk as substrate and aspect was better in G. sordulenta. Growth of these species in differential media containing different carbohydrate sources was also studied in order to determine the activity of the enzyme cellobiose dehydrogenase. In all cases, growth ranged from moderate to low. It was found that G. gargal grows best in xylulose and pectin, which could be indicaive of a preference for the hemicellulosic fraction of the substrates. In contrast, G. sordulenta was observed to grow well on cellulose and xylulose and evidenced cellulose dehydrogenase activity. Growth rate and density of colonization on media containing carbohydrates was higher in colonies of G. frondosa and Ganoderma lucidum, being even higher than those of G. gargal and G. sordulenta which, although they grew in all media, evidenced lower ability to colonize them. Both studies in differential media showed a lower in vitro performance, thus preannouncing a regular to low growth performance when these results were extrapolated to crop-based substrate sunflower husk. In some species the mycelium growing in liquid media have the advantage of reducing losses due to culture, the use of smaller spaces, and allow for an easy harvesting of the biomass and recovery of the metabolites dissolved in the medium. Cultures of G. gargal and G. sordulenta were carried out in agitated liquid medium using 250 and 500 ml Erlenmeyers flasks, and 3-liter bottles, as well as in liquid medium sources using 4-liter glass containers. Different systems were compared considering the work involved in each technique and the amount of biomass produced. Grifola gargal culture was carried out in 3-liter glass flasks and G. sordulenta was carried out in 250 ml Erlenmeyers flasks, yielding a biomass of 4 and 18 g/l after 20 days of culture, respectively. In both species, optimum temperature for this crop was c.a. 18 °C. In this work it was also determined that supplementation with different plant growth regulators and/or vitamins or aminoacids, or benzylaminopurine alone (0.1-10 mg/l) to the media of both species does not significantly increase biomass. Moreover, the use of homogenous innoculum reduced variability within treatments with respect to the use of disks of mycelium grown on agar as inoculum. The fungal material obtained from this work provided mycelial with different qualities to further test the antioxidant properties of these species. Grain spawn is the material used to inoculate large number of substrates in mushroom cultivation. The evaluation of mycelial growth of G. gargal and G. sordulenta by linear growth bioassay of Duncan (1997) revealed that both species can be cultivated in grains of wheat, sunflower, corn and wheat combinations with millet and corn with sunflower. It was also observed that optimum growth is achieved for both species when cultivation of wheat grains is in the pH range of 5.3 to 6.4. The full colonization of grains of wheat, following the production technique in traditional 1 liter bottles, occurs more rapidly at 24 °C, compared with the growth of mycelium in semisolid media and liquid (c.a. 18 ° C). In grain cultivation there were no differences in the number of bottles that completed the colonization by days 25 and 30. For both species and for all types of grains, the largest proportion of substrates in bottles was colonized after 30 days. Considering the number of grains per gram of spawn grains, using wheat is best recommended. Duncan linear growth test was used to assess the substrate mycelia colonization rate, bulk density, increased protein content and laccase activity, and fiber degradation produced G. gargal and G. sordulenta in 20 formulations based substrate sunflower husk. Another test was further conducted to study the effect of certain supplements on the colonization rate and apparent mycelial density in 10 formulations. Taken together, findings from our study support the conclusion that both species grow in these substrates, that sunflower seed husks needs no supplements such as bran or Pleurotus ostreatus spent substrate to sustain regular growth of the mycelium. For G. gargal colonization was found to improve with an acid treatment of the substrate or with the addition of enzyme cofactors (Mn (II) and Zn (II)), or other lignocellulosic sources such as oak, poplar, wheat straw. For G. sordulenta colonization was found to improve only in terms of mycelial density with an acid treatment of the substrate, or with the addition of enzyme cofactors (NH4 (I), Mn (II) and Zn (II)). The axenic culture of G. gargal and G. sordulenta on artificial synthetic logs using sunflower husks as substrate showed that both species can colonize the substrate, but with a longer production cycle and increased risk of contamination in relation to other mushroom species with the same technique. The thermal shock induction of 5 °C produced a significant induction of primordia and produced some fructifications. Gas exchange is crucial to the development of basidiomas, as expected based on previous research on the production of G. frondosa. The production sequence of both species at different stages is similar to that of G. frondosa: gray granular primordia that grow into fruitbodies of brain shape, then cauliflower shape and finally cluster flower. The antioxidant properties of methanolic extracts of fruiting bodies, mycelium from liquid culture and/or wheat grains were analyzed in terms of their radical scavenger properties (DPPH radical) and reducing power. The content of phenolic compounds was compared and methanol extracts were characterized using thin layer chromatography. It was thus possible to learn more about the properties of G. gargal and to confirm them for the first time in the case of G. sordulenta. These species have antioxidant reducing power properties. Different bioforms of mycelium and also different culture systems modify forms of qualitative and quantitative antioxidant content causing variations in radical scavenger activity and reducing power. In other words, the mycelium can be induced to change their antioxidant content using plant growth regulators and variability in the content of antioxidant property is independent of that produced in other antioxidant property. Antioxidant activity was found to be due in part to the presence of phenolic compounds but it was not the only active compound. Thin layer chromatography also helped to show that the majority of antioxidant compounds were polar, in these were always revealed the presence of phenolic compounds, and in some bands, also the presense of flavonoids. Non-polar metabolites were observed in all chromatograms of extracts. In some cases they could be associated with phenolic compounds while in others could be associated to non-phenolic metabolites. In G. sordulenta it was found that the antioxidant activity was preferentially associated to flavonoid compounds. Antigenotoxic properties of fruiting bodies and mycelia from liquid cultures of G. gargal, as well as grains of wheat flour fermented with G. gargal, G. sordulenta and/or G. frondosa were also studied to test somatic mutation and recombination in Drosophila melanogaster. The chemical agent used to cause mutations (promutagen) was DMBA (7-12-dimethylbenz (α) anthracene). Research on toxicity revealed that treatment with DMBA increased larval mortality from 9 to 45%. Still, when fungal extracts were added larval mortality rate decreased. Both mutation and recombination were assessed as the number of white spots per hundred eyes, showing an increased frequency in the treatments with DMBA, and a decrease in co-treatments with both: DMBA and fungal extracts in the following order: G. gargal fruiting body, three grain meals colonized and G. gargal liquid culture mycelium. It could be concluded that the material evaluated was not toxic and that in combination with procarcinogenic promutagenic DMBA both mortality and genotoxicity decreased. The protective response observed with fungal materials triggered detoxification mechanisms in D. melanogaster larvae which could be either desmutagenic or bioantimutagenic and which could be produced due to some bioactive compounds present in higher fungi with antigenotoxic activity, such as phenolics, linoleic acid, polysaccharides and polypeptides. Summing up, findings on the absence of genotoxicity and antioxidant and antigenotoxic properties, in the fungal species studied in this Ph.D. thesis, will be greatly benefited from further research on the optimization of both species for the production of fruiting bodies through fermentation in the solid state. In the meantime, the production of mycelia and metabolites in liquid culture medium is the alternative for such optimitization. A final section of this Ph.D. thesis includes information on the mineral content of different nutrients which were analyzed in samples of mycelium and fruiting bodies and colonized wheat grains. A novelty with biotechnological potential derived from this section concerns the obtention of wheat flour colonized by these fungi, which evidenced factibility of being used as functional nutrient.

El hongo comestible Agaricus blazei Murrill es reconocido y muy pretendido por sus propiedades medicinales, pero su cultivo aún no se desarrolló en Argentina. Para su cultivo se emplea la misma metodología que para el champiñón (Agaricus bisporus), obteniéndose rendimientos aún bajos y variables según las diferentes cepas, sustratos y manejo técnico. Este método, incluye la preparación de un compost mediante un proceso fermentativo bifásico, y tiene importantes desventajas: ciclo de producción prolongado, importante requerimiento de espacio y mano de obra, gran inversión inicial y potencial perjuicio ambiental. De modo que los objetivos del estudio realizado durante la ejecución de esta tesis, fueron: 1) Formular y optimizar medios de cultivo y sustratos compostados y no compostados, a base de cáscara de semilla de girasol (residuo local abundante), para la producción eficiente de A. blazei. 2) Determinar la posibilidad de reemplazar como material de cobertura del sustrato a la turba Sphagnum por vermicompost. 3) Determinar la degradación de los componentes de los materiales lignocelulósicos empleados en los distintos sustratos para el cultivo de estos hongos. 4) Evaluar el efecto de la incorporación separada de sales de Zn2+ y Cu2+ en el sustrato, cama de cobertura o en el agua de riego, sobre la productividad y su bioabsorción y biodisponibilidad por el hongo. 5) Evaluar la evolución de la actividad de lacasas en los sustratos con fórmulas diferentes en un ciclo de producción. 6) Determinar la efectividad del sustrato gastado remanente del cultivo de A. blazei en la degradación del herbicida metsulfurón metilo. Como principales resultados, se encontró ventajoso el uso de un medio nutritivo basado en caldo de compost, a un pH 6,5, por sobre el tradicional, a base de caldo de papa, para la conservación o propagación del micelio de A. blazei. Se confirmó la posibilidad de preparar compost para el cultivo exitoso de A. blazei utilizando como sistemas contenedores, durante el compostaje, a un tanque metálico de 200 L y tanques plásticos de 400 L ó 600 L. A su vez, se corroboró la posibilidad de emplear cáscara de girasol como parte fundamental en la fórmula del compostaje para la obtención del sustrato para el cultivo de A. blazei por el método tradicional, con rendimientos similares e incluso mejores a los informados. También, se observó que el vermicompost, empleado como cama de cobertura, tiene un efecto estimulador en la inducción de los carpóforos. Se demostró la posibilidad de cultivar A. blazei sobre sustratos sin compostar con rendimientos cercanos a los informados en sustratos compostados. De manera interesante, el sustrato gastado de hongo, además de mejorar los rendimientos en comparación al sustrato que contenía solo cáscara de girasol, produjo un efecto preventivo de la contaminación, tanto cuando se mezcló con cáscara de girasol sola como cuando se lo usó suplementado. Se observó que la mayor degradación de la materia orgánica del compost/sustrato ocurre durante el cultivo, un 50 % superior a la ocurrida durante el compostaje, y que los componentes lignocelulosos más utilizados durante el cultivo de A. blazei fueron la hemicelulosa y la lignina. Pudo verificarse una mayor degradación del sustrato en aquellos que tuvieron mayor productividad. Por otro lado, el agregado de 100 ó 200 ppm de Zn2+ durante la preparación de la cama de cobertura en un sustrato compostado, o al sustrato o cama de cobertura en sustratos sin compostar, mejoró significativamente los parámetros productivos de A. blazei. A su vez, se encontró que la acumulación y biodisponibilidad de Cu2+ incrementaban proporcionalmente con la concentración del elemento agregado, en cualquiera de sus formas de aplicación. En cuanto a la actividad de lacasas durante el cultivo se pudo observar una diferencia según el tipo de sustrato ensayado, lo que señala una estrategia de degradación y crecimiento diferenciada por parte del hongo. Por último, se determinó que el extracto enzimático obtenido de un sustrato compostado, a base a cáscara de girasol y forraje de trigo, remanente del cultivo de dos oleadas de hongos A. blazei, y con una incubación a 25 C de por lo menos 72 h, es capaz de atenuar el efecto fitotóxico del metsulfurón metilo (5 x 10-3 ppm) sobre el crecimiento de B. napus. / The edible mushroom Agaricus blazei Murrill is recognized and very requested by its medicinal properties, but its cultivation was not developed until now in Argentina. The cultivation methodology employed is the same that the one used for the white button mushroom (Agaricus bisporus), and low and variables yields are obtained depending on the different strains, substrates and technical handling. This procedure includes the preparation of compost by means of a two-phase fermentative process, which has important disadvantages: a long production cycle, an important space and work force is required, a great initial investment and is a source of potential environmental damage. The objectives of the study carried out during the execution of this thesis, were: 1) to formulate and optimize cultivation media and composted and non-composted substrates, containing sunflower seed hulls (abundant local residue), for the efficient production of A. blazei. 2) to determine for the possible substitution of the Sphagnum peat moss by vermicompost as a casing material. 3) to determine the degradation evolution of the ignocellulosic material components employed in the different substrates for the cultivation of these mushrooms. 4) to evaluate the effect of the separated incorporation of Zn2+ and Cu2+ salts either in the substrate, casing or in the water for watering, on both the productivity and in the A. blazei fruitbody accumulation and their bioavailability from it. 5) to evaluate the laccase activity evolution in the substrates with different formulations during a production cycle. 6) to determine the effectiveness of the A. blazei spent mushroom compost in the degradation of the herbicide metsulfuron methyl. As main results, it was found valuable the use of a compost broth based medium, at pH 6,5, over traditional potato broth based, for the conservation or propagation of the A. blazei mycelium. The possibility of obtaining compost for successful cultivation of A. blazei using as system containers a metallic tank of 200 L and plastic tanks of 400 L or 600 L was confirmed. For the first time, it is demonstrated the possibility of using sunflower seed hulls as fundamental part in the compost formula for the obtaining of the substrate for the A. blazei cultivation for the traditional method, with similar and even better yields to the reported ones. In addition, it was observed that the vermicompost, employed as casing material, has a stimulating effect in the induction of the cap differentiation. The possibility of cultivating A. blazei on non-composted substrates, with yields near to the informed ones in composted substrates, was also demonstrated. Interestingly, the spent mushroom compost, besides improving the yields in comparison to the substrate containing just sunflower seed hulls, showed a contamination preventive effect, so much when it was mixed half part with sunflower seed hulls as when it was used supplemented. It was observed that the major organic matter degradation in the compost/substrate happens during cultivation, and it was 50 % superior to the one occurred during the composting, and that the main used lignocellulosic components during the A. blazei cultivation were hemicellulose and lignin. Larger degradation could still occur in substrates leading to better yield. On the other hand, the addition of 100 or 200 ppm of Zn2+ during the preparation of the casing in a composted substrate, or to the substrate or casing, in non-composted substrates, improved significantly the productive parameters in A. blazei cultivation. In turn, it was found that the accumulation and bioavailability of Cu2+ increased proportionally with the concentration of the added element, irrespective of the application modes. As for the laccases activity, during the cultivation a difference according to the type of substrate employed could be observed, what points out a different strategy for substrate utilization and mushroom growth. Lastly, it was determined that the enzymatic extract obtained from a compost, based on sunflower seed hulls and wheat forage, resulting from the cultivation of A. blazei during two flushes, and with a 25 C incubation of at least 72 h, is able to markedly attenuate the phytotoxic effect of the metsulfuron methyl (5 x 10-3 ppm) on the growth of B. napus.

No description available.

La presencia en Argentina de Anastrepha fraterculus (Diptera: Tephritidae) (especie nativa) y Ceratitis capitata (especie exótica) limitan la exportación de frutas y hortalizas al estado fresco, ya que estas plagas son de importancia cuarentenaria. A nivel mundial existe una tendencia a disminuir el empleo de plaguicidas de sintesis contra “moscas de la fruta”, debido fundamentalmente a los efectos nocivos de estos sobre el ambiente y la salud humana, sumado a la necesidad de la conservación de la biodiversidad en los agro-ecosistemas. Por tal motivo, los programas para su control se basan en la utilización de un sistema integrado de técnicas bio-racionales o no contaminantes. Como medio bio-rracional de control de estas especies, en Argentina se emplean la técnica del insecto estéril y un himenóptero parasitoide exótico. El uso de microorganismos patógenos como agentes de control biológico es de gran importancia, debido a las enfermedades epizoóticas sobre poblaciones de insectos plaga. Entre ellos, los hongos constituyen un importante grupo de patógenos de insectos y otros artrópodos plaga y son considerados excelentes candidatos como agentes de control biológico, ya que pueden infectar a los insectos directamente a través de la penetración de la cutícula, presentan dispersión activa y pasiva, persistencia en el medio, tolerancia a factores adversos debido al desarrollo de esporas de resistencia, y su manipulación in vitro es relativamente fácil. En Argentina existen varias referencias sobre la presencia y el uso de hongos patógenos sobre insectos plaga, sin embargo, aún no han sido utilizados contra “moscas de la fruta”. Por tal motivo la finalidad de la investigación fue seleccionar especies de hongos patógenos que puedan ser utilizados como agentes de control de A. fraterculus y C. capitata. Se realizó la prospección semanal de larvas y pupas de A. fraterculus y C. capitata que se encontraban en fruta de nogal, durazno y guayaba y en suelo, en la selva de Las Yungas durante los veranos de 2007-2008, 2008-2009 y 2009-2010. Como resultado se obtuvieron 59 aislamiento fúngicos, de los cuales 4 correspondieron al hongo entomopatógeno Beauveria bassiana (Hypocreales: Cordycipitaceae) aislados de larvas de A. fraterculus, 31 al género Fusarium Link, 12 al género Aspergillus Link, 6 a los géneros Penicillium Link y Mucor Micheli. Se evaluó la patogenicidad de los 4 aislamientos nativos de B. bassiana sobre larvas de A. fraterculus, mediante el método de inmersión y de larvas de A. fraterculus y C. capitata, mediante el método de espolvoreo. Y se siguió la mortalidad diferida en pupas y adultos. La mortalidad de larvas y pupas de las dos especies de tefritidos fue mayor al 55% cuando fueron tratadas por el método de espolvoreo. Valores menores al 27% fueron registrados para larvas y pupas de A. fraterculus inoculadas por el método de inmersión. En el caso de los adultos de ambas especies los porcentajes de mortalidad fueron menores al 1% y 22%, mediante la aplicación del inoculo por inmersión y espolvoreo, respectivamente. Se observó que el método de espolvoreo fue más efectivo para el control de los estados inmaduros y que causo un control de la plaga del 80%. También se evaluó la mortalidad de 3 aislamientos de B. bassiana y 1 de Isaria fumosorosea Wizw (Eurotiales: Trichocomaceae) aislados de hospederos no tefritidos, contra larvas y adultos de A. fraterculus, inoculados mediante los métodos de aspersión en tierra e inmersión y aspersión, respectivamente. Se registró una mortalidad entre 12 y 16% para larvas y pupas. Los adultos inoculados por inmersión registraron mortalidades de 44% y 86%, mientras que los inoculados por aspersión menor al 12%. Se realizó un ensayo para evaluar la acción conjunta de B. bassiana aislado a partir de Myzus sp (Hemiptera: Aphididae) y del parasitoide de pupas Coptera haywardi Loiácono (Hymenoptera: Diapriidae) para el control de C. capitata, tanto cuando actuaron juntos como separados, en condiciones de semicampo. Las larvas de la plaga fueron inoculadas mediante la aspersión del inóculo en suelo y se hizo un seguimiento en los estados de pupa y adulto. La acción conjunta de ambos enemigos naturales produjo un control del 95% (eficacia), siendo los adultos el estado más susceptible, mientras que B. bassiana y C. haywardi produjeron un control de 65% y 45%, respectivamente, cuando actuaron independientemente. La mortalidad del hongo sobre el parasitoide fue del 15,6 ± 1,8%. De estos estudios podemos concluir que para lograr un efectivo control de las “moscas de la fruta” es preferible el empleo de cepas aisladas a partir de ellas mismas. Por otra parte se observó que el método de aplicación más efectivo sería la inoculación del hongo en suelo, de este modo las larvas se infectarían al momento de enterrarse y al permanecer en el suelo junto con las pupas muertas y esporuladas, serían una fuente de inoculo para la infección de los adultos emergentes. En cuanto a las cepas nativas de B. bassiana aisladas de larvas de A. fraterculus, se deberían realizar evaluaciones a campo y pruebas de patogenicidad sobre adulto, debido a que no fue evaluado en el presente trabajo.

Los cultivos agrícolas se ven expuestos a adversidades de diferentes orígenes, ya sean bióticos o abióticos. En los sistemas extensivos e intensivos de la Región Pampeana Argentina (centro norte) los áfidos representan una importante limitante ya sea en cultivos de cereales u hortícolas. El manejo de las poblaciones de estos insectos se realiza principalmente mediante el uso de insecticidas de síntesis orientando las acciones hacia la eliminación del insecto blanco que se intenta controlar. Se considera al cultivo aislado del ecosistema y por lo tanto del resto de los elementos que lo conforman. El manejo integrado de plagas (MIP) se presenta como una alternativa viable que posibilita la obtención de altos rendimientos compatibles con la sustentabilidad del sistema. Dentro del MIP una estrategia difundida con mayor énfasis en los últimos años, es el Control Biológico mediante la utilización de hongos entomopatógenos. En este grupo de agentes de control biológico, los Hongos Entomophthorales son importantes antagonistas de áfidos en condiciones de campo y presentan un alto potencial para su utilización en estrategias de Control Biológico Conservativo (CBC). Sin embargo, un profundo conocimiento de la biología y ecología de estos organismos es necesario para respaldar la toma de decisiones que permitan potenciar su uso en estrategias de MIP. Los objetivos de este trabajo de tesis se basaron fundamentalmente en la identificación y caracterización de los hongos entomophthorales como factores de mortalidad de los áfidos, en la determinación de los niveles de infección en cada cultivo y en el estudio de los factores que favorecen o inhiben su actividad en condiciones de campo. Además, se consideró el estudio de la vegetación de crecimiento espontáneo presente en los bordes de los cultivos para su posible inclusión en estrategias de CBC de áfidos en agroecosistemas de la región pampeana argentina. Se registraron cuatro especies de hongos Entomophthorales entomopatógenos, infectando áfidos en cultivos de cereales, hortícolas y en la vegetación aledaña a los cultivos. Las identificaciones fueron realizadas por métodos de taxonomía clásica y molecular. La especie más prevalente fue Pandora neoaphidis (Remaudière & Hennebert) Humber, seguido por Zoophthora radicans (Brefeld) Batko, Entomophthora planchoniana Cornu y Neozygites fresenii (Nowakowski) Remaudière & Keller (Neozygitales: Neozygitaceae). Se registraron prevalencias de E. planchoniana y de P. neoaphidis de hasta el 98.1 (n=3212) y 90.2 % (n=278) en cultivos de pimiento y de trigo respectivamente; mientras que infecciones causadas por Z. radicans alcanzaron el 63.7% (n=270) en áfidos en cultivo de trigo. Asimismo se registraron hongos patógenos de áfidos en la vegetación no cultivada presente en los bordes de los cultivos. Pandora neoaphidis fue la especie prevalente alcanzando un nivel de infección de 73.9% (n=88) en Hypermyzus carduellinus (Theobald) sobre la planta sustrato Sonchus oleraceus (L). En relación a los factores bióticos o abióticos que influencian el desarrollo de las micosis en estos insectos, se logró determinar que en algunos casos la densidad de la población hospedadora fue un factor determinante para el desarrollo de epizootias, mientras que en otros no hubo asociación entre estas variables. Se observaron diferencias en las infecciones entre los estados de desarrollo de los áfidos, siendo mayor el riesgo de infección de ninfas en comparación con el riesgo de infección de adultos ápteros y de adultos alados. Asimismo se detectó la presencia de parasitoides y depredadores en simultáneo con la ocurrencia de infecciones fúngicas sin haber sido registradas infecciones en estos enemigos naturales. Por otro lado, infecciones fúngicas se desarrollaron aún con aplicaciones de agroquímicos, lo que permite suponer que los activos de síntesis no inhibieron por completo la transmisión de los hongos entomopatógenos. En cuanto a la estacionalidad, se observaron infecciones fúngicas en todas las estaciones del año, siendo más predominantes en otoño-invierno. Las temperaturas relativamente bajas y los porcentajes de humedad altos propiciaron la transmisión de los hongos patógenos a los insectos “blanco” sanos. Importantes epizootias de P. neoaphidis y de E. planchoniana fueron registradas en cultivos de pimiento, berenjena, trigo y en plantas de crecimiento espontáneo presente en los bordes de los cultivos. En algunos cultivos, en determinados momentos, las infecciones fúngicas lograron reducir las poblaciones de áfidos por debajo del umbral de daño económico. La ocurrencia y los niveles de infección fúngica de hongos entomophthorales permiten inferir que podrían ser utilizados en programas de MIP. La predicción de los momentos en que se presentan podría constituir una herramienta útil en la toma decisiones en programas de manejo sustentable de las poblaciones de áfidos lo cual contribuiría a establecer buenas prácticas agrícolas que tiendan a la sustentabilidad de los sistemas productivos, permitiendo la protección y la integridad de los recursos naturales, siendo rentables para el productor para contribuir al crecimiento económico y el bienestar de la sociedad.

Estudia el potencial de distintos residuos lignocelulósicos generados en la región del cantón Alausí, como sustratos para el cultivo del hongo Pleurotus ostreatus. Estos fueron vaina de arveja, bagazo de maíz y paja de trigo. Se evaluó el potencial de los tres sustratos con relación a la producción del hongo a través de los indicadores como la eficiencia biológica, el rendimiento y el porcentaje de biodegradación tras las cosechas. Los resultados obtenidos indicaron que todos los sustratos, principalmente vaina de arveja y paja de trigo son aptos para el cultivo de Pleurotus ostreatus. La producción en peso de la biomasa que se obtuvo en los sustratos evaluados fue de 317,26 g para la vaina de arveja, 227,98 g para la paja de trigo y de 147,59 g para el bagazo de maíz. La mayor eficiencia biológica (EB) se obtuvo en el sustrato vaina de arveja con 90,35%, la paja de trigo con 70,80 % y el bagazo de maíz obtuvo la eficiencia biológica más baja de 58,05.%. En la vaina de arveja se obtuvo el mayor rendimiento con el 31.9 %, seguido por la paja de trigo con 22.15 % y finalmente el bagazo de maíz con un 14.73 %. El sustrato que mayor biodegradación experimento por la seta Pleurotus ostreatus en base a la pérdida de peso del mismo fue la vaina de arveja con el 36 %, en segundo lugar está la paja de trigo con el 32 % y finalmente el bagazo de maíz con el 26 %. Los resultados obtenidos establecen que es posible utilizar los residuos lignocelulósicos como sustrato para el desarrollo y producción del hongo Pleurotus ostreatus además que este procedimiento de biodegradación mediante un organismo celulolítico constituye una alternativa viable para la minimización de los residuales de difícil degradación que se generan en grandes cantidades, con la ventaja adicional de transformar la materia orgánica en un alimento de alta calidad. / Tesis