Atualmente, a busca por opções de tratamento com medicações financeiramente mais acessíveis e menos agressivas ao organismo, aliada à uma visão mais humana de tratar o paciente, fez da homeopatia uma prática mais utilizada. Em se tratando de uma das sete endemias de maior impacto mundial, a Leishmaniose é uma doença negligenciada causada pelo parasita do gênero Leishmania, com estimativas alarmantes de novos casos e óbitos por ano, se tornando um grande problema de saúde pública. No Brasil, a Leishmaniose Visceral em áreas urbanas se destaca pelo fato de ser uma zoonose que possui como principal reservatório também o cão, que sempre esteve presente e em estreito contato com grande parte das famílias brasileiras. O mesmo, quando infectado pela doença, é submetido à eutanásia como norma do Ministério da Saúde, por apresentar riscos à população. Utilizando-se a Lei da Similitude, instruída por Hahnemann, chegou-se à medicação Antimonium crudum para possível tratamento e profilaxia da Leishmaniose Visceral Canina. Portanto, no presente trabalho, visou-se o estudo da ação da medicação homeopática Antimonium crudum, in vitro, diretamente em promastigotas de Leishmania (Leishmania) infantum chagasi, através do teste de MTT (brometo de 3-[4.5 dimetitiazol- 2- il) 2,5 difenil- 2 H- tetrazólio), que visa mensurar a atividade metabólica e a observação da curva de crescimento do parasito na forma promastigota, bem como a ação na infecção das Leishmanias em macrófagos da linhagem J774, em sua forma amastigota. Os resultados obtidos para a forma promastigota mostram que o estímulo homeopático não teve influência direta sobre os parasitos, tanto no teste de MTT quanto na curva de crescimento, corroborando os estudos que sugerem que a homeopatia não age diretamente sobre o parasito e sim em conjunto com o sistema imune do hospedeiro. Já nos resultados dos ensaios infectivos, observa-se, em geral, maior porcentagem de macrófagos infectados, assim como maior taxa de fagocitose nos grupos tratados com Antimonium crudum, o que sugere uma maior atividade dos mesmos levando à uma resposta imune secundária mais representativa e consequentemente, à destruição do antígeno. Quando se verificou o pré e o pós-tratamento de macrófagos, observou-se que as potências mais baixas, CH6 e CH12, parecem ter maior eficiência e quando a infecção já está instalada, a potência CH30 parece ter uma maior significância na profilaxia da infecção. Apesar disso, a resolução da doença dependerá da ação imunológica de cada hospedeiro, que irá controlar o crescimento e manutenção do parasito ou não / Currently, the search for treatments with medicines that are financially affordable, less aggressive to the host, and more humane in treating the patient, homeopathy is the most practical course. When it comes to one of the seven largest worldwide impact endemics, Leishmaniasis is a neglected public health complex with alarming estimates of new cases and deaths per year. In Brazil, urban Visceral Leishmaniasis also stands out because the reproductive cycle of this zoonotic disease can include the dog, which has always been present and in close contact with most Brazilian families. Dogs, when infected by the disease are euthanized as a rule from the Ministry of Health to prevent risks to the population. Using the Law of Similars, developed by Hahnemann, the medication Antimonium crudum was identified as possible treatment and prophylaxis for Canine Visceral Leishmaniasis. Therefore, the present work was to study the direct action of the homeopathic medicine Antimonium Crudum in vitro against the promastigotes of Leishmania (Leishmania) infantum chagasi, through the MTT test (3- [4.5 - dimetitiazol- 2-yl) - 2.5 diphenyl tetrazolium H 2), which aims to measure the metabolic activity; the promastigote growth curve; as well as the performance of promastigote infectivity in J774 macrophages. The results from both the MTT assay as well as the growth curve show that the homeopathic stimulus did not directly influence the promastigote form of the parasites, corroborating studies that suggest that homeopathy has no direct action on the parasite, but may function together with the host\'s immune system. Treatment with Antimonium crudum led to a higher percentage of infected macrophages in the infectivity assays and a higher rate of phagocytosis, which suggests increased activity leading to a stronger secondary immune response and as a result, antigen destruction. Assays in which macrophages were treated before or after infection suggest that lower concentrations (CH6 and CH12) seem most effective when the cells are already infected, however a higher concentration (CH30) appears to have greater activity in preventing infection. Ultimately, the resolution of the disease depends on the immunological action of each host, which may control the growth and maintenance of parasite

A definição de caso confirmado de leishmaniose visceral é baseada em aspectos clínicos, epidemiológicos e laboratoriais. As técnicas padrão-ouro para o diagnóstico laboratorial da leishmaniose visceral são as parasitológicas esfregaço e cultura de aspirado de medula óssea, que permitem a identificação do gênero Leishmania por visualização microscópica do parasito em lâmina, e os testes sorológicos, como o imunocromatográfico, que apresenta baixa sensibilidade em indivíduos imunodeprimidos. Em determinadas situações, como na coinfecção Leishmania/HIV, para o tratamento específico ou nos inquéritos epidemiológicos, faz-se necessária a identificação do agente etiológico da leishmaniose visceral, que comumente é a L. (L.) infantum. Desse modo, propusemos um algoritmo para o diagnóstico molecular da leishmaniose visceral, com o emprego da kDNA PCR (K20-K22 E RV1-RV2) do ITS1 PCR (LITSR e L5. 8S), tendo como referência os resultados obtidos nos exames parasitológicos e sorológicos, além de dados clínicos e epidemiológicos dos pacientes. Complementando nossa proposta, a realização da técnica de análise dos polimorfismos dos fragmentos da ITS1 PCR por RFLP, para identificação do agente etiológico, foi avaliada como alternativa à laboriosa técnica de eletroforese de isoenzimas, padrão-ouro para definição de espécies no diagnóstico das leishmanioses. As técnicas moleculares empregadas foram validadas em 82 amostras (ITS 1 PCR e kDNA PCR RV1-RV2) e 48 amostras (kDNA PCR K20-K22) de pacientes com leishmaniose visceral confirmada e em 30 amostras de pacientes saudáveis. Os ensaios obtiveram as seguintes sensibilidades: 97,5% (80/82) na ITS1 PCR, 98% (47/48) na kDNA PCR K20-K22, e 92,7% (76/82) na kDNA PCR RV1-RV2, e 100% de especificidade em todos os testes. Quando comparados os resultados obtidos nos testes moleculares ITS1 PCR, kDNA PCR K20-K22 e kDNA PCR RV1-RV2 ao padrão ouro observou-se uma concordância quase perfeita, com um índice kappa maior que 0,80, e um valor de p < 0,001. No que concerne à realização da ITS1 PCR RFLP nas 80 amostras positivas, 52,5% (42/80) demonstraram perfil semelhante ao de L. (L.) infantum. Três das amostras que não demonstraram perfil na RFLP da ITS1 PCR e na kDNA PCR K20-K22 obtiveram mais de 90% de identidade com a cepa de L. (L.) chagasi, mediante análise das amostras na técnica do sequenciamento. Concluímos o presente estudo com a proposta de um algoritmo de diagnóstico molecular da leishmaniose visceral, que deverá considerar a realização prévia do diagnóstico parasitológico e imunocromatográfico. E sugerimos, quando necessário, a realização da kDNA PCR K20-K22 e a kDNA PCR RV1-RV2 para a determinação do gênero e de subgênero da Leishmania, respectivamente. Por fim, que se complemente com a ITS1 PCR, seguida da ITS1 RFLP para a definição do agente etiológico da leishmaniose visceral. / The definition of visceral leishmaniasis case is based on clinical, epidemiological and laboratory aspects. The gold standard techniques for laboratory diagnosis of visceral leishmaniasis are parasitological, smear and culture of bone marrow aspirate, which allow the identification of Leishmania in microscopic visualization, and the serological tests, like the immunochromatographic, which presents low sensitivity in immunodepressed individuals. In certain situations, such as Leishmania/HIV co-infection, for specific treatment or in epidemiological surveys, it is necessary to identify the etiological agent of visceral leishmaniasis, commonly caused by L. (L.) infantum. In this way, an algorithm for the molecular diagnosis of visceral leishmaniasis by kDNA PCR (K20/K22 and RV1/RV2) and ITS1 PCR (LITSR e L5.8S) was proposed, using as the gold standard, the parasitological and serological results, as well as clinical and epidemiological data of patients. Complementing our proposal, the performance of the Restriction Fragment Length Polymorphism of the ITS1 (ITS1 PCR RFLP) to identify the etiological agent, was evaluated as an alternative to technical laboriously isoenzyme electrophoresis, the gold standard for defining species in the diagnosis of leishmaniasis. The molecular techniques were validated on 82 samples (ITS 1 kDNA PCR and PCR-RV1 RV2) and 48 samples (K20-K22 kDNA PCR) from patients with confirmed visceral leishmaniasis and 30 samples from healthy patients. The following sensitivities were presented by the molecular tests: 97.5% (80/82) for the ITS1 PCR, 98% (47/48) for kDNA PCR K20-K22 and 92.7% (76/82) for kDNA PCR-RV2 RV1, and 100% specificity for all tests. When comparing the results from molecular tests ITS1 PCR, kDNA PCR K20-K22 and kDNA PCR RV1-RV2 with the established gold standard, we see an almost perfect agreement with kappa index higher than 0.80, and p value <0.001 were obtained. As regard to ITS1 PCR RFLP, from 80 positive samples, 52.5% (42/80) showed a similar profile to that of L. (L.) infantum. Three of the samples that did not demonstrate RFLP profile in the ITS1 PCR and PCR kDNA K20-K22 obtained more than 90% of identity with strain L. (L.) chagasi, by analyzing the samples in sequencing. As our conclusion, an algorithm for the molecular diagnosis of visceral leishmaniasis must consider a previous performance of the parasitological and immunochromatographic diagnosis. When necessary kDNA PCR K20-K22 and kDNA RV1-RV2 PCR are suggested to determine the genus and the subgenus Leishmania, respectively. In addition, this molecular diagnosis can be complemented, with the ITS1 PCR, followed by RFLP ITS1, which can define the etiological agent of visceral leishmaniasis.

A leishmaniose visceral canina (LVC) é uma grave zoonose, causada pela Leishmania infantum (syn. chagasi). O ciclo deste parasito é heteroxeno e a transmissão acontece principalmente pela picada da fêmea do vetor, dípteros da espécie Lutzomyia longipapis. O cão doméstico é o principal alvo das campanhas de controle da doença por ser a principal fonte de infecção para o vetor no ambiente urbano. O Ministério da Saúde adota testes sorológicos para a detecção de animais positivos; no entanto a sensibilidade e especificidade desses testes são questionáveis. Além das falhas inerentes a qualquer teste diagnóstico, no caso da LVC existem alguns entraves, especialmente pela distribuição geográfica, comum a outras doenças causadas por tripanossomas, e pela similaridade genética com os outros parasitas da mesma família. Nessas áreas de sobreposição pode haver tanto reação cruzada quanto co-infecção, dificultando a interpretação dos testes. No presente estudo, foram coletadas amostras de suabe conjuntival e sangue de cães em inquérito soroepidemiológico realizado no município de Ilha Solteira - SP. A presença de Leishmania spp. e Leishmania infantum foram testadas por PCR convencional e PCR em tempo real com primers direcionados ao kDNA de Leishmania spp. A avaliação sorológica foi realizada através da RIFI, e a identificação e caracterização dos tripanossomatídeos foi realizada através da PCR com primers ITS1. A SC-qPCR foi o teste que detectou o maior número de animais. De 204 cães utilizados no estudo, 19,12% (30/204) foram positivos na SC-qPCR. Na SG-qPCR foram 12,74% (26/204) de animais positivos. O teste que detectou o menor número de animais foi a SC-cPCR, com 10,78% (22/204). Enquanto na SG-cPCR obtivemos 13,23% (27/204) animais positivos. De 28 amostras selecionadas para o sequenciamento do gene ITS1, 19 (67,85%) foram 100 ou 99% similares à L. infantum, sugerindo que a maioria dos cães positivos para LVC estavam realmente infectados com esta espécie. Entretanto, 2 cães (7,14%), que tiveram suas amostras sequenciadas para tal gene, revelaram 99% de similaridade com Crithidia fasciculata. Dos testes avaliados, esses cães foram positivos apenas na SG-cPCR para Leishmania spp. Os resultados indicam que a SC-qPCR foi o teste mais eficaz em detectar amostras realmente positivas para L. infantum, e que se deve atentar ao fato de existirem outros tripanossomatídeos infectando os cães em área endêmica de LVC, podendo dificultar o diagnóstico adequado dos animais infectados por L. infantum. / Canine visceral leishmaniasis (CVL) is a serious zoonosis caused by Leishmania infantum (syn. chagasi). The life cycle of this parasite is heteroxenous and the transmission occurs through the bite of the female sandfly, diptera species Lutzomyia longipalpis. The domestic dog is the main focus disease control campaigns, since it is the most important source of infection for the vector in urban environment. For positive dogs detection the health ministry uses serological tests, however the sensitivity and specificity of these tests are questionable. In addition to flaws inherent in any diagnostic test, in case of CVL there are some obstacles, especially by geographic distribution, common to other diseases caused by trypanosomes, and also by genetic similarity with other parasites of the same family. In areas of disease overlap, cross-reaction or co-infection may occur, making it difficult to interpret the results. In this study, conjunctival swab samples and whole blood of dogs were collected in seroepidemiological survey conducted in Ilha Solteira - SP. The presence of Leishmania spp. and Leishmania infantum were tested by conventional PCR and real-time PCR with Leishmania spp. kDNA-targeted primers. The serological evaluation was carried out by RIFI, and the identification and characterization of trypanosomatids was performed by PCR with ITS1 primers. SC-qPCR was the test that detected the largest number of animals. Of 204 dogs used in this study, 19.12% (30/204) were positive in SC-qPCR. In SG-qPCR 12.74% (26/204) animals were positive. The test that detected the lowest number of animals was SC-cPCR, with 10.78% (22/204). While in the SG-cPCR we obtained 13.23% (27/204) positive animals. From 28 samples selected for ITS1 gene sequencing, 19 (67.85%) were 100 or 99% similar to L. infantum, suggesting that most CVL positive dogs were infected with this species. However, two dogs (7.14%), which had their samples sequenced for the same gene, showed 99% similarity with Crithidia fasciculata. From the evaluated tests, these dogs were only positive in SG-cPCR for Leishmania spp. The results indicate that SC-qPCR was the most effective test to detect L. infantum positive samples , and it should be noted that there are other trypanosomatids infecting dogs in an endemic CVL area, which can difficult to diagnose animals properly infected by L. infantum.

Nas Américas, em especial na América do Sul, a infecção por Leishmania (L.) infantum chagasi causa manifestações subclínicas e leishmaniose visceral (LV), a qual quando não tratada é potencialmente fatal. Na América Central, especialmente em Honduras, a leishmaniose cutânea não ulcerada ou atípica e a leishmaniose visceral são causadas pelo mesmo agente etiológico Leishmania (L.) infantum chagasi e ocorrem na mesma região geográfica. Pouco se conhece sobre o perfil da infecção humana por Leishmania (L.) infantum chagasi em Honduras, especialmente sobre a forma não ulcerada ou atípica, sendo assim, no sentido de compreender melhor a patogênese da infecção causada por esta espécie de parasito no município de Amapala (Valle) e Orocuina (Choluteca), Honduras, o presente estudo visou a caracterização histopatológica e da resposta imune celular in situ em lesões de pacientes com leishmaniose cutânea não ulcerada ou atípica. Foram utilizadas 20 biópsias de pele de pacientes com diagnóstico parasitológico confirmado por raspado de lesão corado por Giemsa e observado em microscópio ótico. A histopatologia foi avaliada em cortes histológicos corados por hematoxilina-eosina (HE) e a resposta imune por meio da reação de imunoistoquímica utilizando anticorpos primários para macrófagos (CD68), linfócitos T (CD4, CD8), células natural killer - NK (CD56), linfócitos B (CD20), óxido nítrico sintetase (NOS2) e interferon-gama (IFN-y. Microscopicamente as alterações histopatológicas mais significativas foram observadas na derme superficial e profunda caracterizando-se por um infiltrado inflamatório predominantemente linfohistiocitário de intensidades variável com arranjo difuso e, por vezes, associado à formação de granulomas epitelioides. A observação de formas sugestivas do parasito ocorreu em apenas 55 % dos casos. A análise imunoistoquímica das lesões confirmou a presença de células mononucleares no infiltrado inflamatório caracterizada principalmente pela presença de linfócitos TCD8+, seguido por TCD4+, macrófagos, linfócitos B e células NK. A grande densidade de células INF-y+ e a presença da enzima iNOS, responsável pela produção de óxido nítrico, molécula com atividade leishmanicida, em quase a totalidade dos macrófagos do infiltrado inflamatório, sugere uma resposta imune local bastante efetiva, que colabora para o controle do número de parasitos e consequentemente a evolução do tamanho da lesão / In America, especially in South America, infection by Leishmania (L.) infantum chagasi causes subclinical manifestations and visceral leishmaniasis (VL), which when untreated is potentially fatal. In Central America, especially in Honduras, non-ulcerated or atypical cutaneous leishmaniasis and visceral leishmaniasis are caused by the same etiologic agent Leishmania (L.) infantum chagasi and occur in the same geographic region. Little is known about the profile of human infection by Leishmania (L.) infantum chagasi in Honduras, especially on the non-ulcerated or atypical form. In order to better understand the pathogenesis of the infection caused by this species of parasite in the municipality of Amapala (Valle) and Orocuina (Choluteca), Honduras, the present study aim the characterization of histopathological changes and cellular immune response in situ in lesions of patients with non-ulcerated or atypical cutaneous leishmaniasis. Twenty skin biopsies from patients with parasitological diagnosis confirmed by scraping of Giemsa-stained lesion and observed using an optical microscope. Histopathology, was evaluated by hematoxylin-eosin (HE) and the immunohistochemistry using the primary antibodies to macrophages (CD68), T lymphocytes (CD4, CD8), natural killer cells - NK (CD56), B lymphocytes CD20), nitric oxide synthase (NOS2) and interferon-gamma (IFN-y). Microscopically, the most significant histopathological changes were observed in the superficial and deep dermis, characterized by a predominantly lymphohistiocytic inflammatory infiltrate of variable intensities with diffuse arrangement and sometimes associated with the formation of epithelioid granulomas; the observation of suggestive forms of the parasite occurred in only 55 % of the cases. The immunohistochemical analysis of the lesions confirmed the presence of mononuclear cells in the inflammatory infiltrate characterized mainly by the presence of T-CD8+ lymphocytes, followed by T-CD4+, macrophages, B lymphocytes and NK cells. The high density of INF-y+ cells and the presence of iNOS, enzyme responsible for the production of nitric oxide, molecule with activity leishmanicide, in almost all of the macrophages in the inflammatory infiltrate, suggest an effective local immune response that collaborate to the control in the number of parasites and consequently the evolution of the lesion

Les phlébotomes sont les vecteurs reconnus de plusieurs arbovirus, en particulier du genre Phlebovirus, ainsi que de parasites du genre Leishmania. Les infections par les phlébovirus sont responsables chez l’homme de maladies décrites depuis longtemps, pourtant ils demeurent méconnus, avec en particulier un manque de données épidémiologiques et d’outils de diagnostic.Dans une première partie, des études de séroprévalence nous ont permis d’aborder l’impact en santé publique, dans le sud-est de la France, de deux phlébovirus connus pour leur pouvoir pathogène chez l’homme, Toscana virus (TOSV) et Sandfly fever Sicilian virus (SFSV). Pour ce dernier, des anticorps spécifiques (IgG) ont été détectés dans moins de 1% des sérums testés, ce qui suggère que SFSV joue un rôle mineur dans les pathologies humaines de cette région ; ces résultats sont corroborés par l’absence, durant ces dernières décennies, de cas documentés d’infection aigüe due à SFSV en Europe occidentale. Nous avons donc pu concentrer notre travail sur le deuxième groupe de phlébovirus d’intérêt chez l’homme, le groupe des Sandfly fever Naples virus, qui inclut notamment TOSV. Nous avons démontré l’existence d’un lien épidémiologique entre les infections à Leishmania infantum et celles à TOSV, certainement dû au fait que ces pathogènes sont transmis par un vecteur commun (Phlebotomus perniciosus). Les analyses statistiques ont montré que les personnes exposées aux infections à TOSV ont plus de chance d’être aussi infectées par les parasites leishmanies (et vice versa). En admettant que ce lien épidémiologique entre leishmanioses et infections à TOSV est représenté par l’exposition à la piqûre d’un vecteur commun, cette étude confirme l’implication de Phlebotomus perniciosus en tant que vecteur principal de TOSV dans le sud de la France. Cette étude suggère également que certaines données épidémiologiques disponibles pour la leishmaniose pourraient être utilisées pour décrypter l’épidémiologie des infections à TOSV.La deuxième partie de cette thèse est consacrée à la détection, l’isolement et la caractérisation de virus, déjà connus ou inconnus, dans les populations de phlébotomes en France et en Afrique du Nord. Pour atteindre cet objectif, nous avons dû développer une plateforme d’analyse à au débit, adaptée pour la découverte de virus dans les phlébotomes, qui permette de traiter un grand nombre d’échantillons à faible coût. Cette plateforme a récemment été complétée par un outil de Next Generation Sequencing, afin de réaliser la caractérisation génétique complète des virus isolés et découverts. Au total, 12 576 phlébotomes ont été capturés au cours de 12 campagnes de capture menées en France, en Tunisie et en Algérie. Au sein d’une même zone géographique, la découverte de plusieurs nouveaux phlébovirus, ainsi que leur taux d’infection observé dans les populations de phlébotomes, ont démontré que la diversité de phlebovirus est bien plus importante qu’attendue.Dans la troisième partie de cette thèse, une étude de séroprévalence a été menée sur des sérums humains en utilisant des tests comparatifs de neutralisation de virus. Cette étude nous a permis d’exclure le virus Punique, récemment découvert, de la liste des principales menaces en santé publique au nord de la Tunisie, et de confirmer que TOSV est le principal phlebovirus pathogène ayant un impact en santé publique dans cette région du pays. Cette méthode de neutralisation est capable d’identifier précisément, parmi des virus génétiquement proches, le virus contre lequel les anticorps présents dans le sang ont été produits, ce qui permet de déterminer la capacité de chacun de ces virus à jouer un rôle en santé publique. / Sandflies are vectors of various arthropod-borne viruses, in particular viruses within the genus Phlebovirus, family Bunyaviridae, and of parasites in the genus Leishmania. Human diseases caused by infection with sandfly-borne phleboviruses are known for a long time, but they remain neglected due to the lack of epidemiological knowledge and of diagnostic tools.The first part consisted of seroprevalence studies in human sera to address the public health impact in south-eastern France of two recognized sandfly-borne phleboviruses, namely Toscana virus (TOSV) and Sandfly fever Sicilian virus (SFSV). Concerning the latter, specific IgG were detected in less than 1% of tested sera, suggesting that SFSV play a minor role in human disease in the region; this finding was corroborated with the lack of documented case of acute infection due to SFSV in Western Europe during the last decade. This pleaded for focusing on the other group of sandfly fever viruses known for their human interest, namely the group of Sandfly fever Naples virus that includes TOSV. We demonstrated an existing epidemiological relationship between Leishmania infantum and TOSV infections, presumably through the transmission by the common arthropod vector (Phlebotomus perniciosus). Statistical analysis showed that persons exposed to TOSV infection are at greater risk of being infected with Leishmania parasite (and vice versa). Assuming that epidemiological link between leishmaniasis and TOSV infection may be represented by the exposure to the bite of a common vector, this study confirms the involvement of Phlebotomus perniciosus as the major vector of TOSV in the South of France. This study also suggests that some of the epidemiological data available on Leishmaniasis may be used to decipher the epidemiology of TOSV infections..The second part of this thesis was dedicated to detection, isolation and characterization of existing and/or new phleboviruses in sandfly populations in France and in North Africa. To achieve this aim, we had to set up a high-throughput cost-effective platform amenable to virus discovery in sandflies; this sandfly-processing platform has been recently docked to a Next Generation Sequencing platform for full genetic characterization of newly isolated and discovered viruses. A total of 12,576 sandflies were trapped during 12 campaigns conducted in France, Tunisia and Algeria. The discovery of several new phleboviruses and their observed frequency in sandfly populations has clearly demonstrated that within a given geographic area, virus diversity is much higher than previously believed.In the third part of this thesis, a seroprevalence study based on comparative virus neutralization tests was performed on human sera and allowed to exclude the newly described Punique virus from the list of major public health threats in northern Tunisia, and to confirm that TOSV is the dominant phleboviral pathogen with an impact on public health in this part of the country. This neutralization method is suitable to identify precisely the virus against which antibodues were elicited, allowing to discriminate among closely related phleboviruses, and to determine their propensity to play a role in public health.

Nas leishmanioses, sabe-se que tanto na resistência quanto na suscetibilidade à infecção, a resposta imune celular é considerada a mais importante. No entanto, na fase inicial, fatores inespecíficos estão sendo considerados fundamentais na determinação do curso da doença, como o fator de crescimento insulina-símile I (\"insulin-like growth factor\"-IGF-I). Em trabalhos anteriores realizados no grupo de pesquisa da Profa. Dra. Hiro Goto mostraram que IGF-I extrínseco favorece a proliferação do parasito e progressão da infecção, com diminuição na produção de óxido nítrico e ativação da arginase de macrófagos e do parasito. Sabendo que os macrófagos produzem intrinsecamente IGF-I, avaliamos o efeito do fator intrínseco no parasitismo em macrófagos de camundongos BALB/c infectados por L. (L.) infantum silenciando a expressão do RNA mensageiro (mRNA) de IGF-I na célula pela técnica de RNA de interferência (siRNA). Iniciamos avaliando a expressão do mRNA de IGF-I e do seu receptor (IGF-IR). Foi observado uma diminuição de 1,4 vezes da expressão do mRNA de IGF-I em 24 horas e um aumento de 1,5 vezes em 48 horas quando comparado com o grupo controle. Também foi observado um aumento na expressão de mRNA do receptor de IGF-I em 24 como em 48 horas nos grupos infectados quando comparado com o grupo controle. Com o silenciamento do IGF-I por siRNA, houve diminuição da expressão de mRNA do IGF-I no macrófago em torno de 71% em 24 horas e de 51% em 48 hora. Na ausência ou diminuição do IGF-I no macrófago, observou-se uma diminuição do parasitismo na infecção com promastigotas, sendo o parasitismo recuperado com a reposição de IGF-I extrínseco no sistema, atestando a importância de IGF-I na proliferação do parasito. Esses resultados reforçam a importância do IGF-I na infecção por L. infantum, sugerindo que o IGF-I está diretamente relacionado ao parasitismo. / In leishmaniasis, it is known that in both resistance and susceptibility to infection, the cellular immune response is considered the most important. However, in the initial phase, nonspecific factors are being considered as fundamental in determining the course of the disease, such as insulin-like growth factor I (IGF-I). Studies carried out in the research group of Profa. Dr. Hiro Goto showed that extrinsic IGF-I favors parasite proliferation and infection progression, with decrease in nitric oxide production and activation of arginase of macrophages and parasite. It is known that macrophages produced IGF-I (intrinsic IGF-I), thus, in the present study we have investigated the effect of the intrinsic factor in the parasitism on macrophages of BALB/c mice infected with L. (L.) infantum by silencing the expression of messenger RNA (IGF-I mRNA) in the cell by the interference RNA technique (siRNA). We started evaluating the expression of IGF-I mRNA and its receptor (IGF-IR). A 1.4-fold decrease in IGF-I mRNA expression was observed in 24 hours and a 1.5-fold increase in 48 hours as compared to the control group. An increase in mRNA expression of the IGF-IR was also observed in 24 as well as in 48 hours in the infected groups as compared to the control group. With IGF-I silencing by siRNA, there was a decrease in IGF-I mRNA expression in the macrophage around 71% in 24 hours and 51% in 48 hours. In the absence or decrease of IGF-I in the macrophage, a decrease in the parasitism in the infection with promastigotes was observed, and the parasitism recovered with the replacement of extrinsic IGF-I in the system, confirming the importance of IGF-I in the proliferation of the parasite. These results reinforce the importance of IGF-I in L. infantum infection, suggesting that IGF-I is directly related to the parasitism.

Leishmaniose visceral (LV) é uma doença causada por Leishmania (Leishmania) infantum no Brasil. Na infecção ao lado da reposta imune específica, fatores inespecíficos do hospedeiro podem desempenhar um papel importante. Em trabalhos desenvolvidos pelo nosso grupo observou-se na infecção in vitro de macrófagos murinos por L. (L.). major o papel de IGF-I como efetor da resposta a IL-4, demonstrando que o IGF-I é um fator importante envolvido na interação parasito-hospedeiro no modelo de Leishmania (L.) major. Observou-se que os fatores envolvidos na interação mudam dependendo da espécie de Leishmania envolvida na infecção, desta forma, procuramos o papel do IL-4 e sua relação com o IGF-I na infecção de macrófagos humanos THP-1 por L. (L.) infantum. Macrófagos THP-1 foram infectados com L. (L.) infantum, sob o estimulo de IL-4 e IGF-I recombinante. Nossa análise do parasitismo não revelou um aumento após 24 e nem 48 horas e sim após 72 horas sob estimulo de IL-4 e o parasitismo sob estimulo de IGF-I não aumento após 24 e nem 72 horas e sim uma diminuição após 48 horas. Enquanto a produção de NO e a atividade da arginase se mantiveram constantes em todos os períodos avaliados a expressão de arginase 1 aumenta na infecção, mas os estímulos de IL-4 e IGF-I não tem efeito sobre a expressão. A expressão de IGF-I aumenta na infecção e os estímulos de IL-4 e IGF-I não tem efeito sobre a expressão. Já a expressão do receptor apresentou uma diminuição durante a infecção nos tempos avaliados. Considerando os nossos achados, onde a infecção de macrófago humano por L. (L.) infantum não estimulou a produção de NO e nem a atividade da arginase e os estímulos de IL-4 e IGF-I nas células infectadas não provocou um aumento significativo da atividade da arginase, os dados sugerem que a arginase tanto da célula quanto do parasita não sejam fundamentais para o desenvolvimento do parasita e onde a produção de NO na célula não seja danosa para o parasita. / Visceral leishmaniasis (LV) is a disease caused by Leishmania (Leishmania) infantum in Brazil. During infection the specific immune response, nonspecific host factors may play an important role. In studies developed by our group we observed the role of IGF-I as an effector of the IL-4 response in the in vitro infection of murine macrophages by L. (L.). major, demonstrating that IGF-I is an important factor involved in the parasite-host interaction in the Leishmania (L.) major model. It was observed that the factors involved in the interaction depend on the species of Leishmania involved in the infection. In this way, we look for the role of IL-4 and its relationship with IGF-I in L. (L.) infantum infected human THP-1 macrophages. THP-1 macrophages were infected with L. (L.) infantum under stimulation of recombinant IL-4 and recombinant IGF-I. Parasitism analysis did not show an increase after 24 and 48 hours, but after 72 hours under IL-4 stimulation and parasitism under IGF-I stimulation did not increase after 24 nor 72 hours but a decrease after 48 hours. While NO production and arginase activity remained constant at all evaluated periods, arginase 1 mRNA expression increased in infection, but the IL-4 and IGF-I stimuli had no effect on expression. Expression of IGF-I mRNA increases in infection and the IL-4 and IGF-I stimuli have no effect on expression. Already the expression of the receptor presented a decrease of mRNA during the infection in the evaluated times. The expression of the receptor showed a decrease in expression during infection at the times evaluated. Considering our findings, where human macrophage infection by L. (L.) infantum did not stimulate NO production and neither arginase activity nor the IL-4 and IGF-I stimuli in infected cells did not induce a significant increase of the arginase activity, the data suggest that neither cell nor parasite arginase are critical to parasite development and where NO production in the cell is not harmful to the parasite.

A leishmaniose visceral, causada no Brasil por protozoários da espécie Leishmania (L.) infantum, apresenta-se nos canídeos com manifestações similares à doença humana. Diversos trabalhos tem investigado a relação entre raças caninas e suscetibilidade/resistência à doença sendo as alterações lipídicas consideradas também nessa avaliação. Para avaliar o grau de comprometimento conforme a raça e as alternações lipídicas nos cães portadores de leishmaniose visceral, analisamos alterações hematológicas e bioquímicas frente à manifestação da doença em diferentes raças ou grupos raciais. Para tanto, incluímos 162 cães de área endêmica, sem histórico de outras patologias ou de vacinação contra leishmaniose, organizados em grupos de cães naturalmente infectados segundo a raça, quais sejam, Boxer, Labrador, Pit Bull, Sem Raça Definida (SRD) e Outras Raças, e grupo controle não infectados. Na avaliação das manifestações clínicas, dividimos os animais, dentro de cada grupo de cães infectados em assintomáticos (sem nenhum sinal clínico), oligossintomáticos (de 1 a 3 sinais clínicos) e polissintomáticos (acima de 3 sinais clínicos). As raças/grupos formadas pelo total de cães infectados (assintomáticos + oligossintomáticos + polissintomáticos) também foram avaliados segundo o escore de gravidade da infecção. Para analisar as possíveis alterações laboratoriais decorrentes da infecção de cães por Leishmania (L.) infantum foram realizados hemograma, leucograma, dosagens de albumina, globulinas, proteínas plasmáticas totais, creatinina, ureia, alanino aminotransferase (ALT), Fosfatase Alcalina (FA), colesterol total, lipoproteínas de alta densidade (high density lipoproteins, HDL), lipoproteínas de baixa densidade (low density lipoproteins, LDL), lipoproteínas de densidade muito baixa (very low density lipoproteins, VLDL) e triglicérides. Analisados em conjunto, observamos que os animais assintomáticos, independentemente de raça/grupo, apresentaram parâmetros bioquímicos e hematológicos similares aos valores descritos para o grupo controle não infectado. Não observamos diferença na gravidade das manifestações da doença entre as raças ou grupos raciais para o desenvolvimento da Leishmaniose Visceral Canina. As diversas raças e grupos raciais apresentaram alterações nos parâmetros pesquisados, porém os quadros de hipoalbuminemia, hiperglobulinemia e anemia foram identificados com maior frequência, sendo correlacionados à gravidade na raça Labrador e nos grupos SRD e Outras Raças. O quadro de anemia foi mais importante na raça Pit Bull. O grupo Outras Raças apresentou o maior número de alterações correlacionadas à gravidade. A raça Labrador apresentou concentração de HDL diminuída em relação às demais raças. As alterações lipídicas, principalmente em HDL, VLDL e triglicérides foram correlacionadas à gravidade no grupo Outras Raças. / Visceral leishmaniasis caused in Brazil by protozoa Leishmania (L.) infantum, presents in dogs similar manifestations as human disease. Some work has investigated the relationship between dog breeds and susceptibility/resistance to disease and lipid changes has been also considered in this evaluation. To assess the degree of commitment according breed and lipid changes in dogs with visceral leishmaniasis, we analyzed hematological and biochemical parameters and the manifestation of the disease in different breeds or groups. Therefore, we included 162 dogs from an endemic area of Brazil with no history of other diseases or vaccination against leishmaniasis, organized in groups of dogs naturally infected by breed, namely Boxer, Labrador, Pit Bull, Mogrel dogs, Other Breeds and uninfected control group. In the evaluation of the clinical manifestations, we divided the animals in infected asymptomatic (no clinical signs), oligosymptomatic (1-3 clinical signs) and polisymptomatic dogs (above 3 clinical signs). Breeds/groups formed by the total of infected dogs (asymptomatic+oligosymptomatic+polisymptomatic) were also assessed according to the severity of the infection. To analyze the possible laboratory changes resulting from infection of dogs by Leishmania (L.) infantum were performed red blood cell count, white blood cell count, evaluation of albumin, globulin, total plasma protein (TPP), creatinine, urea, alanine aminotransferase (ALT), alkaline phosphatase (ALP), total cholesterol, high density lipoproteins (HDL), low density lipoproteins (LDL), very low density lipoprotein (VLDL) and triglycerides. Taken together, we observed that asymptomatic animals, regardless of breeds/group, showed biochemical and hematological parameters similar to values reported for the uninfected control group. There were no differences in severity of disease manifestations among breed or racial groups for the development of Canine Visceral Leishmaniasis. The different breeds and racial groups showed changes in the parameters studied, but hypoalbuminemia, hypergammaglobulinemia and anemia were identified more frequently being correlated to the severity in Labrador, mongrel and Other Breeds groups. The anemia was most important in Pit Bull. The group Other Breeds had the largest number of changes correlated to the severity. The Labrador showed decreased HDL levels compared to other breeds. Lipid changes, especially in HDL, VLDL and triglycerides were correlated to the severity in the Other Breeds group.

A leishmaniose é um termo global para doenças causadas por parasitos do gênero Leishmania, sendo a Leishmaniose Visceral (LV) a forma mais grave da doença. No Brasil é causada pelo parasita Leishmania (Leishmania) infantum chagasi. Para garantir a sua sobrevivência, alguns parasitas são capazes de manipular respostas de defesa das células do sistema imune. Recentes estudos demonstraram a participação da proteína imunomodulatória CD200 durante o processo de infecção de L. (L.) amazonenses. O presente estudo teve como objetivo investigar se os parasitos L. (L.) infantum chagasi são capazes de induzir a expressão da proteína CD200 durante o processo infeccioso. Em ensaios de infecção ex vivo, não foi observado proliferação de parasitas intracelulares. Apesar disso, L. (L.) infantum chagasi foi capaz de induzir a expressão do gene CD200. De maneira interessante, diferente de infecções por L. (L.) amazonenses, a indução de CD200 nessas células foi observada em tempos mais tardios de infecção. Ensaios de imunoprecipitação e Western blot indicaram a síntese da proteína, que atingiu os seus maiores níveis a 120 horas pós-infecção. A presença de CD200 sugere o envolvimento dessa molécula em tempos mais tardios de infecção por L. (L.) infantum chagasi. / Leishmaniasis is a global term for diseases caused by parasites of the genus Leishmania, and Visceral Leishmaniasis (VL) are the most severe form of the disease. In Brazil is caused by the parasite Leishmania (Leishmania) infantum chagasi. To ensure their survival, some parasites can handle defensive responses of the cells of the immune system. Recent studies have demonstrated the participation of immunomodulatory protein CD200 during the infection process of L. (L.) amazonenses. This study aimed to investigate whether the parasites L. (L.) infantum chagasi are capable of inducing the expression of CD200 protein during the infectious process. In trials of ex vivo infection, there was no proliferation of intracellular parasites. Nevertheless, L. (L.) infantum chagasi was able to induce the expression of CD200 gene. Interestingly, unlike infection by L. (L.) amazonenses, CD200 induction of these cells was observed at later times in infection. Immunoprecipitation assays and Western blot indicated protein synthesis, which reached their highest levels at 120 hours post-infection. The presence of CD200 suggests the involvement of this molecule at later times of infection with L. (L.) infantum chagasi.

INTRODUÇÃO: A leishmaniose visceral (LV), pertence ao grupo de endemias consideradas prioritárias no mundo. É uma doença grave e com poucas opções de tratamento e, mesmo quando adequadamente tratada, possui um nível de letalidade de 5 a 7%. Apesar da expansão da doença, o tratamento para leishmaniose visceral não obteve avanços. O tratamento da leishmaniose possui apenas dois grupos de medicamentos utilizados: os antimonoiais e os não-antimoniais. Os compostos nitroheterocíclicos foram utilizados pois acredita-se que a eficácia desta classe de compostos está na habilidade desses compostos inibirem a tripanotiona redutase. Os compostos foram obtidos por via sintética e refinados pelo método QSAR por remodelagem molecular. Foram obtidos séries de compostos nitroheterocíclicos, onde a série BSF (derivados 5-nitro-2-furfurilideno - azometínicos) foi utilizada para avaliar a bioatividade in vitro destes compostos frente à Leishmania. Para avaliação da atividade anti-Leishmania foram usadas formas promastigotas de Leishmania (Leishmania) infantum. Os métodos utilizados para determinar a atividade anti-Leishmania dos compostos da série BSF foram os métodos colorimétrico 3-[4,5-dimetiltiazol-2-il] 2,5 brometo de difeniltetrazólio (MTT), apoptose por Anexina V e reação de Griess (dosagem de NO). Ao comparar os resultados com os respectivos controles positivos e com a Anfotericina B, foi observado que a atividade anti-Leishmania em formas promastigotas de L. L. infantum dos compostos foi menos significativa quando comparado com anfotericina B. Porém, ao comparar os resultados de macrófagos infectados e citotoxicidade com a anfotericina B, os compostos mostraram resultados expressivos, ao apresentarem baixa taxa de citotoxicidade e significativa diminuição da proliferação intracelular. A expressiva produção de nitrito pelos macrófagos infectados tratados com os compostos da série BSF sugere-se que estes compostos possuam uma ação indireta de potencialização de produção de NO nas células hospedeiras. Os resultados in vitro utilizando derivados nitroheterocíclicos mostraram atividade destes sobre formas promastigotas e amastigotas intracelulares, e são compostos em potencial para avaliação de efeito in vivo contra leishmaniose visceral / INTRODUCTION: Visceral leishmaniasis (VL) belongs to the group of endemics prioritized worldwide. It is a serious disease with few treatment options, and even when adequately treated, it has a lethality level of 5 to 7%. Despite the expansion of the disease, treatment for visceral leishmaniasis has not made progress. Treatment of leishmaniasis has used only two groups of drugs: antimonial and non-antimonial. Nitro-heterocyclic compounds were used in this study because it is believed that the effectiveness of this class of compounds is the ability to inhibit trypanothione reductase. The compounds were obtained synthetically and refined by QSAR method molecular remodeling. Nitro-heterocyclic series of compounds were obtained, where the BSF series (derived from 5-nitro-2-furfurylidene - azometínicos) was used to evaluate the in vitro bioactivity of these compounds against the Leishmania. To evaluate the anti-Leishmania activity, promastigotes of Leishmania (Leishmania) infantum were used. The methods used to determine the anti-Leishmania activity of the BSF series compounds were colorimetric methods 3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl] 2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT), apoptosis by Annexin V, and Griess reaction (IN dosage). By comparing the results with the respective positive controls and with amphotericin B, it was observed that the anti-Leishmania activity of L. L. infantum promastigotes of the compounds was less significant when compared with amphotericin B. However, comparing the results of infected macrophages and cytotoxicity with amphotericin B, compounds showed significant results, presenting low cytotoxicity rate and significant decrease in intracellular proliferation. The significant nitrite production by infected macrophages treated with the BSF series compounds suggested that these compounds have an indirect potentiation action in the NO production in the host cells. In vitro results using nitro-heterocyclic derivatives showed their activity on these promastigotes and intracellular amastigotes, and presented them as potential compounds for in vivo effect evaluation against visceral leishmaniasis