Lesões medulares resultam em uma perda irreversível da função abaixo do sítio da lesão. Esses comprometimentos são permanentes e ocorrem devido à perda de neurônios localmente e também dos tratos axonais ascendentes e descendentes da medula espinal. Na tentativa de criar um ambiente favorável à regeneração dos axônios lesionados, células da glia embainhante olfatória (GEO) vêm sendo transplantadas como estratégia de tratamento em animais submetidos a diferentes modelos experimentais de lesões medulares. Entretanto, um consenso sobre o potencial terapêutico desse tipo de transplante celular ainda precisa ser estabelecido. O objetivo do presente trabalho foi verificar a eficácia do transplante de lâmina própria (LP) olfatória (que possui células da GEO) e de LP respiratória (desprovido de células da GEO), quando implantadas imediatamente, 2 ou 4 semanas após a realização da transecção da medula espinal. Doze semanas após a realização dos implantes, os animais que receberam LP olfatória e respiratória apresentaram uma melhora sutil na função motora dos membros posteriores. Além disso, o transplante de LP olfatória quando realizado imediatamente após a lesão reduziu a hiperatividade do reflexo de retirada, enquanto o implante desse tipo de tecido 4 semanas pós-lesão produziu uma discreta depressão dependente de frequência do reflexo de Hoffman (um análogo elétrico do reflexo monossináptico de estiramento). Nas diferentes janelas terapêuticas utilizadas, o transplante de ambos os tipos de LP produziu resultados comparáveis em relação à preservação do tecido medular, brotamento de neuritos e regeneração de fibras mielínicas no local da lesão, indicando que o tempo decorrido antes da realização dos transplantes não parece limitar os efeitos regenerativos. Todavia, as fibras mielínicas observadas no sítio da transecção nos animais que receberam LP olfatória 2 e 4 semanas pós-lesão possuíam menor área, diâmetro e espessura da bainha de mielina quando comparados aos animais que receberam LP respiratória nesses mesmos períodos. O transplante imediato de LP olfatória e respiratória também favoreceu o restabelecimento das conexões entre as fibras axonais lesionadas com núcleos do tronco encefálico e até mesmo com a região do córtex somatossensorial, como indicado pela presença de neurônios nessas regiões marcados positivamente com um marcador axonal retrógrado. Um número maior de fibras positivas para 5-HT foi observado no coto proximal dos grupos transplantados com ambos os tipos de LP em comparação às regiões da lesão e do coto caudal. Fibras positivas para CGRP estavam presentes em número considerável no local da lesão. A recuperação locomotora e a regeneração axonal no local da lesão foram limitadas e comparáveis entre os grupos transplantados nos diferentes tempos com LP olfatória e respiratória, sugerindo que esses resultados não estão exclusivamente relacionados à presença de células da GEO nos enxertos utilizados. Um melhor entendimento sobre o potencial restaurativo desse tipo de transplante é necessário a fim de justificar a aplicação dessa terapia em humanos. / Spinal cord injury (SCI) results in an irreversible loss of function below the injury site. These permanent disabilities occur due to local neuronal death and loss of ascending and descending axons in the spinal cord. In attempt to create a favorable environment for the re-growth of injured axons, olfactory ensheathing cells (OECs) have been transplanted as a treatment strategy in animals submitted to different experimental models of SCI. However, a consensus on the efficacy of this cellular transplantation has yet to be reached. The main focus of the present study was explore the efficacy of olfactory lamina propria (OLP, graft containing OECs) or respiratory lamina propria (RLP, graft without OECs) when transplanted immediately, 2-week or 4-week after spinal cord transection. After 12 weeks of transplantation, animals with OLP and RLP grafts showed a subtle hindlimb motor improvement. Furthermore, the transplantation of OLP when performed immediately after injury reduced the withdrawal reflex over-responsiveness, while the implantation of this tissue 4 weeks post-injury produced a discrete frequency-dependent habituation of the Hoffman reflex (the electrical analogue of the classic tendon jerk reflex). In all therapeutic windows used, both lamina propria grafts produced comparable results for tissue sparing, fibers sprouting and re-growth of myelinated fibers at the lesion site, indicating that delayed transplantation approach does not seem to limit the regenerative effects. However, the myelinated fibers observed at the transection site of animals that received OLP 2 or 4 weeks after injury had a smaller myelinated fiber area, diameter and myelin sheath thickness when compared to those animals transplanted with RLP grafts in the same periods. The immediate transplantation of OLP and RLP also foster limited supraspinal axonal re-connection as shown by the presence of neurons stained by retrograde tracing in brainstem nuclei and in the somatosensory cortex. A larger number of 5-HT positive axons were found in the cranial stump of both lamina propria groups compared to the lesion and caudal regions. CGRP positive axons were present in considerable numbers at the SCI site. The locomotor recovery and axon reparative effects were limited and similar between groups transplanted at different times with OLP and RLP, suggesting that these results could not be exclusively related to OECs. In conclusion, a greater understanding of the restorative potential of these tissue grafts is necessary to strengthen the rationale for application of this treatment in humans.

Ces travaux de thèse s’inscrivent dans le cadre du projet ANR NEMRO, visant à étudier le lien entre déficience olfactive et maladies neurodégénératives. A cet effet, une biopsie optique de l’épithélium olfactif doit être réalisée. Son accès est cependant impossible, aujourd’hui, avec les outils conventionnels. Pour résoudre ce problème, nous proposons l’utilisation d’un robot à tubes concentriques (RTC). Sa synthèse est réalisée à partir d’images médicales. Elle prend en compte les critères de stabilité, la variabilité inter-sujet, et est associée à un déploiement ALFI (A La File Indienne). Le dispositif étant porté par le sujet, il doit être léger et compact. Une séquence de déploiement spécifique simplifie alors l’unité d’actionnement, et une implémentation est réalisée par fabrication additive multimatériaux. L’évaluation préliminaire d’un déploiement ALFI et des éléments de technologie clés a permis de valider l’approche retenue dans le projet NEMRO, ainsi que sa faisabilité. / This PhD thesis is part of the ANR NEMRO project, whose goal is to study the hypothetical correlation between olfactory deficiency and neurodegenerative diseases. For this purpose, an optical biopsy of the olfactory epithelium must be performed. However, this area is not accessible today with conventional tools. To go beyond this limitation, we propose to investigate the use a concentric tube robot (CTR). Its synthesis is performed from medical images. It takes into account the stability criteria, inter-subject variability, and is associated to a FTL (Follow-The-Leader) deployment. As the device is mounted on the subject, it has to be compact and lightweight. Thus, a specific deployment sequence simplifies the actuation unit, and an implementation is proposed using multimaterial additive manufacturing. Preliminary evaluations of the FTL deployment capabilities and the key components of the device allowed to validate the approach chosen for the NEMRO project, and its feasibility.

La thèse porte sur la communication olfactive impliquant les individus, en position d’interactants, lors de situations de communication de « face-à-face ». Nous pensons que porter un parfum est une forme d’intention communicative sur ce que le sujet parfumé communicant aspire à être. Dans le champ des sciences de l’information et de la communication, la communication olfactive est étudiée dans un contexte théorique mobilisant des ressources issues de l’interactionnisme et de l’ethnométhodologie.Se parfumer, apparaissant comme une envie de communiquer sur son soi, nous essayons de mieux comprendre les processus de construction identitaire en articulation avec le soi. Cependant, comme l’odorat est un sens très intimiste, se référant notamment aux expériences olfactives passées, la qualité d’un parfum est une donnée très subjective. C’est pourquoi, sur le plan méthodologique, nous avons construit un protocole, axé sur la notion d’interaction (Goffman), afin de manipuler différents contextes d’échanges. L’objectif est de mieux comprendre quel rôle le parfum joue dans diverses situations de communication interpersonnelle.Une enquête qualitative a été menée sur 35 sujets, issus deux pays voisins, la Suisse et la France. Chaque interview en profondeur est basée sur un test projectif où le sujet est amené à construire la représentation d’un individu communiquant en fonction d’une senteur. Les résultats montrent que ne pouvant nous « réapproprier » la perception de l’autre, nous sommes contraints d’inférer, à partir de son comportement et de notre propre expérience, ce qu’il ressent. Le sujet infère des informations qu’il juge adéquates et pertinentes sur l’autre en se basant sur son vécu expérientiel en lien avec le parfum qu’il sent : l’odeur devient un dispositif d’information qui véhicule des données précédemment encodées. L’individu parfumé est alors un dispositif communicationnel exposé au nez de l’interactant. Ce dernier, récepteur de la communication olfactive, infère les intentions communicatives de l’individu parfumé à partir de l’odeur qu’il perçoit. L’odeur est un « marqueur moral » (Le Breton, 2006), révélatrice de ce que nous sommes intrinsèquement, en tant qu’individu, la bonté sent bon, tout ce qui est de l’ordre du malsain « empeste ». La thèse montre qu’hommes et femmes n’ont pas les mêmes impressions olfactives à propos des mêmes parfums, qu’il existe des formes de corrélations olfactives en termes d’imaginaire d’un individu à un autre, indépendamment de l’âge et du pays d’origine. Conduisant à construire une identité sociale, certains parfums inspirent plus de sympathie, voire de naïveté que d’autres. A l’inverse, certains provoquent du mépris et même du dégoût. / The thesis focuses on olfactory communication involving individuals in position of interactants during "face to face" communication situations. I believe that wearing a fragrance is one form of communicative intent on what the communicating subject aspires to be. In the field of information and communication sciences, olfactory communication is studied in a theoretical context which mobilises resources from interactionism and ethnomethodology. Since wearing perfume appears to be a desire to communicate about our self, I try to understand better the processes of identity construction in conjunction with the self. However as the sense of smell is very intimate, for instance it refers to past olfactory experiences, the quality of a fragrance is a very subjective data. Therefore, my methodology was built according to a protocol based on the concept of interaction (Goffman) in order to handle different contexts of exchanges. The aim is to understand better what role scent plays in various situations of interpersonal communication.A qualitative survey was conducted on 35 subjects from two neighboring countries, Switzerland and France. Each in-depth interview is based on a projective test for which the subject is required to build a representation of a communicating individual according to a scent. The results show that since we cannot "reclaim" the perception of the other, we are forced to infer what he feels according to their behavior and our own experience. The subject infers information on the other he deems appropriate and relevant, based on his experiential background in relation with the perfume he smells: the odor becomes an information device that conveys previously encoded data. The perfumed individual is therefore a communicative device exposed to the nose of the interactant. The latter, receiving olfactory communication, infers the communicative intentions of the fragranced individual from the smell he perceives. The odor is a "moral marker" (Le Breton, 2006), revealing who we truly are as an individual, kindness smells good, everything dodgy "stinks." The thesis shows that men and women have different olfactory impressions about the same scents, that there are forms of correlations in terms of olfactory imagination from one individual to another, regardless of how old they are and where they come from. Some perfumes inspire more sympathy or even more ingenuousness than others in order to lead us towards building a social identity. However, others on the contrary can cause contempt and even disgust.

O presente trabalho descreve um programa de computador em linguagem Java que reproduz o modelo compartimental reduzido de célula mitral do bulbo olfativo construído por Davison, Feng e Brown (Brain Res. Bull. 51:393-399,2000), como uma simplificação do modelo detalhado de Bhalla e Bower (J. Neurophysiol., 69:1948-1965, 1993). O modelo reduzido considera a célula mitral como composta por quatro compartimentos, modelados conforme a metodologia de HODGKIN e HUXLEY. Por seu baixo custo computacional, o modelo reduzido permite a construção de modelos de rede de grande porte para o bulbo olfativo. A implementação computacional feita em Java apresenta grande similaridade com a original, indicando uma robustez do modelo com relação a versões em plataformas distintas. / This work describes a computer program written in Java, which reproduces the reduced compartimental model of the mitral cell of the olfactory bulb constructed by Davison, Feng and Brown (Brain Res. Bull. 51:393-399,2000), as a simplified version of the detailed model of Bhalla and Bower (J. Neurophysiol., 69:1948-1965, 1993). The reduced model considers the mitral cell as composed of four compartiments modeled according to the Hodgkin-Huxley formalism. Due to its low computational cost, the reduced model allows the construction of large-scale network models of the olfactory bulb. The computer implementation made in Java shows great similarity with the original, indicating that the model is robust with respect to implementations in different platforms.

O sistema da procineticina desempenha um papel importante na migração dos neurônios secretores de GnRH e na neurogênese do bulbo olfatório. Camundongos com ablação dos genes que codificam a procineticina 2 (PROK2) e seu receptor (PROKR2) apresentaram fenótipos semelhantes ao da síndrome de Kallmann descrita em humanos. Mutações inativadoras nos genes PROK2 e PROKR2 foram identificadas em pacientes com hipogonadismo hipogonadotrófico isolado. Com base nestes achados, investigamos a presença de alterações estruturais nos genes PROK2 e PROKR2 em 107 pacientes brasileiros (63 com síndrome de Kallmann e 47 com hipogonadismo hipogonadotrófico isolado normósmico). Cem indivíduos brasileiros que relataram desenvolvimento puberal normal foram utilizados como grupo controle. As regiões codificadoras dos genes PROK2 e PROKR2 foram amplificadas utilizando-se oligonucleotídeos intrônicos específicos, seguida de purificação enzimática e sequenciamento automático. Duas mutações no gene PROK2 foram identificadas: a mutação p.G100fsX121 em homozigose presente em dois irmãos com síndrome de Kallmann; e a mutação p.I55fsX56 em heterozigose identiificada em um paciente com HHIn. Quatro mutações foram identificadas no gene PROKR2 (p.R80C, p.Y140X, p.L173R e p.R268C) em cinco pacientes com síndrome de Kallmann e um paciente com HHIn. Essas mutações não foram encontradas no grupo controle. As mutações do tipo missense, p.R80C, p.L173R e p.R268C foram identificadas em heterozigose. Mutações nos genes FGFR1, GnRHR, KiSS-1 e GPR54 foram excluídas nesses pacientes. O paciente portador da mutação p.R268C do PROKR2 apresentou deleção dos exons 1 e 2 do gene KAL1. Adicionalmente, as mutações p.R80C e p.R268C foram identificadas em heterozigose em parentes de primeiro grau assintomáticos dos casos índices. A nova mutação p.Y140X do PROKR2, única alteração em homozigose, foi identificada em um paciente com micropênis, criptorquidia bilateral, anosmia e palato ogival. Os pais deste paciente eram portadores da mutação p.Y140X em heterozigose e relataram desenvolvimento puberal normal e ausência de anormalidades olfatórias. Estudos in vitro da nova mutação p.R80C localizada na primeira alça intracelular demonstraram que o acúmulo de fofatidil-inositol (IP), assim como a ativação da via da MAPK foram significativamente afetadas em células transfectadas com o receptor mutado em relação ao receptor selvagem, indicando que a mutação p.R80C determina uma menor atividade do receptor. Avaliação da expressão por Western blot mostrou uma diminuição na expressão do receptor mutado R80C e uma maior expressão de receptores imaturos. Esses achados sugeriram o papel crítico da arginina localizada na posição 80 na atividade normal do receptor. Em conclusão, expandimos o repertório de mutações deletérias nos genes PROK2 e PROKR2 em pacientes com hipogonadismo hipogonadotrófico isolado. A haploinsuficiência do PROKR2 não foi suficiente para causar síndrome de Kallmann ou HHIn, entretanto mutações inativadoras em homozigose nos genes PROK2 e PROKR2 foram responsáveis pelo fenótipo reprodutivo e olfatório anormal, em concordância com os estudos prévios de ablação gênica em modelos animais. Arginina localizada na posição 80 do PROKR2 desempenha um papel crucial na adequada maturação do receptor / Physiological activation of the prokineticin pathway has a critical role in olfactory bulb morphogenesis and GnRH secretion. Knock-out mice for genes that encode prokineticin 2 (PROK2) and the prokineticin receptor 2 (PROKR2) exhibited a phenotype similar to the Kallmann syndrome (KS). Inactivating mutations in PROK2 and PROKR2 have been identified in patients with isolated hypogonadotropic hypogonadism. Based on these findings, we investigated the presence of inactivating mutations of the genes PROK2 and PROKR2 in Brazilian patients with isolated hypogonadotropic hypogonadism associated or not with olfactory abnormalities and performed in vitro studies of the new identified mutations. We studied 107 patients with HH (63 with Kallmann syndrome and 44 with normosmic HH) and 100 control individuals. The coding regions of PROK2 and PROKR2 were amplified by polymerase chain reaction followed by enzymatic purification and direct automatic sequencing. In PROK2, two known frameshift mutations were identified. Two brothers with Kallmann syndrome harbored the homozygous p.G100fsX121 mutation, whereas one male with normosmic HH harbored the heterozygous p.I55fsX56 mutation. In PROKR2, four distinct mutations (p.R80C, p.Y140X, p.L173R and p.R268C) were identified in five patients with Kallmann syndrome and in one patient with normosmic HH. These mutations were not found in the control group. The p.R80C and p.R268C missense mutations were identified in heterozygous state in the HH patients and in their asymptomatic first-degree relatives. The p.L173R was also identified in heterozygous state. In addition, no mutations of FGFR1, GnRHR, KiSS-1 or GPR54 were identified in these patients. The patient with the PROKR2 mutation p.R268C also has a deletion of the exon 1 and 2 in the gene KAL1. Notably, the new nonsense mutation (p.Y140X) was identified in homozygous state in an anosmic boy with micropenis, bilateral cryptorchidism and high-arched palate. His asymptomatic parents were heterozygous for this severe defect. In vitro studies of the new mutation, p.R80C, were performed in order to access the mechanism by which this mutation could affect the activity of the PROKR2. In vitro studies showed that the amount of fofatidil-inositol (PI) and the activation of MAPK were significantly lower in cells transfected with the R80C mutant receptor than in cells transfected with the wild receptor, indicating that this variant is a loss-of-function mutation. Binding studies and Western blot showed a reduction in the expression levels of the receptor in the plasma membrane and in whole cell, respectively. Additionally, Western blot analysis of R80C PROKR2 revealed an additional smaller molecular weight band that represents the presence of immature unglycosylated receptors. The arginine 80 in ICL1 is important for post-translational processing of PROKR2. In conclusion, we expanded the repertoire of PROK2 and PROKR2 mutations in patients with HH and showed that PROKR2 haploinsufficiency is not sufficient to cause Kallmann syndrome or normosmic HH, whereas homozygous loss-of-function mutations either in PROK2 or PROKR2 are sufficient to cause disease phenotype, in accordance with the Prokr2 and Prok2 knockout mouse models. In vitro studies suggested that the arginine located at position 80 of the receptor seems to play an important role in the receptor function

O sistema olfatório de mamíferos é capaz de detectar milhares de substâncias químicas diferentes, mesmo em baixas concentrações. Um odorante disperso no ar pode se ligar a um receptor olfatório (OR) iniciando o processo de detecção. Os ORs são membros da super família de receptores acoplados a proteína G (GPCRs). Apesar de a via de transdução de sinal de odorantes estar bem descrita, pouco se sabe sobre os seus moduladores. Em 2005, nosso laboratório identificou RIC-8B como um possível fator de troca de nucleotídeos de guanina (GEF) que poderia amplificar a atividade da proteína G olfatória (Golf). No presente trabalho mostramos que RIC-8B é capaz de interagir com Gγ13. Procurando os outros componentes desse complexo identificamos Gβ1 como sendo a subunidade Gβ mais expressa no epitélio olfatório. Além disso, RIC-8B, Gαolf, Gβ1 e Gγ13 encontram-se concentrados nos cílios dos neurônios olfatórios e se co-localizam nesse compartimento celular. Nossos experimentos de co-imunoprecipitação mostram que RIC-8B interage mais fortemente com Gαolf, na presença de GDP do que na presença de GTP, como esperado para uma GEF. Curiosamente quando Gβ1 e Gβ13 estão presentes, RIC-8B e Gαolf co-imunoprecipitam igual, independente do nucleotídeo de guanina utilizado. Apesar de, na presença de Gβ1 e Gγ13, não observarmos dissociação física de RIC-8B e Gαolf com a mudança do estado de ativação, o efeito de RIC-8B na produção de AMPc não é afetada. Também mostramos que a quantidade de Gαolf, Gβ1 e Gγ13 presentes na membrana celular aumenta quando estas são co-transfectadas com RIC-8B em células de mamíferos. Nossos resultados apontam para um papel duplo da RIC-8B. Primeiro, RIC-8B poderia funcionar como uma chaperona auxiliando na formação e transporte do complexo heterotrimérico, Golf, em neurônios olfatórios. Em segundo lugar, RIC-8B também atuaria como uma GEF sobre Gαolf, aumentando a produção de AMPc e portanto amplificando a via de transdução de sinal de odorantes. Por fim, acreditamos que um possível papel para Gβ1 e Gγ13 nesse complexo seria funcionar como um andaime molecular, aproximando RIC-8B de seu alvo, Gαolf, potencializando ainda mais a atividade de GEF. / The mammalian olfactory system detects small amounts of thousands of different chemical compounds. Odorant perception starts when an odorant in the air binds to an olfactory receptor (OR). ORs belong to the super family of G-protein coupled receptors (GPCRs). Even though the odorant signaling pathway is well known, little is known about its modulators. In 2005, our lab identified RIC-8B as a putative guanine nucleotide exchange factor (GEF) that is able to interact with the olfactory G-protein (Golf) and amplify its activity. Here we show that RIC-8B also interacts with Gγ13. We also found that Gβ1 is the Gβ subunit that is predominantly expressed in the olfactory epithelium. Furthermore, RIC-8B, Gαolf, Gβ1 and Gγ13 are highly concentrated in the cilia of olfactory neurons and co-localize in this cellular compartment. We also show that RIC-8B interaction with G&#945olf is stronger in the presence of GDP than GTP, as expected for a GEF. Curiously, in the presence of Gβ1 and Gγ13, RIC-8B and Gαolf remain associated, in the presence of both GDP or GTP, probably through an indirect interaction via Gβ1/Gγ13. We also showed that the amounts of Gαolf, Gβ1 and Gγ13 in the cell membrane increase if RIC-8B is cotransfected in the same cell. Our results suggest that RIC-8B plays two roles. First, it may act as a chaperone which assists in the assembly and trafficking of the G protein complex. Second, RIC-8B would also act as a GEF to increase Gαolf dependent cAMP production and thereby amplify odorant signal transduction. Lastly, we believe that Gβ1 and Gγ13 may act as a scaffold to position RIC-8B close to its target, Gαolf, further enhancing the GEF activity.

O objetivo desta Tese foi analisar os efeitos do treino de marcha isolado e em combinação com transplante de glia embainhante olfatória (GEO) na recuperação funcional e na plasticidade neuromuscular dependente da atividade em um modelo experimental de paraplegia. Para tanto, foram realizados 2 experimentos. No 1º experimento foi realizada completa transecção da medula espinal (TME) em ratos Wistar adultos e após 5 dias iniciou-se um protocolo de 9 semanas de treino de marcha em esteira com suporte de peso corporal. No 2º experimento, os animais receberam, imediatamente após a TME, transplante de células gliais embainhantes olfatórias (GEO) e, como no primeiro experimento, iniciaram o treino de marcha 5 dias após a lesão/transplante. Durante o período dos experimentos, estudos comportamentais para acompanhamento da recuperação da função sensório-motora dos animais foram periodicamente realizados. Além disso, ao término da fase de treinamento (10 semanas após a lesão/transplante), análises histológicas e bioquímicas foram realizadas em amostras de tecido retiradas da medula espinal e músculo sóleo. Os resultados mostram que o treino de marcha em esteira promove melhora da função sensório-motora nos membros posteriores (MPs) de ratos com completa transecção da medula espinal (TME). Os animais treinados apresentaram escores mais altos na escala BBB e normalização do reflexo flexor de retirada. Além disso, os animais com TME apresentaram atrofia do soma celular nos motoneurônios alfa, redução na expressão de sinaptofisina e na atividade da Na+,K+-ATPase na região lombar. Os animais treinados mostraram soma motoneuronal, expressão de sinaptofisina e atividade da bomba de Na+,K+-ATPase similares aos controles. No músculo sóleo, a TME causou severa atrofia muscular, que foi acompanhada pela redução na expressão do fator neurotrófico derivado do encéfalo (BDNF) neste músculo. Por outro lado, o treino de marcha foi capaz de parcialmente impedir/reverter a atrofia provocada pela paralisia muscular e promover um significante aumento na expressão do BDNF, o qual teve positiva correlação com o trofismo muscular dependente da atividade motora no músculo sóleo. O transplante de glia embainhante olfatória (GEO) promoveu significativo aumento nos escores da escala BBB nos animais com completa TME. Entretanto, o treino de marcha foi capaz de acelerar este ganho funcional. Apesar de não ser observada significativa regeneração axonal através do local da lesão, sugerindo que as melhoras funcionais ocorreram independentemente da existência de regeneração axonal. Estes resultados sugerem que o treino de marcha após a TME promove plasticidade morfológica e bioquímica dependente da atividade nos tecidos neuromusculares. A melhora funcional ocorreu concomitantemente a estas alterações plásticas. Além disso, a terapia de transplante de GEO mostrou resultados positivos na recuperação da função motora dos MPs que foi acelerada pelo treino de marcha, mesmo na ausência de regeneração axonal através da lesão. Estes dados mostram importantes informações neurobiológicas que fornecem base neurocientífica para o uso seguro e eficaz destas terapias na reabilitação após LME. / The aim of this thesis was to study the effects of treadmill step training alone and in combination with olfactory ensheathing cells (OEC) on functional recovery and activity-dependent neuromuscular plasticity in a traumatic paraplegia model. For this, we made two experiments. In the 1st experiment, complete spinal cord transection (SCT) was made in adult Wistar rats and after 5 days the spinal animals were underwent a 9 week body-weight-supported treadmill training (BWSTT) program. In the 2nd experiment, the spinal animals received acute olfactory ensheathing cell (OEC) transplantation and, similar to the 1st experiment, started a BWSTT 5 days after the injury/transplantation. Behavioral tests were periodically performed in order to study the hindlimb sensorimotor functions in both experiments. Furthermore, after 9 weeks of the training (10 weeks after SCI/transplantation), histological and biochemical analysis were performed in spinal cord and soleus muscle tissues. The results show that treadmill step training improves hindlimb sensorimotor function in rats with complete spinal cord transection (SCT). The trained animals showed higher BBB scores and normalization of the withdrawal reflex. Furthermore, spinal animals showed alpha motoneuron soma size atrophy, decrease in synaptophysin expression and Na+,K+-ATPase activity in lumbar spinal cord. Trained SCT animals showed motoneuron soma size, synaptophysin expression and Na+,K+-ATPase activity values similar to controls. In soleus muscle, SCT led to severe muscular atrophy, which was accompanied by a decrease in brain-derived neurotrophic factor (BDNF) expression in this muscle. On the other hand, treadmill step training was able to revert/prevent this paralysis-induced muscular atrophy and promote significant improvement in soleus BDNF expression, which was positively correlated to activity-dependent muscular trophism. Olfactory ensheathing cell (OEC) transplantation promotes significant improvements in the BBB scores of animals with SCT. However, treadmill step training was able to accelerate this functional gain. There was no significant axonal regeneration that traversed the injury site, which suggests that functional gains occurred in a manner independent of axonal regeneration. Taken as a whole, these results suggest that treadmill step training after SCT promotes activity-dependent morphological and biochemical plasticity in neuromuscular tissues. The functional improvements occurred concomitantly to these plastic changes. Moreover, OEC therapy showed positive results on hindlimb motor function recovery which was accelerated with treadmill step training even in the absence of axonal regeneration across the lesion site. These results represent important neurobiological information for the neuroscientific basis that supports these therapies as an efficient and safe approach in spinal cord injury rehabilitation.

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Inside of the sensilla there are neurones that project themselves to olfactory lobes in the synganglion, the central nervous system. In ticks, there is a gap in how the perception of the olfactory information is integrated in the synganglion and this comprehension would allow obtain details that could be used to the development of new control strategies. This work aims to verify the integration between the Haller organ and the synganglion by determining its neuronal projection patterns until the olfactory lobes as well accomplish its three-dimensional reconstruction. Males and females of A. sculptum were immobilized and the Haller organ was excised. The olfactory nerves were filled with one drop of dextran tetramethylrhodamine 1%. The synganglions were dissected in saline, fixed in 4% paraformaldehyde, washed in saline and triton X-100, dehydrated in alcohol series and mounted in glicerol. The synganlions were examined in a fluorescence microscope (Axio Scope.A1) to confirm filling from the peripheral neurons to the synganglion. The olfactory lobes stained were digitalized in a confocal microscope TCS SP8 (Leica) and the series were examined in the Reconstruct software. The olfactory lobes of one male and three females were selected to tracing the edges of each glomerulus in successive optical sessions in order to obtain the 3D reconstruction. The volume was calculated using the same software and their correlation was analyzed by Pearson correlation. The neuronal projections from the Haller organ were confined in the olfactory lobes, which were organized in glomeruli. The number of glomeruli in the males was 26 and 30 in each olfactory lobe examined and in the females varied between 24 and 29. Male and females showed similar glomeruli in both olfactory lobes, meaning they are homologues, when compared intra and intersexually, with a positive correlation between 72% and 95%. Considering the volume, the glomeruli were also similar and no macroglomerulus was identified, as any glomerulus in the male and female were two times bigger than the average volume. The number of specimens evaluated does not allow inferring if the lower number of glomeruli in the females was statistically significant. This work shows, for the first time, the 3D reconstruction of the olfactory lobe in a tick species. The results obtained contribute to understand how ticks process their olfactory information. / Amblyomma sculptum, pertencente ao complexo A. cajennense, parasita humanos, animais domésticos e silvestres. Apresenta importância mundialmente reconhecida na saúde pública e animal por espoliar seus hospedeiros e transmitir patógenos causadores de doenças, como Rickettsia rickettsii agente de Febre Maculosa no Brasil. Os carrapatos orientam-se por estímulos químicos detectados por seus órgãos sensoriais, como o órgão de Haller, localizado no primeiro par de patas, que possui sensilas olfativas capazes de detectarem moléculas voláteis, como os odores. No interior destas sensilas há neurônios que se projetam para os lobos olfativos, organizados em glomérulos, no interior do singânglio, o sistema nervoso central. Em carrapatos, pouco se sabe sobre como a percepção da informação olfativa é integrada no singânglio e esta compreensão permitiria obter mais detalhes sobre a biologia, contribuindo para o desenvolvimento de novas tecnologias de controle. Objetivou-se verificar a integração entre o órgão de Haller e o singânglio por meio da determinação dos padrões de projeção neuronal das sensilas olfativas aos lobos olfativos e da reconstrução tridimensional dos glomérulos. Machos e fêmeas adultos de A. sculptum foram imobilizados, o órgão de Haller seccionado e o nervos olfativos corados com dextran tetrametilrodamina 1%. Os singânglios foram dissecados em PBS, fixados em paraformaldeído 4%, lavados em PBST e PBS, desidratados em séries ascendente de etanol e montados em lâminas com glicerol. Os singânglios foram observados em microscópio de fluorescência Axio Scope.A1 para determinar aqueles onde houve projeção. Os lobos olfativos corados foram digitalizados em microscópio confocal a laser TCS SP8 e as séries de imagens confocais foram avaliadas no programa Reconstruct. Selecionaram-se os lobos olfativos de um macho e três fêmeas para identificação dos glomérulos, marcação manual e numeração, com posterior reconstrução 3D. O programa permitiu o cálculo dos volumes glomerulares que foram analisados por correlação de Pearson. As projeções neuronais originadas nas sensilas olfativas do órgão de Haller estiveram confinadas estritamente aos lobos olfativos, organizados em glomérulos. Os glomérulos no macho variaram entre 26 e 30 e nas fêmeas, entre 24 e 29. Macho e fêmeas apresentaram glomérulos similares, denominados homólogos, nos dois lobos olfativos quando comparados intra- e intersexualmente, com correlação positiva entre 72% e 95%. Com relação aos tamanhos e formas, os glomérulos foram similares e não foram identificados macroglomérulos, uma vez que os glomérulos com maiores volumes no macho e nas fêmeas não apresentaram valores superiores a duas vezes o valor da média. O número de indivíduos avaliados não permitiu inferir se a menor quantidade de glomérulo nas fêmeas foi estatisticamente significativa e, portanto, não se pode afirmar se há dimorfismo sexual. Em carrapatos este foi o primeiro trabalho em que se realizou a reconstrução tridimensional dos lobos olfativos. Os resultados obtidos contribuem para o conhecimento do processamento central da informação olfativa em carrapatos.

Telômeros são complexos DNA-proteína presentes nas extremidades dos cromossomos. Os telômeros se encurtam a cada divisão celular, sendo o comprimento telomérico, portanto, considerado um biomarcador do envelhecimento celular. Esse encurtamento é vinculado a diversas doenças relacionadas à idade avançada. Na doença de Alzheimer (DA), têm sido associados com diversas vias fisiopatológicas, como a neuroinflamação e o estresse oxidativo, porém seus mecanismos ainda são pouco conhecidos. A maioria dos estudos sobre comprimento telomérico na DA é realizada em DNA leucocitário, pouco se sabendo sobre seu estado no sistema nervoso central. O lítio é um importante estabilizador de humor, com efeitos neuroprotetores amplamente evidenciados, mas pouco se sabe sobre seu efeito na manutenção do comprimento telomérico. O objetivo do presente estudo foi avaliar o efeito do tratamento crônico com lítio no comprimento telomérico em diferentes regiões cerebrais (córtex parietal, hipocampo e epitélio olfatório) de camundongos triplo transgênicos para DA (3xTg-AD) e selvagens. Dezoito animais transgênicos e 22 selvagens foram tratados por oito meses com ração contendo 1,0 g (Li1) ou 2,0 g (Li2) de carbonato de lítio/kg, ou ração padrão (Li0). O comprimento telomérico do DNA extraído destes tecidos foi quantificado por PCR em tempo real. O tratamento crônico com lítio foi associado a telômeros mais longos no córtex parietal (Li1, p=0,04) e hipocampo (Li2, p=0,02) dos camundongos 3xTg-AD comparados com os respectivos selvagens. Nossos achados sugerem que o tratamento crônico com lítio afeta a manutenção do comprimento telomérico, mas que a magnitude desse efeito depende da concentração de lítio ministrada e das características do tecido envolvido. Esse efeito foi apenas observado quando comparando os animais triplo transgênicos com os selvagens, indicando que a presença da patologia, no caso a DA, se faz necessária para a modulação do comprimento telomérico promovida pelo lítio / Telomeres are DNA-protein complexes present in the extremities of chromosomes. Telomeres shorten at each cell division, being the telomere length, therefore, considered a cell aging biomarker. This telomere shortening is associated to several age-related diseases. In Alzheimer\'s disease (AD), telomere length has been linked to several pathophysiological pathways, such as neuroinflammation and oxidative stress, though its mechanism are still poorly understood. Majority of studies regarding telomere length in AD are based in leucocyte DNA, with little information about its status in the central nervous system. Lithium is an important mood stabilizer, with neuroprotective effects widely evidenced, but little is known about its effects in telomere length maintenance. The objective of this present study was to evaluate the effect of chronical lithium treatment on telomere length in different brain regions (parietal cortex, hippocampus and olfactory epithelium) of wild type and triple transgenic mice model for AD (3xTg-AD). Eighteen transgenic and 22 wild type male mice were treated for eight months with chow containing 1.0g (Li1) or 2.0g (Li2) of lithium carbonate/kg, or standard chow (Li0). Telomere length of extracted DNA from theses tissues was quantified by real-time PCR. Chronic lithium treatment was associated with longer telomeres in the parietal cortex (Li1, p=0.04) and in the hippocampus (Li2, p=0.02)of 3xTg-AD compared with the respective wild type.Our findings suggest that chronic lithium treatment does affect telomere maintenance, but the magnitude of this effect depends on the working concentrations of lithium and characteristics of the involved tissue. This effect was only observed when comparing triple transgenic with wild type mice, suggesting that the presence of AD pathology was required for the lithium modulation of telomere length

INTRODUÇÃO: A biópsia do neuroepitélio olfatório (NeuO) oferece perspectivas para aplicações terapêuticas tanto em doenças do olfato como doenças neurodegenerativas. Uma coleta bem sucedida desse tecido in vivo ainda não é rotina, devido á carência de estudos sobre a distribuição do NeuO em conchas superior (CS) e média (CM). Neste trabalho, descrevemos a distribuição do NeuO na CS e CM em cadáveres a partir da retirada integral dessas estruturas e posterior análise histológica por coloração de hematoxilina e eosina (HE) e imunoistoquímica. Além disso, também analisamos a influência do sexo, idade e lateralidade no grau de presença do NeuO nas CS e CM. CASUÍSTICA E MÉTODOS: Estudo anatômico prospectivo realizado de março de 2006 a janeiro de 2008. A CS e a CM foram endoscopicamente retiradas de um total de 25 cadáveres frescos com menos de 12 horas de óbito. Cada concha foi seccionada na metade de seu comprimento ântero-posterior. Assim, cada um dos 25 cadáveres deu origem a oito fragmentos de mucosa de regiões anatômicas distintas, totalizando 200 lâminas para análise tanto por coloração de HE como por reação de imunoistoquímica. Nas lâminas coradas por HE, classificamos a distribuição do NeuO em graus 0, 1, 2, 3, 4, sendo que a análise foi realizada por 3 patologistas de forma cega. Para imunoistoquímica, só obtivemos positividade com a proteína S-100. A concordância entre os três patologistas foi avaliada aos pares utilizando-se o coeficiente de Kappa. A distribuição do NeuO foi analisada de acordo com a idade, sexo, tempo de óbito, simetria entre as fossas nasais e acurácia da imunoistoquímica. RESULTADOS: Pela HE na CS, o NeuO esteve presente em 82,9% das vezes e, na CM, em 17,1%. Na CS, o NeuO foi detectado em 82,9 % das lâminas, 4,9 vezes a prevalência na CM, que foi de 17,1 % das lâminas (p < 0,001). Pela imunoistoquímica, foi possível encontrar NeuO em um total de 15 fragmentos. Desses, 10 (20%) eram da metade posterior da CS e cinco (7,6%) da metade anterior da CS. Pelo cálculo da razão de prevalência, temos que a chance de encontrar NeuO é 4,9 vezes maior na CS do que na CM (IC95%: 3,3 7,4). Dos 15 fragmentos com marcação positiva para proteína S-100, sete corresponderam aos que tinham uma distribuição grau 3 (>50% e 75%) pela HE e outros sete aos que tinham uma distribuição grau 4 (acima de 75%). Somente um fragmento teve marcação positiva para imunoistoquímica no grupo 2 (entre 26 e 50%) na HE. A proteína S-100 apresentou uma sensibilidade de 13,5% e especificidade de 100% para detecção de NeuO. Não houve diferença estatisticamente significante na prevalência de NeuO quando os fragmentos foram divididos de acordo com o sexo, idade de óbito e lado da fossa nasal. No entanto, ao analisarmos a presença de NeuO de acordo com o grau de distribuição entre cada lado, não se percebe uma concordância. CONCLUSÕES: A quantidade total de NeuO foi simetricamente distribuída entre as fossas nasais, mas não houve uma concordância entre os lados quanto à maneira como o NeuO está distribuído. O NeuO apresenta maior probabilidade de ser encontrado na metade posterior de CS. A HE é um método eficaz para distinção entre NeuO e epitélio respiratório, devido a grande concordância entre três patologistas distintos. / INTRODUCTION: Olfactory neuroepithelium (ON) biopsy provides perspectives for several therapeutic applications, both in disorders of olfaction and in neurodegenerative diseases. Successful in vivo collection of ON is still not routine, due to a dearth of studies on ON distribution in the superior and middle turbinate (ST and MT respectively). This study describes the distribution of ON in cadaver ST and MT as determined by complete endoscopic removal of turbinates and histological analysis with hematoxylin and eosin (H&E) and immunohistochemical staining. We also analyzed the influence of gender, age, and naris side on the extent to which ON is present in the superior and middle turbinate. CASE SELECTION AND METHODS: We conducted a prospective anatomical study from March 2006 to January 2008. The superior and middle turbinates of 25 fresh cadavers (less than 12 hours post-mortem) were removed endoscopically. Each turbinate was halved into anterior and posterior fragments. Eight anatomically distinct fragments were therefore obtained from each of the 25 cadavers for a total of 200 specimens, which were analyzed through H&E staining and immunohistochemistry. Hematoxylin and eosin-stained slides were subjected to blind examination by three independent pathologists; ON distribution was graded on a fivepoint numeric scale (grade 0, 1, 2, 3, or 4). Immunohistochemistry was only positive through S-100 staining. Pairwise agreement between pathologists was assessed by means of the Kappa coefficient. The distribution of ON was analyzed regarding age, gender, time elapsed between death and specimen harvesting, symmetry between nares, and accuracy of immunohistochemistry results. RESULTS: In H&E-stained slides, olfactory neuroepithelium was present in 82.9% of ST and 17.1% of MT specimens; prevalence in the superior turbinate was therefore 4.9-fold greater (p < 0.001). Immunohistochemical analysis was able to identify ON in 15 fragments, 10 of which (20%) were from the posterior half of the superior turbinate; the remaining five specimens (7.6%) were from the anterior ST. According to prevalence ratio, the odds of finding ON are 4.9 times greater in superior turbinate than in the middle turbinate (CI, 95%; 3.37.4). Of the 15 immunohistochemistry-positive fragments, seven were assigned distribution grade 3 (>50% and 75% presence of ON) on H&E staining seven others were graded 4 (>75% presence of ON). A single immunohistochemistrypositive fragment was found to have grade 2 ON distribution (i.e., it contained 26% to 50% olfactory neuroepithelium) on H&E staining. S-100 staining showed a sensitivity of 13.5% and specificity of 100% for ON detection. There was no statistically significant difference in ON prevalence when fragments were compared according to gender, age at time of death, and naris side. However, when we analyzed ON presence according to the degree of ON distribution in each side, we found no concordance. CONCLUSIONS: Total ON was distributed symmetrically between nares, but we found no concordance between sides in the manner in which ON is distributed. ON is most likely to be found in the posterior half of the superior turbinate. Hematoxylin and eosin (H&E) staining is an effective method for distinguishing ON from respiratory epithelium, as shown by high inter-rater agreement among three independent pathologists