Introdução: O diagnóstico etiológico da leishmaniose tegumentar baseia-se na detecção do parasito em amostras de lesão colhida por método invasivo. A detecção de DNA do parasito, através da PCR, poderia ser uma alternativa mais sensível, porém não está disponível na rotina diagnóstica e foi padronizada em amostras clínicas colhidas por métodos invasivos, tais como raspado, aspirado ou biópsia da lesão. Uma proposta para o diagnóstico de leishmaniose tegumentar seria a obtenção de material de lesão (mucosa ou cutânea) através de métodos de coleta menos invasivos e que fosse possível detectar DNA do parasito a partir de pequenas quantidades de amostra clínica. Neste trabalho avaliamos a eficácia da PCR, em amostras colhidas por método não invasivo (swab de lesão) como ferramenta para ser utilizada no diagnóstico de leishmaniose (mucosa e cutânea localizada), bem como para detecção precoce de Leishmania em mucosa de pacientes com lesão cutânea ativa e como ferramenta de avaliação de resposta terapêutica na leishmaniose mucosa. Metodologia: Entre os meses de agosto de 2013 a julho de 2015 foram selecionados 57 pacientes no ambulatório de Leishmanioses do Instituto de Infectologia Emilio Ribas, dos quais foram coletadas amostras de lesão cutânea ou mucosa através de swab e de biópsia das lesões. Em paralelo, foi realizada rotina laboratorial para diagnóstico de leishmaniose nos pacientes que apresentavam lesão ativa (anatomopatológico, pesquisa e cultura de Leishmania, sorologia e teste de Montenegro). As amostras colhidas por biópsia ou swab foram avaliadas através da reação em cadeia da polimerase tendo como alvos o minicírculo do DNA do cinetoplasto (kDNA) de Leishmania para PCR convencional e o gene da proteína de choque térmico 70Kda (Hsp70) para PCR convencional e PCR em tempo real. Resultados: A detecção de DNA de Leishmania em amostras colhidas por swab de lesões ativas foi semelhante as das amostras colhidas por biópsia das mesmas lesões. Quando comparado aos métodos comumente empregados no diagnóstico da leishmaniose tegumentar, a PCR em material colhido por swab apresentou desempenho superior. Foi demostrado que utilizando os iniciadores para o alvo kDNA obtivemos maior eficácia quando comparado com o alvo Hsp70, seja pela PCR convencional como pela PCR em tempo real (sensibilidade de 94.1%, 42.4% e 39.4%, respectivamente). Ao analisarmos amostras de pacientes já tratados para leishmaniose mucosa observamos positividade de 86% para kDNA e de 22% para Hsp70. Nas amostras de mucosa nasal íntegra e com leishmaniose cutânea ativa, coletadas com swab para detecção precoce da doença, obteve-se 92.9% de positividade com kDNA e 28.6% com Hsp70. Conclusões: Os resultados obtidos sugerem que o método de coleta de amostra biológica através do swab para o diagnóstico molecular da leishmaniose tegumentar apresenta eficácia comparada com o método de coleta por biópsia. A detecção de DNA em amostras colhidas por swab permite analisar a presença de DNA do parasito em tecido sem lesão, podendo detectar a presença de Leishmania mesmo antes de alterações clínicas estarem presentes. A monitorização da resposta terapêutica da leishmaniose mucosa pode ser feita através da detecção de DNA de Leishmania em amostras colhidas por swab / Introduction: Etiologic diagnosis of tegumentary leishmaniasis is based on the detection of the parasite in injury samples collected by invasive method. DNA detection of the parasite by PCR, could be a more sensible alternative, but is not available in routine practice and it was standardized in clinical samples by invasive methods such as scrapes, aspirate or biopsy of the lesion. A proposal for the diagnosis of tegumentary leishmaniasis lesions would obtaining material (cutaneous or mucosal) through less invasive collection methods, and it was possible to detect parasite DNA from small quantities of clinical specimen. In this study we evaluate the effectiveness of the PCR in samples collected by non-invasive method (swab injury) as a tool to be used in the diagnosis of leishmaniasis (mucosal and localized cutaneous), as well as for early detection of Leishmania in mucosa from patients with cutaneous lesions active and as an evaluation tool of therapeutic response in mucosal leishmaniasis. Methodology: Between August 2013 to July 2015 were selected 57 patients from the Leishmaniasis out clinic from the Institute of Infectious Diseases Emilio Ribas, which samples of cutaneous lesion or mucosa were collected by swab and biopsy of the lesions. In parallel, routine laboratory was carried out for the diagnosis of leishmaniasis in patients with active lesions (histopathology, search and Leishmania culture, serology and Montenegro skin test antigen). The samples taken by biopsy or swab were assessed by polymerase chain reaction having as targets the minicircle kinetoplast DNA (kDNA) of Leishmania for conventional PCR and gene heat shock protein 70kDa (Hsp70) for conventional PCR and real-time PCR. Results: Leishmania DNA detection in samples taken by swab of active lesions was similar to the samples taken by biopsy from the same lesion. When compared to the methods commonly used in the diagnosis of tegumentary leishmaniasis, PCR material collected by swab showed superior performance. It was shown that using the primers for the target kDNA obtained more effectively compared with the target Hsp70, or by conventional PCR and by real-time PCR (sensitivity 94.1%, 42.4% and 39.4%, respectively). When analyzing samples from patients already treated for mucosal leishmaniasis observed positivity of 86% to kDNA and 22% for Hsp70. Samples of nasal mucosa and active cutaneous leishmaniasis, collected by swab for early detection of disease, it obtained 92.9% positivity with kDNA and 28.6% with Hsp70. Conclusions: Our results suggest that the biological sample collection method using the swab for the molecular diagnosis of tegumentary leishmaniasis had compared efficacy with biopsy collection method. The DNA detection collected by swab samples allows to analyze the presence of DNA of the parasite in tissue without damage and can detect the presence of Leishmania even before clinical changes are present. The monitoring of therapeutic response mucosal leishmaniasis can be made by Leishmania DNA detection in samples per swab

Introdução: No Brasil, a leishmaniose tegumentar americana (LTA) é uma importante antropozoonose endêmica na maioria das regiões do país. Apesar da expansão da doença nos últimos anos, a LTA continua a ser uma doença negligenciada. A leishmaniose mucosa (LM) tem como principal agente causador a Leishmania (V.) brasilienses, e habitualmente ocorre meses ou anos após a infecção cutânea sintomática ou assintomática. Aproximadamente 5% dos pacientes com leishmaniose cutânea não tratada adequadamente irão desenvolver a LM, forma que causa importante morbidade aos pacientes. A LM é uma doença progressiva, que acomete cartilagens e estruturas ósseas da face, faringe e laringe. Complicações associadas à leishmaniose mucosa já foram descritas, embora não existam estudos que avaliem as alterações estruturais da face e seios paranasais utilizando métodos radiológicos e que estimem a prevalência de sinusopatia nesta população ou que a compare com a população geral. Objetivo: Avaliar o grau de opacificação dos seios paranasais em pacientes com leishmaniose mucosa tratada, assim como eventuais alterações anatômicas na face associadas à LM, através de tomografia computadorizada multislice (TCM) dos seios paranasais e comparar os achados encontrados nesta população com um grupo controle formado por pacientes que realizaram TCM de órbita. Este estudo também tem o escopo de determinar a prevalência de sinusopatia crônica nos pacientes com LM pós-tratamento, bem como encontrar prováveis variáveis preditoras que possam estar relacionadas com a gravidade da sinusopatia e das alterações tomográficas encontradas. Métodos: Foram avaliados 54 pacientes com LM tratada, que foram submetidos à TCM dos seios da face, e comparados com grupo controle de 40 pacientes que realizaram TCM de órbita. A análise das tomografias foi realizada a partir de reconstruções multiplanares nos planos axial, coronal e sagital. Foram avaliados o grau de opacificação (sinusopatia) dos seios paranasais, bem como a existência de eventuais alterações na face que pudessem estar relacionadas à LM. O grau de sinusopatia foi estabelecido seguindo-se os critérios de Lund-Mackay, segundo os quais foram atribuídos um valor para o grau de opacificação de cada sistema sinusal e dos complexos ostiomeatais, comparando o score dos casos com o dos controles. Posteriormente foi realizada uma análise comparativa entre os pacientes do grupo leishmaniose mucosa, que foram divididos em dois subgrupos, de acordo com a presença (Lund-Mackay >= 4) ou ausência (Lund-Mackay < 4) de doença sinusal, sendo 40 e 14 pacientes respectivamente. Após esta divisão foram feitas análises univariadas exploratórias em busca de variáveis preditoras que pudessem estar associadas com uma maior gravidade de sinusopatia apresentada. O nível de significância foi estabelecido com p<0,05. Resultados: Quarenta dos 54 pacientes com antecedente de LM (74,1%) apresentaram score tomográfico compatível com sinusopatia crônica (Lund-Mackay >= 4). Os pacientes do grupo leishmaniose mucosa apresentaram maior score de Lund-Mackay que os pacientes do grupo controle, bem como maior número de alterações na TCM dos seios paranasais, provavelmente associadas à leishmaniose. Estes pacientes também apresentaram graus mais severos de opacificação parcial e espessamento mucoso pansinusal 23/54 (42.6%). Além disso, opacificação total de pelo menos um dos seios paranasais só foi observada nos pacientes do grupo leishmaniose mucosa. Os pacientes com leishmaniose com score de Lund-Mackay >= 4 apresentaram maior tempo de sintomas até o primeiro tratamento e doença mais grave no momento do diagnóstico, sendo portanto prováveis variáveis preditoras de gravidade da sinusopatia. Conclusão: As tomografias computadorizadas dos seios paranasais dos pacientes com LM apresentaram diversas alterações estruturais, demonstrando o poder destrutivo desta doença. A alta prevalência de sinusite crônica observada nas tomografias computadorizadas desses pacientes quando comparados ao grupo controle, sugere que a LM pode ser um fator de risco para o desenvolvimento de sinusite crônica nesta população. Sexo masculino, tempo de sintomas até o primeiro tratamento e gravidade da LM no momento do diagnóstico podem ser consideradas prováveis variáveis preditoras de sinusite crônica nesses pacientes / Introduction: American tegumentary leishmaniasis (ATL) is an important anthropozoonosis that is endemic in most regions in Brazil. Despite the spread of the disease in recent years, ATL remains a neglected disease. Mucosal leishmaniasis (ML) is mainly caused by Leishmania (V.) brasiliensis agent, and usually occurs months or years after symptomatic or asymptomatic skin infection. Approximately 5% of patients with untreated cutaneous leishmaniasis will develop ML, a presentation that causes significant morbidity to patients. The mucosal leishmaniasis is a progressive disease that affects cartilage and bone structures of the nose and paranasal sinuses as well as other upper respiratory tract structures. Complications associated with ML have been described, but there is a lack of studies which evaluate the structural changes of the nose and paranasal sinuses in ML using radiological methods. Objective: To assess the degree of opacification of the paranasal sinuses in patients with treated mucosal leishmaniasis as well as any anatomic changes in the face associated with ML through multidector computed tomography scans (MDCT) of the sinuses, and compare the findings in this population with a control group. This study also aims at determining the prevalence of chronic sinusitis in patients with treated ML as well as finding probable predictive variables that may be related to the severity of sinus disease and CT findings. Methods: We evaluated 54 patients with treated ML who were submitted to MDCT of the sinuses, and compared with a control group of 40 patients who underwent MDCT of orbit. Analysis of the scans was performed from multiplanar reconstructions in the axial, coronal and sagittal views. The degree of sinus disease was assessed according to the Lund-Mackay criteria, in which a value was assigned to the degree of opacification of each sinus system and ostiomeatal complexes, and the scores from the mucosal leishmaniasis group were compared to the control group. A comparative analysis was then performed among patients in the mucosal leishmaniasis group, who were divided into 2 subgroups according to the presence (Lund-Mackay >= 4) or absence (Lund-Mackay < 4) of sinus disease, with 40 and 14 patients respectively. Following this subdivision, exploratory univariate analysis were performed to identify predictive variables that could be associated to the presentation of greater severity of sinus disease. The level of significance was defined as p <0.05. Results: Forty of the 54 patients with a history of ML (74.1%) had a tomographic score compatible with chronic sinusitis (Lund- Mackay >= 4). CT scans in the leishmaniasis and control groups demonstrated significant differences in terms of facial structural alterations. Patients from the mucosal leishmaniasis group showed more severe levels of partial opacification and pan sinus mucosal thickening 23/54 (42.6%), furthermore complete opacification of at least one paranasal sinus was only observed in the leismaniasis group. Patients from the mucosal leishmaniasis group with Lund-Mackay score >= 4 presented greater length of symptoms before treatment and more severe presentation of the disease at the diagnosis. Conclusion: CT scans of the sinus of patients with ML also presented several structural alterations, expressing the prominent destructive feature of the disease. The higher prevalence of chronic rhinosinusitis observed in CT scans of patients with treated ML in this study when compared to the control group suggests that ML can be seen as a risk factor for chronic rhinosinusitis in this population. Male sex, having the disease for more than two years before first treatment and/or a more severe presentation of ML at diagnosis, can be considered as predictive variables of chronic sinusitis in these patients

A leishmaniose é um termo global para doenças causadas por parasitos do gênero Leishmania, sendo a Leishmaniose Visceral (LV) a forma mais grave da doença. No Brasil é causada pelo parasita Leishmania (Leishmania) infantum chagasi. Para garantir a sua sobrevivência, alguns parasitas são capazes de manipular respostas de defesa das células do sistema imune. Recentes estudos demonstraram a participação da proteína imunomodulatória CD200 durante o processo de infecção de L. (L.) amazonenses. O presente estudo teve como objetivo investigar se os parasitos L. (L.) infantum chagasi são capazes de induzir a expressão da proteína CD200 durante o processo infeccioso. Em ensaios de infecção ex vivo, não foi observado proliferação de parasitas intracelulares. Apesar disso, L. (L.) infantum chagasi foi capaz de induzir a expressão do gene CD200. De maneira interessante, diferente de infecções por L. (L.) amazonenses, a indução de CD200 nessas células foi observada em tempos mais tardios de infecção. Ensaios de imunoprecipitação e Western blot indicaram a síntese da proteína, que atingiu os seus maiores níveis a 120 horas pós-infecção. A presença de CD200 sugere o envolvimento dessa molécula em tempos mais tardios de infecção por L. (L.) infantum chagasi. / Leishmaniasis is a global term for diseases caused by parasites of the genus Leishmania, and Visceral Leishmaniasis (VL) are the most severe form of the disease. In Brazil is caused by the parasite Leishmania (Leishmania) infantum chagasi. To ensure their survival, some parasites can handle defensive responses of the cells of the immune system. Recent studies have demonstrated the participation of immunomodulatory protein CD200 during the infection process of L. (L.) amazonenses. This study aimed to investigate whether the parasites L. (L.) infantum chagasi are capable of inducing the expression of CD200 protein during the infectious process. In trials of ex vivo infection, there was no proliferation of intracellular parasites. Nevertheless, L. (L.) infantum chagasi was able to induce the expression of CD200 gene. Interestingly, unlike infection by L. (L.) amazonenses, CD200 induction of these cells was observed at later times in infection. Immunoprecipitation assays and Western blot indicated protein synthesis, which reached their highest levels at 120 hours post-infection. The presence of CD200 suggests the involvement of this molecule at later times of infection with L. (L.) infantum chagasi.

Em todas as formas clínicas da leishmaniose tegumentar americana os macrófagos são as células efetoras mais importantes na destruição do parasita intracelular. As células dendríticas são células apresentadoras de antígeno localizadas nos sítios de inoculação, como pele e mucosa. Os dendrócitos dérmicos Fator XIIIa positivos são células derivadas de linhagem mielomonocítica e consideradas complementares às células de Langerhans no processo de apresentação de antígenos e indução da resposta imune. As células dendríticas plasmocitoides representam um subgrupo de células dendríticas precursoras presentes no sangue periférico e órgãos linfoides. Estas células são identificadas pela alta expressão de receptor da cadeia alfa da interleucina-3 (CD123) e são fortes produtoras de interferon tipo I. Elas são raramente observadas na pele humana normal, e foram demonstradas em dermatoses inflamatórias e virais. O óxido nítrico e seus derivados atuam como moléculas efetoras da citotoxicidade macrofágica contra parasitas. A expressão da enzima óxido nítrico sintase induzida (iNOS) e a geração de óxido nítrico é importante no controle da infecção por diferentes espécies de Leishmania. Cinqüenta e dois espécimes de biópsias cutâneas de pacientes diagnosticados com leishmaniose tegumentar americana foram classificados histologicamente de acordo com o padrão de resposta tecidual, se granulomatoso ou inflamatório difuso não específico. O objetivo deste estudo foi demonstrar e quantificar a presença de células dendríticas plasmocitoides em 36 das biópsias, através de estudo imuno-histoquímico com anticorpo anti-CD123, comparando os achados entre os diferentes tipos de resposta tecidual; verificar a expressão de iNOS por dendrócitos dérmicos Fator XIIIa positivos e comparar com a expressão de iNOS por macrófagos nas lesões cutâneas, através de estudo imuno-histoquímico com dupla marcação pelos anticorpos antiCD68 e antiiNOS em 43 biópsias cutâneas, e pelos anticorpos anti-Fator XIIIa e antiiNOS em 34 amostras, comparando os achados entre os diferentes padrões de resposta tecidual. Foram evidenciadas células dendríticas CD123+ em todos espécimes de lesões cutâneas de leishmaniose tegumentar americana estudados. Em 22/36 amostras, as células dendríticas plasmocitoides estavam dispostas isoladamente entre outras células inflamatórias; em 14/36 amostras estavam agrupadas, pelo menos focalmente, principalmente no grupo granulomatoso (13 amostras) e em um caso do grupo não específico; dez amostras exibiram células na junção dermoepidérmica, sendo oito no grupo granulomatoso e duas no grupo não específico. Entretanto, não houve diferença no número de células CD123+/mm2 entre os dois grupos estudados. Esses resultados sugerem que as células dendríticas plasmocitoides participam da resposta imune nas lesões cutâneas de leishmaniose tegumentar americana. A expressão de iNOS por dendrócitos dérmicos Fator XIIIa positivos foi evidenciada em todos os espécimes estudados, sendo que a maioria dos macrófagos expressou iNOS. Não houve diferença estatisticamente significativa entre o número de células CD68+/mm2 e CD68+iNOS+/mm2 nos diferentes padrões de resposta tecidual, tampouco no número de células Fator XIIIa+/mm2, mas o número de células FatorXIIIa+iNOS+/mm2 foi maior no grupo granulomatoso. Quando comparadas 34 amostras, todas elas submetidas a estudos com anticorpos anti-Fator XIIIa, anti-CD68, anti- FatorXIIIa/iNOS e anti-CD68/iNOS, foi maior o número total de macrófagos que dendrócitos dérmicos Fator XIIIa positivos, expressando ou não iNOS, e a porcentagem de macrófagos coexpressando iNOS foi maior que a coexpressão de iNOS por dendrócitos dérmicos Fator XIIIa positivos, mas esta diferença não foi estatisticamente significativa quando comparados os grupos histológicos separadamente. Os resultados demonstram que os dendrócitos dérmicos Fator XIIIa positivos expressam iNOS, menos que os macrófagos, mas proeminentemente no grupo granulomatoso, sugerindo a sua participação na patogênese de lesões cutâneas de leishmaniose tegumentar americana, como células com capacidade leishmanicida e/ou apresentadoras de antígeno / In all forms of American tegumentary leishmaniasis lesions, macrophages are the most important effector cells involved in intracellular parasite destruction. Dendritic cells are antigen-presenting cells that are localized at the entry sites, such as skin and mucosa. Factor XIIIa+ dermal dendrocytes are bone marrow-monocytic lineagederived cells and considered complementary cells to Langerhans cells in the process of antigen presentation and inducing immune response. Plasmacytoid dendritic cells constitute a subset of dendritic cells precursors in peripheral blood and organized lymphoid tissue. These cells are identified by their high levels of interleukin-3 receptor alpha chain (CD123) and are vigorous type I interferon producing cells. They are rarely present in normal human skin, and have been demonstrated in inflammatory and viral dermatoses. Nitric oxide radical and derivatives act as effector molecules of macrophage cytotoxicity against invading parasites. Expression of inducible nitric oxide synthase (iNOS) and generation of nitric oxide is important in control of infection in different Leishmania species. Fifty-two samples of skin biopsies obtained from American tegumentary leishmaniasis patients were histologically classified as granulomatous reaction or non specific diffuse inflammatory reaction. The aim of the study was to demonstrate and quantify the presence of plasmacytoid dendritic cells in thirty-six skin biopsies, by immunohistochemistry with anti-CD123, comparing findings in both patterns of tissue response; to verify the expression of iNOS by Factor XIIIa+ dermal dendrocytes and compare to the expression of iNOS by macrophages in cutaneous lesions, by doublestaining technique with antiCD68 and antiiNOS antibodies in forty-three skin biopsies and anti-factor XIIIa and antiiNOS antibodies in thirty-four biopsies, comparing findings between different tissue response patterns. Dendritic CD123+ cells were demonstrated in all specimens of American tegumentary leishmaniasis lesions. The number of CD123+ cells/mm2 in the two groups did not differ. In 22/36 samples, plasmacytoid dendritic cells were intermingled with other inflammatory cells, and were grouped, at least focally, in 14/36 samples. Thirteen cases from the granulomatous group and one non specific case showed clusters of cells in the dermal inflammatory infiltrate. Ten biopsies displayed plasmacytoid dendritic cells at the dermoepidermal junction, two in the non specific group and eight in the granulomatous group. The findings suggest that plasmacytoid dendritic cells participate in the immune response of American tegumentary leishmaniasis skin lesions. Expression of iNOS by Factor XIIIa+ dermal dendrocytes was shown in all specimens, and most of the macrophages expressed iNOS. The total number of CD68+ cells/mm2 and CD68+iNOS+ cells/mm2 in the two groups did not differ, nor the total number of FactorXIIIa+ cells/mm2, but the number of FactorXIIIa+iNOS+ cells/mm2 was higher in the granulomatous group. When comparing thirty-four samples that were all tested to anti-Factor XIIIa, anti-CD68, anti-FactorXIIIa/anti-iNOS and anti-CD68/anti-iNOS, it was higher the total number of macrophages, either non-expressing or expressing iNOS than iNOS-expressing Factor XIIIa+ dermal dendrocytes, and the total percentage of iNOS-expressing macrophages was higher than iNOSexpressing Factor XIIIa+ dermal dendrocytes, but this percentage was not significant when granulomatous and non specific groups were separately analyzed. The results demonstrate that FactorXIIIa+ dermal dendrocytes express iNOS, less than macrophages, but prominently in the granulomatous group, suggesting they play a role in the pathogenesis of American tegumentary leishmaniasis skin lesions as immune effectors and/or antigenpresenting cells

As leishmanioses são doenças parasitárias causadas por protozoários do gênero Leishmania e são importante problema de saúde pública. A leishmaniose cutânea americana é considerada doença autóctone do continente americano e se apresenta com diversas formas clínicas, que dependem da espécie que causa a infecção e de outros fatores como virulência e capacidade de evasão do sistema immune. São reconhecidas seis espécies de Leishmania que causam casos humanos de LCA no Brasil, destas, cinco pertencem ao subgênero Viannia e uma ao subgênero Leishmania. Elas são: Leishmania (Viannia) braziliensis, Leishmania (Viannia) guyanensis, Leishmania (Viannia) lainsoni, Leishmania (Viannia) shawi, Leishmania (Viannia) naiffi e a Leishmania (Leishmania) amazonensis. A transmissão da leishmaniose cutânea se mantém na região do Pontal da Paranapanema, com 20 casos notificados em 2006. A Leishmania (V.) braziliensis é a única espécie considerada como agente da doença na região, com identificação dos vetores envolvidos e de possíveis reservatórios silvestres. O objetivo do trabalho é o estudo dos aspectos epidemiológicos, clínicos e histopatológicos da leishmaniose cutânea no Pontal do Paranapanema e a identificação, por métodos moleculares, PCR, do agente etiológico e a caracterização do gênero, subgênero e a espécie de Leishmania presentes na região. A doença foi encontrada em ambos os sexos, predominando no sexo masculino (67,9%), em todas as faixas etárias, mas 70,5% estavam na faixa de 20 a 49 anos de idade. A forma clínica mais encontrada foi a cutânea, com 92,3% dos casos. A pesquisa de parasita na lesão em 78 pacientes que realizaram biópsias foi positiva em 40 amostras (51.3%), em lâminas coradas pela HE; quando se utilizou a IH foi 66,7%. O índice de concordância entre as técnicas da HE e IH foi de 58,97%. Entretanto, 10 casos negativos na IH foram positivos na HE, e de 38 casos negativos na HE, 22 foram positivos na IH. Isto mostra que há necessidade de associação dos dois métodos. A positividade na PCR foi de 53,8%. Avaliando-se os resultados obtidos nesse estudo, podemos verificar que dos 40 casos positivos pela HE, 24 também foram positivos pela PCR; porém, 16 destes, foram negativos pela PCR. Em contrapartida, das 38 amostras negativas na HE, 18 delas foram positivas pela PCR. Pela imunohistoquímica, do total de 26 amostras negativas, apenas 12 permaneceram negativas e 14 foram positivas na PCR; enquanto que, das 52 amostras positivas pela IH, 28 foram positivas e 24 negativas pela PCR. Os níveis de concordância da PCR com HE foram de 56,41% e da PCR com IH de 51,28%. Esses resultados reforçam a idéia da necessidade de se associar os três métodos para o diagnóstico da LC. As características das lesões histopatológicas foram: reação granulomatosa (RG) encontradas em 71,85%, reação granulomatosa com células gigantes (RGCG) em 12,8%, reação granulomatosa com necrose (RGN) em 10,3% e reação granulomatosa com necrose e células gigantes (RGNCG) em 5,1% dos casos. Utilizando-se os primers SSU rDNA S17/S18, foi possível caracterizar, através do seqüenciamento, 27 (34,6%) amostras como sendo do subgênero Viannia e 06 amostras como L. (L.) amazonensis. Este estudo identificou o primeiro caso de L. (L.) amazonensis na região / Leishmaniasis are parasitic diseases caused by protozoans of the Leishmania genus and are important public health problems. American cutaneous leishmaniasis (ACL) is considered an autochthonous disease of the American continent and presents several clinical forms which depend on the causative species of the infection and other factors such as virulence and ability to evade the immune system. Six Leishmania species are recognized to cause human ACL cases in Brazil of which five belong to the Viannia and one to the Leishmania subspecies. They are: Leishmania (Viannia) braziliensis, Leishmania (Viannia) guyanensis, Leishmania (Viannia) lainsoni, Leishmania (Viannia) shawi, Leishmania (Viannia) naiffi and Leishmania (Leishmania) amazonensis. Cutaneous leishmaniasis transmission is maintained in the Pontal do Paranapanema region, with 20 notified cases in 2006. Leishmania (V.) braziliensis is the only species considered to be the disease agent in the region with identification of the involved vectors and possible wild reservoirs. The aim of this research is the studies of the epidemiological, clinical and histopathological aspects of cutaneous leishmaniasis in the Pontal do Paranapanema and the identification by molecular methods, PCR, of the etiologic agent and characterization of the Leishmania genus, subgenus and species present in the region. The disease was found in both genders, with predominance of males (67.9%), in all age ranges, but 70.5% were in the range of 20 to 49 years. The cutaneous was the mostly found clinical form with 92.3% of the cases. Search for the parasite in the lesion of 78 patients who underwent biopsies was positive in 40 samples (51.5%), in HE stained slides; when IH was used, 66.7% were positive. Agreement index between the HE and IH techniques were 58.97%. However, 10 negative cases using IH were positive with HE, and of 38 HE negative cases 22 were positive using IH. This shows that association of the two methods is needed. Using PCR, there was a positivity of 53.8%. Evaluating the results obtained in this study, we may observe that of the 40 HE positive cases 24 were also positive on PCR; but 16 of these were PCR negative. Contrariwise, of the 38 HE negative samples 18 were positive PCR. Using immunohistochemistry, of the total of 38 HE negative samples, 18 were positive with PCR; while of the 52 IH positive samples, 28 were positive and 24 negative on PCR. Agreement levels of PCR with HE were 56.41%, and of PCR with IH 51.28%. These results reinforce the idea of the need for association of the three methods for CL diagnosis. Histopathological lesion characteristics were: granulomatous reaction (GR) found in 71.85%, granulomatous reaction with giant cells (GRGC) in 12.8T, granulomatous reaction with necrosis (GRN) in 10.3% and granuloma with necrosis and giant cells (GRNGC) in 5.1% of the cases. Using SSU rDNAS 17/S18 primers it was possible to characterize through sequencing 27 (34.6%) samples as being of the Viannia subgenus and 06 samples of the L. (L.).amazonensis This study identified the first L. (L.) amazonensis case in the region

O conhecimento a respeito de mecanismos de reprodução e geração de diversidade genética de organismos do gênero Leishmania vem sendo alterado com o advento de novas tecnologias. Estudos de laboratório demonstraram ocorrência de reprodução sexuada experimentalmente em organismos do gênero Leishmania. Relatos na literatura mostram a ocorrência de híbridos no ambiente natural, associada a casos de leishmaniose tegumentar americana (LTA). A partir da caracterização fenotípica realizada utilizando anticorpos monoclonais e eletroforese de isoenzimas em linhagens isoladas de pacientes com LTA na região Amazônica do Brasil, sete isolados (M15983, M15984, M15987, M15988, M19672, M19676 e M19697) apresentaram um padrão intermediário entre as espécies L. (V.) shawi shawi e L. (V.) guyanensis. O presente estudo visou realizar a confirmação da identidade híbrida desses parasitas através da clonagem dos isolados, seguida da análise do polimorfismo pela clivagem do produto da reação em cadeia da polimerase (PCR RFLP) tendo como alvo a enzima de choque térmico de 70 quilodaltons (hsp70). O hsp70 PCR RFLP também foi utilizado para análise comparativa da intensidade dos produtos de digestão, para estimar a ploidia dos híbridos e a proporção da herança dos alelos de hsp70. Foi realizada ainda, avaliação do comportamento biológico in vitro e experimental in vivo desses parasitas. A curva de crescimento foi realizada na 4° e 12° passagem após isolamento do parasita. Infecções experimentais de BALB/c foram realizadas para avaliação da evolução da infecção causada pelo isolado híbrido selvagem M19672 e sua comparação com as cepas parentais L. (V.) guyanensis e L. (V.) s. shawi. Foi determinada a carga parasitaria em pele, linfonodo e baço dos animais infectados e análise histopatológica das lesões. Os resultados obtidos a partir da clonagem dos isolados demonstraram que se tratavam de populações homogêneas de parasitas. Três isolados apresentaram padrão heterozigoto de L. (V.) guyanensis/L. (V.) s. shawi e quatro isolados apresentaram padrão homozigoto, apresentando somente os alelos de L. (V.) s. shawi. O ensaio de clivagem de sequências polimórficas amplificadas (SNP-CAPS) mostrou que os homozigotos apresentaram o mesmo número de cópias de hsp70 de L. (V.) s. shawi, enquanto que nos heterozigotos os alelos de L. (V.) guyanensis são mais representativos. Os parasitas híbridos apresentaram uma maior plasticidade fenotípica no crescimento in vitro. A infeção de BALB/c pelos parasitas híbridos apresentou uma evolução rápida tendo seu maior pico entre 14 e 28 dias pós-infecção, com regressão posterior da lesão. Esse período foi acompanhado da maior carga parasitária na pele e linfonodo. A infecção causada pelas cepas parentais mostrou aumento progressivo da lesão a partir do 21° dia de infecção para L. (V.) guyanensis e 35° dia para L. (V.) s.shawi. As alterações histopatológicas da lesão causada pelo híbrido apresentaram um padrão intermediário entre as de L. (V.) s. shawi e L. (V.) guyanensis, guardando, no entanto, mais características desta última. Nossos achados confirmam que as cepas analisadas são híbridas entre L. (V.) guyanensis e L. (V.) s. shawi da região do Baixo Amazonas, estado do Pará, área com alta ocorrência de casos de LTA na Brasil e grande diversidade de espécies do parasita, vetores e reservatórios / Knowledge about the mechanisms of reproduction and generation of genetic diversity of the genus Leishmania organisms has been changed with the advent of new technologies for it studies. Laboratory researches have shown the occurrence of experimentally sexual reproduction in the genus Leishmania. Reports in the literature shows the occurrence of hybrids in the natural environment, associated with cases of american cutaneous leishmaniasis (ACL). From the phenotypic characterization performed using monoclonal antibodies and isozymes in strains isolated from patients with ACL in the Amazon region of Brazil, seven isolates (M15983, M15984, M15987, M15988, M19672, M19676 and M19697) showed an intermediate pattern between species L. (V.) shawi shawi and L. (V.) guyanensis. This study aimed to perform the confirmation of the hybrid identity of these parasites by performing cloning of the isolated, followed by analysis of polymorphism by cleavage of the polymerase chain reaction product (PCR RFLP) targeting heat shock enzyme 70 kilodaltons (hsp70). The hsp70 PCR RFLP was also used for comparative analysis of the intensity of the digestion products to estimate the ploidy of the hybrids and the proportion of the inheritance of hsp70 alleles. It was also observed in this study the biological in vitro behavior of these parasites. The growth curve in vitro was held at 4° and 12° passage after the isolation of mammalian host. Experimental infections of BALB /c mice were carried out to evaluate the evolution of the infection caused by the hybrid wild strain M19672 compared to the parental strains L. (V.) guyanensis and L. (V.) s. shawi. The parasitic load was determined on the skin, lymph nodes and spleen of infected animals and histopathology of the lesions. The results from the cloning of the isolates showed that these are homogeneous populations of parasites. Three isolates presented heterozygous L.(V.) guyanensis/ L.(V.) s. shawi pattern and four presented homozygous pattern with only the L.(V.) s. shawi alleles. The cleavage amplified polymorphic sequences assay (SNP-CAPS) showed that the homozygous had the same number of copies of hsp70 L. (V.) s. shawi, whereas in the heterozygous alleles L. (V.) guyanensis are more representative. Hybrid parasites demonstrated a higher phenotypic plasticity growth in vitro. BALB /c infection by M19762 hybrids showed a rapid evolution with a peak between 14 and 28 days post-infection, with subsequent lesion regression. The period of greatest development of the lesion was accompanied by higher parasite burden in the skin and lymph nodes. The infection caused by parental strains showed a progressive increase in the lesion from the 21th day of infection for L. (V.) guyanensis, and day 35 PI for L. (V.) s. shawi The alteration in the histopathological lesions caused by the hybrid strain showed an intermediate pattern between those of L. (V.) s. shawi and L. (V.) guyanensis, keeping, however, more characteristics of the latter. Our findings confirm that the strains analyzed are true hybrids between L. (V.) guyanensis and L. (V.) s. shawi from Amazon region, Pará state, an area with high occurrence of ACL in Brazil and diversity of parasite species, vectors and reservoirs

A leishmaniose tegumentar americana (LTA) é uma doença infecciosa, crônica, não contagiosa, causada por diferentes espécies de protozoários do gênero Leishmania. A interação entre a espécie de Leishmania e os mecanismos da resposta imune do hospedeiro resulta em um amplo espectro de manifestações clínicas, histopatológicas e imunopatológicas na infecção humana. No Brasil, esta endemia representa um sério problema de saúde pública, sendo o estado do Maranhão responsável por 13% da casuística nacional. O objetivo deste estudo foi caracterizar o perfil imunopatológico de lesões cutâneas de 22 pacientes com LTA, causada por Leishmania (Viannia) sp, oriundos do estado do Maranhão. A reação de imunoistoquímica em biópsias de pele foi realizada empregando os anticorpos monoclonais anti-humano CD68, CD1a, fator XIIIa, CD4, CD8, IL-10 e IFN-g e os anticorpos policlonais anti-Lisozima, Foxp3 e TGF-b. A análise histológica das lesões demonstrou a presença de intenso infiltrado inflamatório na derme composto de macrófagos, linfócitos e plasmócitos com formação de granuloma na maioria dos casos. Formas sugestivas de Leishmania foram observadas em 90,9% dos casos examinados. A análise imunoistoquímica mostrou densidade superior de macrófagos ativados (4824,0 células/mm²) quando comparados aos não ativados 3458,9 células/mm²). Foi detectada densidade de células de Langerhans (CD1a+) de 310,4 células/mm² na epiderme e células dendríticas dérmicas (fator XIIIa+) de 633,6 células/mm² na derme. Foi verificada ainda, predominância de linfócitos T CD8+ (2374,1células/mm²) em relação a T CD4+ (1267,6 células/mm²). A densidade de células Treg Foxp3+ foi de 301,3 células/mm². A análise de correlação mostrou correlação positiva entre células TGF-b+ e T CD8+ e fator XIIIa+; e uma correlação negativa entre a densidade de células IFN-g+ e TGF-b+. As lesões de pacientes infectados com L. (Viannia) sp, apresentaram maior densidade de células Treg Foxp3+, e IL-10+ e IFN-g+ quando comparadas a de pacientes infectados por Leishmania (Viannia) braziliensis. A densidade de células TGF-b+ mostrou-se semelhante nos dois grupos de pacientes. A avaliação dos marcadores de acordo com o tempo de evolução da doença, não mostrou diferenças entre as densidades de células imunomarcadas. Esses dados indicam que embora exista um perfil imunopatológico associado ao controle da infecção, a presença de uma resposta regulatória no sítio da lesão pode estar relacionada à persistência parasitária. / American tegumentary leishmaniasis (ATL) is a chronic, non contagious, infectious disease caused by different protozoan parasite species of the genus Leishmania. The interaction between Leishmania species and host response results in a wide spectrum of clinical, histopathological and immunopathological presentations in humans infection. In Brazil, this endemic disease is a serious public health problem and Maranhão State is responsible for 13% of Brazilian cases. The aim of this study was to characterize the immunopathology of lesions from 22 biopsies of patients with ATL, caused by Leishmania (Viannia) sp, from Maranhão State. Immunohistochemistry was carried out by incubating skin biopsies with monoclonal mouse anti- human CD68, CD1a, XIIIa factor, CD4, CD8, IL-10 and IFN-g and polyclonal rabbit\'s anti- human lysozyme, Foxp3 and TGF-b. Analysis of skin biopsies demonstrated a dense inflammatory infiltrate in the dermis, characterized by the presence of mononuclear cells, mainly lymphocytes, macrophages, plasma cells and granulomas in most samples. Suggestive forms of amastigotes were detected in 90.9% samples observed. Immunohistochemistry showed high levels of activated macrophages (4824.0 cell/mm²) when compared to inactive macrophages (3458.9 cells/mm²). In the epidermis, the densities of Langerhans Cells (CD1a+) were 310.4 cells/mm², while in the dermis the densities of dermal dendritic cells (factor XIIIa+) were 633,6 cells/mm². High density of CD8 T+ lymphocytes (2374.1 cell/mm²) has been found compared to CD4+ T lymphocytes (1267.6 cell/mm²). The cellular density of Treg (Foxp3+) was 301 cells/mm². Among cell markers there were positive correlations between TGF-b-producing cells and CD8+ T lymphocytes and between TGF-b-producing cells and dendritic dermal cells, as well as a negative correlation between TGF-b-producing cells and IFN-g-producing cells. Patients infected with L. (Viannia) sp. presented increased densities of Treg cells and IL-10 and IFN-g- producing cells compared to Leishmania (Viannia) braziliensis infected patients. The density TGF-b+ producing cells was similar in both groups of patients. Evaluation of Immunological markers according time of infection showed no differences in the densities of immunostain cell. Results suggest that the profile of immunopathological response is associated to the control of infection, although the presence of a regulatory response at the site of infection can be responsible to the persistence of parasite in skin.

A leishmaniose visceral zoonotica (LVZ) e uma das mais importantes doenc¸as parasitárias emergentes. Em particular, o Brasil é considerado um dos principais centros endêmicos para esta doença. Apesar da publicação de manuais de controle da leishmaniose visceral e dos investimentos aplicados na organizacão de serviços e no desenvolvimento de atividades preventivas e de controle, os vetores e os reservatórios em áreas urbanas são os maiores desafios para os programas de controle. Isto se deve (1) `a necessidade por melhor compreensão do comportamento do vetor no meio urbano; (2) `as dificuldades operacionais para realizar atividades em tempo suficiente para obter resultados de impacto; e (3) ao alto custo envolvido nessas atividades. O principal objetivo deste estudo foi elaborar um modelo de otimização para o controle da leishmaniose, baseado em 5 parâmetros de controle que correspondem `as seguintes estratégias: (I) controle vetorial, (II) eliminação de cães positivos, (III) uso de coleiras impregnadas com inseticida, (IV) vacinação canina e (V) tratamento canino. Este modelo foi construído a partir de um sistema composto por 17 equações diferenciais, sendo que 4 representam a dinâmica da doenc¸a sobre a população humana (humanos suscetíveis (xh), latentes (lh), clinicamente doentes (yh) e recuperados (zh)), 10 para a populacão de cães (cães suscetíveis (xd e xCd ), latentes (ld e lCd ), clinicamente doentes (yd e yCd ), recuperados (zd e zCd ) e vacinados (vd e vCd ), onde o índice C representa as categorias com a aplicação da coleira inseticida) e 3 para a população de vetores (mosquitos não-infectados (s1), infectados (mas não-infectivos) (s2), infectados e infectivos (s3)). Para a an´alise econômica dessas estratégias, foram estimados os custos de cada uma delas por cão (ou, no caso do controle vetorial, por casa tratada). Considerando a simulação sem a introdução das estratégias de controle, as densidades de equilíbrio endêmico para as categorias foram: xh = 0, 394, lh = 0, 0305, yh = 0, 00167, zh = 0, 574, xd = 0, 314, ld = 0, 165, yd = 0, 0163, zd = 0, 505, s1 = 0, 709, s2 = 0, 0858 e s3 = 0, 205. No estado de equilibrio endêmico, o número de reprodutibilidade basal foi estimado em R0 = 4, 50 e o n´umero diário de casos humanos notificados, em R = 3, 58 × 10-6/dia. Considerando a avaliação do impacto das estratégias de controle, o controle vetorial mostrou ser a estrat´egia que causa a diminuição mais rápida sobre o núumero diário de casos humanos notificados e, consequentemente, foi tambem a que mais reduz os custos m´edico-hospitalares. Entretanto, ´e a estratégia que exige o maior investimento. Por outro lado, a estrat´egia de eliminar cães positivos foi considerada a de menor custo. Dado que essas estratégias de controle atuam em pontos distintos na cadeia epidemiológica, o planejamento de um controle envolvendo a ação simultânea delas poderia não apenas apresentar resultados de controle mais interessantes, como tambem poderia otimizar ainda mais os investimentos sobre o controle da leishmaniose visceral / Zoonotic visceral leishmaniasis (ZVL) is one of the most important emerging parasitic diseases. Brazil, in particular, is considered one of the countries in which this disease is most endernic. Despite the publication of visceral leishmaniasis control guidelines and the investment in health services and controljpreventive activities, the vectors and reser- voirs in urban areas are the major challenge for those control programs. This is due to (1) the need for better comprehension regarding the vector behavior in the urban envi- ronment; (2) the operating difficulties in perforrning the activities in time to reach good results; and (3) the high cost of those activities. The main objective of this study was to elaborate an optirnization model for leishmaniasis control. This model is based on 5 con- trol parameters that correspond to the following strategies: (I) vector population control, (11) elirnination of positive dogs, (111) use of insecticide-impregnated dog collars, (IV) dog vaccination and (V) dog treatment. This model was elaborated using an equation system, composed of 17 differential equations, 4 of which represent the disease dynarnic on hu- man population (susceptible (Xh), latent (Ih), clinically ill (Yh) and recovered humans (Zft)), 10 for dog population (susceptible (Xd and xcd), latent (ld and Icd), clinically ill (Yd and Ycd), recovered (Zd and zcd) and vaccinated dogs (Vd and vcd), where C represents the categories using the insecticide-impregnated dog collars) and 3 for vector population (non-infected (SI), infected but not infective (S2), infected and infective sandflies (S3)). For econornic analysis of those control strategies, we estimated the cost of them per dog (in the case of vector control population, it was estimated per treated house). Regarding the nume- rical simulations without the control strategies, the endernic equilibrium densities were: Xh = 0.394, Ih = 0.0305, Yh = 0.00167, Zh = 0.574, Xd = 0.314, Id = 0.165, Yd = 0.0163, Zd = 0.505, SI = 0.709, S2 = 0.0858 and S3 = 0.205. In endernic equilibrium state, the basic reproduction number and the rate of reported human cases per day were estimated as 1%0 = 4.50 and R = 3.58 x 1O-6/day, respectively. Considering the impact evaluation of controI strategies, the vector population control was the strategy that resulted in a fas- ter decrease in the rate of human reported cases per day and, consequently, in the larger reduction of medical and hospital costs too. However, the investment (that is, the cost) of the vector population control was the highest one. On the other hand, the investment in elirninating positive dogs was considered the lowest one. Since those control strategies operate at different points within the epiderniological chain, the planning a control, while taking into account the simultaneous action of these strategies, could not only result in a more interesting control strategy, but could also improve the optirnization of investments on visceralleishmaniasis control

A infecção de cães pela Leishmania (Leishmania) infantum resulta em um espectro de manifestações imunopatológicas que dependem da interação parasito hospedeiro e são definidas por fatores ambientais e pela genética do hospedeiro. Apesar disso, a imunogenética da leishmaniose visceral canina (LVC) permanece inexplorada. Nós realizamos diagnóstico laboratorial, clínico, ensaio de linfoproliferação (LPA), quantificação de citocinas, teste de hipersensibilidade tardia à leishmanina (LST), quantificação de IgA, IgE, IgG, IgM anti L. (L. ) infantum, IgG anti saliva de flebotomíneo e genotipagem ampla afim de identificar polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs) associados aos diferentes perfis de imunidades celular, humoral, resposta clínica e status de infecção em cães de área endêmica, utilizando modelo de componente de variância (EMMAX). O efeito de estrutura da amostra foi controlado em todas as análises. A presença ou ausência de infecção pela L. (L. ) infantum foi associado a regiões contendo os genes PRGR_CANFA, RAB38, NOX4, PRKCI e SMAD7, IL1RA, IL12A_CANFA relacionados à ativação de fagócitos, mecanismos microbicidas, sobrevivência intracelular de patógenos e resposta pró inflamatória; a resposta clínica foi associada a regiões contendo os genes CATA_CANFA, LIAS, IL17A e IL17F relacionados à proteção contra danos do estresse oxidativo e indução de resposta pró inflamatória; o resultado LST+ foi associado à resposta Th1, controle da infecção mas não preveniu a manifestação de sinais clínicos, enquanto o LST- foi associado à resposta Treg e aumento do parasitismo. O resultado do LST foi associado a regiões contendo os genes MEP1B, PTPRM, TLN1, TGFBR1, ITGA9, EPCAM e CALM1 envolvidos com maturação de fagócitos, migração e adesão de leucócitos, estabilidade da sinapse imunológica, diferenciação e proliferação de linfócitos. A linfoproliferação foi dependente da carga parasitária e associada a regiões contendo os genes FOCAD, PIAS2, SMAD2 e IL6R envolvidos com supressão tumoral e diferenciação de linfócitos Th17 ou Treg; o aumento dos níveis de IgA, IgE e IgG anti L. (L. ) infantum foi associado à LVC sintomática enquanto o de IgG anti saliva de Lutzomyia longipalpis foi associado à exposição e infecção assintomática. Quanto à resposta de IgM, foram identificados SNPs nos genes NXN e SH3BP5 relacionados com inibição do crescimento, diferenciação e ativação de linfócitos B e vias de sinalização de TLR4 e TLR9; para IgG anti - L. (L. ) infantum foram identificadas regiões contendo os genes IL17RB, SH2B3 e replicação do loci de susceptibilidade NOX4, RAB38, CTSC envolvidos com linfopoiese, citocinese, resposta pró inflamatória, mecanismos microbicidas, sobrevivência intracelular de Leishmania; os níveis de IgA foram associados a regiões contendo os genes LIN28A e MAFB implicados na predisposição à nefropatia glomerular, já os níveis de IgG anti saliva de Lu. longipalpis foram associados a regiões contendo os genes ERBB2IP, CD180, RAB7A_CANFA, FOXP1, RUNX1, SOD1, Q3HTU8_CANFA, IFNAR1, IFNAR2 e IFNGR2 envolvidos com supressão celular, produção de imunoglobulina via TLR4 e sobrevivência intracelular de Leishmania. Esses resultados apontam regiões cromossômicas úteis para a elucidação da resposta à infecção por L. (L. ) infantum em cães e alvos potenciais para estudos funcionais, estratégias profiláticas e terapêuticas / Leishmania (Leishmania) infantum infection in dogs leads to a range of immunopathological responses, which depend on a parasite - host interaction and are defined by environmental factors and genetic of host. Neverthless, immunogenetic of the canine leishmaniasis (CanL) remains unexplored. We performed diagnosis and clinical evaluation, lymphoproliferation assay (LPA), leishmanin skin test (LST), quantification of cytokine, anti-L. (L. ) infantum IgA, IgE, IgG, IgM, anti- sandfly saliva IgG levels and genome wide association scan of 110.165 SNPs (GWAS) in order to indentify loci associated to clinical, antibody, cell-mediated responses and status of infection in 189 dogs, employng a expedited efficient mix model of association (EMMAX). Control of stratification effects due to sample structure was evideced by the low inflation factors. Status of infection was associated to SNPs in linkage desequilibrium (LD) with PRGR_CANFA, RAB38, NOX4, PRKCI and in the neighborhood of SMAD7, IL1RA, IL12A_CANFA genes related to phagocyte maturation, killing of pathogens and proinflamatory response; clinical outcome was associated to CATA_CANFA, LIAS, IL17A, IL17F loci involved in prevention of oxidative burst mediated injury and proinflamatory response; LST+ was associated to Th1 response although it has not prevented symptoms, whereas LST- was associated to Treg response and enhanced parasite load. Overall, LST response was associated to MEP1B, PTPRM, TLN1, TGFBR1, ITGA9, EPCAM e CALM1 loci committed to phagocyte maturation, leukocyte adhesion and migration, stability in immunological synapse, lymphocyte diferenciation and proliferation. Lymphocyte proliferation was rely on parasit burden and associated to FOCAD, PIAS2 loci in the neighborhood of SMAD2 e IL6R genes, wich are implicated in tumor supression and Treg/Th17 decision; Increased levels of anti-L. (L. ) infantum IgA, IgE, IgG were observed in severity of CanL. In contrast, anti- sandfly saliva IgG was enhenced in asymptomatic dogs. IgM response was associated to NXN e SH3BP5 loci related to fate, growing and activation of B cells; anti-L. (L. ) infantum IgG levels was associated to region containing IL17RB, SH2B3 and replication of NOX4, RAB38, CTSC suscptibility loci involved in proinflamatory response, microbicidal activity, lymphopoiesis and cytokinesis; IgA levels were associated to SNPs on LIN28A and MAFB, wich are implicated glomerular nephropathy, whereas anti-sandfly saliva IgG levels were associated to ERBB2IP, CD180, RAB7A_CANFA, FOXP1, RUNX1, SOD1, Q3HTU8_CANFA, IFNAR1, IFNAR2 e IFNGR2 loci, wich are related to supression of inflamation, antibody response through the TLR4 pathway and survival of intracellular pathogens. These findins provide insights for responses to L. (L. ) infantum infection and point to potential targets for functional investigations, therapeutic and prophylactic strategies

Com o objetivo de investigar a ecoepidemiologia de Leishmania spp com relação a animais silvestres e domésticos e aos flebotomíneos, desenvolveram-se estudos no período entre 2000 e 2009 em duas áreas no Estado de São Paulo (Ilhabela S 23º 48\' W 45º 20\' e Itupeva na Serra do Japi, S 23º 10\' W 47º 02\' ). Cada animal foi examinado por um ou mais dos seguintes métodos: observações clínicas, exame direto de esfregaços ou imprints de aspirados e/ou biópsias, teste rápido com antígeno rk39, intradermorreação com antígeno de L.(V.) braziliensis, inoculação in vivo e in vitro e extração de DNA para testes moleculares. Em relação aos animais silvestres foram utilizadas técnicas de captura-marcação-recaptura o que nos permitiu determinar a dinâmica de circulação de Leishmania spp. Em todas as recapturas os animais foram reexaminados. Coletas de flebotomíneos também foram realizadas nos mesmos locais e em galinheiros, utilizando-se de armadilhas luminosas, tipo Falcão modificada, aspiradores de castro, armadilha de Shannon, armadilha Disney e papéis untados com vaselina líquida. De um total de 2.714 animais silvestres capturados, 2.048 foram recapturas. Em Ilhabela verificou-se que exemplares de Proechimys iheringi e Philander opossum foram recapturados de 2 a 35 vezes e um exemplar de Philander opossum foi recapturado até 79 meses após sua captura. L. (V.) braziliensis foi observado em áreas de LTA infectando cães em Ilhabela e Itupeva, Rodentia (Proechimys iheringi de Ilhabela, Nectomys squamipes e Lutreolina crassicaudata de Itupeva) e Marsupialia (Didelphis aurita de Itupeva). L. (L.) amazonensis foi observado em áreas de LTA em P. iheringi.de Ilhabela. L.(L.) infantum chagasi, de outra parte, foi observado em áreas de LTA em Itupeva (Akodon spp, D. 9 marsupialis). Em algumas áreas foi possível determinar ciclos concomitantes de 2 ou 3 espécies de Leishmania. A recaptura sistemática e o longo tempo de permanência nos mesmos locais de alguns espécimes indicam, de maneira inequívoca, a existência de territórios bem definidos, principalmente para Philander opossum e Proechimys iheringi de onde pode ocorrer a dispersão da leishmaniose. Ny. intermedia e Mg. migonei foram as espécies predominantes em Ilhabela, tanto em áreas florestadas quanto em galinheiros, totalizando 93,81por cento das espécies coletadas. Por outro lado, em Itupeva, Ny. neivai (33.06por cento ), Ny. whitmani (24,06por cento ) e Lu. longipalpis (20,62por cento ) foram as espécies mais abundantes no galinheiro e em áreas com mata. A presença de Lu. longipalpis requer atenção por ser o principal vetor da Leishmania infantum chagasi, no Brasil, em uma região onde foi constatada a presença de ciclo enzoótico. A infecção natural por Leishmania em animais silvestres e domésticos associada à presença de flebotomíneos vetores indica o risco potencial para infecção humana. Infecção de animais silvestres em áreas sem infecção humana ou canina pode indicar a presença ou perpetuação de ciclos do parasita / During the last 9 years (2000-2009) we have studied the ecoepidemiology of Leishmania spp. in natural forested areas in São Paulo State, Brazil by the capture and release of small wild mammal, with dogs and phlebotomines. Each wild mammal were examinated by one or more of the following methods: clinical observations, direct examination of smears or imprints of aspirates and biopsies, rk39 antibody in whole blood, skin test with antigen of L. braziliensis, inoculation in vivo and in vitro and DNA extraction for molecular tests. After the tissue samples were taken the animals were marked on their ears and released at their capture site. At each recapture all the tests were repeated. Phlebotomines were also collected in the same places and in chicken hen by Shannon trap, Disney trap, Falcão modified light trap, Castro aspirator, paper greased with liquid vaselin. Of a total of 2,714 small mammals 2,048 were recaptures. Parasitaemias were not constant and in some animals infections parasites were not found when they were re-examined. Pr. Iheringi and Ph.opossum were captured from 2 to 35 different times in Ilhabela and one specimen of Philander opossum was recaptured 79 months after the first capture. In Itupeva one specimem of Didelphis albiventris was recaptured 15 times and another specimem of D. albiventris was recaptured 35 months after the capture. L. (V.) braziliensis was identified in 2 P. iheringi from Ilhabela; 1 N. squamipes, 1 Lutreolina crassicaudata and 1 D. marsupialis from Itupeva; L. (Leishmania) amazonensis in 4 P. iheringi from Ilhabela and, L.(L.)i. chagasi in 1 Akodon sp. and 2 D. marsupialis from Itupeva; Leishmania sp was identified in 2 D. albiventris, 4 Akodon sp from Itupeva and in 4 Proechimys iheringi from 11 Ilhabela. The recapture results indicate that the circulation and dissemination of Leishmania is intimately linked to animal territories. Proechimys iheringi, Philander opossum, Didelphis aurita, Didelphis albiventris e Akodon sp were the most abundant species in those areas, all of them related to enzootic cycle of Leishmania spp. In some areas it were possible to determine concomitant cycles of two or even three species. Infection of different wild animals in areas without human or canine infection says on behalf of presence and perpetuation of circulation cycles of parasite. Ny. intermedia e Mg. migonei were the predominant phlebotomines in Ilhabela, as much in forest environment as in the chicken hen with 93.81per cent of the total collected.In Itupeva, Ny neivai (33.06per cent ), Ny. whitmani (24,06per cent ) and Lu longipalpis (20,62per cent ) were the most abundant species. The presence of Lu. Longipalpis requires concern due its role as Leishmania infantum chagasi. In this region was described a enzootic cycle of this parasite