Infusões de células T e células NK (Natural Killer) de sangue periférico estão sendo realizadas para tratamento de malignidades. Os linfócitos propagados ex vivo, em normóxia (20% O2), são intravenosamente infundidos e precisam sobreviver a hipóxia associada a circulação venosa, da medula óssea (5% O2) e do microambiente tumoral (1% O2). O objetivo principal deste estudo foi determinar a capacidade proliferativa das células humanas T e NK em normóxia (20% O2) versus hipóxia (1% O2), por 28 dias, utilizando uma célula apresentadora de antígeno artificial (aAPC) para propagação em grau clínico. As células T expostas a hipóxia cresceram 100 vezes menos que as células T cultivadas em normóxia, enquanto que houve uma diminuição de 1000 vezes na taxa proliferativa das células NK hipóxicas, que exibiram um aumento na apoptose bem como um prejuízo na citotoxicidade. Hipóxia também induziu uma diminuição na expressão dos receptores KIR, NCR e NKG2D das células NK. Nesta mesma condição, a produção de IL-2 e IFNγ nas células T estavam diminuídas, sendo que nas células NK esse efeito foi mais acentuado. Hipóxia aumentou a expressão de genes relacionados com apoptose, angiogênese e metabolismo glicolítico, os quais estavam moderadamente aumentados nas células T, mas profundamente super-regulados nas células NK. Os níveis de ATP nas células T foram muito similares em ambas as condições de oxigênio, mas intensamente diminuídos nas células NK cultivadas em hipóxia. Também se observou, que a expressão do miR-210 induzido por hipóxia, estava super regulada nas células NK hipóxicas correlacionando com a perda da expressão da molécula NCAM/CD56. Em conjunto, os resultados deste estudo demonstram um maior impacto da hipóxia sobre as atividades proliferativas e citotóxicas das células NK estimuladas por aAPCs. Estudos adicionais são necessários para o entendimento do impacto deste comportamento das células NK em condições hipóxicas sobre a imunoterapia celular adotiva. / Infusions of T cells and natural killer (NK) cells from peripheral blood (PB) are being undertaken for the treatment of malignancies. Lymphocytes are propagated ex vivo in normoxia (20% O2) and intravenously infused and must survive hypoxia associated with venous blood and bone marrow (5% O2), and the tumor environment (1% O2). The objective this study was to determine the ability of T and NK cells to proliferate under normoxia (20% O2) versus hypoxia (1% O2) over 28 days using an artificial antigen presenting cells (aAPC) to propagate clinical-grade lymphocytes. T cells continuously exposed to 4 weeks of hypoxia grew at a rate of 100-fold less than T cells cultured in normoxia while the proliferative rate of NK cells lagged by 1,000-fold, behind normoxic conditions. Hypoxic cultured NK cells exhibit an increase in apoptosis as well as a correspondent impairment in cytotoxicity. In low oxygen tension the expression of KIR, NCR, and NKG2D receptors were decreased in NK cells. In hypoxia, the production of IL-2 and IFNγ were decreased in T cell and more so in NK cell. Chronic hypoxia increased the expression of related apoptosis, glycolytic metabolism and angiogenesis genes which were moderately increased in T cells but profoundly upregulated in NK cells. ATP levels in T cell were very similar in both oxygen conditions, but profoundly diminished in NK cells under hypoxia. We also noted that hypoxia inducible miR-210 levels are up regulated in hypoxic NK cells correlating with loss of CD56 expression. Taken together, this data show that a greater impact of hypoxia on proliferative and cytotoxic activity of NK cells activated by artificial antigen-presenting cells. More studies are needed to understand the impact of this behavior on the cell adoptive immunotherapy.

Neste trabalho, investigamos os mecanismos da resposta imune estimulados por PAS-1 para o desencadeamento do seu efeito modulatório na inflamação alérgica pulmonar. Para tanto, camundongos C57BL/6 selvagens, IL-12-/-, IFN-<font face=\"Symbol\">g-/- e IL-10-/- foram imunizados e desafiados com OVA ou PAS-1 ou OVA + PAS-1. Ainda, camundongos C57BL/6 imunizados e desafiados com OVA receberam transferência adotiva de células CD19+, B220+, CD3+, CD4+, CD8+, CD4+CD25-, CD4+CD25+ PAS-1-primadas. Nossos resultados demonstraram que o efeito imunomodulatório de PAS-1 é mediado por IFN-<font face=\"Symbol\">g e IL-10, mas não por IL-12, e que somente camundongos que receberam células CD8+ ou CD4+CD25+ não desenvolveram inflamação pulmonar e produziram, respectivamente, IFN-<font face=\"Symbol\">g e IL-10/TGF-ß. Em conjunto, estes resultados demonstraram que o efeito imunomodulatório de PAS-1 é devido à estimulação de células T CD8+ produtoras de IFN-<font face=\"Symbol\">g e por CD4+CD25+ secretoras de IL-10 e TGF-ß. / In this work, we investigate the immune response mechanisms triggered by PAS-1 to promote its immunomodulatory effect in the lung allergic inflammation. For that, wild type, IL-12-/-, IFN-<font face=\"Symbol\">g-/- and IL-10-/- C57BL/6 mice were immunized and challenged with OVA or PAS-1 or OVA + PAS-1. Moreover, wild type C57BL/6 mice were adoptively transferred with PAS-1-primed CD19+, B220+, CD3+, CD4+, CD8+, CD4+CD25-, and CD4+CD25+ lymphocytes. Our results demonstrated that the immunomodulatory effect induced by PAS-1 is mediated by IFN-<font face=\"Symbol\">g and IL-10, but not by IL-12, and only mice which received CD8+ or CD4+CD25+ T cells did not present lung allergic inflammation and produced IFN-<font face=\"Symbol\">g and IL-10/TGF-ß, respectively. Taken together, these results demonstrated that the imunomodulatory effect induced by PAS-1 is due to stimulating CD8+ T cells, which secrete IFN-<font face=\"Symbol\">g, and CD4+CD25+ T cells, which secrete IL-10 and TGF-ß.

Objetivo: Avaliar a freqüência das células T reguladoras (Tregs) em crianças com diagnóstico novo de Púrpura Trombocitopênica Imune (PTI) e a sua associação com a contagem de plaquetas na ocasião, comparando os achados com os de controles saudáveis. Pacientes e Métodos: Foi realizado um estudo caso-controle, no qual foram incluídos 19 pacientes com diagnóstico novo de PTI e 19 controles. Para cada um dos casos, foram coletadas quatro amostras de sangue em períodos distintos, sendo eles ao diagnóstico – antes da instituição de qualquer terapêutica – e após um, três e seis meses do mesmo. Para os controles, utilizou-se amostra de sangue de 19 pacientes saudáveis, coletadas eletivamente. Em todas as amostras de sangue foi realizada contagem de plaquetas através de hemograma e avaliação dos linfócitos Tregs (CD4+ CD25+ Foxp3) por citometria de fluxo. Resultados: A idade média ao diagnóstico de PTI foi de 6,53 ± 4,14 anos. Dos 17 pacientes tratados, 13 receberam apenas corticosteróide oral e quatro pacientes receberam corticosteróide e imunoglobulina endovenosa associada em algum momento do tratamento. Em relação à evolução da doença, 14 crianças apresentaram remissão completa, duas remissão e três PTI crônica. Houve diferença estatisticamente significativa no número de plaquetas entre os grupos caso e controle nas amostras 1 e 4. Não houve diferença significativa na contagem de Tregs entre os casos e os controles em nenhum momento de coleta. Não foi encontrada correlação estatisticamente significativa entre Tregs e o número de plaquetas entre os casos e os controles, nem nos pacientes do grupo caso ou do grupo controle analisados separadamente. Não houve diferença na contagem de células Tregs entre os grupos de pacientes crônicos e não crônicos. Conclusão: Os achados deste estudo não nos permitiu evidenciar correlação estatisticamente significativa entre Tregs e o número de plaquetas nos grupos caso e controle. As células T CD4+ CD25+ Foxp3 (Tregs) parecem não desempenhar um papel crucial na regulação da auto-imunidade em pacientes pediátricos com diagnóstico de PTI, provavelmente, devido à existência de outros mecanismos responsáveis pela auto-imunidade em crianças, ainda não identificados. / Objective: To assess the frequency of regulatory T cells (Tregs) in children with a new diagnosis of Immune Thrombocytopenic Purpura (ITP), and its association with the counts of platelets on the occasion, and compare with healthy controls. Patients and Methods: A case-control study was conducted, in which 19 patients with new diagnosis of ITP and 19 controls were included. For each case, four blood samples were collected at different point times, that is, at the diagnosis – before the establishment of any treatment – and after one, three and six months. For the controls, electively collected blood samples from 19 healthy patients were used. For all blood samples, platelets were counted through a CBC and assessment of Treg lymphocytes (CD4+ CD25+ Foxp3) by flow cytometry. Results: The mean age at the ITP diagnosis was 6.53 ± 4.14 years. Of 17 treated patients, 13 received oral corticosteroid only, and four patients received corticosteroid and associated intravenous human immunoglobulin at some point in the treatment. Regarding the disease course, 14 children showed full remission, two partial remission, and three chronic ITP. There was a statistically significant difference in the number of platelets between the case and control groups in the samples 1 and 4. There was no significant difference in the counts of Tregs between cases and controls at any collection time. No statistically significant correlation was found between Tregs and number of platelets between cases and controls, neither in patients in the case group nor in the control group who were analyzed separately. There was no difference in the counts of Treg cells between the groups of chronic and non-chronic patients. Conclusion: The findings of this study did not show any statistically significant correlation between Tregs and number of platelets in the case and control groups. The T cells CD4+ CD25+ Foxp3 (Tregs) seems did not play a key role in the regulation of self-immunity in pediatric patients diagnosed with ITP. Other mechanisms, which aren’t still identified, are likely to account for self-immunity in children.

Submitted by Heitor Rapela Medeiros (heitor.rapela@ufpe.br) on 2015-03-06T14:26:27Z No. of bitstreams: 2 ULISSES RAMOS MONTARROYOS PGMEDICINA TROPICAL 2012.pdf: 2686992 bytes, checksum: 3ecb0294a790e83bd1668c6611de2ac0 (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-03-06T14:26:27Z (GMT). No. of bitstreams: 2 ULISSES RAMOS MONTARROYOS PGMEDICINA TROPICAL 2012.pdf: 2686992 bytes, checksum: 3ecb0294a790e83bd1668c6611de2ac0 (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Previous issue date: 2012-11-01 / A contagem de linfócitos CD4 é um importante preditor de risco de progressão para a AIDS e monitorar a resposta ao tratamento antirretroviral (TARV) em Pessoas Vivendo com HIV (PVHIV). Baixa contagem de CD4 está associada a um aumento do risco de doenças oportunistas e de evolução para óbito. A variação do CD4 pode estar relacionada a fatores do individuo e assistência a saúde. Com o objetivo de identificar os fatores associados à variação do CD4 em PVHIV ao longo do tempo foi acompanhada prospectivamente uma coorte de pacientes atendidos em dois hospitais em Pernambuco. Para isso, foram realizados dois estudos: No primeiro utilizou-se como desfecho a contagem de CD4 para identificação dos fatores que interferem na variação dessas células; no segundo avaliou-se a resposta virológica e imunológica dos pacientes no primeiro ano de TARV, para identificação dos fatores associados às diferentes respostas ao TARV. Para o primeiro estudo, um total de 1.870 pacientes foi selecionado. Foi estimado uma média de CD4 no início da coorte de 393 cel/mm3 e aumento médio de 1,529 cel/mm3 ao mês. Verificou-se que a idade, o tabagismo, o uso de drogas ilícitas, o serviço no qual o paciente é acompanhado, a condição de mudança de médico, assim como o uso de TARV, foram fatores que interferiram na variação da contagem do CD4 ao longo do tempo. Para o segundo estudo, foram incluídos 1.184 pacientes, dos quais 678 apresentaram resposta imunológica e virológica no primeiro ano de TARV, correspondendo a uma freqüência de 57,3%; a não resposta imunológica e virológica foi observada em 15% dos pacientes e 27,7% tiveram apenas uma resposta, seja imunológica ou virológica. Os fatores associados à apenas uma resposta foram: uso de drogas ilícitas, história de câncer, CD4 no início da TARV acima de 350 cel/mm3, carga viral acima de 100.000 cópias e esquema de TARV inicial com duas drogas da classe de inibidoras de transcriptase reversa nucleosidea mais uma droga da classe de inibidoras de protease (2ITRN+IP). No modelo explicativo da não resposta total, não saber ler e contagem de CD4 acima de 350 cel/mm3 no início da TARV foram fatores preditivos para a não resposta; o esquema inicial com duas drogas ITRN e um IP/r foi fator de proteção para a não resposta total. Os resultados dos dois estudos evidenciaram contagens crescentes de CD4 ao longo do tempo e redução da carga viral nos 12 primeiros meses de TARV. Essas variações foram influenciadas por diferentes fatores, entre os quais, são passíveis de intervenção o tabagismo e o uso de drogas ilícitas. Os fatores ligados à assistência – diferenças entre serviços e mudança de médico – e a condições socioeconômicas precisam ser melhores estudados e compreendidos para que se proponham estratégias que possam contribuir para uma melhor resposta do paciente à terapêutica. Os achados reforçam, a partir da avaliação da resposta terapêutica em condições de rotina, as recomendações do uso de esquemas de TARV inicial com duas drogas ITRN e uma droga ITRNN ou duas drogas ITRN associadas a um IP/r.

Submitted by Daniella Sodre (daniella.sodre@ufpe.br) on 2015-04-15T15:03:50Z No. of bitstreams: 2 Doutorado Carolina_Tese_Final_Pós_banca.pdf: 3244753 bytes, checksum: 877af436492eccb5711942aa55bd53f6 (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-04-15T15:03:50Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Doutorado Carolina_Tese_Final_Pós_banca.pdf: 3244753 bytes, checksum: 877af436492eccb5711942aa55bd53f6 (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Previous issue date: 2013-02-05 / CAPES; CNPq / A leishmaniose tegumentar americana (LTA) é uma doença negligenciada com distribuição mundial, acometendo principalmente àquele com menor status socioeconômico. No Brasil, a LTA já foi visualizada em todos os Estados, sendo endêmica em Pernambuco. A LTA pode apresentar variadas formas clínicas, e a forma cutânea é a manifestação mais comum. A resposta imunológica desempenha um importante papel na cura clínica da doença ou na sua progressão, e os linfócitos T são fundamentais. Células T CD4+ e CD8+ são fontes produtoras de citocinas, atuando nos mecanismos de cura e patogênese da doença. A resposta linfocitária é caracterizada principalmente pelo aumento de células T CD4+. Os subtipos Th1 e Th2, seu direcionamento e papel, são ao mais bem descritos na susceptibilidade e resistência a LTA. Recentemente células T regulatórias e células Th17 também vêm se destacando. Dessa maneira, os objetivos desse estudo foram avaliar a participação de linfócitos T (CD4+, CD8+, Th1, Th2, Th17 e Treg) e de suas citocinas (IFN-, TNF, IL-4, IL-6, IL-10, IL-17, IL-21, IL-22 e IL-23) em indivíduos com LTA ativa e naqueles após a cura clínica (espontânea ou após tratamento). A imunofenotipagem e avaliação de citocinas foram feitas por citometria de fluxo, CBA, e através da quantificação relativa do mRNA das citocinas por qPCR. Os resultados desse trabalho, apresentados em três artigos, mostraram que o balanço na proporção de células T CD4+ e CD8+ é importante para cicatrização das lesões na LTA, e que o tratamento com antimonial não induz nenhum mudança deletéria na proporção de linfócitos T na corrente sanguínea. Além disso, foi visto que as frações antigênicas solúvel e insolúvel de L. (V.) braziliensis são capazes de induzir uma resposta imune específica por parte dos pacientes com LTA. Transcritos para TNF e IFN- foram encontrados significativamente aumentadas após 24h de cultura quando comparado aos controles; no entanto, não foi possível identificar sua população secretora. O desenvolvimento da doença parece estar relacionado a uma desregulação imunológica temporária no início da infecção, caracterizada por um predomínio do perfil Th2 nos pacientes com lesão ativa, e a cura ao desenvolvimento de uma resposta do tipo 1. Essa resposta aparenta ser balanceada/coordenada por mecanismos que envolvem a citocina IL-10, e células Treg e suas subpopulações expressando marcadores de imunossupressão e migração tecidual foram observadas nos indivíduos com LTA ativa. Foi visto ainda a presença significativa de citocinas Th17, sugerindo a sua associação com a patogênese da doença. O estudo mostrou que a resposta imunológica desenvolvida pelo hospedeiro na LTA é dinâmica, e contribui em futuros estudos para desenho apropriado de intervenções imunológicas em pacientes e de vacinas.

Made available in DSpace on 2014-06-12T15:05:22Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo4544_1.pdf: 743719 bytes, checksum: 0d1678ceac5de3e304fce7b8f9370d3d (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2005 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Para averiguar a ocorrência de fungemia, foram analisadas no período de janeiro de 2004 a julho de 2004, amostras de sangue de 530 pacientes portadores do HIV, sendo 159 (30%) sem AIDS e 371 (70%) com AIDS, destes 468 pacientes atendidos em ambulatório e 62 pacientes internos, todos procedentes do Hospital Correia Picanço, Recife-PE. Foi detectada fungemia no sangue de quatro pacientes com HIV sem AIDS e em 20 com AIDS. Em quatro pacientes HIV sem AIDS, fungemia foi detectada através da cultura; nos pacientes com AIDS fungemia foi detectada em sete através do exame direto, em oito através da cultura e em cinco através do exame direto e cultura. Do sangue de pacientes com HIV sem AIDS, foram isoladas as espécies Candida humicola, C. pelliculosa e Fusarium lateritium; do sangue de pacientes com AIDS foram isoladas as espécies C. curvata, C. humicula, C. parapsilosis, Cryptococcus albidus, C. neoformans e Histoplasma capsulatum. Segundo a literatura disponível, esta é a primeira citação de F. lateritium, C. curvata e C. humicula relacionando estas espécies a fungemia em pacientes infectados com HIV. A cada episódio de fungemia correspondeu apenas uma espécie de fungo. No sangue dos pacientes HIV sem AIDS a contagem de CD4 variou de 373 a 573 células/mm3 e de CD8 de 807 a 1445 células/mm3; no sangue dos pacientes com AIDS a contagem de CD4 variou de 12 a 346 células/mm3 e de CD8 de 261 a 1375 células/mm3. Baseado no modelo de Regressão logístico há 152,57 mais chances de ocorrer fungemia em pacientes com lesão de pele e níveis de CD4 &#8804; 200 mm3, e que não existe relação entre a espécie isolada e níveis de CD4 e CD8. Todos os fungos isolados cresceram a 37ºC. Atividade proteásica foi observada nos isolados utilizando-se como substrato caseína do leite e gelatina. Atividade fosfolipásica foi evidenciada com lecitina de soja, entretanto não foi evidenciada com gema de ovo como substrato

Orientador: Maria Heloísa Souza Lima Blotta / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-17T06:53:06Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Oliveira_SaradeJesus_D.pdf: 1409092 bytes, checksum: 77c1f0b5742ae7b24491a77030821e3f (MD5) Previous issue date: 2003 / Resumo: A paracoccidioidomicose, causada pelo fungo dimórfico Paracoccidioides brasiliensis, é a micose sistêmica de maior prevalência na América Latina, acometendo hoje mais de 10 milhões de pessoas e apresentando as maiores taxas de mortalidade nas regiões Sul e Sudeste do Brasil. A infecção se dá pela via respiratória sendo que a grande maioria de indivíduos que entram em contato com o fungo, não desenvolve a doença. Esta condição chamada PCM-infecção ocorre em indivíduos que moram em áreas endêmicas e apresentam teste cutâneo de HTT positivo aos antígenos do fungo. A progressão de infecção para doença origina duas formas clínicas principais: a forma aguda ou juvenil (FJ), de maior gravidade e a forma adulta ou crônica (FA), mais localizada e menos agressiva. Com o objetivo de estudar a epidemiologia e o perfil imunológico da PCM humana na cidade de Campinas, analisamos as características gerais (sexo, idade profissão) de pacientes atendidos no HC da UNICAMP e a incidência da doença na região, juntamente com seus fatores de risco e suas formas clínicas. Avaliamos também a resposta imune celular (proliferação de linfócitos a antígenos do fungo e produção de citocinas do tipo Th1 e Th2), em pacientes com as formas adulta e juvenil da doença, indivíduos portadores da infecção e controles saudáveis (teste cutâneo de HTT negativo). Nossos resultados mostraram que a PCM é endêmica em Campinas e região, acometendo em sua maioria, indivíduos adultos do sexo masculino, trabalhadores rurais e da construção civil. No entanto, encontramos elevado número de pacientes do sexo feminino e crianças com a forma juvenil da doença, mais grave e disseminada. Esses pacientes apresentam resposta imune celular suprimida, caracterizada por teste cutâneo negativo e proliferação de linfócitos reduzida a antígenos do fungo, enquanto produzem citocinas do tipo Th2, com aumento de IL-4 e IL-5, juntamente com baixos níveis de IFN-?, TNF-? e IL-12. Apresentam também, no período inicial da infecção, número elevado de eosinófilos no sangue periférico e em biópsias de linfonodos. Ao contrário, indivíduos portadores da PCM-infecção apresentam proliferação de linfócitos bastante acentuada a antígenos do fungo, teste cutâneo positivo, ausência de anticorpos e padrão de resposta Th1 com produção de IFN-?, IL-2, TNF-? e IL-12, e níveis basais de IL-4, IL-5 e IL-10. Já os pacientes com a forma adulta apresentam resposta imune celular preservada, com teste cutâneo que variam de acordo com a forma unifocal ou multifocal da doença. De modo geral, produzem menores níveis de IL-4 e IL-5 e níveis aumentados de TNF-? e IL-12. Esses resultados nos permitiram situar a forma adulta da paracoccidioidomicose como intermediária entre o padrão Th2 de resposta imune apresentado pela forma juvenil e o padrão Th1 desenvolvido pelos indivíduos portadores da PCM-infecção / Abstract: We studied the clinical-seroepidemiological characteristics of patients with paracoccidioidomycosis (PCM) attended at the University Hospital at UNICAMP (Campinas, São Paulo, Brazil). The study group consisted of 584 individuals (492 M, 92 F) with ages ranging from 5 to 87 years. The highest incidence of the disease occurred between the ages of 41 and 50 years for men and 11 and 40 for women. Rural activities were the principal occupation of 46% of the patients. The diagnosis was confirmed by histopathological examination and by demonstration of fungus in scrapings, secretions or in the sputum. Serological tests for PCM were positive in 80% of the 584 patients studied. The significant number of patients, including 33 children under 14 years old, is an indication of the fungus? presence in the area and indicates that this region is an important endemic area for paracoccidioidomycosis. Cellular immune response to Paracoccidiodes brasiliensis antigens (PbAg) was evaluated in patients with the juvenile (JF) and adult (AF) forms of paracoccidioidomycosis (PCM) as well as in a group of infected individuals living in the endemic area but without any clinical manifestation of the disease. The immune profile of this group of PCM-infected (PI) individuals was characterized by: 1) a positive skin test to P. brasiliensis antigen, 2) absence of specific antibodies, 3) a vigorous lymphoproliferative response to PbAg, and 4) a typical Th1 pattern of cytokines, with production of IFN-?, IL-2, IL-12 and TNF-? and basal levels of IL-4, IL-5 and IL-10. At the opposite end of the spectrum were the JF patients whose proliferative response to PbAg was significantly impaired and whose cytokine pattern was characteristically Th2, i.e., lower IFN-? TNF-? and IL-12 secretion and significantly higher levels of IL-4 and IL-5. These profiles are compatible with forms of higher and lower resistance, respectively. Intermediate immune responses were observed in AF patients, whose specific lymphoproliferative response was lower than in the PI group but higher than in the JF patients. The secretion of IFN-? and IL-10 did not differ from the JF group, although IL-4 and IL-5 levels were significantly lower, and TNF-? and IL-12 higher. Since AF patients are able to control fungal dissemination for decades, they can be considered more resistant than JF patients, who manifest the disease soon after infection / Doutorado / Ciencias Biomedicas / Doutor em Ciências Médicas

Orientadores: Maria Heloisa Souza Lima Blotta, Ronei Luciano Mamoni / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-17T12:57:39Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Fornazim_MarciaCristina_D.pdf: 1869002 bytes, checksum: b2e5012f736532c7b201f92582544179 (MD5) Previous issue date: 2011 / Resumo: A resposta Th1 com a ativação eficiente de macrófagos constituiu o principal mecanismo de defesa na infecção causada pelo Paracoccidioides brasiliensis. Componentes do sistema imune inato que induzem a polarização a resposta adaptativa como as células dendríticas (DCs) e seus produtos foram pouco explorados, principalmente na doença humana. O objetivo do presente estudo foi caracterizar fenotipicamente e funcionalmente DCs obtidas a partir de monócitos do sangue periférico (MSP) de indivíduos saudáveis (C), pacientes com a forma adulta (FA) e juvenil (FJ) da paracoccidioidomicose (PCM), estimuladas in vitro por células leveduriformes do fungo P. brasiliensis das cepas Pb18 (alta virulência) e Pb265 (baixa virulência). Em uma segunda etapa pretendeu-se verificar se estas DCs eram capazes de ativar linfócitos T CD4+/CD8+ autólogos. Os MSP foram cultivados na presença de IL-4 e GM-CSF por 7 dias e posteriormente submetidos à estimulação por células leveduriformes do fungo (Pb18 ou Pb265) ou CD40L (controle positivo) ou somente meio (SE) por 18 horas. DCs derivadas de monócitos do sangue periférico dos 3 grupos estudados (C, FA, FJ) se diferenciam em DCs maduras na presença de células leveduriformes do fungo. Nos pacientes com as FA e FJ as células leveduriformes Pb18 e Pb265 induzem maturação semelhante nas DCs que passam a expressar características morfológicas e fenótipo de células maduras com aumento da expressão dos marcadores de maturação (CD83 e CCR7), das moléculas de coestimulação (CD80/B7-1 e CD86/B7-2), das moléculas envolvidas na apresentação de antígenos (HLA-I e HLA-II), dos receptores envolvidos no reconhecimento de antígenos (TLR2, TLR4 e dectina-1) e diminuição da expressão do CD1a e CD209. No grupo C foram observadas as mesmas características de fenótipo acima mencionadas, mas de forma mais evidente em DCs que foram estimuladas com as células leveduriformes da cepa Pb265, quando comparada a Pb18. DCs estimuladas com CD40L mostraram potencial máximo de expressão dos marcadores de superfície. Constatou-se também em DCs do grupo controle uma diminuição da capacidade fagocítica, após 18h de contato com as células leveduriformes do fungo, comprovando o processo de maturação, que foi mais efetivo na presença de Pb265. A análise da expressão gênica demonstrou que ambas as células leveduriformes do fungo induziram a expressão de TNF- , IL-1 , IL-12p35, IL-23p19 e TGF- . A estimulação das DCs com as células leveduriformes da cepa Pb265 induziu aumento da expressão de IL-6 (C, FA, FJ). Em relação à IL-10 as células leveduriformes Pb265 induziram maior expressão somente nos pacientes (FA e FJ). Na segunda etapa do estudo verificou-se que DCs fenotipicamente competentes foram capazes de estimular a proliferação de linfócitos T CD4+/CD8+ autólogos de forma mais acentuada quando eram provenientes de pacientes. Nestes grupos (FA e FJ) também foi constatada uma diminuição da frequência de linfócito T CD4+/CD8+/CD45RA+ e um aumento da frequência células CD4+/CD8+/CD45RO+ e CD4+/CD8+/CD69+. Inesperadamente, os resultados também mostraram que DCs dos 3 grupos estudados, que foram estimuladas com células leveduriformes do fungo, induziram a proliferação de linfócitos T CD3+CD4+CD25+Foxp3+, em relação às DCs que não receberam estímulos (SE). DCs de pacientes que foram estimuladas por ambas as células leveduriformes do fungo induziram uma maior produção de IL-2, IL-17, IL- 10 e IFN- por LT/CD3+CD8(neg), quando comparada com DCs do grupo C. Por outro lado, DCs dos 3 grupos estudados (C, FA, FJ) que foram estimuladas células leveduriformes do fungo induziram uma maior produção de IFN- por LT/CD3+CD8+. Em conjunto os resultados do nosso estudo mostraram que a estimulação com células leveduriformes do fungo induz uma população heterogênea de DCs, capazes de dar origem a uma resposta linfocitária mista com proliferação de linfócito Th1 (produtoras de IFN-?), Th17 (produtoras de IL-17) e células com fenótipo regulatório Foxp3+ (produtoras de IL-10) / Abstract: A Th1 response with an efficient activation of macrophages is the main mechanism of defense in Paracoccidioides brasiliensis infection. Components of the innate immune system that induce the polarization of the adaptive response such as dendritic cells (DCs) and their products have been little explored, particularly in human disease. The aim of this study was to phenotypically and functionally characterize DCs obtained from peripheral blood monocytes (PBM) of healthy individuals (C), patients with the adult form (AF) and juvenile form (JF) of paracoccidioidomycosis (PCM), induced in vitro by P. brasiliensis yeasts cells of Pb18 (high virulence) and Pb265 (low virulence) strains. In a second step we sought to determine whether these DCs were capable of activating autologous CD4/CD8 T cells. PBM were cultured in the presence of IL-4 and GM-CSF for 7 days and then stimulated by yeasts cells (Pb18 or Pb265) or CD40L (positive control) or medium only (WE), for 18 hours. PBM of the 3 groups (C, AF, JF) acquired the capacity to differentiate into DCs in the presence of P. brasiliensis yeasts cells. In patients with FA and FJ yeast cells induced maturation of DCs with increased expression of maturation markers (CD83 and CCR7), co-stimulatory molecules(CD80/B7-1 and CD86/B7-2), antigen presentation molecules (HLA-I and HLA-II), receptors involved in antigen recognition (TLR2, TLR4 and dectin-1) and decreased expression of CD1a and CD209. DCs from group C showed the same phenotypic characteristics, more evident in DCs that were stimulated with Pb265 when compared to Pb18. DCs stimulated with CD40L showed maximum expression of surface markers. A decrease in phagocytic capacity was detected in DCs of the control group after stimulation with yeast cells, demonstrating the maturation process, which was more effective in the presence of Pb265. The gene expression analysis showed that both strains of yeasts cells induced expression of TNF- , IL-1 , IL-12p35, IL-23p19 and TGF- mRNA. Stimulation of DCs with Pb265 induced increased expression of IL-6 in all groups. Pb265 also induced a higher expression of IL-10 mRNA only in patients (AF and JF). Our study also showed that phenotypically competent DCs were able to stimulate the proliferation of autologous CD4+/CD8+ cells, mainly in patients. In these groups (FA and FJ) it was also observed a reduction in the frequency of CD4+/CD8+/CD45RA+ and na increased frequency of CD4+/CD8+/CD45RO+ and CD4+/CD8+/CD69+. Unexpectedly, the results also showed that DCs stimulated with the yeast cells induced proliferation of T lymphocytes CD3+CD4+CD25+Foxp3+, compared to DCs that received no stimulation. DCs from patients stimulated by both strains of yeast cells induced a higherr production of IL-2, IL-17, IL-10 e IFN- by LT/CD3+CD8(neg) compared with DCs from group C. Moreover, DCs from the 3 groups also induced a stronger IFN-? production by CD3+/CD8+T cells. Altogether the results showed that stimulation with P. brasiliensis yeast cells induces a heterogeneous population of DCs, capable of giving rise to a mixed lymphocyte response with proliferation of Th1, Th17, and Foxp3+ cells / Doutorado / Ciencias Biomedicas / Doutor em Ciências Médicas

Orientador: Leonilda Maria Barbosa dos Santos / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-17T20:16:49Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Farias_AlessandrodosSantos_D.pdf: 4349733 bytes, checksum: 319c7b608b0ec53ed2bab3d2bbb43a23 (MD5) Previous issue date: 2009 / Resumo: A Esclerose múltipla (EM) é a mais comum doença neurológica crônica que acomete adultos jovens. Apesar da etiologia da EM ser desconhecida, está bem descrito que a doença é resultante da combinação de uma pré-disposição genética associada a fatores ambientas. Nos últimos anos, tem sido evidenciada a hipótese da participação da vitamina D na evolução da EM e do modelo experimental, a encefalomielite experimental auto-imune (EAE). No presente estudo, fomos capazes de mostrar que a administração da vitamina D3 in vivo na EAE, assim como a transferência de células dendríticas tolerogênicas, induzidas pela vitamina D3 in vitro, aumentam significativamente a porcentagem das células reguladoras CD4+CD25+Foxp3+ e a expressão de IL-10 nos linfonodos, resultando na redução dos sinais clínicos nesses animais. Simultaneamente, há uma diminuição do numero de células nos infiltrados inflamatórios no sistema nervoso central, acompanhada da diminuição das citocinas proinflamatórias como a IL-17A, IFN'gama' e TNF'alfa'. Ainda, os animais tratados apresentam uma maior quantidade de IL-10 e TGF'beta'1 liberados no soro, quando comparados aos animais não tratados. Esses mecanismos contribuem ativamente para a criação de um microambiente no linfonodo que é capaz de suprimir a ativação das células auto-reativas, diminuindo a resposta inflamatória no sistema nervoso central. Ainda, fomos capazes de demonstrar que a maioria das mudanças neurológicas que acontece durante a fase aguda da EAE desaparecem quando a resposta inflamatória é controlada. No presente estudo avaliamos a expressão diferencial de proteínas no SNC em diferentes fases da EAE. Nossos resultados demonstram que várias proteínas estão diferencialmente expressas na fase aguda da doença em comparação aos animais naive como: as proteases e proteínas estruturais e metabólicas, que estão envolvidas na neurodegeneração. Essas alterações retornam aos níveis normais durante a fase de remissão da doença / Abstract: A growing body of evidence supports the hypothesis that vitamin D is an environmental factor important in the etiology of T-cell-mediated autoimmune diseases such as multiple sclerosis (MS). In the present study, evidence is provided that the in vivo administration of vitamin D3, as well as the adoptive transfer of vitamin D3-induced immature/tolerogenic dendritic cells lead to a significant increase of the percentage of CD4+CD25+Foxp3+ regulatory T cells in the lymph nodes but, not in the blood or spleen, in the rat model of MS, the experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE). Simultaneously with the increase of this cell population the treatment with Vitamin D3 induced is a significant decrease in the number of auto-reactive T cells in the central nervous system, as well as the reduction of the expression of pro-inflammatory cytokines. Moreover, the treatment increases the level of IL-10 and TGF'beta'1 in the serum and in the lymph nodes. The adoptive transfer of vitamin D3-induced DC also induces a significant increase in the expression of IL-10 in the lymph nodes, with no change in the expression of TGF'beta'1. These mechanisms contribute actively to the generation of a microenvironment in the lymph nodes that suppress the activation of encephalitogenic T cells, which result in the downregulation of the inflammatory response in the central nervous system. Moreover, we provide evidence that most of neurological changes that take place during the clinical phase of EAE disappear when inflammatory response is controlled. We have identified protein expression in different phase of the EAE. The result demonstrated various proteins which are regulated during the acute phase of the disease, such as some enzymes and proteins from the neurodegenerative process, return to normal levels in the remission phase of the disease / Doutorado / Ciencias Basicas / Doutor em Clínica Médica

Orientadores: Ronei Luciano Mamoni, Maria Heloisa Souza Lima Blotta / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-13T02:22:29Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Ferreira_MariaCarolina_M.pdf: 3235698 bytes, checksum: 858844d8c2fb54db25e9acd5fcdbb327 (MD5) Previous issue date: 2009 / Resumo: Pacientes com paracoccidioidomicose (PCM) apresentam supressão da resposta imunológica celular, caracterizada por testes de hipersensibilidade do tipo tardio negativos a antígenos do P. brasiliensis, alta taxa de apoptose de linfócitos e alta expressão de CTLA-4 (CD152) e alta produção de citocinas supressoras (IL-10 e TGF-b). Esses dados indicam a possível participação de células T regulatórias (CD4+CD25+ - Tregs) na PCM. O objetivo desse trabalho foi verificar se, e por qual mecanismo as células T regulatórias estão envolvidas nessa imunossupressão. Para isso, analisamos o número, fenótipo, assim como a atividade funcional das células regulatórias do sangue periférico de pacientes com PCM antes e após o tratamento antifúngico efetivo. O número e o fenótipo das células T regulatórias foram avaliados por citometria de fluxo, e os resultados demonstraram que pacientes com PCM ativa (DA) apresentam um maior número dessas células que pacientes tratados (DT) ou controles normais (C). Além disso, observamos uma maior expressão de CD95L, CTLA-4, LAP-1 e GITR em células regulatórias do grupo DA em relação aos grupos DT e C. A expressão do RNAm (quantificado por PCR em tempo real) para FoxP3, IL-10 e TGF-ß em CMSP ex vivo também foram maiores no grupo DA que nos controles e pacientes do grupo DT. Com o intuito de comparar a atividade funcional das células T regulatórias, analisamos o efeito da cocultura com células T regulatórias na resposta proliferativa de CMSP estimuladas com ConA. As células regulatórias do grupo DA exibiram uma atividade supressora maior que as provenientes do grupo DT ou C, de uma maneira dose dependente. Para verificar se o mecanismo por meio do qual as células regulatórias exercem sua atividade é dependente de contato, utilizamos um sistema "transwell". Os resultados demonstraram que a atividade supressora das células T regulatórias do grupo controle é dependente de contato, mas que essa atividade para as células provenientes dos pacientes do grupo DA é apenas parcialmente revertida com esse sistema. A adição de citocinas supressoras recombinantes (IL-10 e TGF-ß), assim como de anticorpos neutralizantes para essas citocinas nas coculturas, mostrou que a produção de citocinas regulatórias pode ser outro mecanismo utilizado pelas células regulatórias do grupo DA. Em conclusão, o número aumentado de células T regulatórias no sangue periférico de pacientes com DA, expressando altos níveis de moléculas associadas à atividade regulatória, ao lado da alta expressão do RNAm para FoxpP3, IL-10 e TGF-b, sugere uma participação dessa população de linfócitos na imunossupressão observada em pacientes com PCM ativa. Além disso, nossos resultados indicam que as células T regulatórias dependem principalmente do contato intercelular para exercer seus efeitos supressores, e que a produção de citocinas supressoras também está envolvida nesse processo. / Abstract: Patients with paracoccidioidomycosis (PCM) present suppression of cellular immune response characterized by negative DTH to P. brasiliensis antigens, elevated apoptosis of lymphocytes, high expression of CTLA-4, and production of IL-10 and TGF-ß. Together these data point towards the involvement of regulatory T cells (CD4+CD25+ - Tregs) in PCM. The aims of this study were to verify whether and how Tregs are involved in this immunosuppression, through the analysis of the number and the phenotype, as well as, the functional activity of Tregs cells from peripheral blood of patients before and after antifungal treatment. The number and phenotype of Tregs cells were evaluated by flow cytometry, and the results showed that PCM patients with active disease (AD) present higher number of Treg cells than patients after treatment (TD) or healthy controls (C). Furthermore, we observed higher expression of CD95L, CTLA-4, LAP-1 and GITR on Tregs from AD group, than in cells from TD and C groups. mRNA expression (quantified by qRT-PCR) for FoxP3, IL-10 and TGF-ß in ex vivo PBMC, were also higher in AD group than in controls and in TD group. In order to compare the functional activity of Tregs, we analyzed the effect of Treg cells on the proliferative response of PBMC stimulated with ConA. Tregs from AD group exhibited stronger regulatory activity than cells from TD and C groups, in a dose dependent manner. To verify the possible mechanism through which Tregs suppress the cell proliferation we utilized a transwell system, which showed that the contact is mandatory for regulatory activity of Treg cells from C group, but had only a partial involvement in cells from AD patients. The addition of IL-10 and TGF-ß and anti cytokines in the co-cultures showed that the production of immunoregulatory cytokines may be other mechanism used by Tregs. In conclusion, the increased number of Treg cells in peripheral blood of patients with active disease, expressing high levels of regulatory markers and suppressive activity, besides the high expression of Foxp3, IL-10 and TGF-ß mRNAs suggest the potential participation of this population in the immunosuppression observed during the disease. Moreover, our results indicate that Tregs act mainly by contact to exert their inhibitory effects, but the production of immunoregulatory cytokines are also involved. / Mestrado / Ciencias Biomedicas / Mestre em Ciências Médicas