Submitted by Ana Maria Fiscina Sampaio (fiscina@bahia.fiocruz.br) on 2012-06-25T20:55:47Z No. of bitstreams: 1 Cristiane Garboggini Pinheiro Avaliação da resposta imune em camnundongos....pdf: 3469982 bytes, checksum: 4041d40a1d0e55867e25c7be92f3dd02 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-06-25T20:55:47Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Cristiane Garboggini Pinheiro Avaliação da resposta imune em camnundongos....pdf: 3469982 bytes, checksum: 4041d40a1d0e55867e25c7be92f3dd02 (MD5) Previous issue date: 2011 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisas Gonçalo Moniz. Salvador, Bahia, Brasil / A leishmaniose visceral é uma doença parasitária causada por Leishmania chagasi. Os cães são considerados como principais reservatórios do parasito. Uma vacina efetiva para o cão pode contribuir para o controle da LV tanto no homem como no cão. Em um estudo prévio, antígenos recombinantes, obtidos a partir de uma biblioteca de cDNA da forma amastigota de Leishmania chagasi, foram selecionados a fim de serem avaliados como candidatos a componente de uma vacina contra leishmaniose visceral canina. No presente trabalho, a resposta imune humoral e celular de camundongos foi avaliada após injeção de alguns desses antígenos recombinantes, em cinco diferentes protocolos de imunização. Grupos de camundongos BALB/c foram injetados com as proteínas rLci4A-NH6 ou rLci2B-NH6, isoladamente ou associadas aos adjuvantes saponina, ODN 1826 ou diferentes doses de um plasmídeo codificando IL-12 murina. Além disso, animais foram sensibilizados com plasmídeo codificando Lci2B e receberam reforço com a proteína rLci2B-NH6 associada à saponina. Por último, os animais foram injetados com plasmídeos codificando novos antígenos, Lci2-NT-5R-CT ou Lci2-NT-CT, e recebram reforço com as respectivas proteínas recombinantes rLci2-NT-5R-CT-NH6 ou rLci2-NT-CT-NH6 associadas à saponina. Nesse último protocolo, os plasmídeos utilizados continham o gene para uma proteína transmembrana associada a lisossomos, LAMP, visando à produção in vivo de quimeras de dos antígenos de Leishmania com LAMP, a fim de direcionar a apresentação dos peptídeos para linfócitos T CD4+ via moléculas de MHC-II. Em um dos protocolos, os animais foram desafiados com 1 x 107 Leishmanias para avaliação da carga parasitária no baço após imunização. Os resultados encontrados mostraram que animais que receberam rLci4A-NH6, isoladamente ou com diferentes doses de plasmídeo codificando IL-12, apresentaram níveis signficantes de IgG e IgG1, ao passo que o uso do antígeno com os adjuvantes saponina ou ODN 1826 induziu a produção de IgG, IgG2a e IgG1, além de produção de IL-5 pelo grupo que recebeu saponina. Animais que receberam rLci2B-NH6, isoladamente ou associado aos plasmídeos contendo inserto de IL-12, produziram IgG e IgG1 antígeno específicos e falharam também na produção de citocinas e proliferação celular. A utilização de saponina com esse antígeno induziu produção de IgG, IgG2a e IgG1, assim como de IFN-γ. Já o uso de ODN 1826, induziu a produção de IgG e IgG1, favoreceu a produção de IgG2a, mas falhou na indução de resposta imune celular significante. Por outro lado, animais que receberam plasmídeo codificando Lci2B e reforço com a proteína associada à saponina apresentaram uma resposta imune com predominância de anticorpos IgG2a e produção de IFN-γ por alguns animais, a qual não conferiu proteção contra infecção pelo parasito. Por fim, a utilização de quimeras de LAMP/Lci2-NT-5R-CT ou LAMP/Lci2-5R-CT induziu uma fraca resposta imune humoral, com produção de IgG, IgG1 e IgG2a por alguns animais. No entanto, a utilização da quimera LAMP/Lci2-NT-CT induziu proliferação celular e tendência a produção de IFN-γ. Em conclusão, nenhum dos cinco protocolos utilizados foi capaz de induzir uma resposta imune específica predominantemente celular do tipo Th1 ou capaz de conferir proteção contra infecção dos animais. / Visceral leishmaniasis is a disease caused by Leishmania chagasi. Dogs are the main reservoir of the parasite. A canine vaccine may contribute to the desease control in humans and dogs. In a previous study, recombinant antigens were selected from a cDNA library of Leishmania chagasi amastigotes in order to be evaluated as components of a vaccine against canine visceral leishmaniasis. In this study, five immunization protocols were assessed in mice with some of these antigens. BALB/c mice were injected with either rLci4A-NH6 or rLci2B-NH6 proteins, associated or not with the adjuvants saponin, ODN 1826 and different doses of a plasmid encoding murine IL-12 (pIL-12). Moreover, animals were primed with a plasmid encoding Lci2B (pLci2B) and boosted with rLci2B combined with saponin. Finally, all mice were primed with new antigens, Lci2-NT-5R-CT or Lci2-NT-CT, and they were boosted with the following recombinant proteins rLci2-NT-5R-CT-NH6 or rLci2-NT-CTNH6 associated with saponin. In this late experiment, the used plasmids had an insert of a lisossome associated membrane protein, LAMP, to produce in vivo chimeras composed of LAMP with the antigens and to direct the presentation of the peptides to CD4+ T cell through MHC-II molecules. The humoral immune response was assessed by antibodies production (IgG, IgG1 and IgG2a) in animal serum samples and the cellular immune response by cellular proliferation and cytokine production (IFN-γ and IL-5). The results showed that animals that were injected with rLci4A-NH6 alone or combined with pIL-12 generated IgG and IgG1 specific antibodies, while others that received saponin and ODN 1826 as adjuvants produced IgG, IgG2a and IgG1. Furthermore, IL-5 was detected in rLci4A-NH6/saponin group, but only in one of two experiments. Animals that were injected with rLci2B-NH6, alone or associated with pIL-12, presented IgG and IgG1 antibodies but no cellular immune response. The saponin used as adjuvant induced IgG, IgG2a and IgG1 antibodies, as well as IFN-γ. The use of ODN 1826 induced IgG and IgG1, and favored IgG2a production, but failed in inducing IFN-γ. On the other hand, animals that were primed with pLci2B and boosted with the protein associated with saponin produced IgG IgG1 and more intensively IgG2a, and only some animals produced IFN-γ. Nevertheless, such immune response did not protect the animals against the parasite infection. At last, LAMP/Lci2-NT-5R-CT or LAMP/Lci2-5R-CT chimeras induced a weak humoral immune response, in which IgG, IgG1 and IgG2a antibodies were detected in only a few animals. However, mice that were injected with LAMP/Lci2-NT-CT presented cellular proliferation and some animals produced IFN-γ. In conclusion, in spite of the fact that the antigens are immunogenic in a murine model, none of the used protocols elicited an intense Th1 cellular immune response or a protective one.

Submitted by Nuzia Santos (nuzia@cpqrr.fiocruz.br) on 2013-01-15T17:01:51Z No. of bitstreams: 1 Dissertacao_Izabela Coimbra Ibraim.pdf: 3600819 bytes, checksum: 7dc73c7a016be4f2bdca2b741e85a75e (MD5) / Made available in DSpace on 2013-01-15T17:01:51Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertacao_Izabela Coimbra Ibraim.pdf: 3600819 bytes, checksum: 7dc73c7a016be4f2bdca2b741e85a75e (MD5) Previous issue date: 2012 / O LPG apresenta variações estruturais que são importantes para os diferentes estágios de desenvolvimento do parasito. Nas formas procíclicas, o LPG de L. braziliensis (cepa M2903), não apresenta cadeias laterais enquanto um a dois resíduos de β-glicose podem aparecer nas unidades repetitivas da forma metacíclica. O LPG de L. infantum (cepa BH46), apresenta até três cadeias laterais de glicoses nas unidades repetitivas da forma procíclica e ainda não foi caracterizado nas formas metacíclicas. Esses polimorfismos nas unidades repetitivas do LPG e seu papel na interação com o hospedeiro vertebrado e invertebrado já foram amplamente estudados, sobretudo, para as espécies do Velho Mundo. Entretanto, para a maioria das espécies do Novo Mundo, o papel desses polimorfismos no perfil imunopatológico da doença é ainda desconhecido. Este projeto teve como objetivo avaliar o estudo da interação entre os LPGs de duas espécies epidemiologicamente importantes no Brasil e macrófagos murinos. Estas incluem L. braziliensis e L. infantum, responsáveis pela forma cutânea e visceral, respectivamente. Neste estudo, os macrófagos peritoneais de camundongos BALB/c, C57BL/6 e C57BL/6 knock-out (TLR2 -/- e TLR4 -/-), foram primados com IFN- e estimulados com LPG de ambas as espécies. A produção de citocinas (IL-1β, IL-2; IL-4, IL-6, IL-10, IL-12p40, IFN- e TNF-α) foi determinada por citometria de fluxo e a concentração de nitrito pelo método de Griess. A ativação de ERK e p38 foi avaliada por Western blot. Os macrófagos estimulados com LPG de L. braziliensis, apresentaram uma maior produção de TNF-α, IL-1β, IL-6 e NO em comparação aos estimulados com LPG de L. infantum. Também foi observada uma cinética de ativação diferencial das MAPK entre os LPGs. Leishmania infantum apresentou uma ativação constante até 45 minutos após estimulação, enquanto L. braziliensis apresentou um único pico de ativação após 15 minutos. Estes dados sugerem que variações interespecíficas no LPG de Leishmania podem ter um papel importante nos eventos iniciais do compartimento imune inato do hospedeiro. / The structural variations observed on LPG are important for the different parasite developmental stages. The procyclic form of L. braziliensis LPG (strain M2903), is devoid of side chains, while one to two β-glucose side chains are added in the repeat units of the metacyclic LPG. The L. infantum LPG has with up to 3 glucoses residues in the repeat units in the procyclic parasites, while those structures are not known in the metacyclic stage. Those polymorphisms in the composition and sequence of the sugars branching off the repeat units of the LPG have been assessed in the interaction with vertebrate and invertebrate hosts, especially for the Old World Leishmania species. However, for most of New World species of Leishmania, the role of those polymorphisms in the mmunopathology of the disease is still unknown. This study aimed to evaluate the interaction between the LPGs of two epidemiologically important Brazilian species and murine macrophages. Those include L. braziliensis and L. infantum, causative agents of cutaneous and visceral leishmaniasis, respectivelly. Mice peritoneal macrophages from BALB/c, C57BL/6, and C57BL/6 knock-out (TLR2 -/- e TLR4 -/-) lineages were primed with IFN- and stimulated with LPG from both species. Cytokine production (IL-1β, IL-2; IL-4, IL-6, IL-10, IL-12p40, IFN- and TNF-α) and nitrite concentration were determined by flow cytometry and Griess reaction, respectivelly. Western blot was performed to evaluate the activation of the MAPKs ERK and p38. Macrophages stimulated with L. braziliensis LPG, had a higher TNF-α, IL-1β, IL-6 e NO production than those stimulated with L. infantum’s. A different MAPK activation kinetics between the two species was detected. Leishmania infantum LPG exhibited a gradual activation profile until 45 min after stimulation, whereas L. braziliensis LPG showed an activation peak at 15 min. These data suggest that interpecies variations in Leishmania LPG may have an important role during initial steps of infection in the host’s innate imune system.

Submitted by Nuzia Santos (nuzia@cpqrr.fiocruz.br) on 2013-05-24T13:07:02Z No. of bitstreams: 1 Dissertação Bruno Nascimento.pdf: 2690979 bytes, checksum: 8895b1e7cb440d8618cfcad07cc3cb46 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-05-24T13:07:03Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertação Bruno Nascimento.pdf: 2690979 bytes, checksum: 8895b1e7cb440d8618cfcad07cc3cb46 (MD5) Previous issue date: 2013 / A transmissão das espécies de Leishmania aos hospedeiros vertebrados envolve várias espécies de flebotomíneos no Brasil. Um estudo sobre a composição da fauna de flebotomíneos foi realizado no município de Divinópolis, Minas Gerais, Brasil, área endêmica para leishmaniose tegumentar (LT), e de transmissão moderada para leishmaniose visceral (LV). Foram realizadas coletas sistematizadas mensais para captura de flebotomíneos durante um ano, de setembro de 2010 a agosto de 2011, com armadilhas luminosas HP instaladas em área urbana, em 15 peridomicílios de casas onde se registrou pelo menos um caso de LT ou LV, e em 5 fragmentos de mata. Também foram realizadas coletas não sistematizadas utilizando armadilhas de Shannon nos fragmentos de mata. A detecção de DNA de Leishmania sp. nos espécimes de flebotomíneos foi realizada por meio da Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) e para a identificação da amostra positiva foi utilizada a técnica de sequenciamento genético de fragmentos de DNA. Um total de 1.088 espécimes de flebotomíneos foram coletados pertencentes ao gênero Brumptomyia e Lutzomyia, e 18 espécies. Lutzomyia longipalpis, o principal vetor da Leishmania infatum no Brasil, foi a espécie mais freqüente, sendo encontrada em 14 das 20 localidades. As espécies Lu. longipalpis e Lu. whitmani foram as únicas coletadas em todos os meses de estudo. Nenhuma das espécies foi encontrada em todas as localidades de estudo. As cinco espécies mais frequentes foram: Lu. longipalpis (76,9%), Lu. lenti (8,3%), Lu. whitmani (5,0%), Lu. sallesi (2,8%) e Lu. aragaoi (2,2%). Não foi observada correlação estatisticamente significativa entre densidade total de flebotomíneos e variáveis climáticas durante o período de estudo. As análises moleculares detectaram DNA de Leishmania infantum em um exemplar de Lu. longipalpis. Os dados apontam para a necessidade de medidas de controle da população de flebotomíneos no município de Divinópolis e adoção de estratégias de vigilância entomológica. / The transmission of Leishmania species to vertebrate hosts involves several species of sand flies in Brazil. A study of the sand flies fauna composition was carried out in the city of Divinópolis, Minas Gerais state, Brazil, an endemic area for cutaneous leishmaniasis (CL), and of moderated transmission of visceral leishmaniasis (VL). Monthly systematic collections were made during one year, from September 2010 to August 2011. The HP light traps were installed inperidomicile of 15 houses where at least one case of CL or VL has been recorded and in five forested areas. Systematized collections were carried out using Shannon traps. The detection of DNA of Leishmania sp. in the sand fly specimens was performed by Polymerase Chain Reaction (PCR) and the technique for identification of positive samples genetic sequencing of DNA fragments technique. A total of 1,088 specimens of sand flies were collected, belonging to the genera Brumptomyia e Lutzomyia and 18 species. Lutzomyia longipalpis, the main vector of Leishmania infatum in Brazil, was the most frequent species, being collected in 14 of the 20 locations. The species Lu. longipalpis and Lu. whitmani were the only ones collected in every month studied. None of the collected species were found in all localities sampled. The five most abundant species were: Lu. longipalpis (76.9%), Lu. lenti (8.3%), Lu. whitmani (5.0%), Lu. sallesi (2.8%) and Lu. aragaoi (2.2%). No significant statistical correlation between the total sand fly density and the climatic variables was found. Molecular analysis identified natural infection by Leishmania infantum in one specimen of Lu. longipalpis. The data points to for measures to control the sand fly populations and adoption of strategies for entomological surveillance in Divinópolis municipality.

Made available in DSpace on 2014-07-22T17:02:52Z (GMT). No. of bitstreams: 4 license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) 68700.pdf: 2578722 bytes, checksum: 8c5310d6fb306ce43d34892517750ffc (MD5) 68700.pdf.txt: 211841 bytes, checksum: cb3a25da2d45d4cf6b421b83c876f820 (MD5) 68700.pdf.jpg: 1263 bytes, checksum: 09883dde54f8c4065ee9c8c3e8f0cb35 (MD5) Previous issue date: 2013-11-21 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, Brasil / A leishmaniose visceral (LV) é causada no Brasil pela Leishmania (Leishmania) infantum. A fase ativa da LV é caracterizada por uma imunossupressão parasito-específica acompanhada de baixos níveis de células T CD4+. Apesar disso, uma intensa ativação celular e resposta pró-inflamatória são observadas. Em outras doenças deficientes de célula T, tais como o HIV-1/AIDS, o lipopolissacarídeo (LPS), provavelmente oriundos da translocação microbiana são um componente crucial na ativação imune. Resultados recentes do nosso grupo mostraram que o LPS, juntamente com os antígenos parasitários, estão envolvidos na ativação das células T e na produção de citocinas pró-inflamatórias nos pacientes com LV. Nesse contexto, o objetivo do trabalho foi avaliar os níveis plasmáticos de LPS na LV experimental, assim como a influência do tratamento específico anti-Leishmania e/ou o tratamento com antibiótico para bactérias Gram-negativas na evolução clínica desses animais e nos níveis do LPS plasmático. Além disso, avaliou-se a ocorrência da ativação celular e o desenvolvimento da resposta humoral ao longo do acompanhamento e dos diferentes tratamentos. Para isso, foram utilizados 117 golden hamsters (Mesocricetus auratus), que foram divididos em oito grupos: sem infecção (G1), infectado com L. infantum (G2), infectado e tratado com o antimonial pentavalente e/ou com o antibiótico amicacina (G3, G4 e G5, respectivamente). Três grupos sem infecção tratados com os fármacos propostos também foram incluídos (G6, G7 e G8) Na avaliação clínica realizou-se a pesagem dos animais, bem como do fígado e do baço. Os aspectos físicos dos animais infectados e as alterações macroscópicas do intestino delgado também foram avaliados. A carga parasitária esplênica também foi quantificada pelo imprint. Os níveis plasmáticos do LPS foram avaliados através de um kit comercial. As dosagens do anticorpo IgG total anti- Leishmania foram realizada no soro dos animais pela técnica de ELISA. A avaliação do grau de comprometimento do sistema imune dos hamsters foi feita através da quantificação do percentual de células T CD4+ e o grau de ativação celular pela molécula CD25, através da citometria de fluxo. Os hamsters com LV apresentaram parâmetros laboratoriais e imunológicos similares aos da LV humana, exceto pela ausência de sinais clínicos visíveis característicos dessa infecção. Os animais apresentaram um aumento de peso progressivo ao longo dos 101 dias pós-infecção (dpi), mas este foi condizente com seu crescimento e idade. Os tratamentos propostos não influenciaram no peso dos animais avaliados. O fígado e o baço dos hamsters apresentaram também um aumento de peso condizente com seu crescimento, entretanto foram observadas alterações macroscópicas em momentos tardios da infecção pelo parasito, que coincidiram com o aumento da carga parasitária esplênica desses animais. O intestino delgado dos animais infectados mostraram-se mais friáveis à manipulação e observou-se uma diminuição significativa do número de placas de Peyer em toda sua superfície quando comparados ao grupo não-infectado Elevados níveis de LPS plasmático foram observados nos animais infectados a partir de 15 dpi, como já foi descrito na LV humana. Uma intensa ativação celular foi observada nos animais infectados, tanto através da molécula CD25 nos linfócitos T CD4+ quanto pelos níveis de anticorpos IgG total anti-Leishmania, ambos aumentaram com o tempo de infecção. Os níveis de LPS se correlacionaram positivamente com a ativação das células T quando todos os animais infectados tratados ou não foram avaliados, sugerindo que o LPS pode contribuir para a ativação já descrita na LV humana. De modo geral, verificou-se nesse trabalho que o tratamento concomitante com o antimonial pentavalente e o antibiótico amicacina foram benéficos em diversos aspectos, como na recuperação do aspecto acroscópico dos órgãos, na diminuição da carga parasitária esplênica e imunológica (redução dos níveis de ativação) nos hamsters com LV, inferindo um possível sinergismo terapêutico entre esses fármacos. Esses resultados permitem sugerir a elegibilidade dessa estratégia terapêutica para o tratamento da LV humana / Visceral leishmaniasis (VL) is caused in Brazil by Leishmania (Leishmania) infantum. The active phase of VL is characterized by parasite-specific immunosuppression along with low levels of CD4+T cells. Despite this, an intense cellular activation and pro-inflammatory cytokine response is observed. In other T-cell deficient diseases such as HIV-1/AIDS, the lipopolisaccharide (LPS) probably from gut microbial translocation has a crucial role on immune activation. Our recent results showed that LPS along with parasite antigens are implicated in T-cell activation and pro-inflammatory cytokines in VL patients. In this context, our aim was to evaluate whether plasma LPS levels were increased in experimental VL and the influence of the specific treatment anti-Leishmania and/or the treatment with gram-negative antimicrobial in the clinical evolution of this animals and in the LPS levels. Also, we investigated the occurrence of the cellular activation and the development the humoral response during the follow up and under the different treatments. For this, 117 golden hamsters (Mesocricetus auratus) were divided into eight groups: without infection (G1), infected with L. infantum (G2), infected and treated with anti-leishmanial therapy (antimonial) and/or with antibiotic amikacin (G3, G4 and G5, respectively). Three groups without infection treated with the different drugs were also included (G6, G7 and G8). The clinical evaluation included animal weighting as well as spleen and the liver weight. The physical aspects of infected animals and the macroscopic alterations of the small intestine were also evaluated. Parasite load was quantified by the number of stained amastigotes in the spleen imprint. Plasma LPS levels were measured using a commercial kit. The quantification of serum anti-Leishmania IgG levels was performed by ELISA. The assessment of immune system impairment was done by quantifying the percentage of CD4 + T cells and the degree of cell activation by the CD25 molecule by flow cytometry. The infected hamsters presented laboratory and immunological parameters similar to those of a human VL, except for the absence of visible clinical signs characteristic of this infection. The animals also showed a progressive weight gain over the 101 days post-infection (dpi), but this was consistent with their growth and age. The proposed treatments did not affect the weight of the animals evaluated. The liver and spleen of hamsters also showed an increase in weight consistent with its growth, however anatomical changes were observed at late times of parasite infection, which coincided with the increased splenic parasite load in these animals. In addition, the small intestine of infected animals was more friable to handle and showed a significant decrease in the number of Peyer's patches across its surface compared to uninfected group. Elevated plasma levels of LPS were observed in infected animals from 15 dpi, as previously described in human VL. An intense cellular activation was observed in the infected hamsters using the CD25 molecule on CD4+ T lymphocytes and the total IgG anti-Leishmania levels, both of which increased with time of infection. LPS levels were positively correlated with the activation of T cells when all infected animals treated or not were evaluated, suggesting that LPS may contribute to the activation already described in VL patients. In general, this study showed that concomitant treatment with pentavalent antimony and the antibiotic amikacin were beneficial in many aspects, such as the recovery of macroscopic aspects of the organs, the decrease of splenic parasite load and reduced levels of immune activation in hamsters with VL, suggesting a possible therapeutic synergism between these drugs. These results suggest the eligibility of this therapeutic strategy for the treatment of human VL.

Submitted by Ana Maria Fiscina Sampaio (fiscina@bahia.fiocruz.br) on 2014-08-11T13:24:14Z No. of bitstreams: 1 Diego Moura Santos. Avaliação... 2014.pdf: 3934510 bytes, checksum: 06fa6fa5250655c119370a03b641e2d0 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-08-11T13:24:14Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Diego Moura Santos. Avaliação... 2014.pdf: 3934510 bytes, checksum: 06fa6fa5250655c119370a03b641e2d0 (MD5) Previous issue date: 2014 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisa Gonçalo Moniz. Salvador, BA, Brasil / A leishmaniose é uma doença de escala global, que afeta 12 milhões de pessoas e pode causar um espectro de doenças que vai desde a forma cutânea localizada, que tende para a cura espontânea, até a forma visceral que é fatal. Apesar da gravidade da doença, até o momento não existe uma vacina efetiva para prevenir a leishmaniose. Dentre os antígenos promissores para o desenvolvimento de uma vacina, destacam-se as proteínas ribossomais (S4, S6, L3 e L5) e a KMP-11, uma proteína de superfície presente nos membros da família tripanosomatidae. Nosso estudo consistiu em avaliar os efeitos da imunização com estes antígenos frente ao desafio com L. major e com L. braziliensis, empregando modelos experimentais de infecção. Primeiramente, avaliamos a capacidade protetora dos antígenos ribossomais frente à infecção por L. major. Dos quatro antígenos avaliados, apenas L3 ou L5 foram capazes de prevenir o desenvolvimento da lesão e de diminuir a carga parasitária. A vacinação de camundongos com estes antígenos, na presença de CpG, induziu um perfil de resposta Th1, com elevada produção de IFN-γ, baixa produção de IL-10 e presença de anticorpos IgG2a. Em seguida, avaliamos a capacidade protetora dos antígenos L3 e L5 contra o desafio por L. braziliensis, na presença da saliva do vetor. A imunização com os antígenos L3 e/ou L5 também induziu uma elevada produção de IFN-γ, resultando em significativa redução na espessura da lesão e menor carga parasitária. Com relação ao antígeno KMP-11, investigamos a sua capacidade protetora utilizando duas estratégias vacinais: a estratégia homóloga que consistiu na imunização de camundongos com um plasmídeo de DNA que codifica KMP11 (DNA KMP-11) e a estratégia heteróloga que consistiu na imunização com nanopartículas de PLGA contendo DNA KMP-11, seguido de um reforço com nanopartículas contendo a proteína KMP-11 sob forma recombinante, na presença de CpG. As nanopartículas protegem o antígeno da degradação enzimática e promovem a liberação controlada deste, além de atuar como um adjuvante. Ambas as estratégias não impediram o desenvolvimento da lesão, após o desafio com L. braziliensis e na presença de saliva do vetor. Entretanto, os animais imunizados com a estratégia heteróloga apresentaram uma maior redução da carga parasitária comparado com o grupo imunizado pela estratégia homóloga. Este efeito foi associado com uma maior produção de IFN-γ e de TNF-α no sítio da infecção. Por fim, avaliamos a indução da resposta imune inata em macrófagos estimulados com KMP-11 encapsulados em nanopartículas. Observamos que a estimulação de macrófagos murinos com KMP-11, encapsulada em nanopartículas de PLGA, reduziu a carga parasitária intracelular e aumentou a produção de oxido nítrico, superóxido, TNF-α, IFN-γ, IL-6, IL-1β, IL-18, CCL2/MCP-1, CXCL-1/KC sugerindo a indução de uma potente resposta imune inata. Assim, concluímos que os antígenos L3 e/ou L5 mostraram ser promissores para o desenvolvimento de uma vacina que proteja contra as principais espécies de Leishmania e que o encapsulamento de antígenos em nanopartículas é capaz de induzir uma forte resposta imune. Essa estratégia deve ser considerada quanto ao desenvolvimento de vacinas para a leishmaniose. / Leishmaniasis is a global disease affecting 12 million people and can cause diseases that range from self-healing localized cutaneous leishmaniasis to fatal visceral leishmaniasis. Despite the severity of the disease, there is no effective vaccine to prevent leishmaniasis. Among the promising antigens for the development of a vaccine, stand out the ribosomal proteins (S4, S6, L3, and L5) and KMP-11, a surface protein, widely found in the members of family Trypanosomatidae. Our study evaluated the effects of immunization with these antigens upon challenge with L. major and L. braziliensis, employing the experimental models of infection. First, we evaluated the protective ability of ribosomal antigens to infection by L. major. Among the four antigens examined only L3 or L5 were able to prevent lesion development and decrease the parasite load. Mice vaccinated with these antigens, plus CpG, developed a Th1-type response with high production of IFN-γ, low production of IL-10 and presence of IgG2a antibodies. Next, we evaluated the protective capacity of L3 and L5 antigens against challenge by L. braziliensis, in the presence of sand fly saliva. Vaccination with L3 or L5 also induced a high production of IFN-γ, resulting in significant inhibition of lesion development and lower parasite load. Regarding KMP-11, we investigated its protective capacity using two immunization strategies: the homologous strategy, which consisted in immunizing mice with a plasmid DNA encoding KMP-11(DNA KMP-11) while the heterologous immunization strategy consisted of inoculation of PLGA nanoparticles (NPs) containing DNA KMP-11 followed by a booster inoculation with nanoparticles containing recombinant KMP-11, in the presence of CpG. Nanoparticles protect the antigen from enzymatic degradation and promote controlled release, in addition to acting as an adjuvant. Lesion development was not inhibited following either immunization strategy, after challenge with L. braziliensis in the presence of sand fly saliva. However, animals immunized with the heterologous strategy showed a greater reduction in parasite load compared with the group immunized by the homologous strategy. This effect was associated with increased production of IFN-γ e TNF-α at the infection site. Finally, we evaluated the induction of the innate response in macrophages stimulated with KMP-11 encapsulated in NPs. We observed that stimulation of murine macrophages with KMP-11 encapsulated in NPs reduced the parasitic load and increased production of nitric oxide, superoxide, TNF-α, IFN-γ, IL-6, IL-1β, IL-18, CCL2/MCP-1, CXCL-1/KC suggesting the induction of a potent innate immune response. We conclude that the L3 and/or L5 are promising antigens for the development of a vaccine that protects against the main species of Leishmania and that encapsulation of antigens into nanoparticles induces strong immune response. This strategy should be considered for the development of vaccines against leishmaniasis.

Submitted by Nuzia Santos (nuzia@cpqrr.fiocruz.br) on 2015-04-07T14:28:24Z No. of bitstreams: 1 Tese_BCM_CarolinaPauladeSouzaMoreira.pdf: 2546138 bytes, checksum: 434d23f2a06b0ab5b462d8c8c67dafe8 (MD5) / Approved for entry into archive by Nuzia Santos (nuzia@cpqrr.fiocruz.br) on 2015-04-07T14:28:39Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Tese_BCM_CarolinaPauladeSouzaMoreira.pdf: 2546138 bytes, checksum: 434d23f2a06b0ab5b462d8c8c67dafe8 (MD5) / Approved for entry into archive by Nuzia Santos (nuzia@cpqrr.fiocruz.br) on 2015-04-07T18:25:45Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Tese_BCM_CarolinaPauladeSouzaMoreira.pdf: 2546138 bytes, checksum: 434d23f2a06b0ab5b462d8c8c67dafe8 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-04-07T18:25:45Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tese_BCM_CarolinaPauladeSouzaMoreira.pdf: 2546138 bytes, checksum: 434d23f2a06b0ab5b462d8c8c67dafe8 (MD5) Previous issue date: 2014 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisa René Rachou. Belo Horizonte, MG, Brasil / Existe uma necessidade urgente de drogas leishmanicidas mais eficazes e/ou menos tóxicas para contribuir com o arsenal terapêutico atualmente disponível. O grupo de pesquisa de Química de Produtos Naturais Bioativos do Laboratório de Química de Produtos Naturais bioativos do CPqRR tem realizado projetos de bioprospecção de flora brasileira buscando por novos hits que possam ser utilzados no tratamento das leishmanioses. A espécie Baccharis platypoda (Asteraceae) foi uma espécie que mostrou atividade leishmanicida e que foi pouco investigada do ponto de vista químico e biológico. O estudo químico biomonitorado do extrato etanólico das folhas dessa espécie levou à obtenção de cinco frações com elevada toxicidade para formas amastigotas intracelulares de L. (L.) amazonensis e o fracionamento de uma dessas frações resultou no isolamento de um novo diterpeno clerodano, de baixa atividade, que após análise de RMN e ESI-TOF-MS/MS foi denominado platypodiol ou 1R,3R,4R,8aR)-3-(hidroximetil)-4-[(3E)-5-hidroxi-3-metilpent-3-en-1-il]-4,8,8a-trimetil-1,2,3,4,4a,5,6,8a-octahidronaftalen-1-ol. Em estágio sanduíche realizado na Universidade de Granada – Espanha os compostos fenólicos do extrato etanólico das folhasd de B. platypoda foram investigados por HPLC–ESI-Q-TOF-MS/MS no modo negativo e 19 ácidos fenólicos, 10 flavonas, 5 flavonóis e 6 flavanonas foram identificados. Além disso, o potencial antioxidante do extrato foi avaliado em quatro ensaios, mostrando o potencial antioxidante da espécie. Esses resultados aumentaram o conhecimento fitoquímico sobre a espécie brasileira B. platypoda, considerando que ela foi até o momento pouco investigada cientificamente / There is an urgent need for effective leishmanicida drugs to replace or supplement those in current use. Our group have been bioprospecting many Brazilian plants looking for potential new ‘hits’ to combat leishmaniasis. We found that Baccharis platypoda was one of the Asteraceae species that displayed leishmanicidal activity and it was few investigated. The bioassay-guided chemical study of the ethanolic extract of the leaves resulted in five fractions with high toxicity for intracellular amastigotes of L. (L.) amazonensis and the fractionation of one of these fractions led to a new diterpene clerodane with low activity that was named platypodiol or 1R,3R,4R,8aR)-3-(hidroxymethyl)-4-[(3E)-5-hydroxy-3-methylpent-3-en-1-yl]-4,8,8a-trimethyl-1,2,3,4,4a,5,6,8a-octahydronaftalen-1-ol upon NMR and ESI-TOF-MS/ MS analysis. We investigated in Granada University - Spain the phenolic components of the ethanolic leaf extract using HPLC–ESI-Q-TOF-MS/MS in negative mode and provided the identification of 19 phenolic acids, 10 flavones, 5 flavonols and 6 flavanones. We also determined the antioxidant capacity of the extract. Considering the few publications about this species, this result has increased the phytochemical knowledge about B. platypoda.

Submitted by Nuzia Santos (nuzia@cpqrr.fiocruz.br) on 2015-06-18T19:01:01Z No. of bitstreams: 1 Dissertacao_DIP_AgnesAntoniaSampaioPereira (2).pdf: 3979166 bytes, checksum: 17d10f25aaa6a7bb5ceb08f07a44820c (MD5) / Approved for entry into archive by Nuzia Santos (nuzia@cpqrr.fiocruz.br) on 2015-06-18T19:01:13Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Dissertacao_DIP_AgnesAntoniaSampaioPereira (2).pdf: 3979166 bytes, checksum: 17d10f25aaa6a7bb5ceb08f07a44820c (MD5) / Approved for entry into archive by Nuzia Santos (nuzia@cpqrr.fiocruz.br) on 2015-06-18T19:01:22Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Dissertacao_DIP_AgnesAntoniaSampaioPereira (2).pdf: 3979166 bytes, checksum: 17d10f25aaa6a7bb5ceb08f07a44820c (MD5) / Made available in DSpace on 2015-06-18T19:01:22Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertacao_DIP_AgnesAntoniaSampaioPereira (2).pdf: 3979166 bytes, checksum: 17d10f25aaa6a7bb5ceb08f07a44820c (MD5) Previous issue date: 2015 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisa René Rachou / O conhecimento dos reservatórios de Leishmania spp. é crucial para o estabelecimento de medidas eficientes de controle das leishmanioses. A detecção, identificação da espécie de Leishmania bem como a quantificação da carga parasitária em diferentes amostras de animais podem ser ferramentas úteis na indicação da participação de um determinado hospedeiro como fonte de infecção para os vetores. Neste trabalho foi realizado um estudo sobre a infecção por Leishmania spp. em roedores e marsupiais em áreas endêmicas para as leishmanioses de Minas Gerais. As amostras utilizadas foram provenientes de pequenos mamíferos capturados em cinco localidades: Regional Nordeste de Belo Horizonte, Município de Divinópolis, Terra Indígena Xakriabá no Município de São João das Missões, Barra do Guaicuí em Várzea da Palma e Casa Branca, localidade pertencente ao Município de Brumadinho. A detecção e quantificação do DNA de Leishmania foram realizadas através da Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) e PCR em tempo real (qPCR) direcionadas ao alvo kDNA e a identificação da espécie através da PCR-RFLP direcionada ao hsp70. Foram capturados animais pertencentes a 14 diferentes espécies, das ordens Rodentia e Didelphimorfia. Os resultados mostraram que, em geral, a maioria dos animais foi capturada em áreas não urbanizadas e a maioria dos espécimes pertencem a ordem Rodentia. Dos 346 animais examinados, 78 (22%) foram positivos em pelo menos um tecido. A maior positividade foi observada na Terra Indígena Xakriabá (35%), seguido pela Regional Nordeste de Belo Horizonte (27%), Casa Branca (24%), Divinópolis (9%) e Barra do Guaicuí (8%). Quanto às espécies de animais, Thrichomys apereoides e Didelphis albiventris tiveram um número expressivo de exemplares capturados (76 e 113 respectivamente) e uma positividade considerada alta (28% e 19%). Com relação aos tecidos, o fígado apresentou maior positividade (14%), seguido por medula (9%), baço (6%), pele de orelha (5%) e pele de cauda (4%). Nas amostras dos animais foram identificadas as espécies L. (V.) braziliensis, L. (L). infantum e L. (V.) guyanensis, sendo que a primeira foi encontrada infectando um maior número e uma maior diversidade de espécies de animais. Os animais capturados na Terra Indígena Xakriabá apresentaram a carga parasitária mais elevada, e, com relação às espécies dos hospedeiros, T. apereoides foi o que apresentou a maior carga parasitária. Quanto aos tecidos, houve uma alta positividade em amostras de fígado enquanto as amostras de baço apresentaram uma alta carga parasitária, o que aponta para a importância desses órgãos na infecção dos pequenos mamíferos por Leishmania spp.. A pele de orelha se mostrou eficiente na detecção das três espécies de Leishmania encontradas. Os resultados obtidos, aliados ao conhecimento epidemiológico da área, mostraram a importância da participação deste animais no ciclo de transmissão de Leishmania nas áreas endêmicas estudadas. Esses dados ressaltam a necessidade de mais estudos a respeito destas diferentes espécies de mamíferos, possíveis reservatórios de Leishmania spp., visando a implementação de novas estratégias de vigilância epidemiológica e aplicação de medidas de controle específicas, tanto para leishmaniose tegumentar como para leishmaniose visceral. / The knowledge about the reservoir of Leishmania spp. is crucial to establish the efficient leishmaniasis control measures. The detection, identification of the Leishmania species and the parasite burden quantification in different clinical animal samples can be useful tools to indicate the participation of a certain host as a source of infection to the vectors. In this work it was done a study about the infection by Leishmania spp. in rodents and marsupials in leishmaniasis endemic areas in Minas Gerais. The used samples were from small mammals captured in five localities: the Northeast Region of Belo Horizonte, the municipality of Divinópolis, the Xakriabá Indian Reservation in the municipality of São João das Missões, Barra do Guaicuí in the municipality of Várzea da Palma and Casa Branca, placed in the municipality of Brumadinho. The detection and quantification of the Leishmania DNA was done through the Polimerase Chain Reaction (PCR) targeted to the kDNA and the identification of the species through the PCR-RFLP targeted to the hsp70. Animals from 14 different species of the orders Rodentia and Didelphimorfia were captured. The results showed that, in general, most of the animals were captured in non urbanized areas and most of the specimens belong to the Rodentia order. From the 346 tested animals, 78 (22%) were positive in at least one tissue. The higher positivity was observed in the Xakriabá Indian Reservation (35%), followed by the Northeast Region of Belo Horizonte (27%), Casa Branca (24%), Divinópolis (9%) and Barra do Guaicuí (8%). Related to the animal species, Thrichomys apereoides and Didelphis albiventris had an expressive number of captured specimens (76 and 113 respectively) and a high positivity (28% and 19%). About the tissues, the liver had the higher positivity (14%), followed by bone marrow (9%), spleen (6%), ear skin (5%) and tail skin (4%). In the animals samples were identified the species L. (V.) braziliensis, L. (L). infantum and L.(V.) guyanensis, wherein the first was found infecting a higher number and a higher diversity of animals species. The captured animals in the Xakriabá Indian Reservation showed a more elevated parasite burden and, related to the host species, T. apereoides showed the higher parasite burden. About the tissues, there was a high positivity in liver samples as the spleen samples showed a high parasite burden, which points to the importance of these organs for the infection of small mammals by Leishmania spp. The ear skin was efficient in the detection of the three Leishmania species found. The obtained results, allied to the area epidemiologic knownledge, showed important participation of these animals in the Leishmania cicle transmission in the studied endemic areas. These data show the need of more researches about these different mammals species, possible Leishmania reservoirs, seeking the implementation of new epidemiological surveillance srtatetegies and the aplliance of specific control measures to the cutaneous leishmaniasis as well to the visceral leishmaniasis.

Made available in DSpace on 2015-11-11T12:13:57Z (GMT). No. of bitstreams: 2 flavia_cardoso_ioc_dout_2012.pdf: 4710105 bytes, checksum: dc3501a4d3afbbe60d475111f040507c (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2015-05-21 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / No presente trabalho a imunopatologia da infecção por Leishmania amazonensisfoi estudada em quatro linhagens de camundongos singênicos. Diferentes parâmetros como análise da expressão/produção de citocinas em diferentes órgãos e no soro, quantificação da carga parasitária, caracterização das populações celulares presentes no infiltrado inflamatório, assim como alterações histopatológicas e na matriz extracelular foram avaliados a fim de verificar as diferenças existentes na resposta imunopatológica entre as linhagens de camundongos utilizadas. A partir destas análises observamos que na fase inicial da infecção, tanto na lesão primária como no linfonodo, as células predominantemente encontradas foram eosinófilos e mastócitos em todas as linhagens de camundongos. A maior presença de células como linfócitos T\03B3\03B4, células B, plasmócitos, assim como altos níveis de anticorpos foi verificada nos camundongos sensíveis a infecção por L. amazonensissugerindo o papel destes na suscetibilidade a doença. Quanto à carga parasitária, as linhagens mais sensíveis (C57BL/10 e CBA) apresentaram maior densidade de amastigotas e maior destruição tecidual com lesões grandes, além de metástase e visceralização do parasito, enquanto os camundongos resistentes (C3H.He) apresentaram poucos parasitos, sem formação de úlceras ou visceralização De acordo com nossas observações, a resposta imunológica à L. amazonensisdemonstra uma compartimentalização e consequente diferença na produção/expressão de citocinas nos diferentes órgãos estudados. As linhagens mais sensíveis apresentaram, na lesão primária, níveis mais elevados de expressão de citocinas próinflamatórias como IL-12, TNF-\03B1e IFN-\03B3, assim como a indução de iNOS, estando tais níveis associados a maior destruição tecidual observada, enquanto níveis elevados de TGF-\03B2 estariam associados a desativação do macrófago e consequente estabelecimento do parasito no início da infecção. A expressão de IL-4 foi mais evidente nos linfonodos dos camundongos sensíveis. Já no baço de camundongos C57BL/10 uma expressão concomitante de TNF-\03B1e IL-10, assim como IL-12, IFN-\03B3e iNOS estavam associadas a presença de parasitos.A expressão de citocinas proinflamatórias (INF-\03B3, TNF-\03B1e IL-12) no fígado de camundongos C57BL/10 foi observada na fase inicial da infecção,enquanto citocinas regulatórias (TGF-\03B2e IL-10) na fase tardia. Os camundongos resistentes àinfecção por L. amazonensis apresentaram baixos níveis de expressão de citocinas em todos os órgãos analisados Apesar de não haver uma correlação direta na produção/expressão destas citocinas nestes órgãos, a infecção induz uma produção mista de citocinas que é independente da constituição genética do hospedeiro. Na análise da expressão de proteínasda matriz observamos uma associação entre o aumento na expressão fibronectina, colágenoI e III com a expressão de TGF-\03B2no fígado e linfonodo de C57BL/10 e C3H.He. Tal associação não foi observada na pata e no baço destes animais. A expressão de colágeno III napata, na fase tardia da infecção, estava relacionada à presença maciça de histiócitos parasitados. Altos níveis de expressão de laminina foram observados na pata de camundongos C57BL/10, 30 dias após a infecção, assim como o aumento de colágeno IV e fibronectina / In the present work L. amazonensis infection immunopathology was studied in four inbred mouse strains. With the aim of evaluate the differences in immunopathologic response between all strains, different parameters such as: cytokines analysis expression/production, in different organs and serum, parasite quantification , inflammatory infiltrate description, as well as histopathological and extracellular matrix alter ations were evaluated. The association of these analyzes showed that in the early phase of in fection, in both primary lesion and lymph nodes, the cells predominantly found in all mouse s trains were eosinophils and mast cells. A highest presence of T γδ lymphocytes, B cells, plasma cells, as well as hig h levels of antibodies were observed in L. amazonensis susceptible mice, suggesting a role of this parameters in disease susceptibility. In regard the parasite load, the more susceptible strains (C57BL/10 and CBA) showed a heavy parasite load, ma ssive tissue destruction with large lesions and metastasis, and parasite visceralizatio n. The resistant mice (C3H.He) showed few parasites and no scars or visceralization were obse rved. According to our observations, L. amazonensis immune response showed cytokines production/expres sion compartmentalization in different studied organs. T he more susceptible strains showed an increase of proinflammatory (IL-12, TNF- α and IFN- γ ) cytokines expression, as well as the iNOS induction, in the primary lesion. This enhance ment of expression was associated with tissue destruction, while high levels of TGF- β were associated with macrophages deactivation and subsequent parasite establishment in the early infection. The expression of IL-4 was more evident in susceptible mice lymph nodes. In C57BL/1 0 mice spleen a concomitant expression of TNF- α and IL-10, as well as IL-12, IFN- γ and iNOS, were associated with parasites presence. Proinflammatory cytokines (IFN- γ , TNF- α and IL-12) expression in C57BL/10 mice liver was observed in the initial phase of inf ection, whereas regulatory (TGF- β and IL- 10) cytokines were seen in the late phase. The resi stant to L. amazonensis mice showed low levels of cytokine expression in all examined organ s. Although there is not a direct association between cytokines production/expression in these organs, the L. amazonensis infection induces a mixed cytokines production that is independent of the host genetic background. The analysis of extracellular matrix pr oteins expression showed an association between FN, collagen I and III expression increase with the expression of TGF- β in the liver and lymph nodes of C57BL/10 and C3H.He mice. This a ssociation was not observed in the footpad and spleen of these animals. The footpad ex pression of collagen III in the late phase of infection was associated with the massive presen ce of parasitized histiocytes. A highest level of laminin, as well as the increase of collag en IV and fibronectin expression was observed in C57BL/10 mice footpad, 30 days after in fection.

Made available in DSpace on 2016-03-28T12:39:39Z (GMT). No. of bitstreams: 2 vater_neto_ioc_mest_2009.pdf: 2942126 bytes, checksum: 50b2b2273e9c6f75bd2fa9a09c6548a3 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2016-01-13 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / Todos os fármacos atualmente em uso para o tratamento da leishmaniose apresentam restrições, como toxicidade, graves efeitos colaterais, custo elevado, administração parenteral ou teratogenicidade. Desta forma, o desenvolvimento de fármacos mais eficazes e seletivos é de suma importância e a identificação de vias metabólicas exclusivas do parasito que possam ser usadas como alvo pode ser um ponto de partida interessante. Acredita-se que a leishmania não dependa da utilização do colesterol exógeno para sua sobrevivência, uma vez que sintetiza seus próprios esteróis. Porém, apesar disso, um percentual expressivo de colesterol é encontrado em suas membranas sendo, em alguns casos, o esterol majoritário indicando um papel biológico para essa molécula. O presente trabalho visa estudar a importância para a L. amazonensis da utilização do colesterol proveniente do soro, em diversas situações, avaliando o potencial desse sistema como um possível alvo farmacológico. A atividade dos inibidores da biossíntese do ergosterol (cetoconazol, miconazol, terbinafina e sinvastatina) foi avaliada, na presença de soro normal ou deslipidado. Foi observada que a privação das lipoproteínas do soro potencializa o efeito dos inibidores do ergosterol. Os promastigotas tratados com esses inibidores mostraram diferenças na sua composição lipídica, com acúmulo de colesterol nas células tratadas, principalmente, com cetoconazol e miconazol, indicando um possível mecanismo de compensação da leishmania, para suprir a inibição do ergosterol. Experimentos com LDL-I125, no qual tanto a leishmania tratada com cetoconazol, quanto a tratada com sinvastatina, que inibe o início da via de biossíntese de ergosterol, aumentaram a captação da LDL A suramina, um inibidor da captação de LDL, mostrou uma diminuição do conteúdo de colesterol da leishmania e, em associação com a sinvastatina, obteve um efeito sinérgico, mostrando que o conteúdo da LDL, principalmente colesterol, pode estar envolvido na manutenção da integridade da membrana da célula. Em adição, a resistência ao cetoconazol induzida in vitro foi estudada. Foi observada uma relação direta entre o aumento da expressão gênica da C14-desmetilase com o nível de resistência induzido em promastigotas de L. amazonensis, sugerindo que esse seja o principal mecanismo de resistência a essa classe de fármacos. De uma maneira geral, a análise dos resultados como um todo sugere que o colesterol desempenhe um importante papel na atividade dos inibidores da biossíntese do ergosterol e que o bloqueio da sua utilização pode ser um possível alvo farmacológico / All drugs currently in use for the treatment of lei shmaniasis present restrictions, such as toxicity, serious side effects, high cost, paren teral administration or teratogenicity. Thus, the development of more effective and selecti ve drugs is a priority and the identification of exclusive metabolic pathways of t he parasite that can be used as a target could be an interesting starting point. It i s believed that leishmania is not dependent on the use of exogenous cholesterol for s urvival, since it synthesizes its own sterols. But, nevertheless, a significant perce ntage of cholesterol is found in its membranes and, in some cases, as the major sterol, indicating a biological role for this molecule. This work aims to study the importance fo r L. amazonensis of the use of cholesterol from the serum in various situations, a ssessing the potential of this system as a possible drug target. The activity of the ergo sterol biosynthesis inhibitors (ketoconazole, miconazole, terbinafine and simvasta tin) was evaluated in the presence of normal or delipidated serum. It was observed tha t the deprivation of the serum lipoprotein potentiates the effect of inhibitors of ergosterol. The promastigotes treated with these inhibitors showed differences in their lipid composition, with accumulation of cholesterol in treated cells, mainl y with ketoconazole and miconazole, suggesting a compensation mechanism in leishmania, which may overcome ergosterol inhibition. Experiments with LDL-I 125 , indicated an increased uptake of LDL in leishmania treated with either ketoconazole or simv astatin, the latter inhibits an early step in the ergosterol biosynthectic pathway. Suram ine, an inhibitor of the uptake of LDL, showed a decrease in cholesterol content of th e leishmania and in combination with simvastatin, had a synergistic effect, showing that content of LDL, especially cholesterol, could be involved in maintaining the c ell membrane integrity. In addition, resistance to ketoconazole induced in vitro was studied. There was a direct relationship between increased gene expression of C 14-desmetilase and the level of resistance induced in promastigotes of L. amazonensis , suggesting that this is the main mechanism of resistance to this class of drugs. Tak en together, these results suggest that cholesterol plays an important role in the act ivity of ergosterol inhibitors biosynthesis and that the blocking of its use by le ishmania may be a possible drug target.

Made available in DSpace on 2016-03-28T12:53:43Z (GMT). No. of bitstreams: 2 luzinei_couto_ioc_mest_2014.pdf: 3229136 bytes, checksum: e00df22ea1070f548fd298cf2fe9a40c (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2016-01-13 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / Resultados anteriores demonstraram que a administração oral e intranasal de antígenos brutos de Leishmania (Leishmania) amazonensis (LaAg) protege parcialmente camundongos contra a infecção por L. amazonensis. No entanto, estudos de vacinação contra as espécies do subgênero Viannia, as principais espécies causadora da leishmaniose cutânea e mucosa nas Américas, têm sido dificultados pela falta de modelos experimentais de fácil manuseio que reproduzam a doença humana. Recentemente, foi demonstrado que o hamster dourado é um modelo adequado para o estudo da imunopatogênese da leishmaniose cutânea causada por L. (Viannia) braziliensis. Usando o modelo hamster, investigamos se o efeito protetor da imunização intranasal com LaAg pode ser estendido a infecção por L. braziliensis. Hamsters foram vacinados com duas doses de LaAg (10 \03BCg) intranasal (IN) ou duas doses de LaAg (20 \03BCg) por via intramuscular (IM) e duas semanas após a vacinação foram desafiados com L. braziliensis Os resultados demonstraram que a imunização com LaAg reduziu significativamente o crescimento da lesão e da carga parasitária, bem como os níveis de IgG e IgG2 no plasma. No final do experimento, 114 dias após a infecção, os hamsters que foram considerados protegidos expressaram na pele níveis semelhantes de mRNA para IFN-\03B3 e IL-10 comparados aos níveis na pele de animais não infectados, diferentemente do observado nos animais não protegidos. Comparando com a via nasal, a imunização pela via intramuscular (IM) não induziu proteção. Estes resultados demonstram pela primeira vez que a imunização pela via nasal pode induzir proteção cruzada contra a infecção por L. braziliensis / Previous results have shown that oral and intranasa l administration of crude Leishmania (Leishmania) amazonensis antigens (LaAg) partially protects mice against L. amazonensis infection. However, vaccination studies on species of the subgenus Viannia , the main causative species of cutaneous and mucos al leishmaniasis in the Americas, have been hampered b y the lack of easy-to-handle bio-models that accurately mimic the human disease. Recently, we demonstrated that the golden hamster is an appropriate model for studying the immunopathogenesis of cutaneous leishmaniasis cause d by L. (Viannia) braziliensis. Using the golden hamster model, we investigated whe ther the protective effect of intranasal immunisation with LaAg can be extended t o L. braziliensis infection. Golden hamsters vaccinated with either two intranas al (IN) doses of LaAg (10 μ g) or two intramuscular doses of LaAg (20 μ g) were challenged 2 weeks post-vaccination with L. braziliensis. The results showed that IN immunisation with LaAg s ignificantly reduced lesion growth and parasitic load as well as serum IgG and IgG2 levels. At the experimental endpoint on day 114 post-infection , IN-immunised hamsters that were considered protected expressed IFN- γ and IL10 mRNA at similar levels as uninfected skin. Unlike what was observed in animal s not protected. In contrast to the nasal route, intramuscular (IM) immunisation failed to provide protection. These results demonstrate for the first time that the nas al route of immunisation can induce cross protection against L. braziliensis infection.