Made available in DSpace on 2014-12-17T14:03:26Z (GMT). No. of bitstreams: 1 PatriciaBBMB.pdf: 749567 bytes, checksum: e355ba98f4fd47889fd16327a3ca1f09 (MD5) Previous issue date: 2005-07-11 / Coordena??o de Aperfei?oamento de Pessoal de N?vel Superior / American visceral leishmaniasis is a zoonosis caused by Leishmania infantum and transmitted by the bite of the sand flies Lutzomia longipalpis.The main domestic reservoir is the dog, while foxes and opposums are the known wild reservoirs. However, identification of natural infections with L. infantum in rodents appears for need of investigating the participation of these rodents how source of infection of the parasite. In the present work the Leishmania infantum infection was investigated in rodents captured in Rio Grande do Norte, aiming at to offer subsidies to the understanding of the epidemic chains of LVA in the State. Thirteen Galea spixii were distributed in four groups, being G1 the group control with four animals and the others, G2, G3 and G4, with three animals each. Those animals were intraperitoneally inoculated with 107 promastigotas of L. infantum and accompanied for, respectively, 30, 90 and 180 days. Weekly the animals were monitored as for the corporal weight and rectal temperature. At the end of each stipulated period the animals were killed. Blood were used for determination of the parameters biochemical and haematological, PCR, ELISA, microscopic examination and cultivation in NNN medium. Liver, spleen and lymph node were used in Giemsa-stained impression and cultivation in NNN medium. Liver and spleen fragments were still used in PCR and histopathological, respectively. At the same time 79 rodents of the species Rattus rattus, Bolomys lasiurus, Oligoryzomys nigripis, Oryzomys subflavus and Trichomys apereoides were captured in the Municipal districts of Brejinho, Campo Grande, Coronel Ezequiel, Passa e Fica and V?zea for identification of natural infection with L. infantum. Evidence of infection was checked by direct examination of Giemsa-stained impression of liver, spleen and blood and culture of these tissues in NNN medium. Antibodies were researched by ELISA. They were not found differences among the weigh corporal final, rectal temperature and biochemical and haematological parameters of the Galea spixii controls and infected. The rectal temperature of the animals varied from 36OC to 40OC. For the first time values of the haematocrit (33,6% to 42,8%), hemoglobin (10,2 to 14,5g/dl), erythrocyts number (4,67x106 to 6,90x106/mm3), total leukocytes (0,9x103 to 9,2x103/mm3), platelets (49x103 to 509x103/mm3) total proteins (1,56 to 6,06 g/dl), albumin (1,34 to 3,05 g/dl) and globulins (0,20 to 3,01 g/dl) of the Galea spixii were determined. The lymphocytes were the most abundant leucocytes. Infection for L. infantum was diagnosed in two animals euthanasied 180 days after the infection. In one of the animals was also identified antibodies anti-Leishmania. The parasite was not found in none of the five other species of rodents captured. Galea spixii are resistant to the infection for L. infantum and they are not good models for the study for visceral leishmaniose, although they can act as infection sources. More studies are necessary to determine the paper of the rodents in the epidemic chain of transmission of the visceral leishmaniose in the State of Rio Grande do Norte / A leishmaniose visceral americana ? uma zoonose causada pelo parasita Leishmania infantum e transmitida pela picada do fleb?tomo Lutzomya longipalpis. O c?o ? o principal reservat?rio dom?stico, enquanto que raposas e gamb?s s?o os reservat?rios silvestres conhecidos. No entanto, a identifica??o de infec??es naturais com L. infantum em roedores aponta para a necessidade de se investigar a participa??o destes animais como fonte de infec??o do parasita para os insetos vetores. No presente trabalho investigou-se a infec??o com parasita Leishmania infantum em roedores capturados no Rio Grande do Norte, objetivando oferecer subs?dios ? compreens?o das cadeias epidemiol?gicas da LVA no Estado. Treze pre?s da esp?cie Galea spixii foram distribu?dos em quatro grupos, sendo G1 o grupo controle com quatro animais e os demais, G2, G3 e G4, com tr?s animais cada. Esses animais foram inoculados por via intraperitonial com 107 promastigotas de L. infantum e acompanhados por, respectivamente, 30, 90 e 180 dias. Semanalmente os animais foram monitorados quanto ao peso corporal e temperatura retal. Ao final de cada per?odo estipulado os animais foram eutanasiados. O sangue colhido foi utilizado na determina??o dos par?metros bioqu?micos e hematol?gicos, PCR, ELISA, confec??o de esfrega?o sangu?neo e cultivo em meio NNN. Fragmentos de f?gado, ba?o e linfonodos foram utilizados para confec??o de l?minas por aposi??o e cultivo em meio NNN. Fragmentos de f?gado e ba?o foram ainda utilizados para realiza??o de PCR e histopatol?gico, respectivamente. Concomitantemente 79 roedores das esp?cies Rattus rattus,Bolomys lasiurus, Oligoryzomys nigripis, Oryzomys subflavus e Trichomys apereoides foram capturados nos Munic?pios de Brejinho, Campo Grande, Coronel Ezequiel, Passa e Fica e V?rzea para identifica??o de infec??o natural por L. infantum. O diagn?stico da infec??o nos animais foi realizado pelo exame direto das impress?es coradas com Giemsa e cultura em meio NNN de f?gado, ba?o e sangue. N?o foram encontradas diferen?as no o ganho de peso total, temperatura retal e par?metros bioqu?micos e hematol?gicos dos pre?s controles e infectados. A temperatura retal variou entre 36OC e 40OC. Pela primeira vez foram determinados os valores do hemat?crito (33,6% a 42,8%), hemoglobina (10,2 a 14,5g/dl), n?mero de eritr?citos (4,67x106 a 6,90x106/mm3), leuc?citos totais (0,9x103 a 9,2x103/mm3), plaquetas (49x103 a 509x103/mm3), prote?nas totais (1,56 a 6,06 g/dl), albumina (1,34 a 3,05 g/dl) e globulinas (0,20 a 3,01 g/dl) nesta esp?cie. Os linf?citos foram os leuc?citos mais abundantes. Infec??o por L. infantum foi diagnosticada em dois animais eutanasiados aos 180 dias, sendo que em um desses tamb?m foram identificados anticorpos contra o parasita. N?o foi observada positividade em nenhuma das cinco outras esp?cies de roedores capturadas. A esp?cie Galea spixii ? resistente ? infec??o por L. infantum e, portanto, n?o ? bom modelo para o estudo da leishmaniose visceral, embora possam atuar como fontes de infec??o. Mais estudos s?o necess?rios para que se possa determinar o papel dos roedores na cadeia epidemiol?gica da leishmaniose visceral no Estado do Rio Grande do Norte

A leishmaniose visceral, causada no Brasil por protozoários da espécie Leishmania (L.) infantum, apresenta-se nos canídeos com manifestações similares à doença humana. Diversos trabalhos tem investigado a relação entre raças caninas e suscetibilidade/resistência à doença sendo as alterações lipídicas consideradas também nessa avaliação. Para avaliar o grau de comprometimento conforme a raça e as alternações lipídicas nos cães portadores de leishmaniose visceral, analisamos alterações hematológicas e bioquímicas frente à manifestação da doença em diferentes raças ou grupos raciais. Para tanto, incluímos 162 cães de área endêmica, sem histórico de outras patologias ou de vacinação contra leishmaniose, organizados em grupos de cães naturalmente infectados segundo a raça, quais sejam, Boxer, Labrador, Pit Bull, Sem Raça Definida (SRD) e Outras Raças, e grupo controle não infectados. Na avaliação das manifestações clínicas, dividimos os animais, dentro de cada grupo de cães infectados em assintomáticos (sem nenhum sinal clínico), oligossintomáticos (de 1 a 3 sinais clínicos) e polissintomáticos (acima de 3 sinais clínicos). As raças/grupos formadas pelo total de cães infectados (assintomáticos + oligossintomáticos + polissintomáticos) também foram avaliados segundo o escore de gravidade da infecção. Para analisar as possíveis alterações laboratoriais decorrentes da infecção de cães por Leishmania (L.) infantum foram realizados hemograma, leucograma, dosagens de albumina, globulinas, proteínas plasmáticas totais, creatinina, ureia, alanino aminotransferase (ALT), Fosfatase Alcalina (FA), colesterol total, lipoproteínas de alta densidade (high density lipoproteins, HDL), lipoproteínas de baixa densidade (low density lipoproteins, LDL), lipoproteínas de densidade muito baixa (very low density lipoproteins, VLDL) e triglicérides. Analisados em conjunto, observamos que os animais assintomáticos, independentemente de raça/grupo, apresentaram parâmetros bioquímicos e hematológicos similares aos valores descritos para o grupo controle não infectado. Não observamos diferença na gravidade das manifestações da doença entre as raças ou grupos raciais para o desenvolvimento da Leishmaniose Visceral Canina. As diversas raças e grupos raciais apresentaram alterações nos parâmetros pesquisados, porém os quadros de hipoalbuminemia, hiperglobulinemia e anemia foram identificados com maior frequência, sendo correlacionados à gravidade na raça Labrador e nos grupos SRD e Outras Raças. O quadro de anemia foi mais importante na raça Pit Bull. O grupo Outras Raças apresentou o maior número de alterações correlacionadas à gravidade. A raça Labrador apresentou concentração de HDL diminuída em relação às demais raças. As alterações lipídicas, principalmente em HDL, VLDL e triglicérides foram correlacionadas à gravidade no grupo Outras Raças. / Visceral leishmaniasis caused in Brazil by protozoa Leishmania (L.) infantum, presents in dogs similar manifestations as human disease. Some work has investigated the relationship between dog breeds and susceptibility/resistance to disease and lipid changes has been also considered in this evaluation. To assess the degree of commitment according breed and lipid changes in dogs with visceral leishmaniasis, we analyzed hematological and biochemical parameters and the manifestation of the disease in different breeds or groups. Therefore, we included 162 dogs from an endemic area of Brazil with no history of other diseases or vaccination against leishmaniasis, organized in groups of dogs naturally infected by breed, namely Boxer, Labrador, Pit Bull, Mogrel dogs, Other Breeds and uninfected control group. In the evaluation of the clinical manifestations, we divided the animals in infected asymptomatic (no clinical signs), oligosymptomatic (1-3 clinical signs) and polisymptomatic dogs (above 3 clinical signs). Breeds/groups formed by the total of infected dogs (asymptomatic+oligosymptomatic+polisymptomatic) were also assessed according to the severity of the infection. To analyze the possible laboratory changes resulting from infection of dogs by Leishmania (L.) infantum were performed red blood cell count, white blood cell count, evaluation of albumin, globulin, total plasma protein (TPP), creatinine, urea, alanine aminotransferase (ALT), alkaline phosphatase (ALP), total cholesterol, high density lipoproteins (HDL), low density lipoproteins (LDL), very low density lipoprotein (VLDL) and triglycerides. Taken together, we observed that asymptomatic animals, regardless of breeds/group, showed biochemical and hematological parameters similar to values reported for the uninfected control group. There were no differences in severity of disease manifestations among breed or racial groups for the development of Canine Visceral Leishmaniasis. The different breeds and racial groups showed changes in the parameters studied, but hypoalbuminemia, hypergammaglobulinemia and anemia were identified more frequently being correlated to the severity in Labrador, mongrel and Other Breeds groups. The anemia was most important in Pit Bull. The group Other Breeds had the largest number of changes correlated to the severity. The Labrador showed decreased HDL levels compared to other breeds. Lipid changes, especially in HDL, VLDL and triglycerides were correlated to the severity in the Other Breeds group.

Alguns parasitas modificam o perfil de Compostos Orgânicos Voláteis (COVs) de seus hospedeiros na tentativa de atrais/dispersar seus vetores, assegurando a propagação do parasita e a manutenção do ciclo da doença. É sabido que o mosquito Lutzomyia longipalpis, vetor da Leishmaniose Visceral (LV) são mais atraídos por cães infectados que não infectados. Este trabalho tem como objetivo identificar e caracterizar os Compostos Orgânicos Voláteis emitidos por culturas de células e hamsters infectados Mesocricetus auratus com Leishmania infantum (MHOM/74/PP75). Células aderentes mononucleares de baço de hamsters foram separadas com Ficoll e distribuídas em placas de 24 poços com 2x106 células por poço. Após 42 horas, as células foram infectadas e os COVs foram coletados por \"headspace\" por 18 horas. Os COVs foram determinados por comparação com as placas controle: controle células aderentes mononucleares, controle L. infantum, e controle meio RPMI 1640.40 Hamsters foram subdivididos em 2 grupos: 20 animais foram infectados com formas promastigotas metacíclicas de L. infantum selecionadas com aglutinina de amendoim (PNA) por via intracardíaca com 1x107 parasitas. Os animais foram acompanhados por 4 meses pós infecção e as amostras foram coletadas colocando os animais em sacos de poliéster conectados com um tubo de metal recheado com Tenax TA acoplado a uma bomba de sucção automática por 10 minutos. Todas as amostras foram analisadas por dessorção térmica via Cromatografia gasosa/ Espectrometria de Massas (CG-EM). Nas culturas de células, 2 compostos estão presentes apenas nas culturas infectadas: 1,2-difenilciclobutano e (E)-(2,3-Difenil Ciclopropil)-metil-fenilsulfóxido. O 2,4-dimetilbenzaldeído estava presente na placa controle contendo meio RPMI 1640. Por outro lado, em ambas as placas infectadas e controle com células aderentes mononucleares, o 3-metileno-heptano estava presente. Outros compostos contendo os grupos químicos aldeídos ou álcoois ou hidrocarbonetos aromáticos foram detectados em todas as placas, mas com diferentes áreas de pico (quantidade). Quando comparamos os COVs emitidos por hamsters infectados e controles, nenhuma diferença foi encontrada. Os compostos emitidos por culturas de células infectadas mostram que a infecção com L.infantum é capaz de modificar o perfil de COVs em culturas de células. Outros compostos encontrados em todas as placas, mas com diferentes áreas de pico podem indicar que a infecção aumenta a liberação de algumas substâncias que são possíveis atrativos para vetores. / Some parasites can modify their hosts Volatile Organic Compounds (VOCs) profile in order to attract / disperse their vectors, ensuring spreading of the parasite and maintenance of the disease cycle. It is already known that Lutzomyia longipalpis sandflies, the vectors of Visceral Leishmaniasis (VL), are more attracted to infected than to non-infected dogs. This work aims to identify and characterize the VOCs emitted by cell cultures and hamsters Mesocricetus auratus infected with Leishmania infantum (MHOM/74/PP75). Spleen adherent mononuclear cells of hamsters were separed with Ficoll and distributed in flat-bottomed 24-well plates at 2x106 cells per well. After 42 hours, the cells were infected and VOCs were collected from the \"headspace\" for 18 hours. The VOCs were determined in comparison with the controls plates: control mononuclear adherent cells, control L. infantum and control medium RPMI 1640. 40 Hamsters were subdivided in two groups: 20 animals were used as a control group and 20 animals were infected with metaciclic form of L. infantum selected by peanut agglutinin (PNA) by intracardiac route with 1x107 parasites. The animals were followed up for 4 months post-infection and the samples were collected by introducing the hamsters in a polyester bag connected with a metal tube filled with the Tenax TA adsorbent coupled to an automatic suction pump for 10 minutes. All samples were analyzed by thermal desorption via Gas Chromatography/Mass Spectrometry (GCMS). In cell cultures, two compounds were present only in infected cultures: 1, 2- diphenyl cyclobutane, and trans-[(2, 3-Diphenylcyclopropyl) methyl] phenyl sulfoxide. 2, 4-dimethyl benzaldehyde was present in the control well containing RPMI 1640 medium. On the other hand, in both infected and control wells with mononuclear adherent cells, 3-methylene heptane was present. Other compounds containing either aldehydes or alcohols or aromatic hydrocarbon chemical groups were detected in all plates, but with different peak areas (i.e., amounts). When comparing the VOCs emitted by infected and control hamsters, no difference was found. The compounds emitted only by infected cell cultures show that the infection with L. infantum is able to modify the profile of VOCs in cell cultures. The other compounds found in all plates but with different peak areas may indicate that infection may increase the release of some substances that are possible attractants for vectors.

Devido ao largo espectro de manifestações na leishmaniose visceral canina (LVC), o exame clínico não é capaz de confirmar o diagnóstico, já que muitos dos sinais clínicos não são exclusivos da LVC, tornando-se imprescindível o diagnóstico laboratorial para confirmação da infecção por L. (L.) infantum chagasi. A sorologia tem sido a primeira escolha para o diagnóstico da leishmaniose canina; porém, a diversidade de técnicas empregadas e de antígenos tem levado a resultados conflitantes. O emprego de formas promastigotas e amastigotas do parasito tem boa concordância no sorodiagnóstico de LVC pela Reação de Imunofluorescência Indireta (RIFI), porém o teste com amastigotas mostrou-se mais sensível sem perda da especificidade. Sendo assim, o objetivo deste estudo foi avaliar o desempenho do ELISA no sorodiagnóstico da LVC empregando antígeno total bruto de formas amastigotas provenientes de cultura axênica (ELISA-AXE) e amastigotas purificadas de tecido de animal experimental cronicamente infectado (ELISA-AMA) comparando com o desempenho do ELISA feito com antígeno total bruto de formas promastigotas (ELISA-PRO) de L. (L.) infantum chagasi. Foram avaliados 115 soros de cães parasitologicamente positivos para a pesquisa de DNA de Leishmania por PCR, domiciliados a pelo menos 2 anos em municípios com alta transmissão de leishmaniose visceral, classificados em sintomáticos (n=67) e assintomáticos (n=48) de acordo com sinais clínicos e exames laboratoriais. Como controle, foram utilizados 81 soros de cães parasitologicamente negativos oriundos do município sem transmissão comprovada de leishmaniose visceral e 13 soros de cães com outras enfermidades. Os resultados não mostraram diferença significante em sensibilidade, especificidade, valores preditivos e acurácia entre os testes ELISA-AXE, ELISA-AMA e ELISA-PRO, com forte correlação e concordância entre os três antígenos testados. O ensaio de Western Blot mostrou reatividade para proteínas de diferentes pesos moleculares, entre 14 a 178kDa dependendo da fonte de antígeno. Os resultados mostraram desempenho semelhantes nos testes de ELISA com amastigotas axênicas, amastigotas purificadas e promastigotas como fonte de antígeno para sorologia da leishmaniose canina. A ampla e diversificada reatividade no Western Blot com poucas bandas altamente especificas sugere o emprego de quimeras de antígenos de diferentes pesos moleculares oriundos tanto de formas amastigotas como de formas promastigotas do parasito no diagnóstico da LVC / Due to the wide spectrum of manifestations in canine visceral leishmaniasis (CVL), clinical exam is not able to confirm the diagnosis, since many of the signs and symptoms are not exclusive of CVL, making it imperative that the laboratory diagnosis for infection confirmation by L. (L.) infantum chagasi. Since the direct search involves invasive material collection, time-consuming and expensive; the serology has been the first choice for diagnosis of canine leishmaniasis. However, the diversity of techniques employed and antigens have led to conflicting results in both diagnostic routine and applied research. Since the use of promastigotes and amastigotes of L. (L.) infantum chagasi have good agreement on serum diagnosis of CVL by reaction of Indirect Immunofluorescence (RIFI), despite the amastigote test proved more sensitive without loss of specificity. The main objective of this study was to evaluate and compare the performance of ELISA in the CVL using crude total antigen of axenic amastigote and promastigote culture, and purified amastigote from experimental chronically infected animal tissue of L. (L.) infantum chagasi. One hundred and fifty-five sera from dogs residing on areas with high disease incidence were evaluated by PCR and diagnosed positive for Leishmania, these were used as positive control on the present study. The animals were examined clinically and in accordance with the characteristic clinical signs of visceral leishmaniasis and laboratory tests, then were classified into 2 groups: symptomatic (n=67) and asymptomatic (n=48) animals. As negative control, eighty-one sera were used from dogs parasitologically negative by PCR in real time from the municipality without proven transmission of visceral leishmaniasis. The results showed no significant difference in sensitivity, specificity, predictive values and accuracy between ELISA-AXE, ELISA-AMA and ELISA-PRO, with strong correlation and concordance between the three antigens tested. The Western Blot assay showed reactivity for proteins of different molecular weights ranging from 14 to 178kDa depending on the antigen source. The results showed similar performance in the ELISA tests with axenic amastigotes, purified amastigotes and promastigotes as source of antigen for serology of canine leishmaniasis. The broad and diverse reactivity in Western Blot with few highly specific bands suggests the use of antigen chimeras of different molecular weights derived from both amastigote and promastigote forms of the parasite in the diagnosis of LVC

O cão (Canis familiaris) é o principal reservatório de Leishmania (Leishmania) infantum. Sua alta competência em transmitir o parasito para o inseto vetor contribui para a manutenção do ciclo e aumento do risco para os humanos em áreas endêmicas. O amplo espectro de manifestações clínicas da leishmaniose visceral canina (LVC) torna seu diagnóstico bastante complexo, já que essas manifestações podem se sobrepor àquelas causadas por outros agentes infecciosos. Fator agravante é que a infecção, na maior parte das vezes, tem caráter subclínico, podendo passar despercebida. Diante disto, um diagnóstico confiável se faz necessário para confirmar uma suspeita clínica ou infecção inaparente. A reação em cadeia da polimerase (PCR) tem contribuído em muito para o aumento da sensibilidade do diagnóstico, e seu uso mostra que a prevalência da infecção canina por L. (L.) infantum em áreas endêmicas pode ser bem maior do que a apontada pela sorologia. É sabido que um dos fatores limitantes do emprego de uma técnica diagnóstica em larga escala refere-se à coleta do material clínico que, idealmente, deve ser simples, rápida e indolor. Assim, entende-se que a associação da PCR com amostras não invasivas, de fácil coleta, poderia representar uma contribuição importante para o diagnóstico da LVC. Dessa forma, a proposta do presente projeto foi investigar o valor do swab oral (SO) na detecção de L. (L.) infantum em cães oriundos de áreas onde ocorre transmissão do parasito, através do uso da PCR em tempo real, considerada a mais sensível dentre as técnicas moleculares. Para tanto, comparamos sua positividade com a encontrada em outra amostra não invasiva (swab conjuntival= SC), pouco invasiva (sangue periférico= SG) e invasiva (aspirado de linfonodo=LN) e com a sorologia, considerando grupos clínicos, carga parasitária, índice de concordância entre os resultados, e a combinação dos resultados das diferentes amostras e a sorologia com aqueles obtidos no SO. Noventa e dois cães com comprovada infecção participaram do estudo. Os animais foram classificados em sintomáticos (n=63) e assintomáticos (n=29), de acordo com o exame físico e provas laboratoriais. No presente estudo a positividade do SO (67,4%) foi equivalente a do SC (68,5 %), maior do que a encontrada no SG (52,2%), e menor quando comparada ao LN (84,8%). Considerando os grupos clínicos, o SO foi positivo em 81 % dos cães sintomáticos e em 37,9 % dos assintomáticos. A positividade encontrada no SC também foi maior no grupo sintomático em relação ao assintomático (82,5 % x 37,9 %), assim como no LN (93,7 % x 65,5 %), mas não no SG (62,1 % x 47,6 %) e na sorologia (77,8 % x 79,3 %). Salienta-se que o SO foi positivo em 35 % dos cães com sorologia negativa (n=20), o SC em 35%, o SG em 40 %, o LN em 70 %, e OS+CS em 60% deles. A concordância dos resultados do SO foi moderada em relação à conjuntiva (k= 0,3) e fraca em relação às demais amostras e a sorologia (0.2 < k < 0.3). A carga parasitária do SO, por sua vez, não se diferiu da conjuntival, ambas foram maiores do que a encontrada no SG, e o LN apresentou a maior carga, mostrando uma clara correlação da intensidade do parasitismo com os índices de positividade obtidos. O LN mostrou o maior parasitismo entre as amostras analisadas. A combinação dos resultados do SO e SC atingiram 84 % de positividade nos 92 cães estudados, 92,1 % no grupo sintomático e 65,5 % no assintomático. Em suma, o presente estudo mostrou a presença do DNA de L. (L.) infantum no swab oral de cães infectados através da PCR em tempo real, revelando seu potencial uso no diagnóstico da LVC em cães com suspeita clínica dada a sua alta positividade nos animais com sintomatologia, equivalente à encontrada na amostra invasiva, o aspirado de linfonodo. Em oposição, encontrou-se baixa positividade nos cães assintomáticos, mas seu uso combinado com outra amostra não invasiva, a conjuntiva, atingiu patamares satisfatórios. O fato do SO ter sido positivo em parte dos animais soronegativos aponta vantagem adicional do seu uso na investigação de infecção por L. (L.) infantum em inquéritos epidemiológicos ou mesmo na rotina clínica. Por fim, os nossos resultados mostraram que a combinação de testes e amostras é necessária para a identificação de cães infectados por L. (L.) infantum, e que a PCR com o swab oral, especialmente associado ao swab conjuntival, pode contribuir de forma significativa para o diagnóstico da infecção canina, seja ela sintomática ou assintomática / Dog (Canis familiaris) is the major reservoir of Leishmania (L.) infantum. Its high competence for transmitting the parasite to the vector contributes to the maintenance of the cycle and for increasing risk to humans in endemic areas. The wide spectrum of clinical manifestations of canine visceral leishmaniasis (CVL) makes the diagnosis quite complex, since the symptoms can overlap those caused by other infectious agents. Of note, the infection is mostly subclinical, making the diagnosis even more difficult. Therefore, an accurate diagnosis is necessary to confirm a clinical suspicion or the silent infection. The polymerase chain reaction (PCR) has greatly contributed for increasing the diagnostic sensitivity, and its use shows that L. (L.) infantum canine infection in endemic areas may be much higher than that pointed by serology. It is known that one limiting factor of using a diagnostic method in large scale refers to the collection of clinical samples which should be ideally simple, quick, and painless. Thus, it is understood that the association of PCR with non-invasive samples could represent an important contribution to the diagnosis of CVL. Therefore, the purpose of this study was to investigate the value of the oral swab (OS) in detecting L. (L.) infantum in dogs from areas of parasite transmission through the use of real-time PCR that is considered the most sensitive among the molecular techniques. To this end, we compared the OS positivity with that found in other non-invasive (conjunctival swab = CS), minimally invasive (blood = BL) and invasive (lymph node aspirate = LN) samples and serology, considering clinical groups, parasite load, agreement among results, and the combination of results from different samples and serology with those obtained with OS. Ninety-two dogs with proven infection were selected for this present study. The animals were divided into symptomatic (n = 63) and asymptomatic (n = 29) dogs, according to the physical examination and laboratory tests. Here, the positivity in OS (67.4%) was equivalent to the CS (68.5%), higher than that found in BL (52.2%), and lower when compared to LN (84.8%). Regarding clinical groups, OS was positive in 81% of the symptomatic dogs and in 37.9% of asymptomatic ones. The positivity in CS was also higher in the symptomatic compared to the asymptomatic group (82.5% x 37.9%) and in LN (93.7% x 65.5%), but not in BL (62.1% x 47.6%) and serology (77.8% x 79.3%). Noteworthy, the OS was positive in 35% of dogs with negative serology (n = 20), CS in 35%, BL in 40% and LN in 70%. Moderate agreement was found between OS results and CS results (k = 0.3) and weak in comparison to other samples and serology (0.2 < k < 0.3). The parasite load was equivalent between OS and CS, both were higher than that found in BL, and LN presented the highest burden, showing that parasitism intensity and the positivity rates are correlated. The combination of OS and CS results reached 84% positivity in 92 dogs studied, 92.1% for symptomatic dogs and 65.5% for asymptomatic ones. In summary, the present study showed the presence of L. (L.) infantum DNA in oral swab of infected dogs by real-time PCR, revealing its potential use for diagnosing CVL in animals with clinical suspicion due to its high positivity in dogs with symptoms, equivalent to that found in invasive sample, the lymph node aspirate. In contrast, low positivity was found in asymptomatic dogs, but the combined use with other non-invasive sample, the conjunctiva, reached satisfactory levels. OS positivity found in part of the seronegative animals points additional advantage of using OS in the investigation of L. (L.) infantum infection in epidemiological surveys or in clinical practice. Finally, our findings pointed that combination of tests and samples is required for identifying dogs infected with L. (L.) infantum, and that the PCR with oral swab, especially associated with the conjunctival swab, can contribute for diagnosing both asymptomatic and symptomatic dogs

Na América Central, em países como Honduras, El Salvador, Nicarágua e Costa Rica, tem sido descrito lesões cutâneas não ulceradas, designadas como leishmaniose cutânea não ulcerada ou atípica (LCNU) causadas por Leishmania (L.) infantum chagasi. Em Honduras, leishmaniose visceral e leishmaniose cutânea não ulcerada ou atípica são produzidas pelo mesmo agente etiológico, Leishmania (L.) infantum chagasi e ocorrem na mesma área geográfica. A LCNU é a forma clínica mais comum, afetando principalmente crianças maiores de 5 anos e adultos jovens. A lesão é definida como uma pápula, nódulo indolor, não ulcerativo, eritematoso ou da cor da pele, na presença ou ausência de halo hipopigmentado. Tendo em vista que existe uma lacuna no conhecimento do padrão de resposta imunológica tecidual da leishmaniose cutânea não ulcerada ou atípica, este trabalho visou avaliar a resposta imunológica inflamatória e regulatória in situ das lesões de pele. Foram utilizadas 20 biópsias de pele, com diagnóstico parasitológico confirmado por raspado de lesão corado por Giemsa e observado em microscópio ótico. O estudo histopatológico foi avaliado em cortes histológicos corados com hematoxilina e eosina (HE) e o padrão da resposta imune inflamatória e regulatória por meio da reação de imuno-histoquímica utilizando marcadores para linfócito T (CD4 e CD8), T regulatório (FoxP3), e antígenos intracelulares como: IL-17, TGF-beta, IL-10, IL-6 e IFN-y. As alterações histopatológicas mais significativas foram observadas na derme e caracterizadas por um infiltrado inflamatório linfohistiocitário de intensidade variável e associado à formação de granulomas epitelioides. Já as alterações histopatológicas identificadas na epiderme mostraram-se mais leves e correspondem a leve adelgaçamento, leve acantose e exocitose focal linfohistiocitária. Em 55% dos casos, o parasitismo mostrou-se discreto. A análise imuno-histoquímica das lesões cutâneas dos pacientes com LCNU mostrou no infiltrado inflamatório a presença de todos os marcadores utilizados neste estudo, em especial de linfócitos T CD8+ e CD4+, e das citocinas inflamatórias IFN-y e IL-6. A participação de células FoxP3+, TGF-beta+ e IL-10+ foi discreta, assim como das células IL-17+. Os dados mostram uma participação maior da resposta inflamatória na leishmaniose cutânea não ulcerada ou atípica, capaz de controlar o parasitismo e consequentemente a evolução do tamanho da lesão; porém, embora mais discreta, a resposta imune regulatória pode ser responsável para manter um balanço na resposta imune celular evitando danos teciduais e levando a baixa persistência parasitária no tecido, necessária para a manutenção de uma imunidade protetora e duradoura / Honduras: evaluation of the inflammatory and regulatory immune response in situ in skin lesions [dissertation]. São Paulo: \"Faculdade de Medicina, Universidade de São Paulo\"; 2017. In Central America, in countries such as Honduras, El Salvador, Nicaragua and Costa Rica, non-ulcerated skin lesions, designated as non-ulcerated or atypical cutaneous leishmaniasis (NUCL) caused by Leishmania (L.) infantum chagasi, has been reported. In Honduras, visceral leishmaniasis and non-ulcerated or atypical cutaneous leishmaniasis are caused by the same etiologic agent, Leishmania (L.) infantum chagasi and occur in the same geographical area. NUCL is the most common clinical form, affecting mainly children older than 5 years and young adults. The lesion is defined as a papule, painless nodule, non-ulcerative, erythematous or skin color, in the presence or absence of hypopigmented halo. Considering that, there is a gap in the knowledge of the tissue immune response pattern of non-ulcerated or atypical cutaneous leishmaniasis, this study aimed to evaluate the in situ inflammatory and regulatory immune response of skin lesions. Twenty skin biopsies with a confirmed parasitological diagnosis by scraping of lesion stained by Giemsa and observed under an optical microscope were used. The histopathological study was evaluated in histological sections stained with hematoxylin and eosin (HE) and the inflammatory and regulatory immune response through the immunohistochemistry reaction using T lymphocyte (CD4 and CD8), regulatory T (FoxP3) markers, and intracellular antigens such as IL-17, TGF-beta, IL-10, IL-6 and IFN-y. The most significant histopathological changes were observed in the dermis, and they were characterized by a lymphohistiocytic inflammatory infiltrate of variable intensity and associated to the formation of epithelioid granulomas. On the other hand, the histopathological changes identified in the epidermis were lighter and correspond to mild thinning, mild acanthosis and focal lymphohistiocytic exocytosis. In 55% of the cases, the parasitism was discreet. The immunohistochemistry analysis of the cutaneous lesions of patients with NUCL showed in the inflammatory infiltrate the presence of all the markers used in this study, especially CD8+ and CD4+ T lymphocytes, and the inflammatory cytokines IFN-y and IL-6. The participation of FoxP3+, TGF-beta+ and IL-10+ cells was discrete, as well as IL-17+ cells. The data show a higher participation of the inflammatory response in non-ulcerated or atypical cutaneous leishmaniasis, able to control the tissue parasitism and consequently the evolution of the lesion size; however, although discreet, the regulatory immune response may be responsible for maintaining a balance in the cellular immune response avoiding tissue damage and leading to low tissue parasitic persistence necessary for the maintenance of a protective and lasting immunity

INTRODUÇÃO: A leishmaniose visceral (LV), pertence ao grupo de endemias consideradas prioritárias no mundo. É uma doença grave e com poucas opções de tratamento e, mesmo quando adequadamente tratada, possui um nível de letalidade de 5 a 7%. Apesar da expansão da doença, o tratamento para leishmaniose visceral não obteve avanços. O tratamento da leishmaniose possui apenas dois grupos de medicamentos utilizados: os antimonoiais e os não-antimoniais. Os compostos nitroheterocíclicos foram utilizados pois acredita-se que a eficácia desta classe de compostos está na habilidade desses compostos inibirem a tripanotiona redutase. Os compostos foram obtidos por via sintética e refinados pelo método QSAR por remodelagem molecular. Foram obtidos séries de compostos nitroheterocíclicos, onde a série BSF (derivados 5-nitro-2-furfurilideno - azometínicos) foi utilizada para avaliar a bioatividade in vitro destes compostos frente à Leishmania. Para avaliação da atividade anti-Leishmania foram usadas formas promastigotas de Leishmania (Leishmania) infantum. Os métodos utilizados para determinar a atividade anti-Leishmania dos compostos da série BSF foram os métodos colorimétrico 3-[4,5-dimetiltiazol-2-il] 2,5 brometo de difeniltetrazólio (MTT), apoptose por Anexina V e reação de Griess (dosagem de NO). Ao comparar os resultados com os respectivos controles positivos e com a Anfotericina B, foi observado que a atividade anti-Leishmania em formas promastigotas de L. L. infantum dos compostos foi menos significativa quando comparado com anfotericina B. Porém, ao comparar os resultados de macrófagos infectados e citotoxicidade com a anfotericina B, os compostos mostraram resultados expressivos, ao apresentarem baixa taxa de citotoxicidade e significativa diminuição da proliferação intracelular. A expressiva produção de nitrito pelos macrófagos infectados tratados com os compostos da série BSF sugere-se que estes compostos possuam uma ação indireta de potencialização de produção de NO nas células hospedeiras. Os resultados in vitro utilizando derivados nitroheterocíclicos mostraram atividade destes sobre formas promastigotas e amastigotas intracelulares, e são compostos em potencial para avaliação de efeito in vivo contra leishmaniose visceral / INTRODUCTION: Visceral leishmaniasis (VL) belongs to the group of endemics prioritized worldwide. It is a serious disease with few treatment options, and even when adequately treated, it has a lethality level of 5 to 7%. Despite the expansion of the disease, treatment for visceral leishmaniasis has not made progress. Treatment of leishmaniasis has used only two groups of drugs: antimonial and non-antimonial. Nitro-heterocyclic compounds were used in this study because it is believed that the effectiveness of this class of compounds is the ability to inhibit trypanothione reductase. The compounds were obtained synthetically and refined by QSAR method molecular remodeling. Nitro-heterocyclic series of compounds were obtained, where the BSF series (derived from 5-nitro-2-furfurylidene - azometínicos) was used to evaluate the in vitro bioactivity of these compounds against the Leishmania. To evaluate the anti-Leishmania activity, promastigotes of Leishmania (Leishmania) infantum were used. The methods used to determine the anti-Leishmania activity of the BSF series compounds were colorimetric methods 3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl] 2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT), apoptosis by Annexin V, and Griess reaction (IN dosage). By comparing the results with the respective positive controls and with amphotericin B, it was observed that the anti-Leishmania activity of L. L. infantum promastigotes of the compounds was less significant when compared with amphotericin B. However, comparing the results of infected macrophages and cytotoxicity with amphotericin B, compounds showed significant results, presenting low cytotoxicity rate and significant decrease in intracellular proliferation. The significant nitrite production by infected macrophages treated with the BSF series compounds suggested that these compounds have an indirect potentiation action in the NO production in the host cells. In vitro results using nitro-heterocyclic derivatives showed their activity on these promastigotes and intracellular amastigotes, and presented them as potential compounds for in vivo effect evaluation against visceral leishmaniasis

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La leishmaniose viscérale (LV) est la forme la plus sévère de la leishmaniose humaine. Elle est transmise par la piqûre d'un phlébme. La leishmaniose viscérale est mortelle en l'absence de traitement. Les options thérapeutiques courantes contre la leishmaniose viscérale sont limitées. En région méditerranéenne, la LV est due à Leishmania infantum, zoonose dont le chien est le principal réservoir. A côté de quelques cas d'infection systémique, un nombre important d'humains porteurs asymptomatiques a été mis en evidence. En première partie, nous avons étudié l'intérêt du MultiLocus Microsatellite Genotyping (MLMT) pour l'identification des souches de Leishmania du sud de la France. Par MLMT nous avons étudié la variabilité génétique de différentes souches et recherché une association avec les différentes formes cliniques, la résistance aux médicaments et les phénomènes de rechutes. Nous avons observé une hétérogénéité génétique entre les différentes souches de L. infantum MON-1. Si l'association de certains génotypes avec les différentes expressions cliniques de la leishmaniose n'a pu être démontrée, nous avons par contre observé une répartition préférentielle géographique de certains génotypes. En deuxième partie, nous avons mis au point un protocole expérimental destiné au criblage de nouveaux agents anti-Leishmania infantum ayant pour cible la machinerie cellulaire mise en route par la cellule hôte pour l'élimination du parasite intracellulaire. Nos résultats ont montré que les altérations du système de trafic intracellulaire de la cellule-hôte induites par certains composés étaient corrélées à la mort du parasite et à son élimination. / Visceral leishmaniasis (VL) is the most severe form of Human Leishmaniases, which occurs when protozoan parasites Leishmania donovani or L. infantum, given by phlebotomine sandfly bites. The disease is fatal when untreated. Current treatment options against VL are very limited with few drug molecules, often expensive, not always safe and able to induce resistance phenomenon.In this report, we have characterized on one hand, different genetic variants of Leishmania infantum strains isolated in different geographical areas from southern France and on the other hand have identified new potential anti-Leishmania infantum compounds and characterized their molecular mechanism of action.In the first part, we studied the interest of Multilocus Microsatellite Genotyping (MLMT) for the identification of Leishmania strains from southern France. By genotyping technique MLMT, we studied the genetic variability of different strains and sought an association with different clinical forms of leishmaniasis, resistance to drugs and relapse. We observed genetic heterogeneity among different strains of L. infantum-MON-1. we observed a preferential geographic distribution of certain genotypes.In the second part, we have developed an experimental protocol for the screening of new anti-Leishmania infantum compounds that target the host cell machinery responsible for the intracellular parasite killing, we studied the different steps of endocytic pathways potentially targeted by these compounds. Our results showed that with some compounds, modifications of the intracellular trafficking of the host cell were correlated with parasite death and its elimination.

Células produtoras de IFN-? e IL-17A são envolvidas na proteção contra infecção por Leishmania infantum (L. infantum). Ainda não está claro como o sistema imune coordena, ou o parasito manipula, o balanço entre Th1 e Th17 durante a leishmaniose visceral (LV). Utilizando RNAseq, PCR array e citometria de fluxo, nós demonstramos que, enquanto o padrão Th1 é altamente induzido, o perfil Th17 é inibido durante a infecção por L. infantum, e que as células B compõem uma fonte importante de IL-17A nesse modelo. Usando animais Nod2-/- e Rip2-/- nós caracterizamos essa via como um regulador negativo de células Th17 na LV. Por outro lado, a potente indução de Th1 foi dependente da sinalização via NOD2-RIP2 em células dendríticas CD8??+XCR1+, o que foi crucial para produção de IL-12 através da fosforilação de p38 e JNK. Como consequência, camundongos Nod2-/- e Rip2-/- tiveram defeito na resposta Th1, aumento de Th17, e maiores cargas parasitárias comparado com camundongos WT. Juntos, os dados mostram que a via de NOD2-RIP2 desempenha um papel importante na modulação da resposta imune adaptativa e promove proteção contra LV causada por L. infantum / IFN-? and IL-17A-producing cells are described to be related to protection against Leishmania infantum (L. infantum) infection. How the immune system coordinates, or the parasite manipulates, the balance between Th1 and Th17 during visceral leishmaniasis (VL) is still unknown. We showed here that Th17 is suppressed during L. infantum infection and B cells are an important source of IL-17A in this model. By using Nod2-/- and Rip2-/- mice we characterized this pathway as a negative regulator for Th17 cells in VL. On the other hand, the high level of Th1 induction was dependent on the NOD2-RIP2 signaling in CD8?+XCR1+ dendritic cells (DCs), which was crucial for IL-12 production through the phosphorylation of p38 and JNK. As a consequence, Nod2-/- and Rip2-/- mice showed a Th1 defective response, more Th17, and higher parasite loads compared to WT mice. Together, the data demonstrate that NOD2-RIP2 signaling pathway plays a role in shaping adaptive immunity and promotes protection against VL caused by L. infantum