La hernie est une maladie racinaire affectant les Brassica, causée par Plasmodiophora brassicae. Le déploiement de variétés présentant des facteurs génétiques de résistances est le moyen de lutte principal contre cette maladie. Toutefois, l’efficacité de ces variétés résistantes dans les nouveaux systèmes d’agriculture durable, à bas intrant azoté, est encore à évaluer. Dans ce contexte, les questions de recherche posées dans cette thèse sont les suivantes : i) La modulation de la résistance à la hernie par la réduction de l’apport azoté est-elle génotype/isolat dépendante ? ii) Y-a-t-il un effet de la réduction des apports azotés sur l’architecture génétique de la résistance à la hernie chez le colza ? iii) Quels sont les réponses transcriptomiques et métabolomiques impliquées dans la réduction du développement des symptômes en condition de carence azotée ? Le criblage de la réponse de nombreux génotypes de colza vis-à-vis de plusieurs isolats de P. brassicae a été réalisé dans deux conditions de fertilisation azotée (8 mM et 1 mM de nitrate). Basé sur ces expériences, le contrôle génétique du développement des symptômes et de la production des spores de repos lors de l’infection par deux isolats (eH et K92-16) a été étudié par génétique de liaison chez une population biparentale et par génétique d’association chez un panel de colza d’hiver. Enfin, les réponses moléculaires impliquées dans la réduction du développement des symptômes observée chez le génotype ‘Yudal’ en condition 1mM ont été étudiées par des méthodes de RNA-seq et de métabolomique. L’impact de la fertilisation azotée sur la quantité de symptômes et la production de spores de repos est variable selon la combinaison génotype/isolat. Les modulations observées entraînent une augmentation de la résistance en condition 1mM. La fertilisation azotée module également l’effet (R2) de certains des Quantitative Trait Loci (QTL) impliqués dans la résistance. Dans le cas de l’isolat eH, elle affecte principalement l’effet des QTL C09 et C02. L’augmentation de résistance observée chez le génotype ‘Yudal’ en condition 1mM, vis-à-vis de l’isolat eH, semble liée à la surexpression de gènes impliqués dans l’assimilation des nitrates (famille NRT2) et dans le transport de l’auxine. / Clubroot is a Brassica root disease caused by Plasmodiophora brassicae. The use of varieties including genetic resistance factors is the most efficient strategy to manage clubroot disease. However, efficiency of these resistant varieties newly integrated in low-input agricultural systems (especially low nitrogen input) needs to be evaluated. In this context, the research questions investigated in this thesis are: i) Is clubroot resistance modulation by nitrogen fertilization genotype/isolate dependent? ii) Is there an effect of nitrogen fertilization reduction on the genetic architecture of clubroot resistance in rapeseed? iii) What are the transcriptomic and metabolomic responses implicated in symptom reduction under low nitrogen fertilization? To answer these questions, clubroot responses of several rapeseed genotypes were screened using different P. brassicae isolates under two nitrogen fertilizations (8mM and 1mM of nitrate). Based on this experiment, genetic control of symptom development and resting spore production during inoculation using two isolates (eH and K92-16) was studied by linkage analyses using a bi-parental population and by genome wide association using a winter rapeseed diversity set. Last, molecular responses implicated in symptom development, observed in ‘Yudal’ genotype under 1mM condition, were studied using RNA-seq and metabolomic methods. We revealed that impact of nitrogen fertilization on symptom quantity and resting spore production are dependent to genotype/isolate combination. Modulations observed were characterized by an increase of resistance under 1mM condition. Additionally, nitrogen fertilization modulates also the effect (R²) of some Quantitative Trait Loci implicated in clubroot resistance (QTL). Using eH isolate, nitrogen fertilization principally impacts C09 QTL and C02 QTL effects. Ultimately, increase of resistance observed on ‘Yudal’ genotype under 1mM condition, using eH isolate, seems to be related with overexpression of genes implicated in nitrate assimilation (NRT2 family) and auxin transport.

Submitted by Márcio Maia (marciokjmaia@gmail.com) on 2016-09-08T17:34:01Z No. of bitstreams: 1 arquivototal.pdf: 3383101 bytes, checksum: e52ccda15daee8307b55ff0e71eeea15 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-09-08T17:34:01Z (GMT). No. of bitstreams: 1 arquivototal.pdf: 3383101 bytes, checksum: e52ccda15daee8307b55ff0e71eeea15 (MD5) Previous issue date: 2015-08-31 / Cissampelos sympodialis Eichl., (Menispermaceae) is popularly known as “milona". This species has shown potential to interfere with the pathophysiology of asthma by exerting multiple synergistic effects. Warifteine, a bisbenzilsioquinoline alkaloid has been considered as the main bioactive substance present in the leaves and roots of this species. The present work used a metabolomics approach combined with multivariate data analysis to study quantitative and qualitative chemical variations in the leaf extracts during the phenological development of the plant (between 60 and 210 days after seedling, and the corresponding extracts were coded as CsL60, CsL90, CsL120, CsL150, CsL180 e CsL210) and its relation with the relaxing effect using in vitro guinea pig tracheal. 1H-NMR data from extracts were submitted to PCA analysis and the concentration of the identified compounds was quantified by 1H qNMR. The contents of warifteine and methylwarifteine were determined by HPLC and the total phenolic content of extracts was determined using the Folin-Ciocalteu method, using galic acid as standard. Extracts submitted to 1H-NMR spectroscopy were simultaneously screened to determine their potency in relaxing in vitro guinea-pig tracheal pre-contracted with carbachol. To investigate the relationship between chemical profile and pharmacological activity we used PLS regression. The method was able to identify and to quantitate 20 primary and secondary metabolites in the extracts. The concentration of the major alkaloids decrease from 2.0 ± 0.32 μg/mL for warifteine and 1.0 ± 0.14 μg/mL for methylwarifteine to undetectable levels from 90 days onwards after seedling for warifteine and 120 days for methylwarifteine. Phenolic compounds and derivatives of the flavonols quercetin and kaempferol behave in na opposite fashion, increasing its levels towards fructification (from 0.1 ± 0.05 to 1.0 ± 0.12 mmol/L for quercetin and from 0.4 ± 0.12 to 1.0 ± 0.16 mmol/L for kaempferol). The metabolomics study based on 1H-NMR spectroscopy with PCA was able to discriminate all extracts demonstrating that the phenological cycle is associated with clear differences in chemical composition, mainly due to variations in the concentration of sugars and quinic acid derivatives. The extract obtained during fructification (CsL210) was the most distinctive amongst all samples mainly due to signals from quinic acid derivatives, kaempferol and quercein derivatives. The content of major alkaloids decreased from 2.0 ± 0.32 μg/mL for warifteine and 1.0 ± 0.14 μg/mL to methylwarifteine to undetectable levels from 90 days onwards after seedling for warifteine and 120 days for methylwarifteine. The phenolic compounds and flavonoids quercetin (0.1 ± 0.05 a 1.0 ± 0.12 mmol/L) and kaempferol (0.4 ± 0.12 a 1.0 ± 0.16 mmol/L) behaved in an opposite fashion, increasing its concentration towards fructification. The six extracts relaxed the trachea pre-contracted with carbachol guinea pig, and the CsF210 extract (EC50 = 74.6 ± 7.9 μg/mL) more potent compared to CsL90 extracts (EC50 = 231.6 ± 38.9 μg/ml) and CsL180 (EC50 = 239.7 ± 15.1 μg/ml) in the presence of functional epithelium. There was no correlation between the content of alkaloids as determined by HPLC and the spasmolytic activity of the extracts. PLS analysis revealed a moderate correlation between 1H-NMR signals for quercetin and kaempferol derivatives and the spasmolytic activity of extracts. Taken together our results demonstrate for the first time that bisbenzylisoquinoline alkaloids warifteine and methylwarifteine do not seem to participate in the spasmolytic actions of polar Cissampelos sympodialis extracts. / Cissampelos sympodialis Eichler, pertence a família Menispermaceae, sendo conhecida popularmente como “milona". A espécie tem demonstrado por meio de testes pré-clínicos, potencial de interferir em processos relacionados com a fisiopatologia da asma, exercendo múltiplos efeitos sinérgicos. A warifteína, um alcaloide bisbenzilisoquinolínico, tem sido apontada como a principal substância bioativa presente nas folhas e nas raízes desta espécie. O presente estudo utilizou metodologia metabolômica baseada em RMN e combinação com análise multivariada para analisar a variação química qualitativa e quantitativa dos constituintes presentes nos extratos hidroalcoólicos das folhas durante o desenvolvimento da planta (entre 60 a 210 dias após o plantio, codificados como CsF60, CsF90, CsF120, CsF150, CsF180 e CsF210) e a relação com o efeito in vitro sobre traqueia isolada de cobaia. Os dados de RMN-1H dos seis extratos das folhas foram submetidos à análise por PCA e os teores dos compostos identificados foram quantificados por RMNq-1H. O teor de warifteína e metilwarifteína foram determinados por CLAE e o teor de fenólicos totais determinado pelo método de Folin-Ciocalteu, utilizando ácido gálico como o composto fenólico padrão. Os extratos submetidos à análise por RMN-1H foram simultaneamente testados quanto à sua potência em relaxar in vitro a traqueia de cobaia pré-contraída com carbacol. Para estudar a relação entre o perfil químico e a atividade farmacológica foi empregada a técnica de PLS (Partial Least Squares). O estudo foi capaz de identificar e quantificar vinte substâncias dentre metabólitos primários e secundários presentes em todos os extratos das folhas. Os teores dos alcaloides majoritários decaem de 2,0 ± 0,32 μg/mL para warifteína e 1,0 ± 0,14 μg/mL para metilwarifteína a níveis não detectáveis, a partir de 90 dias após o plantio para a warifteína e a partir de 120 dias para metilwarifteína. Os compostos fenólicos e os flavonóis quercetina (0,1 ± 0,05 a 1,0 ± 0,12 mmol/L) e caempferol (0,4 ± 0,12 a 1,0 ± 0,16 mmol/L) se comportam de forma contrária, aumentando os seus níveis no sentido da frutificação. Através da análise de PCA foi possível diferenciar todos os extratos, demonstrando que o ciclo vegetativo está associado com diferenças claras na composição química, principalmente devido a variações na concentração de açúcares, compostos fenólicos e derivados do ácido quínico. O extrato (CsF210) originado das folhas no período da frutificação foi o mais distinto entre as amostras, sendo os sinais atribuídos aos derivados do ácido quínico, quercetina e caempferol responsáveis por esta discriminação. Os seis extratos foram capazes de relaxar a traqueia de cobaia pré-contraída com carbacol, sendo o extrato CsF210 (CE50 = 74,6 ± 7,9 μg/mL) mais potente em relação aos extratos CsF90 (CE50 = 231,6 ± 38,9 μg/mL) e CsF180 (CE50 = 239,7 ± 15,1 μg/mL) na presença de epitélio funcional. Não houve correlação entre o teor de alcaloides determinados por CLAE e a atividade espasmolítica dos extratos. Por outro lado, a análise por PLS demonstrou correlação entre os sinais de derivados dos flavonóis quercetina e caempferol e a potência espasmolítica dos extratos. Em conjunto nossos resultados demonstram pela primeira vez que os alcaloides bisbenzilisoquinolínicos warifteína e metilwarifteína não parecem estar envolvidos nas ações espasmolíticas dos extratos polares de Cissampelos sympodialis.

Submitted by Andréia Fujimoto null (andreia.fujimoto@gmail.com) on 2017-07-18T04:41:49Z No. of bitstreams: 1 Tese_Andréia_Fujimoto.pdf: 4726485 bytes, checksum: c5c04fef91dcac42292a2f2a70af9a32 (MD5) / Approved for entry into archive by Luiz Galeffi (luizgaleffi@gmail.com) on 2017-07-19T17:16:00Z (GMT) No. of bitstreams: 1 fujimoto_a_dr_jabo.pdf: 4726485 bytes, checksum: c5c04fef91dcac42292a2f2a70af9a32 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-07-19T17:16:00Z (GMT). No. of bitstreams: 1 fujimoto_a_dr_jabo.pdf: 4726485 bytes, checksum: c5c04fef91dcac42292a2f2a70af9a32 (MD5) Previous issue date: 2017-06-19 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / O setor citrícola é o maior produtor de frutos no mundo, porém, encontra-se ameaçado por diversos patógenos, dentre esses, o fungo Phyllosticta citricarpa, agente causal da mancha preta dos citros. Como alternativa à utilização de fungicidas sintéticos para o controle do patógeno, o controle biológico, utilizando bactérias do gênero Bacillus, apresenta destaque. Tais microrganismos possibilitam o biocontrole pela produção de compostos orgânicos voláteis ou não voláteis. Sendo assim, este trabalho teve por objetivos: identificar os isolados de Bacillus spp. por meio de técnicas moleculares; avaliar a produção de compostos orgânicos voláteis produzidos por Bacillus spp. em diferentes meios de cultura; verificar os seus efeitos na evolução dos sintomas da doença em frutos de laranja, na morfologia de P. citricarpa em lesões de mancha preta e na indução de resistência, identificar os compostos voláteis por cromatografia gasosa unidimensional e finalmente, avaliar o efeito de diferentes meios de cultura no antagonismo e metabolismo secundário dos isolados de Bacillus. Os isolados bacterianos foram identificados como pertencentes às espécies de Bacillus subtilis, B. amyloliquefaciens e B. methylotrophicus. Os resultados mostraram que houve maior controle do patógeno, em decorrência da produção de voláteis, quando se utilizou os meios triptona de soja ágar (TSA) e caldo de triptona (TSB) para cultivo da bactéria, apresentando valores de inibição da colônia do fungo de até 73%. Com relação ao efeito dos compostos voláteis na evolução dos sintomas da doença, verificou-se que os melhores resultados, em termos de inibição (86%) de manchas sardentas que evoluíram para manchas duras, foram obtidos com o ACB-65 e ACB-73, quando cultivados em meio de cultivo TSB. Tais antagonistas causaram deformações nas hifas do patógeno, que podem explicar a não evolução dos sintomas da doença, como relatado anteriormente. Os voláteis de Bacillus spp. não foram capazes de ativar a atividade de enzimas indicativas de indução de resistência em frutos de laranja. As frações voláteis produzidas pelas bactérias foram identificadas e apresentaram álcoois, cetonas, aminas, éteres, aldeídos, fenóis e ácidos carboxílicos que podem servir como arsenal contra o fitopatógeno. Em relação ao efeito de diferentes meios de cultivo no antagonismo microbiano e no metabolismo secundário dos isolados de Bacillus, não houve diferença significativa entre os meios testados, porém proporcionaram redução significativa da colônia do fungo. Os metabólitos difundidos no meio de cultura foram identificados e apresentaram dois tipos de antibióticos, as iturinas e as surfactinas. O presente trabalho demonstrou o potencial de compostos orgânicos voláteis e não voláteis produzidos por Bacillus spp. no controle de P. citricarpa in vitro e in vivo, sendo uma alternativa ao uso de fungicidas sintéticos para o controle da mancha preta dos citros. / The citrus sector is the largest producer of fruits in the world, but it is threatened by several pathogens, among them Phyllosticta citricarpa fungus, causal agent of the citrus black spot. As an alternative to the use of synthetic fungicides to control the pathogen, the biological control, using bacteria of the genus Bacillus, is highlighted. Such microorganisms enable biocontrol by the production of volatile or non-volatile organic compounds. Therefore, this work had as objectives: to identify the isolates of Bacillus spp. by means of molecular techniques; to evaluate the production of volatile organic compounds produced by Bacillus spp. in different culture media; to verify its effects on the evolution of orange disease symptoms, P. citricarpa morphology in black spot lesions and induction of resistance, to identify the volatile compounds by one-dimensional gas chromatography and, finally, to evaluate the effect of different culture in the antagonism and secondary metabolism of Bacillus isolates. The bacterial isolates were identified as belonging to the species of Bacillus subtilis, Bacillus amyloliquefaciens and Bacillus methylotrophicus. The results showed that there was greater control of the pathogen, due to the volatile production, when tryptone broth (TSA) and tryptone broth (TSB) were used to culture the bacteria, presenting inhibition values of the fungus colony up to 73%. With regard to the effect of volatile compounds on the evolution of disease symptoms, the best results in terms of inhibition (86%) of freckles that progressed to hard spots were obtained with ACB-65 and ACB-73, when cultured in TSB culture medium. Such antagonists have caused deformations in the hyphae of the pathogen, which may explain the non-evolution of the disease symptoms, as previously reported. The volatiles of Bacillus spp. were not able to activate the enzyme activity indicative of induction of resistance in orange fruits. The volatile fractions produced by the bacteria were identified and showed alcohols, ketones, amines, ethers, aldehydes, phenols and carboxylic acids that can serve as arsenal against the phytopathogen. In relation to the effect of different culture media on the microbial antagonism and the secondary metabolism of the Bacillus isolates, there was no significant difference between the media tested, but provided a significant reduction of the fungus colony. The metabolites diffused in the culture medium were identified and presented two types of antibiotics, iturins and surfactins. The present work demonstrated the potential of volatile and non-volatile organic compounds produced by Bacillus spp. In the control of P. citricarpa in vitro and in vivo, being an alternative to the use of synthetic fungicides for the control of citrus black spot.

Orientador: Alberto José Cavalheiro / Banca: Paulo Clairmont Feitosa de Lima Gomes / Banca: Carmen Lúcia Cardoso / Resumo: Separações utilizando cromatografia líquida bidimensional têm atraído grande interesse nas últimas décadas devido ao seu elevado potencial no poder de separação para análises de misturas complexas. Apesar do uso de colunas ortogonais e da multiplicação teórica da capacidade de picos quando essa técnica é utilizada, uma questão permanece: "As técnicas bidimensionais são realmente melhores do que as monodimensionais para análises de extratos vegetais?". Esta questão motivou o presente trabalho, que consistiu em comparar o desempenho entre LC e LC×LC, utilizando amostras de folhas de Casearia sylvestris, também conhecida como "guaçatonga", uma árvore amplamente utilizada na medicina popular brasileira por apresentar diversas atividades biológicas. Além disso, devido ao grande volume de resíduos gerados em LC, a substituição de solventes convencionais por etanol (EtOH), um candidato menos tóxico e biodegradável, foi implementada. A parte mais desafiadora de qualquer cromatografia multidimensional é o desenvolvimento do método cromatográfico, pelo grande número de variáveis que devem atuar de forma integrada em uma única análise. Duas estratégias de desenvolvimento foram propostas neste trabalho. A primeira foi dividida em 4 etapas, que consistiram em selecionar o par de colunas mais ortogonal dentre as combinações disponíveis; o desenvolvimento de um método para a 1D utilizando planejamento experimental; seguido do estudo das melhores condições para a 2D (2tc, tempo de modulação ... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Bidimensional liquid chromatographic separations have attracted intense interest over the past decade based on the potential improvements in resolving power they offer for analysis of complex samples. Despite the use of orthogonal columns and the theoretical multiplication of peak capacity from both dimensions, one question remains: "Are bidimensional techniques superior to monodimensional ones for analysis of vegetal extracts?". This question led to the purpose of the present work, that was to compare the performance between LC and LC×LC, using leaves from Casearia sylvestris, a widely used tree in Brazilian folk medicine by its biological activities. Furthermore, due to the large volume of waste generated by LC, the replacement of conventional solvents by ethanol (EtOH), a less toxic and biodegradable alternative solvent was chosen. The most challenging issue of any multidimensional chromatography is the method development, since the large number of interacting parameters that must work together in a single run. Two strategies for method development were used in this work. The first one was divided into 4 steps: experiments were carried out to select the most orthogonal pair of columns, 1D method development using design of experiments, another design of experiments for 2D conditions was proposed (2tc, modulation time and tre, re-equilibration time after each modulation) and aware of the best conditions for both dimensions, 2D gradient types were evaluated. The second strat... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

The metabolomics is an area of science "omics" that characterizes the phenotypes of the metabolites and the connection of these with their corresponding genotypes, allowing the identification of the metabolome of an individual. This metabolomics research allows to view the rapid responses of the biochemical and biological analysis of metabolism in any situation, whether environmental change, pathological, genetic or in response to exercise stress. This study aims main to present the mass spectrometry together with the clinical laboratory as a research tool for obtaining the metabolome of an athlete's Olympic Windsurfing Class RS:X. During exercise, the energy demand is increased by requiring changes in metabolism, and thus the metabolism provides answers to these various metabolic modifications. Therefore, analytical techniques, such as laboratory tests and mass spectrometry may be used for the metabolic evaluation, allowing to investigate and intervene in a scientific manner, the exercise prescription, control and monitoring of athlete training, helping with interventions to adaptation of physical exercise in improving their athletic performance. / A metabolômica é uma área da ciências ômicas que caracteriza os fenótipos dos metabólitos bem como a ligação destes com os seus genótipos correspondentes, permitindo identificar o metaboloma de um indivíduo. Essa investigação metabolômica permite visualizar as rápidas respostas dos mecanismos bioquímicos e biológicos do metabolismo analisado em qualquer situação, seja alteração ambiental, patológica, genética ou em resposta ao estresse causado pelo exercício físico. Esse estudo tem como objetivo principal apresentar a espectrometria de massas junto com as análises laboratoriais clínicas como ferramenta de investigação para obtenção do metaboloma de um atleta olímpico de Windsurf classe RS:X. Durante o exercício físico, a demanda energética é aumentada exigindo adaptações no metabolismo, e desta forma o metabolismo apresenta respostas para essas diversas modificações metabólicas. Portanto, as técnicas analíticas, como os exames laboratoriais e a espectrometria de massas, podem ser utilizadas para a avaliação metabólica, permitindo investigar e intervir de maneira científica, na prescrição, controle e acompanhamento dos processos de treinamento desse atleta, auxiliando-o com intervenções para a sua adaptação ao exercício físico na melhoria da sua performance atlética. / Mestre em Genética e Bioquímica

abstract: The ability to tolerate bouts of oxygen deprivation varies tremendously across the animal kingdom. Adult humans from different regions show large variation in tolerance to hypoxia; additionally, it is widely known that neonatal mammals are much more tolerant to anoxia than their adult counterparts, including in humans. Drosophila melanogaster are very anoxia-tolerant relative to mammals, with adults able to survive 12 h of anoxia, and represent a well-suited model for studying anoxia tolerance. Drosophila live in rotting, fermenting media and a result are more likely to experience environmental hypoxia; therefore, they could be expected to be more tolerant of anoxia than adults. However, adults have the capacity to survive anoxic exposure times ~8 times longer than larvae. This dissertation focuses on understanding the mechanisms responsible for variation in survival from anoxic exposure in the genetic model organism, Drosophila melanogaster, focused in particular on effects of developmental stage (larval vs. adults) and within-population variation among individuals. Vertebrate studies suggest that surviving anoxia requires the maintenance of ATP despite the loss of aerobic metabolism in a manner that prevents a disruption of ionic homeostasis. Instead, the abilities to maintain a hypometabolic state with low ATP and tolerate large disturbances in ionic status appear to contribute to the higher anoxia tolerance of adults. Furthermore, metabolomics experiments support this notion by showing that larvae had higher metabolic rates during the initial 30 min of anoxia and that protective metabolites were upregulated in adults but not larvae. Lastly, I investigated the genetic variation in anoxia tolerance using a genome wide association study (GWAS) to identify target genes associated with anoxia tolerance. Results from the GWAS also suggest mechanisms related to protection from ionic and oxidative stress, in addition to a protective role for immune function. / Dissertation/Thesis / Results of GWAS for Adults Exposed to 6 H of Anoxia / Results of GWAS for Larvae Exposed to 1 H of Anoxia / Doctoral Dissertation Evolutionary Biology 2018

Orientador: Rodrigo Ramos Catharino / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-18T06:24:05Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Eiras_MarinaMarques_M.pdf: 1209753 bytes, checksum: 3a49ee749d21e2dce0ee49574819d71a (MD5) Previous issue date: 2011 / Resumo: A Cannabis sativa L. é a droga de abuso ilícita mais consumida e apreendida ao redor do mundo. A identificação de Cannabis pode ser alcançada através de diversos métodos, como inspeção visual, cromatografia em camada delgada, cromatografia gasosa e cromatografia líquida, acopladas ou não a espectrometria de massas, entre outros. Entretanto, esses métodos apresentam desvantagens significantes como ambiguidade nos resultados, necessidade de derivatização da amostra, análise relativamente demorada e/ou etapa lenta de preparação da amostra. Neste trabalho, foi desenvolvido um método de fingerprinting metabólico através da técnica de ESI-MS para identificação dos principais canabinóides e aditivos em amostras apreendidas de Cannabis sativa L., para utilização nos laboratórios de toxicologia forense. Ao fazer a determinação instantânea dos compostos das amostras ou fingerprinting metabólico por inserção direta ESI(+)-MS, foi possível observar as diferenças entre os canabinóides e conservantes existentes na Cannabis. O resultado é um fingerprinting metabólico que tem um grande potencial para ser utilizado como método de screening rápido e simples sendo simultaneamente empregado para detectar os canabinóides e conservantes e extrair espectros de diferentes amostras apreendidas em diferentes regiões, além de ser capaz de fazer distinção entre as amostras de uma região e as amostras de outra, o que mostra o potencial da técnica para a certificação de origem geográfica mediante o processo de produção, e possibilidade de ser empregada para outros tipos de drogas de abuso / Abstract: Cannabis sativa L. is the most used and seized drug worldwide. The identification of Cannabis products is achieved by several methods, such as visual inspection, thin layer chromatography, gas chromatography and liquid chromatography coupled or not to mass spectrometry, among others. However, these methods present important disadvantages like ambiguity in the results, the need to sample derivatisation, relatively long analysis or sample preparation. Herein, an ESI-MS metabolic fingerprinting method was tested for the identification of major cannabinoids and additives in seized Cannabis samples, to be used in forensic toxicology laboratories. Instantaneous determination of the sample composition via metabolic fingerprinting by direct insertion ESI(+)-MS reveals the differences in cannabinoids and preservatives in Cannabis samples. The result is a metabolic fingerprinting that has great potential to be used as a fast and simple screening method detecting cannabinoids and preservatives, being simultaneously applied to detect cannabinoids and preservatives and extracting spectra from different samples seized in different regions, besides being able to distinguish them from each other, which shows the potential of the technique to geographical origin certification by processing markers and the possibility to be applied to other types of drugs of abuse / Mestrado / Ciencias Biomedicas / Mestre em Ciências Médicas

Árvores evolutivas de espécies de Peperomia baseadas nas regiões de ITS e matK foram confrontadas com perfis metabólicos de extratos brutos obtidos por RMN 1H, HPLC-DAD e LC-ESI-MS. A análise de clusters (HCA) e a análise discriminante de componentes principais (DAPC) suportaram em parte os agrupamentos observados por ITS e matK. As principais classes de metabólicos secundários observadas foram policetídeos, meroterpenos, cromenos, fenilpropanoides e amidas, sendo que foram ainda isolados um policetídeo (malabaricona D) de P. megapotamica; o fenilpropanoide elemicina e a lignana tetraidrofurânica diyangambina de P. rotundifolia; e as flavonas 5,6,7-trimetoxiflavona e 4\',5,6,7- tetrametoxiflavona de P. sincorana. As PKS tipo chalcona sintase (CHS) de peperomias, diferiram daquelas de famílias filogeneticamente próximas como Myristicaceae (Virola) e Lauraceae (Aniba). Como muitos meroterpenos de espécies de Peperomia possuem como núcleo básico o ácido orselínico, produto típico de líquens e bactérias, o gene ácido orselínico sintase (OSAS) foi investigado nas plantas e nos 27 fungos endofíticos isolados de espécies de Peperomia (identificados pelas sequências de ITS1-5.8S-ITS2). Foram amplificadas pelo menos uma PKS (NR, HR e PR) em cada uma das linhagens e AOS em várias delas (UR1, UC3, UF1, UF2, UF3, UF4, GC3, NR1, NC1, NC2, NF1, AR1, AC1, AC4, OC1 e OF1). A homologia de 60% da OSAS amplificada de UR1 com a sequência de Streptomyces viridochromogenes é sugestivo de transferência horizontal de bactéria para fungos. / Phylogenetic tree of Peperomia species based on ITS and matK were compared to the metabolic profiling of crude extracts using 1H NMR, HPLC-DAD and LC-ESI-MS. Cluster analysis (HCA) and discriminant analysis of principal componentes (DAPC) supported significantly the clustering observed by ITS and matK. The major classes of secondary metabolites were polyketides, meroterpenes, chromenes, phenylpropanoids and amides and besides, one polyketide (malabaricone D) of P. megapotamica; the phenylpropanoid elemicin and the tetrahydrofuran lignan diyangambin from P. rotundifolia; and the flavones 5,6,7- trimethoxyflavone and 4\',5,6,7-tetramethoxyflavone were isolated from P. sincorana. The PKS chalcone synthase type (CHS) from peperomia, differed from phylogenetically related families Myristicaceae (Virola) and Lauraceae (Aniba). Since several meroterpenes from Peperomia species have the orsellinic acid as an aromatic core, typical of liquens and bacteria, the orsellinic acid (OSAS) was investigate in the plants and 27 endophytes isolated from Peperomia (identified based on ITS1-5.8S-ITS2 sequences). At least one PKS (NR, HR and PR) were isolated from each strains and AOS were isolated from several strains (UR1, UC3, UF1, UF2, UF3, UF4, GC3, NR1, NC1, NC2, NF1, AR1, AC1, AC4, OC1 and OF1). The 60% of homology observed for OSAS amplified from UR1 with that of Streptomyces viridochromogenes is suggestive of a horizontal transferring from bacteria to fungi.

Em uma sociedade que lida com pressão diariamente para completar suas tarefas, a privação de sono é uma consequência comum. Como artifício para manter-se apto a trabalhar ou se divertir à noite, algumas pessoas utilizam a cocaína, cujo consumo é estudado há décadas, mas cuja associação com a privação de sono ainda não foi avaliada pela toxicologia. Este estudo utiliza a metabolômica para gerar um mapa de alterações metabólicas associadas a estas condições e sua iteração. Utilizando análise cromatográfica líquida no modo HILIC e espectrometria de massas com um analisador do tipo \"tempo de voo\" (TOF), os cromatogramas e espectros urinários de 60 ratos Wistar machos foram analisados utilizando o pacote XCMS (Bioconductor) na plataforma R. Os tratamentos estatísticos de dados (PCA, OPLS-DA, MANOVA) foram realizados através dos programas SIMCA 11 P+ e IBM SPSS, culminando em atribuições putativas dos metabólitos discriminantes nas condições estudadas (efeito da cocaína, efeito da privação total de sono e seu efeito combinado). Foram então evidenciados cinco marcadores biológicos de dano associados à cocaína, três associados à privação de sono e dois à sua iteração. Estes metabólitos foram identificados putativamente através de busca em banco de dados (Metlin, MassTrix, HMDB, Lipidmaps) e tiveram suas rotas metabólicas associadas através do banco de rotas metabólicas KEGG. Há diferenças metabólicas estatisticamente evidenciáveis e inclusive duradouras nas vias do ciclo da tirosina e do sistema dopaminérgico, além do ciclo do citrato. / In a society that deals daily with pressure to complete its tasks, sleep deprivation is a common consequence. As an excuse to keep oneself fit to work but to have fun at night some people use cocaine, whose consumption is studied for decades, but the association with sleep deprivation had not yet been evaluated by toxicology. This study uses metabolomics to generate a map of metabolic abnormalities associated with these conditions and its iteration. Using liquid chromatographic in HILIC mode and \"time of flight\" mass spectrometry (TOF), mass chromatograms of urine from 60 male Wistar rats were analysed using XCMS package (Bioconductor) running on R platform. Statistical data treatment (PCA, OPLS-DA, MANOVA) were performed using the programs SIMCA P + 11 and IBM SPSS, culminating in putative metabolites assignments that discriminate the conditions in the study (cocaine effect, total sleep deprivation effect and their combined effect). We highlighted five biological markers of damage associated with cocaine, three associated with sleep deprivation and their iteration. These metabolites were putatively identified by public databases (Metlin, MassTrix, HMDB, Lipidmaps) and their associated metabolic pathways were assessed through KEGG database. There are significant differences on metabolic pathways of the tyrosine cycle, the dopaminergic system and the citrate cycle.

A quimioterapia disponível para o tratamento das leishmanioses conta com um número reduzido de fármacos, com efeitos adversos severos e progressivo aumento de resistência. O reposicionamento de fármacos oferece uma grande oportunidade para introdução de novas terapias. Antidepressivos orais têm demonstrado eficácia tanto in vitro quanto in vivo contra espécies de Leishmania spp. Neste estudo, o antidepressivo sertralina (SRT), e o fármaco ciclobenzaprina (CBP), um relaxante muscular de estrutura tricíclica análoga a antidepressivos, foram avaliados quanto a atividade contra Leishmania (L.) infantum. Estudos metabolômicos não dirigidos utilizando multiplataforma analítica, foram combinados a análises de parâmetros celulares, essenciais para obtenção de uma ampla descrição dos mecanismos de ação. A CBP mostrou uma atividade leishmanicida in vitro, com valor de CE50 de 4,3 ?M contra formas promastigotas e 8,6 ?M contra formas amastigotas intracelulares. O fármaco apresentou uma citotoxicidade (CC50) de 70,6 ?M em células NCTC, e um índice de seletividade similar a miltefosina. Os estudos de mecanismo de ação, sugeriram que a CBP se difunde pela membrana plasmática, causando diminuição do ??p e no interior citoplasmático, parece induzir um estresse do RE com liberação de Ca+2; concomitantemente, induz um desacoplamento brando da cadeia respiratória mitocondrial e depleção dos níveis de ATP. Com o efeito prolongado, a liberação de Ca+2 parece ativar a autofagia, e seu influxo para a mitocôndria potencializar os efeitos deletérios, diminuindo o ??m e aumentando a produção de ROS. A longo prazo, o CBP induz uma extensa alteração metabólica, caracterizada aumento dos níveis da maioria dos metabólitos identificados e atividade desregulada de transportadores de membrana, gerando alto gasto energético associado a condições insuficientes de produção de energia mitocondrial, resultando em morte celular. A sertralina também apresentou atividade leishmanicida in vitro, com valor de CE50 de 2 ?M contra formas promastigotas e 3,9 ?M contra formas amastigotas intracelulares. Sua toxicidade em células NCTC foi de 19,6 ?M, resultando em um índice de seletividade similar a miltefosina. Nossos estudos confirmaram a mitocôndria de Leishmania como alvo primário e, o efeito de desacoplamento da cadeia respiratória associado ao colapso energético, estresse oxidativo seguido da despolarização do ??m como a possível origem desta disfunção mitocondrial. Estudos metabolômicos evidenciaram que a extensão do desarranjo metabólico, abrange diminuição da capacidade de detoxificação do metabolismo tiol-redox, uma severa depleção do pool intracelular de aminoácidos e poliaminas, evidenciando uma completa deterioração do metabolismo energético, por meio de um mecanismo multialvo direcionado a vias metabólicas essências do parasita. Finalmente, este estudo descreve a atividade anti-Leishmania de dois fármacos orais aprovados, com mecanismos de ação letais e irreversíveis no parasita, encorajando o prosseguimento para futuros estudos pré-clínicos na leishmaniose visceral americana / The available chemotherapy for the treatment of leishmaniasis has a reduced number of drugs, with severe adverse effects and progressive increase of resistance. The drug repurposing offers a great opportunity for the introduction of new therapies. Oral antidepressants have been demonstrated efficacy both in vitro and in vivo against Leishmania spp. In this study, the antidepressant sertraline (SRT), and the drug cyclobenzaprine (CBP), a muscle relaxant with tricyclic structure analogous to antidepressants, were evaluated against Leishmania (L.) infantum. Untargeted metabolomic studies using multiplataform analysis were combined to cellular parameters to a broad description of the mechanisms of action. Cyclobenzaprine showed an in vitro leishmanicidal activity with an EC50 value of 4.3 ?M against promastigotes and 8.6 ?M against intracellular amastigote forms. The drug showed a cytotoxicity (CC50) of 70.6 ?M in NCTC cells, and a selectivity index similar to miltefosine. Mechanism of action studies suggested that CBP diffuses through the plasma membrane, causing a decrease of the ??p and inside the cytoplasm, the drug seems to induce an ER stress, with release of Ca+2; concomitantly, it induces a mild decoupling of the mitochondrial respiratory chain and depletion of ATP levels. With the prolonged effect, a release of Ca+ 2 appears to activate an autophagy, and its mitochondrial influx results in a potentiation of deleterious effects as decreasing of ??m and increasing ROS production. In long term, CBP induces an extensive metabolic alteration, characterized increased levels of most of the identified metabolites and unregulated activity of membrane transporters. These generates a high energy expenditure associated to limited conditions of mitochondrial energy production, resulting in the cellular death. Sertraline also showed in vitro leishmanicidal activity, with an EC50 value of 2 ?M against promastigotes and 3.9 ?M against intracellular amastigote forms. Its toxicity in NCTC cells was 19.6 ?M, resulting in a selectivity index similar to miltefosine. Our studies confirmed the mitochondria of Leishmania as the primary target, and the uncoupling of the respiratory chain associated with energy collapse, oxidative stress, and the depolarization of ??m as the possible origin of this mitochondrial dysfunction. Metabolomics evidenced an extended metabolic disarray caused by SRT encompassing a decrease in the scavenging capacity of the thiol-redox metabolism and a severe depletion of the intracellular pool of amino acids and polyamines. The complete deterioration of energetic metabolism was evident through a multi-target mechanism, affecting the main metabolic pathways of the parasite. Finally, this study describes an anti-Leishmania activity of two approved oral drugs with lethal and irreversible mechanisms of action in the parasite, encouraging future preclinical studies in American visceral leishmaniasis.