Neurocysticercosis (NC) is a polymorphic disease and the immune response in human carrier is heterogenic. In this study, 35 primers were used for amplifications by Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD) of Taenia solium metacestodes, from five different geographic areas in Brazil: 1) Distrito Federal (DF), Center West; 2) Barreiras (BA), Northeast and Southeast; 3) Hydro Basin of the Mosquito River (North of Minas Gerais, RM-MG), 4) São Paulo (SP) and 5) Uberaba (Minas Gerais, UB-MG). Metacestodes saline crude extracts of four populations (DF, BA, RM-MG e SP) were used for the detection of specific IgG antibodies by ELISA and Western Blotting (WB). A total of 157 serum samples of three groups, (G1): 49 NC patients; (G2): 68 patients with other helminthiasis: hydatidosis (10), taeniasis (20), strongyloidiasis (20), schistosomiasis (10) and hymenolepiasis (8); and (G3): 40 healthy individuals; were analyzed by ELISA. From these, the 98 serum samples were assayed by WB; G1 (49), G2 (39) and G3 (10). The genetic distances, in disagreement percentage, between the metacestode populations were calculated from of 15 RAPD markers and showed 49.5% (DF), 48% (BA), 38.5% (UBMG) and 28% (RM-MG and SP) of genetic distances. Six primers identified polymorphic fragments and the primers 26 (GGGTTTGGCA) and 29 (TCGCCAGCCA) allowed a better differentiation of populations. The fragments of 1000, 500 and 326 pb (pairs of bases) in the UB-MG and of 600 and 244 pb in RM-MG were amplified by primer 26. The fragments generated by primer 29 were 500, 800 and 1191 pb, 300 and 1377 pb, 1000 pb and 244 and 434 pb in SP, UB-MG, DF and BA populations, respectively. In G1, the positivity by ELISA was: 90% (DF), 69% (BA), 71% (MG) and 67% (SP). The DF extract was more antigenic than others (p=0.02). In WB, the 64-68 kDa antigens were recognized in all extracts, exclusively, in serum samples from active NC patients (p=0.001). Variation in banding pattern was detected between the extracts (p<0.05). In G2, the serum samples of hydatidosis patients presented from 70 to 90% positivity by ELISA in antigenic extracts (p<0.05); however, the bands recognition pattern in WB was different from that presented in G1 samples. The 77 kDa band was significantly identified in hydatidosis samples (p=0.0001). In conclusion, the T. solium populations analyzed showed genetic variability and antigenic differences. / A neurocisticercose (NC) constitui doença polimórfica, apresentando heterogeneidade da resposta imune no hospedeiro humano. Nesse estudo, o teste Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD) foi utilizado com 35 primers na detecção de polimorfismo em metacestódeos de Taenia solium provenientes de cinco áreas geográficas distintas do Brasil: 1) Distrito Federal (DF), região Centro-Oeste; 2) Barreiras (BA), região nordeste e da região sudeste: 3) Bacia Hidrográfica do Rio Mosquito (norte de Minas Gerais, RM-MG), 4) São Paulo (SP) e 5) Uberaba (Minas Gerais, UB-MG). Os extratos salinos totais de metacestódeos de quatro populações (DF, BA, RM-MG e SP) foram utilizados na detecção de anticorpos IgG específicos pelo ELISA e Western Blotting (WB). As 157 amostras de soro de três grupos (G) de indivíduos: G1: 49 pacientes com NC; G2: 68 pacientes com outras helmintíases, sendo hidatidose (10), teníase (20), estrongiloidíase (20), esquistossomose (10) e himenolepíase (8) e G3: 40 indivíduos saudáveis (controles); foram analisadas pelo ELISA. Foram ensaiadas 98 amostras de soro: G1 (49), G2 (39) e G3 (10) pelo WB. As distâncias genéticas, por porcentagem de desacordo, foram de 49,5% (DF), 48% (BA), 38,5% (UB-MG) e 28% (RM-MG e SP) nas populações de metacestódeos, calculadas a partir de 15 marcadores de RAPD. Seis primers geraram fragmentos polimórficos nos isolados analisados, sendo que os primers 26 (GGGTTTGGCA) e 29 (TCGCCAGCCA) permitiram melhor diferenciação entre as populações, o primer 26 gerou os fragmentos de 1000, 500 e 326 pb (pares de bases) na amostra de UB-MG, e de 600 e 244 pb em RM-MG. O 29 gerou fragmentos em quatro das populações analisadas, sendo 500, 800 e 1191 pb em SP, 300 e 1377 pb em UBMG, 1000 pb no DF e 244 e 434 pb na BA. No G1, as freqüências de positividade no ELISA, foram: 90% (DF), 69% (BA), 71% (MG) e 67% (SP), sendo o extrato do DF mais antigênico que os demais (p = 0,02). No WB, o peptídeo de 64-68 kDa foi reconhecido em todos os extratos, exclusivamente, em amostras de pacientes com NC ativa (p=0,001). Detectou-se variação no padrão de reconhecimento de bandas entre os extratos (p<0,05). No G2, as amostras de soro de pacientes com hidatidose apresentaram de 70 a 90% de positividade no ELISA frente aos extratos analisados (p<0,05); porém, o padrão de reconhecimento de bandas no WB diferiu do apresentado pelas amostras do G1, sendo que a banda de 77 kDa foi significativamente identificada pelas amostras de pacientes com hidatidose (p=0,0001). Concluiu-se que as populações de T. solium analisadas nesse estudo, apresentaram variabilidade genética e diferenças de antigenicidade. / Doutor em Imunologia e Parasitologia Aplicadas

Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de Minas Gerais / The purpose of this study is to evaluate the amount of transcripts from the Major Histocompatibility Complex (MHC) class I classical (BoLA-N *) and non-classical (BoLA-NC*), as well as of TNF-&#945; (Tumor Necrosis Factor alpha) and TGF-&#946;1 (Transforming Growth Factor beta 1) cytokines in bovine non-pregnant uterus, caruncles, cotyledons and blastocysts throughout the pregnancy period, in order to understand the immune and physiological mechanisms that occur in pregnancy in cows. The samples were analyzed by qPCR, the qualification (presence or absence) by conventional RT-PCR and the immune fluorescence with sheep monoclonal antibody against MHC class I. As positive control we used a sample of tissue from the bovine lymph node and/or spleen in all experimental tests. The amount of transcript BoLA-N* and BoLA-NC* was small (fold change 0 to 3) in blastocysts and cotyledons. Cotyledons transcription BoLA-NC* is greater than the transcription of BoLA-N*. Blastocysts transcription of BoLA-N* was higher than BoLA-NC*. Blastocysts transcribed more BoLA-NC2 than in cotyledons. Blastocysts not transcribed BoLA-NC4. Cotyledons transcribed BoLA-NC4 more than BoLA-NC2. The caruncles showed large amounts of transcripts (fold change 5 to 400), which were higher for pregnancy period of \"8-9\" month to BoLA-N* and one month for BoLA-NC*. Caruncles BoLA-NC2 transcription was higher than the BoLA-NC4. The uterus non pregnant had fewer transcripts BoLA-N* and BoLA-NC* than in caruncles. The uterus non pregnant no have transcripts of BoLA-NC2, but they had a small amount of transcripts of BoLA-NC4. Caruncles had large amounts of transcripts (fold change 50 to 500) of BoLA-NC2 with pregnancy age greater than one month; those are seemed to protect the fetus from rejection. TNF-&#945; appears in greater amount in late gestation (8 and 9 months), showing the beginning of an inflammatory reaction, necessary to the adequate removal of the fetus and the placenta during delivery. Since TGF-&#946;1 has a peak of expression in the sixth and seventh months of gestation, just when the fetus has its greatest growth, demonstrating a probable involvement of this cytokine in this phenomenon. / Com o intuito de entender os mecanismos imunofisiológicos da gestação em vacas esta tese teve como objetivo avaliar a quantidade de transcritos do Complexo de Histocompatibilidade Principal (MHC) de classe I clássico (BoLA-N*) e não clássico (BoLA-NC*), bem como das citocinas TNF-&#945; (Fator de Necrose Tumoral alfa) e TGF-&#946;1 (Fator de Crescimento Transformador beta 1) em úteros não gestantes, carúnculas, blastocistos e cotilédones bovino durante todo o período gestacional. Utilizou-se a quantificação por qPCR, a qualificação (presença ou ausência) via RT-PCR convencional e a imunofluorescência com anticorpo primário monoclonal MHC de classe I ovino. Como controle positivo foi utilizado uma amostra de tecido de linfonodo e/ou baço bovino em todos os ensaios experimentais. A quantidade de transcrito de BoLA de classe I clássico e não clássico foi pequena (fold change variando de 0 a 3) nos blastocistos e cotilédones. Nos cotilédones a transcrição de BoLA-NC* foi maior do que a transcrição de BoLA-N*. Nos blastocistos houve maior transcrição de BoLA-N* do que de BoLA-NC*. BoLA-NC2 transcreveu mais nos blastocisto do que nos cotilédones. BoLA-NC4 não transcreveu nos blastocistos. Os cotilédones transcreveram mais BoLA-NC4 do que BoLA-NC2. As carúnculas apresentaram grandes quantidades de transcritos (fold change variando de 5 a 400), que foram maiores nos períodos gestacionais de 8 a 9 para BoLA_N* e até 1 mês para BoLA-NC*. A transcrição de BoLA-NC2 foi maior do que a de BoLA-NC4 nas carúncula. O útero não gestante teve menor quantidade de transcritos de BoLA-N* e BoLA-NC* do que nas carúnculas. Não há transcrição de BoLA-NC2 no útero não gestante, mas há uma pequena quantidade de transcritos de BoLA-NC4 neste tecido. A presença de grandes quantidades de transcritos (fold change variando de 50 a 500) de BoLA-NC2 nas carúnculas, com idade gestacional maior do que um mês, parece proteger o feto da rejeição. Nas carúnculas parece existir um pico de transcrição de TGF-&#946;1 no sexto e sétimo meses de gestação, justamente quando o feto tem seu maior crescimento, sinalizando um provável envolvimento desta citocina neste fenômeno. O TNF-&#945; surge em maior quantidade no final da gestação, tanto nas carúnculas quanto nos cotilédones, demonstrando o início de uma reação inflamatória, necessária para a adequada expulsão do concepto e da placenta durante o parto. / Doutor em Imunologia e Parasitologia Aplicadas

CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / FAPEMIG - Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de Minas Gerais / Muitos microorganismos desenvolveram a habilidade de adquirir ferro a partir do seu hospedeiro para seu próprio metabolismo. Toxoplasma gondii, um parasito intracelular obrigatório, produz proteinas de roptrias que são capazes de ligar ao transportador de ferro. Além disso, quelante de ferro foi capaz de controlar o parasitismo em células intestinais de rato. Logo, este trabalho teve como objetivo investigar a relação do efeito da adição ou privação de ferro na multiplicação de T. gondii e resultado da infecção quando o parasito é administrado por via oral e em cultura celular. Camundongos C57BL/6 foram infectados oralmente com T. gondii e tratados com um quelante de ferro, deferoxamina ou suplementados com ferro e o parasitismo, parâmetros imunológicos e histológicos foram analisados. Observou-se que a infecção aumentou a deposição de ferro no intestino delgado, pulmão e fígado e também sistematicamente. O tratamento com deferoxamina foi capaz de diminuir os níveis de ferro nas amostras de soro. O tratamento com deferoxamina diminuiu a carga parasitária no intestino delgado e alterações inflamatórias no órgão, preservando seu comprimento e também diminuiu o parasitismo pulmonar. Além disso, a suplementação com ferro aumentou a carga parasitária no intestino delgado, pulmão e fígado, associado com alterações inflamatórias nesses órgãos, bem como houve aumento da proliferação parasitária em cultivo celular com células Caco-2. A infecção oral modulou o perfil de expressão de marcadores de absorção de ferro, aumentando os níveis de IL-6 sistêmicos. Juntos, nossos resultados sugerem que a quelação de ferro comumente usada para tratar a sobrecarga de ferro pode ser um medicamento promissor para controlar a proliferação de T. gondii e consequentemente a inflamação causada por infecção e que o ferro é um nutriente essencial para o metabolismo de T. gondii. / Many microorganisms have developed the ability to acquire iron from their host to their own metabolism. Toxoplasma gondii, an obligate intracellular parasite, produces rhoptry proteins that are capable of binding to the iron transporter. In addition, iron chelator was able to control parasitism in rat intestinal cells. Therefore, the objective of this work was to investigate the relationship of the effect of iron addition or deprivation on the multiplication of T. gondii and the result of infection when the parasite is administered orally and in cell culture. C57BL/6 mice were orally infected with T. gondii and treated with an iron chelator, deferoxamine or iron supplemented and parasitism, immunological and histological parameters were analyzed. It was observed that the infection increased the deposition of iron in the small intestine, lung and liver and also systematically. Treatment with deferoxamine was able to decrease iron levels in the serum samples. Treatment with deferoxamine reduced parasite burden in the small intestine and inflammatory changes in the organ, preserving its length and also decreased pulmonary parasitism. In addition, iron supplementation increased parasite burden in the small intestine, lung and liver, associated with inflammatory changes in these organs, as well as increased parasite proliferation in cell culture with Caco-2 cells. Oral infection modulated the expression profile of iron absorption markers, increasing systemic IL-6 levels. Together, our results suggest that iron chelation commonly used to treat iron overload may be a promising drug to control T. gondii proliferation and consequently inflammation caused by infection and that iron is an essential nutrient for the metabolism of T. gondii. / Tese (Doutorado)

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The definitive diagnosis of strongyloidiasis is normally done by detection of larvae on faecal samples; however, the number of parasites is limited in most cases and the elimination of larvae is irregular. Thus, developing reliable serological methods for the diagnosis of strongyloidiasis becomes imperative. The aim of this study was to establish a coproantigen ,antigen, antibody and immune complex detection by enzyme-linked immunosorbent assay in serum and bronchoalveolar lavage fluid (BALF) samples of non immunosuppressed or immunosuppressed rats experimentally infected with Strongyloides venezuelensis. For kinetics of coproantigen detection (0 and 5, 8, 13 and 21 days post-infection (d.p.i)), we used an anti-L3 polyclonal antibody produced in rabbits. For antigen and immune complex detection in serum and BALF samples (0 and 2, 5, 8, 13 and 21d.p.i), the microtitre plates were coated with IgG anti-S. venezuelensis and with alkaline parasite extract for antibody detection. The statistical analysis were analyzed using Two Way ANOVA, followed by the Bonferroni test. The criterion for statistical significance was set at p<0,05. The number of eggs/g of faeces recovered at 8 d.p.i was significantly higher for non immunosuppressed and immunosuppressed animals (p<0.01). The coproantigen detection was significantly higher at 13° d.p.i in non immunosuppressed (p<0.05) and in immunosuppressed it was anticipated to the 5th d.p.i. It was observed that antigen detection in serum samples was not a good approache for evaluating the infection however in BALF samples it showed superior results. In immunosuppressed animals, IgG specific for S. venezuelensis was preferentially detected during the 5° and 13° d.p.i and in immunosuppressed animals, during the entire experimental kinetics. In BALF samples, antibodies detection was observed from the 8° to the 21° d.p.i in non immunosuppressed animals and in immunosuppressed animals it was anticipatedto the 2° d.p.i, with higher reactivity at 5° d.p.i (p<0.05). The immune complex detection in serum samples of the non immunosuppressed animals was observed from the 5° to the 13° d.p.i and in immunosuppressed animals, during the entire kinetics. In BALF samples, immune complex detection was higher in non immunosuppressed animals. In conclusion, coproantigen and immune complex detection in serum and BALF samples are alternatives for early strongyloidiasis diagnosis, mainly in immunocompromised cases. / O diagnóstico definitivo da estrongiloidíase normalmente é realizado mediante a detecção de larvas nas fezes; porém a quantidade de parasitos é limitada e a eliminação de larvas é reduzida e irregular. Sendo assim, o desenvolvimento de testes sorológicos confiáveis para o diagnóstico da estrongiloidíase torna-se uma alternativa necessária. O objetivo deste estudo foi demonstrar a cinética de detecção de coproantígenos e de antígenos, anticorpos e imunocomplexos circulantes em amostras de soro e de lavado bronco alveolar (LBA) de ratos imunossuprimidos e experimentalmente infectados por Strongyloides venezuelensis. Para a cinética (0 e 5, 8, 13 e 21 dias pós-infecção (d.p.i)) de coproantígenos utilizou-se anticorpo policlonal anti-L3 produzido em coelhos. Para a detecção de antígenos e de imunocomplexos em amostras de soro e de LBA (0 e 2, 5, 8, 13 e 21 d.p.i), placas de microtitulação foram sensibilizadas com IgG anti-S. venezuelensis e com extrato alcalino de larvas para a detecção de anticorpos. A análise estatística foi realizada por Two Way ANOVA, seguida pela teste de Bonferroni, considerando p<0,05 significativo. A cinética de eliminação de ovos/g de fezes mostrou que o pico ocorre no 8° d.p.i sendo significativamente maior nos animais imunossuprimidos (p<0,01). O pico de detecção de coproantígenos nos animais não imunossuprimidos foi no 13° d.p.i (p<0,05), sendo que nos animais imunossuprimidos a detecção foi antecipada para o 5° d.p.i. A detecção de antígeno em amostras de soro não foi uma boa ferramenta diagnóstica para avaliar a infecção enquanto que em amostras de LBA mostrou ser ferramenta auxiliar. A detecção de IgG específica para S. venezuelensis em amostras de soro de animais não imunossuprimidos foi preferencialmente durante o 5° e o 8° d.p.i. e em animais imunossuprimidos, durante toda a cinética experimental. Nas amostras de LBA, a detecção de anticorpos ocorreu do 8° ao 21° d.p.i em animais não imunossuprimidos e em animais imunossuprimidos, foi antecipada para o 2° d.p.i, como pico de reatividade no 5° d.p.i (p<0,05). A detecção de imunocomplexos em amostras de soro de animais não imunossuprimidos foi possível do 5° aos 13° d.p.i e em animais imunossuprimidos, durante toda a cinética. Em amostras de LBA, a detecção de imunocomplexo foi maior em animais não imunossuprimidos. Concluiu-se que a detecção de coproantígeno e de imunocomplexos circulantes em amostra de soro e em amostras de LBA são uma alternativa para o diagnóstico precoce da estrongiloidíase principalmente nos casos de imunossupressão. / Doutor em Imunologia e Parasitologia Aplicadas

Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de Minas Gerais / Several immunological mechanisms are responsible for the control of Toxoplasma gondii infection. The immune response occurs initially because of the participation of innate immune cells, in which macrophages play an important role. The existence of atypical strains of T. gondii with a genetic pattern different from clonal strains lead concern worldwide, principally because these strains cause severe symptoms especially in immunocompromised individuals and congenitally infected newborn. In this sense, we investigated the in vitro polarization of human macrophages to M1 or M2 profile after the infection with RH, ME49 clonal strains and TgChBrUD2 Brazilian strain. THP-1 cells were treated with PMA to induce their differentiation into macrophages. The cells were plated and infected with T. gondii tachyzoites from TgChBrUD2, RH or ME49 strains at a 2:1 (parasites: host cell) ratio or incubated only with medium (control uninfected cells). The supernatant was collected for cytokine analysis and measurement of nitrite. The macrophages were used for quantification of urea, evaluation of parasitism, analysis of morphology and surface markers. Our results showed an up-regulation of MIF during infection by TgChBrUD2, RH and ME49, and low levels of IL-10 compared to control. In addition, TgChBrUD2-infected macrophages show high levels of IL-6 production compared to non-infected macrophages and RH infection. Regarding secretion of nitrite, the infection by TgChBrUD2 exhibited high levels of nitrite compared to control and RH infection. The urea production showed a down-regulation in macrophages infected with TgChBrUD2 and ME49 in comparison to control. The analysis of morphology revealed that TgChBrUD2-infected macrophages induced the cells to change their morphology to spindle shaped. On the other hand, PCR analysis showed an increased amount of T. gondii DNA in RH-infected macrophages compared to infection with TgChBrUD2 and ME49. Thus, our results showed that RH strain produced an insuficient pro-inflamatory response that influenced the proliferation of parasite, in contrast, TgChBrUD2 and ME49 induced characteristic factors of polarization to M1 macrophages, in which the atypical strain showed high production of pro-inflamatory mediators that helped to countain the replication of this strain. / Vários mecanismos imunológicos são responsáveis pelo controle da infecção por Toxoplasma gondii. A resposta imune a este patógeno ocorre inicialmente pela participação de células da imunidade inata, na qual macrófagos têm papel importante. A existência de cepas atípicas de T. gondii com padrão genético diferente das clonais desperta grande preocupação mundial, uma vez que, geralmente, causam sintomas graves particularmente em indivíduos imunocomprometidos e naqueles infectados congenitamente. O objetivo deste estudo foi comparar, in vitro, a polarização de macrófagos humanos derivados da linhagem THP-1 para um perfil M1 ou M2 após infecção com as cepas clonais RH, ME49 e a cepa atípica TgChBrUD2. Células THP-1 foram tratadas com PMA para induzir sua diferenciação em macrófagos funcionais. Após a diferenciação, esses macrófagos foram plaqueados e infectados com as cepas TgChBrUD2, RH ou ME49 de T. gondii em diferentes abordagens experimentais. Como controle foram utilizados macrófagos não infectados. Os sobrenadantes de cultura de macrófagos nas diferentes condições experimentais foram coletados para análise de citocinas pelo teste ELISA e dosagem de nitrito pela reação de Griess. As células foram utilizadas para avaliação da morfologia, quantificação da ureia por espectrofotometria, dos marcadores expressos na superfície celular por citometria de fluxo e do parasitismo por PCR. Nossos resultados mostraram um aumento das citocinas MIF durante infecção pelas cepas TgChBrUD2, RH e ME49, bem como uma diminuição de IL-10 quando comparado aos macrófagos não infectados. Além disso, macrófagos infectados pela cepa atípica apresentaram altos níveis de secreção de IL-6 em relação ao controle. Em relação a produção de nitrito, apenas os macrófagos infectados por TgChBrUD2 apresentaram aumento em relação aos macrófagos controle e aos infectados por RH. A dosagem de ureia revelou uma redução da atividade de arginase na infecção por TgChBrUD2 e ME49 comparado aos macrófagos não infectados. A análise da morfologia celular mostrou que a infecção por TgChBrUD2 induziu os macrófagos a mudarem seu formato de circulares para fusiformes. Por outro lado, a análise de PCR mostrou que a cepa RH proliferou significativamente mais nos macrófagos em comparação com as cepas TgChBrUD2 e ME49. Desse modo, nossos resultados mostraram que a cepa RH induziu resposta pró-inflamatória insuficiente que influenciou na proliferação do parasito, por outro lado, TgChBrUD2 e ME49 induziram fatores característicos da polarização para macrófagos M1, de modo que a cepa atípica mostrou maior liberação de mediadores pró-inflamatórios que auxiliaram a conter a replicação desta cepa. / Mestre em Imunologia e Parasitologia Aplicadas

Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de Minas Gerais / The diagnosis of strongyloidiasis is difficult the irregular larval excretion and in most cases, individuals are asymptomatic; detection of latent cases of Strongyloides stercoralis in immunosuppressed may decrease morbidity and mortality. In this sense, the improvement of reliable diagnostic methods is essential. The objective of the study was to compare the release of eggs in the feces by the technique of Egg counts per gram of feces (EPG), coproantigens detection by ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) and amplification bands by conventional (Polymerase Chain Reaction) PCR from feces of non immunosuppressed and immunosuppressed mice experimentally infected with Strongyloides venezuelensis. In the experimental kinetic days 0 and 5, 8, 13, and 21 after infection p.i. were used. Comparing the EPG, coproantigens detection by ELISA and PCR, it was observed in the non immunosuppressed group the release of eggs from the EPG test day on 5 to day 13 p.i, being absent on day 21 p.i. Coproantigen positivity was observed in 33.3% 5 and 8 p.i. and 100% on days 13:21 p.i. and PCR, the presence of amplified bands was observed along the entire kinetics. In immunosuppressed animals, 100% of the released eggs in the feces, the data of the ELISA, 100% of the animals were evaluated in both positive and PCR, the presence of amplified bands during kinetics. It is concluded that detection of coproantigens by ELISA and PCR diagnosis could be useful tools for diagnosis of strongyloidiasis especially in cases of immunosuppression. / O diagnóstico da estrongiloidíase é difícil, pois, a excreção larval é irregular e na maioria dos casos, os indivíduos são assintomáticos; a detecção de casos latentes de Strongyloides stercoralis em imunossuprimidos pode diminuir a morbidade e mortalidade da infecção. Assim, o aprimoramento de métodos confiáveis de diagnóstico são imprescindíveis. O objetivo do estudo foi comparar a liberação de ovos nas fezes pela técnica de Contagem de Ovos por Grama de Fezes (OPG), a detecção de coproantígenos pelo ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) e amplificação de bandas pela Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) convencional de fezes de ratos não imunossuprimidos e imunossuprimidos e experimentalmente infectados por Strongyloides venezuelensis. Na cinética experimental foram utilizados os pontos 0 e 5, 8, 13 e 21 pós-infecção (d.p.i). Para o cálculo dos resultados foram utilizadas porcentagens simples e descrição dos resultados obtidos. Comparando-se o OPG, a detecção de coproantígenos pelo ELISA e a PCR, observou-se no grupo não imunossuprimido a liberação de ovos no teste OPG do dia 5 ao dia 13 p.i, sendo ausente no 21 d. p.i. Para a detecção de coproantígeno observou-se positividade de 33,3% no 5 e 8 d. p.i e de 100% no 13 e 21 d. p.i e na PCR, a presença de bandas amplificadas em todos os dias da cinética. Nos animais imunossuprimidos, 100% liberaram ovos nas fezes, no teste ELISA, 100% dos animais foram positivos e na PCR, a presença de bandas amplificadas em toda a cinética. Concluiu-se que a detecção de coproantígenos pelo ELISA e o diagnóstico por PCR podem ser ferramentas úteis para o diagnóstico em animais não imunossuprimidos e imunossuprimidos. Em comparação ao OPG, a detecção de coproantígenos pelo ELISA e amplificação de bandas pela PCR mostraram mais sensíveis nos dias analisados e podem ser métodos de escolha para diagnóstico da estrongiloidíase principalmente nos casos de imunossupressão. / Mestre em Imunologia e Parasitologia Aplicadas

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Rickettsiosis is a human disease caused by bacteria of the genus Rickettsia, and its main vector ticks (Ixodidae), which are also considered reservoirs of the Spotted Fever Group rickettsiae in Brazil. Small mammals are frequent hosts for immature stages of rickettsial diseases vector ticks, and it is known that some species of small mammals are hosts amplifiers for Rickettsia sp..The aim of this study was to determine seropositivity against five species of Rickettsia and tick fauna of small mammals captured in periurban region of Uberlândia, MG, Brazil. For this purpose, 416 small mammals representing 13 species of wild rodents and marsupials were captured between the months of July 2011 to August 2012. Of these, 48 were infested with ticks of the genus Amblyomma and Ixodes, and 70 (16.8%) of the animals were seropositive for Rickettsia spp.. Our results indicate the circulation of four species of Rickettsia, R. rickettsii, R. parkeri, R. rhipicephali and R. bellii, in the periurban area of Uberlândia. The first two Rickettsia species are considered pathogenic to man and thus a more thorough investigation to confirm the species of bacteria and epidemiological aspects related to these Rickettsia spp. is the detection locations. / Riquetsiose é uma doença causada em humanos por bactérias do gênero Rickettsia, e tem como principais vetores os carrapatos, que são considerados também reservatórios de riquétsias do grupo da febre maculosa no Brasil. Frequentemente os estágios imaturos de carrapatos vetores de riquetsioses têm pequenos mamíferos como hospedeiros, e sabe-se que algumas espécies de pequenos mamíferos são hospedeiros amplificadores para Rickettsia sp.. O objetivo deste trabalho foi determinar a sororreatividade contra cinco espécies de riquétsias e a fauna de carrapatos de pequenos mamíferos na região periurbana de Uberlândia, MG, Brasil. Foram capturados, entre julho de 2011 a agosto de 2012, 416 animais representando 13 espécies de roedores silvestres e marsupiais. Destes, 48 estavam infestados com carrapatos dos gêneros Amblyomma e Ixodes, e 70 (16,8%) dos animais foram soropositivos para Rickettsia spp.. Nossos resultados indicam a circulação de quatro espécies de riquétsias, R. rickettsii, R. parkeri, R. rhipicephali e R. bellii, próximo à área urbana do município de Uberlândia. As duas primeiras espécies são consideradas patogênicas ao homem, evidenciando a necessidade de se realizar uma investigação mais minuciosa tanto para a confirmação das espécies de bactérias circulantes, quanto para a compreensão do ambiente que mantém as riquétsias nos locais de detecção. / Mestre em Imunologia e Parasitologia Aplicadas

Handwashing frequency may result in harmful effects on the skin, promoting the increase of the prevalence of nosocomial important microorganisms. This study purpose was to assess the quantitative and qualitative changes of the total microbiota (both permanent and transient) from hands of nursing professionals and university laboratory technicians and students due to the irritant action provoked by frequent washing and/or wearing gloves. Sixty health professionals were enrolled from whom collections were performed by the sterile polyethylene bag, before and after washing hands with 3 mL of nonantimicrobial soap for 30 seconds. In the group formed by students and laboratory technicians (n=30), these collections were performed before and after consecutive washings with water and soap. Damaged hands health professionals hands contamination was higher when compared with healthy hands. Hygiene proved to be efficient in both students and laboratory technicians without complaints of irritation after successive washings, a fact not seen among health care workers. Nurses with damaged hands presented higher frequency of S. aureus, Gram negative bacteria and yeast than the healthy ones (P>0.05), as well as the sum of these microorganisms (P=0.07) and presence of S. haemolyticus (P=0.02). The frequency of S. aureus and antimicrobial resistant Gram negative bacteria was higher among nurses damaged hands. The irritation caused on the skin by the frequent washing and/or wearing of gloves may cause changes of hands microbiota and should be considered when choosing hygiene products. / A freqüência da lavagem de mãos pode resultar em efeitos prejudiciais na pele promovendo aumento da prevalência de microrganismos de importância hospitalar. Os objetivos deste trabalho foram avaliar quantitativa e qualitativamente as alterações na microbiota total (residente e transitória) das mãos de profissionais de enfermagem e estudantes universitários e técnicos de laboratório associadas à ação irritante provocada pela freqüente lavagem e/ou uso de luvas. Foram incluídos 60 profissionais de saúde, nos quais foram realizadas coletas, pelo método do saco estéril de polietileno, antes e após a lavagem com 3 mL de sabão não medicamentoso, por 30 segundos. No grupo constituído por estudantes e técnicos de laboratório (n=30), estas coletas foram realizadas antes e após lavagens consecutivas com água e sabão. A contaminação das mãos de profissionais de saúde com danos na pele foi maior em relação às sadias. A higiene se mostrou eficiente nos estudantes e técnicos de laboratório sem queixas de irritação após lavagens sucessivas, fato não observado entre profissionais de saúde. Enfermeiras com mãos com danos apresentaram maior freqüência de S. aureus, bacilos Gram-negativos e fungos leveduriformes do que as sadias (P>0,05), assim como quanto à soma destes microrganismos (P=0,07) e a presença de S. haemolyticus (P=0,02). A freqüência de S. aureus e bacilos Gram-negativos resistentes aos antibióticos foi maior nas mãos lesadas de enfermeiras. A irritação causada na pele devido à lavagem freqüente e/ou uso de luvas pode provocar alterações da microbiota das mãos e deve ser considerada pelas instituições quando da escolha de produtos de higiene. / Mestre em Imunologia e Parasitologia Aplicadas

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The incidence of infections caused by multidrug-resistant Pseudomonas aeruginosa producing metallo-&#946;-lactamase is increasing, especially in critically ill patients. The objective of this study was to evaluate the incidence of ventilator associated-pneumonia (VAP) caused by P.aeruginosa producing metallo-&#946;-lactamase (MBL-PA) or non-MBL-PA in patients admitted at a adult intensive care unit (ICU) of a Uberlândia Federal University Hospital Clinic, looking epidemiologic and molecular aspects. A cohort study was performed including 93 patients with VAP caused by P.aeruginosa from January/2004 to November/2006. The collection of the tract respiratory superior secretions was made by the swab-rinse sampling method and of the endotracheal aspirate when for suspicion of VAP. In total, 40 (43%) patients had VAP by MBL-PA and 53 (57%) by non-MBL-PA. The study was approved by the Ethical Committee of the University. The results of univariate analysis of risk factors for MBL-PA VAP showed that the ASIS score, clinical condition in admission, prior hospitalization, prolonged stay in the ICU, prolonged time of mechanical ventilation, exposure of carbapenems, fluorquinolones and use of three or more antibiotics were risk factors for VAP by MBL-PA. After logistic regression the following risk factors continued significant: prior hospitalization and prolonged time of mechanical ventilation. Additionally, the mortality was also independently associated with MBL-PA VAP. During the study period we identified 40 (43%) isolates of P.aeruginosa presumptive MBL producers according to the disk approximation tests and of the 59% of the AmpC phenotype. Resistance to &#946;-lactam and non-&#946;-lactam agents was significantly higher among MBL-PA isolates with the 82,5% of this multidrug-resistant. Only 18,8% (3/16) of MBLproducing strains were positive for the blaSPM-1 gene. To determine the genomic diversity of P.aeruginosa multidrug-resistant 20 isolates were analysed by macrorestriction profile analysis following PFGE. That showed of polyclonal Pseudomonas aeruginosa (16 genotypes). Altogether the detection of horizontal dissemination was observed in three patients (Clone A), two (Genotype C) and more two patients (Genotype E). The two epidemic MBL-PA isolates from the outbreak in 2003 presented macrorestriction profiles different from the endemic MBL-PA. The presence of MBL-PA in our unit indicates problems in nosocomial infection control practice, likely associated with low adherence to hand hygiene and especially in the abusive use of antibiotics. / A incidência de infecções causadas por Pseudomonas aeruginosa multiresistente produtora de metalo-&#946;-lactamase está aumentando mundialmente, especialmente em pacientes críticos. O objetivo deste estudo foi determinar a incidência de pneumonia associada à ventilação mecânica (PAV) por Pseudomonas aeruginosa produtora ou não de metalo-&#946;- lactamases em pacientes internados na Unidade de Terapia Intensiva (UTI) de adultos do Hospital de Clínicas da Universidade Federal de Uberlândia (HC-UFU), caracterizando aspectos epidemiológicos, dentre os quais fatores de risco dos pacientes, e moleculares das amostras. Foi realizado um estudo de coorte incluindo 93 pacientes com PAV por Pseudomonas aeruginosa no período de janeiro/2004 a novembro/2006. Foram realizadas coletas de secreção de orofaringe das primeiras 48 horas de internação, depois em quatro dias, e a seguir semanalmente, e de aspirado endotraqueal quando da indicação clínica da pneumonia. No estudo epidemiológico, 40 (43 %) pacientes tiveram PAV por P.aeruginosa produtora de metalo-&#946;-lactamase (PA-MBL) e 53 (57 %) PAV por não-PAMBL, com os seguintes fatores de risco significativos (p&#8804;0,05) associados com PAV por PA-MBL: escore ASIS, diagnóstico clínico na admissão, hospitalização prévia, estada prolongada na UTI, uso prolongado de ventilação mecânica (VM), uso de carbapenemas, fluorquinolonas e de três ou mais antibióticos, na análise univariada; e, confirmados como independentes por análise multivariada apenas hospitalização prévia e tempo mais longo de VM. Adicionalmente, a taxa de mortalidade foi significantemente maior no grupo de PAV por PA-MBL, tanto na análise univariada quanto na regressão logística. Quarenta (43 %) amostras de P.aeruginosa foram identificadas como produtoras de MBL pelo teste fenotípico de sinergismo com duplo-disco e a maioria (59 %) comportou-se como do fenótipo AmpC. A resistência aos agentes &#946;-lactâmicos assim como aos demais antibióticos foi significantemente maior entre as amostras de PA-MBL, detectando-se a presença de multiresistência na maioria (82,5%) daquelas MBL positivas. O gene blaSPM-1 foi detectado em apenas três (18,8%) das 16 amostras do fenótipo MBL testadas. O estudo de epidemiologia molecular através da técnica de PFGE revelou a ocorrência de uma policlonalidade (16 genótipos em 20 amostras), com evidência de transmissão cruzada em três pacientes (clone A), dois (genótipo C) e outros dois pacientes (genótipo E) e de similaridade entre amostras recuperadas de dois pacientes colonizados e posteriormente infectados. As duas amostras associadas ao surto responsável pela emergência das PAMBL em nosso hospital, diferiram das amostras de PA-MBL recuperadas em condições endêmicas no nosso estudo. A presença destas amostras representa uma grave ameaça aos pacientes, exigindo uma revisão quanto a uma política do uso mais racional de antibióticos e na implementação de programas de controle e prevenção de infecções hospitalares mais efetivos. / Doutor em Imunologia e Parasitologia Aplicadas

Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de Minas Gerais / Neospora caninum is an intracellular parasite that has the dog as its definitive host and other mammals, especially cattle, as intermediate hosts. Economically, neosporosis is an important disease in Veterinary medicine due to the induction of relevant clinical signs, as abortions in cattle and neuromuscular paralysis in dogs. The aim of this study was to evaluate the role of the TLR adaptor protein TRIF in the resistance against N. caninum infection. For this, in vitro experiments with bone marrow derived macrophages (BMDMs) from C57BL/6 wild-type (WT) and TRIF knockout (TRIF-/-) mice, stimulated by tachyzoites and in vivo infections, were performed in order to investigate the production of cytokines and antibodies, cellular and tissue parasitism, histological changes during different phases of infection and survival analysis. We observed that TRIF-/- BMDMs presented notable defects in inflammatory cytokine production in relation to WT macrophages. Additionally, we found that the concentration of NO, IL-12p40, IFN-y and TNF were decreased in peritoneal fluids and lungs of TRIF-/- mice, while IL-2, IFN-γ, TNF and IL-17 were reduced in sera of these animals compared to WT mice. Higher parasite burden was observed in peritoneal cells, lungs and brain during the acute and chronic phases of infection, which were associated with inflammatory changes in the analyzed tissues, while TRIF-/- mice survival rate decreased 2-fold compared to WT. In conclusion, our results show that TRIF is required for resistance against the infection induced by N. caninum, regulating the production of key Th1 cytokines and participating in the control of the tissue parasitism and inflammatory lesions induced against the parasite. / Neospora caninum é um parasito intracelular que tem como hospedeiro definitivo o cão e outros mamíferos, especialmente bovinos, como hospedeiros intermediários. Economicamente, a neosporose é uma doença de grande importância na medicina veterinária por induzir relevantes sinais clínicos, como abortos em bovinos e paralisia neuromuscular em cães. O objetivo deste estudo foi avaliar o papel da molécula adaptadora TRIF da via de sinalização dos TLRs na resistência contra a infecção por N. caninum. Para isso, experimentos in vitro com macrófagos derivados de medula óssea (BMDMs) obtidos de camundongos do tipo selvagem (WT) e TRIF knockout (TRIF-/-) estimulados com taquizoítos e infecções in vivo foram realizadas a fim de se investigar a produção de citocinas e anticorpos, parasitismo celular e tecidual, alterações histológicas durante diferentes fases da infecção e análise de sobrevida. Nós observamos que BMDMs TRIF-/- apresentaram reduções significativas na produção de citocinas inflamatórias em relação a macrófagos WT. Adicionalmente, foi visto que as concentrações de NO, IL-12p40, IFN- e TNF foram diminuídas no lavado peritoneal e nos pulmões de camundongos TRIF-/-, enquanto que IL-2, IFN-γ, TNF e IL-17 foram reduzidas no soro desses animais em comparação aos WT. Alta carga parasitária foi encontrada nas células peritoneais, pulmões e cérebro durante as fases aguda e crônica da infecção, associada com alterações teciduais inflamatórias significativas nos pulmões. Além disso, camundongos TRIF-/- tiveram uma taxa de sobrevida 2 vezes menor quando comparada aos animais WT. Concluindo, nossos resultados mostram que TRIF é requerido para a resistência contra a infecção induzida por N. caninum, regulando a produção de citocinas chave do perfil Th1 de resposta imune e participando no controle do parasitismo tecidual e das lesões inflamatórias oriundas desta infecção. / Mestre em Imunologia e Parasitologia Aplicadas