DE LA TESI:El diagrama complet de les pertorbacions genètiques i epigenètiques que afecten el càncer colorectal (CCR) està lluny de ser totalment conegut. L'LOH és una de les alteracions més recurrents en CCR així com en d'altres neoplàsies. Acostuma a ser un bon indicador de la presència de gens rellevants per a la carcinogènesi. L'estudi de les alteracions somàtiques en gens situats en aquestes regions recurrents de desequilibri al·lèlic ha estat fonamental en el passat per la identificació d'alguns dels gens supressors tumorals més coneguts, com és el cas de p53, Smad4, p16, APC o Rb. Els desequilibris al·lèlics a 4p s'han associat amb una major agressivitat i un pitjor pronòstic en pacients de CCR, malgrat que els gens diana d'aquests alteracions resten encara per ser identificats. En aquesta tesi s'ha dut a terme un treball d'anàlisi genètica integral per a una regió crítica situada a 4p15 am la intenció de localitzar-hi els gens que més probablement estiguin contribuint a la progressió tumoral. Hem realitzat un exhaustiu treball d'al·lotipat mitjançant la utilització de marcadors microsatèl·lit, sobre un model de tumors xenoempeltats en ratolins atímics. Hem identificat una regió crítica en al que els gens candidats han estat analitzats d'acord a les seves possibles alteracions somàtiques genètiques i/o epigenètiques. També hem analitzat els patrons d'expressió dels gens candidats per tal d'identificar possibles alteracions transcripcionals. Mitjançant prediccions de regulació transcripcional bioinformàtiques hem trobat que PI4K2B i STIM2 són dos gens regulats per TCF4/B-catenina. Això ha estat confirmat mitjançant immunoprecipitació de cromatines. Hem avaluat el valor pronòstic de les alteracions en aquests dos gens i el seu valor com predictors de la resposta al tractament basat en el 5-FU de pacients de CCR. A més, hem realitzat experiments de depleció mitjançada per siRNA sobre línies cel·lulars de CCR, alhora que hem transfectat de forma estable aquests dos gens. Finalment hem realitzat assajos de formació de tumors en ratolins immunodeprimits per comprovar si la sobreexpressió dels nostres gens candidats té o no un efecte en la formació dels tumors generats a partir de línies cel·lulars. Els patrons de LOH identificats a 4p descarten que, com s'havia proposat, es doni en l'estadi metastàtic una acumulació d'aquestes alteracions. L'LOH detectat no correlaciona amb la dosi gènica, és a dir que les pèrdues d'heterozigositat no comporten una pèrdua de material genètic i probablement són la conseqüència de processos de recombinació mitòtica i/o pèrdua i duplicació associats a un escenari d'inestabilitat cromosòmica. Els gens d'aquesta regió crítica no són portadors de mutacions, microdelecions ni delecions en homozigosi, ni tampoc presenten alteracions en els patrons de metilació de les seves regions promotores. Per contra, vam trobar que PI4K2B i STIM2 estaven significativament sobreexpressats en pacients afectes de CCR i metàstasi hepàtiques (MH) independentment de la presència o no d'LOH, i que, a més, la seva transcripció estava sot control del complex TCF4/B-catenina. Els nivells elevats de PI4K2B, tant de proteïna com d'mRNA estan assocats a un millor pronòstic i una millor resposta al tractament quimioteràpic dels pacients de CCR. Finalment, els estudis de depleció amb siRNA han demostrat que el silenciament d'aquests dos gens comporta un increment significatiu de la proliferació cel·lular i que la sobreexpressió en línies cel·lulars de STIM2 resulta en una disminució del volum tumoral i per tant té un efecte de supressió de la proliferació. Conclusions: Hem identificat PI4K2B i STIM2 com a gens diana de les alteracions recurrents a 4p15 i hem demostrat que són dianes transcripcional de la via de B-catenina. La sobreexpressió d'aquests dos gens té un efecte supressor de la proliferació cel·lular, que alhora, té un impacte en el pronòstic i el tractament dels pacients de càncer colorectal.

El adenocarcinoma de páncreas y el cáncer de colon son una de las causas de muerte, relacionadas con el cáncer, más comunes en los países desarrollados. Los tratamientos convencionales para este tipo de tumores son poco efectivos y es necesario el desarrollo de nuevas terapias. Entre las terapias experimentales destaca la terapia con genes suicidas, que consiste en la eliminación selectiva de las células tumorales que han sido modificadas con un gen suicida. La eficacia de dicha terapia depende de la transducción de una proporción elevada de células tumorales y de un potente efecto colateral in vivo. A pesar de las mejoras enfocadas a incrementar la llegada de los genes suicidas a las células tumorales con vectores más eficientes, los resultados obtenidos en los ensayos clínicos han sido muy reducidos.Con tal de aumentar el porcentaje de las células modificadas con genes suicidas en el tumor, proponemos utilizar los genes de resistencia a drogas en combinación con una droga de selección. En presencia de dicha droga, la población de células modificadas reemplazaría las células tumorales sensibles. Después de esta selección positiva, la terapia suicida induciría la muerte de las células modificadas. El efecto colateral permitiría eliminar todo el tumor aunque este reemplazamiento celular no fuese completo.La primera prueba de concepto se realizó en el modelo colorrectal HCT116 modificado con el marcador de selección dihidrofolato reductasa (DHFR) y el gen suicida timidina quinasa (TK). El gen DHFR otorga resistencia a metotrexato (MTX) y la TK confiere sensibilidad a la prodroga ganciclovir (GCV). En presencia del compuesto MTX, estas células se enriquecieron de un 0.1% a más de un 90% en cocultivos con HCT116 sin modificar. Después de esta selección positiva, la selección negativa con GCV eliminó las células modificadas. El tratamiento con MTX in vivo aumentó la proporción inicial de células modificadas. Este enriquecimiento mejoró la eficacia de la terapia suicida per se en tumores con un 1% o un 4% inicial de células modificadas.En una segunda aproximación, modificamos la línea de adenocarcinoma pancreático NP18 con el gen de resistencia a multidrogas MDR1 y con el gen suicida TK. Las células modificadas mostraron resistencia a docetaxel y sensibilidad a GCV, tanto in vitro como in vivo. La aplicación de la droga de selección en ratones aumentó la proporción de células modificadas de un 4% inicial a un 22%. La estrategia de selección positiva-negativa permitió inhibir completamente el crecimiento tumoral en un modelo murino a partir de tumores con un 10% inicial de células modificadas. Estas dos aproximaciones demuestran que la selección positiva-negativa de células modificadas con un marcador de selección y con el gen suicida TK representa una estrategia efectiva para aumentar la proporción de células que expresan el gen TK en el tumor y mejorar la eficacia de la terapia suicida.Por otro lado, las células madre mesenquimales (MSC) han mostrado su capacidad de dirigir genes suicidas de forma sistémica hacia el tumor. En este apartado, nos planteamos si estas células podían seleccionarse positiva y negativamente en presencia de células tumorales. En primer lugar, se determino el enriquecimiento de las MSC de ratón (mMSC) en cocultivos con NP18, mediante tratamiento con docetaxel. A pesar de observarse una cierta selección positiva de las mMSC en cultivo, este enriquecimiento no sucedió en tumores mixtos tratados con la droga de selección. La generación de MSC de hígado fetal de conejo (rFL-MSC) modificadas con el gen MDR1 y el gen suicida FCU mejoró la selección positiva in vitro y permitió eliminar estas células en presencia de la prodroga 5-FC. Aún así, estas células no se enriquecieron en tumores mixtos tratados con docetaxel. / Thymidine kinase (TK)-mediated suicide gene therapy has been considered for the treatment of cancer. However, despite a bystander effect, the proportion of transduced tumor cells has proven too low to result in efficacy. We propose the use of a drug-selectable marker (DHFR or MDR1) to enrich TK-expressing cells using chemotherapy. This enrichment or positive selection phase may increase the efficacy of suicide gene therapy. The prove of concept was performed in colon cancer cells modified with a fusion gene of dihydrofolate reductase (DHFR) and thymidine kinase (TK). DHFR confers resistance to methotrexate (MTX) and TK confers sensitivity to ganciclovir (GCV). Under MTX treatment, tumor cells transfected with the DHFR-TK fusion gene efficiently replaced the parental cells (from 0.1 to 90% in 35 days). After this positive selection period, negative selection with GCV eliminated the transfected cells. In vivo, positive selection was also achieved and resulted in a statistically significant therapeutic effect.In other approximation we generated stable NP18MDR/TK-GFP transfectants and showed docetaxel resistance in vivo. Mixed tumors of MDR/TK-expressing cells and parental NP18 cells were established and docetaxel was used to increase the proportion of TK-expressing cells. Upon positive selection, the proportion of TK-expressing cells increased from 4% to 22%. Subsequent suicide gene therapy with GCV was more effective compared with a control group without positive selection. Starting with 10% of TK-expressing cells the positive-negative selection strategy completely inhibited tumor growth. Finally we tried to induce positive selection with Mesenchymal Stem Cells (MSC). We determined that mMSC could be enriched in cocultures with NP18 after docetaxel treatment. However, positive selection was not observed in vivo. The modification of rabbit fetal liver MSC (rFL-MSC) with the gene MDR1 and FCU improved positive selection in vivo and allowed negative selection in presence of the prodrog 5-FC. However, positive selection was not observed in mixed tumors. Taken together, these results suggest that a positive-negative selection strategy based on drug resistance genes represents an efficient way to increase the proportion of suicide expressing cells in the tumor and the efficacy of suicide gene therapy.

L'objectiu d'aquesta tesi doctoral ha estat el d'estudiar el comportament in vivo de les cèl·lules mare mesenquimàtiques derivades de teixit adipós (hAMSC), implantades en animals vius durant períodes extensos de temps, per a determinar la seva funcionalitat com a cèl·lules vehicle per a la teràpia gènica en tumors i per a la reparació de teixits.Per a dur a terme aquest objectiu es van marcar permanentment les cèl·lules hAMSC amb un vector lentivíric que contenia dos gens traçadors. Per una banda contenia el gen de la proteïna verda fluorescent (GFP) que ens va permetre la selecció de les cèl·lules marcades mitjançant la separació de cèl·lules activada per fluorescència, i per altra, el gen de la luciferasa de Photinus Pyralis (PLuc) que ens va permetre el seguiment no invasiu in vivo mitjançant la bioluminescència no invasiva (BLI). Aquestes cèl·lules, marcades i seleccionades, es van injectar en ratolins immunodeprimits on es van mantenir durant 8 mesos. Durant aquest període de temps, es va observar que aquestes cèl·lules es mantenien estables, que no formaven tumors i que no presentaven desequilibris cromosòmics greus.Posteriorment vam observar que les cèl·lules hAMSC també podien viure en tumors de pròstata (PC-3), inoculats en els músculs dels ratolins immunodeprimits, durant llargs períodes de temps i mantenir-se de manera estable. La detecció simultània de les cèl·lules tumorals i de les hAMSC va ser possible gràcies al marcatge de les cèl·lules amb diferents luciferases, la PLuc i la luciferasa de Renilla reniformis (RLuc). D'aquí es va concloure que aquestes cèl·lules eren vehicles segurs per a la teràpia cel·lular.Per portar a terme una teràpia gènica citotòxica en tumors, les cèl·lules hAMSC es van marcar amb un gen suïcida (timidina quinasa), de manera que gràcies a la mort d'aquestes cèl·lules suïcides quan s'administrava la prodroga (Ganciclovir) es produïa un efecte adjacent sobre les cèl·lules veïnes tumorals, fet que provocava la reducció dels tumors fins a un 98,5%. Amb la visualització dels dos tipus cel·lulars va ser possible determinar la dosi necessària de cèl·lules suïcides per obtenir un efecte adjacent major. A més, també es va poder quantificar la modulació del creixement que produïen les cèl·lules hAMSC en diferents tumors injectats de manera ortotòpica.Paral·lelament, el procediment de la BLI també ens va permetre determinar canvis en l'expressió d'un gen, el col·lagen 2 (COL2A1), el qual té un paper clau durant la condrogènesi: Les cèl·lules hAMSC es van transduir permanentment amb el gen de la PLuc, dirigit a partir del promotor específic del COL2A1, i es va observar una inducció de l'expressió de l'aquesta luciferasa, acompanyada també d'un canvifenotípic característic dels condròcits, quan es diferenciaven in vitro al llinatge condrogènic. Per tal de poder fer un seguiment in vivo, no invasiu, aquestes cèl·lules marcades es van transduir també amb la luciferasa RLuc, expressada constitutivament, per tal que fos l'indicador de la proliferació d'aquestes cèl·lules. Les cèl·lules hAMSC doblement marcades i sembrades en matrius d'os desmineralitzat (DBM) implantades subcutàniament en ratolins immunodeprimits van demostrar diferents patrons de diferenciació condrogència d'acord amb els resultats de les anàlisis histològiques. Aquest model, doncs facilitaria el desenvolupament de combinacions entre cèl·lules progenitores i esquelets per a la reparació de teixits. / The aim of this thesis was to study the behaviour of the human mesenchymal stromal cells derived from adipose tissue (hAMSCs) implanted in animals during prolonged time to determine their functionality as vehicles for genetic therapy in tumours and for tissue regeneration.For this purpose the hAMSCs were labelled by a permanent transduction with lentiviral vectors for the expression of two reporter gens. The green fluorescent protein (GFP) gene which proved to be useful for the enrichment of labelled cells, histological analysis and recovery of cells from tissue implants and the Photinus pyralis luciferase (PLuc) gene which allowed us the long term monitoring with the non-invasive bioluminescence imaging (BLI).The labelled and selected hAMSCs were injected in immunosupressed mice and maintained during 8 months. During this period, cells maintained a steady state and no detectable chromosomal abnormalities nor tumours formed during the 8 months of residence in the host's tissues.We also observed that hAMSCs could live long periods when implanted within PC-3 tumours, inoculated in the thighs of immunosupressed mice. The use of two luminescent reporters, allowed the simultaneous and independently monitoring in real time of two different cells populations implanted in the same anatomical site of the animal. Thus, from these observations we conclude that the hAMSCs could be safe vehicles for cell therapy.In order to perform a citotoxic gene therapy in PC-3 tumours, hAMSCs were labelled with a suicide gene (thymidine kinase). The addition of the prodrug (Gangiclovir) produced the death of these cells and killing of the neighbouring tumour cells (Bystander effect). This bystander effect produced a reduction of the tumours treated with suicide cells of 98.5% comparing with the control ones. The use of BLI and the dual labelling allowed us to optimize the ratio of the suicide vehicles to tumour cells to obtain a major bystander effect. Furthermore it was possible to quantify the tumour growth modulation produced by the injection of hAMSCs within different types of tumour cells.BLI procedures allowed us to analyze changes in gene expression and monitor cell differentiation in a live animal model of cartilage and bone formation.

El càncer d'endometri és la malaltia ginecològica més comuna i representa la quarta neoplàsia més freqüent en la dona en els països desenvolupats. Actualment és possible diagnosticar el 80% dels casos de EEC en estadiatge I FIGO, per tant, poder aplicar cirurgia i presentar un bon pronòstic. L'estadiatge I FIGO inclou tres subtipus: afecta l'endometri (IA), infiltra el miometri <50% (IB) i >50% (IC). El nostre grup es va centrar en la identificació de nous gens implicats en el EEC mitjançant l'estudi dels patrons d'expressió gènica diferencial entre teixit endometrial sa, hiperplàsic i tumoral, així com la cerca de nous gens associats al fenotip carcinomatós endometrial amb potencial valor diagnòstic i/o pronòstic. Es va trobar que els dos gens majorment sobreexpressats eren RUNX1/AML1 i ERM/ETV5 i alhora, es troben sobreexpressats en la fase en la qual el EEC esdevé invasiu. Partint d'aquí, vam plantejar la caracterització del mecanisme d'acció del factor de transcripció ERM/ETV5 en el EEC durant els esdeveniments inicials d'invasió i disseminació. La sobreexpressió d'ERM/ETV5 a la línia cel·lular de càncer d'endometri Hec-1A indueix dispersió cel·lular que correlaciona amb un augment de l'activitat gelatinasa de la MMP2. Tant els experiments de ChiP com amb iRNA o l'ús d'un inhibidor específic de MMP2 mostren un nexe funcional entre la sobreexpressió d'ERM/ETV5 i l'activació de MMP2. En el model animal ortotòpic de EEC es demostra que l'augment de l'activitat de MMP2 associat a la sobreexpressió d'ERM/ETV5 confereix major capacitat invasiva als tumors endometrials i aquests mostren un patró més agressiu i infiltrant. Es va confirmar que ERM/ETV5 tenia un paper en els passos inicials de la disseminació endometrial ja que es van localitzar ERM/ETV5 i MMP-2 en el front d'invasió de mostres de EEC humanes amb infiltració miometrial. Per tant podem proposar que en el EEC, ERM/ETV5 actua a través de l'activitat gelatinolítica de MMP-2 per a donar major capacitat invasiva, associat al punt d'inici de la infiltració miometrial. Tot seguit vam plantejar determinar les alteracions moleculars associades a la sobreexpressió del factor de transcripció ERM/ETV5 durant la infiltració miometrial en el EEC, identificant nous marcadors moleculars o dianes terapèutiques que podrien estar sota el control de l'activitat transcripcional d'ERM/ETV5. L'anàlisi comparatiu mitjançant 2D-DIGE i espectrometria de masses dels patrons d'expressió proteica diferencial de la línia cel·lular que sobreexpressa de forma estable GFP-ERM/ETV5 anvers la línia cel·lular sense transfectar i la que presenta el vector GFP buit, determina un llistat de proteïnes diferencialment expressades que es troben implicades en la regulació d'actina i la senyalització per TGF-beta i progesterona. Vam caracteritzar la sobreexpressió específica de la proteïna Hep27 que presenta localització mitocondrial depenent d'ERM/ETV5. Estudis funcionals van demostrar associació amb l'estrès oxidatiu. L'anàlisi dels resultats obtinguts reforcen el paper d'ERM/ETV5 com a factor regulador de la migració i invasió tumoral, i assenyala la seva implicació en la resposta a l'estrès oxidatiu associat a l'inici de la invasió en el carcinoma endometrial. Fins ara, la immunohistoquímica ha estat l'eina utilitzada per a la identificació de proteïnes implicades en la invasió del carcinoma endometrial, sense tenir en compte la percepció global del front d'invasió. En aquest últim treball hem dut a terme una aproximació proteòmica per a caracteritzar components específics del front d'invasió o l'estroma reactiu mitjançant la comparació de l'àrea invasiva d'un carcinoma endometrial anvers l'àrea tumoral superficial no invasiva i el teixit normal provinents de la mateixa pacient. Així hem pogut identificar proteïnes diferencialment expressades en el front d'invasió i que es troben implicades en la morfologia cel·lular, acoblament i moviment, així com els mecanismes moleculars relacionats amb la senyalització i interacció cèl·lula-cèl·lula i la resposta moduladora a l'estrès oxidatiu. / We have recently described the Ets family transcription factor, ERM/ETV5, specifically up-regulated in EEC, and associated with myometrial infiltration. Ets family members have been correlated to tumor progression by up-regulating the expression of matrix-degrading proteases. We investigated the possibility that in EEC, ERM/ETV5 may induce the expression of genes involved in extra-cellular matrix remodeling. The overexpression of ERM/ETV5 induced scattering in the EEC cell line Hec-1A, correlating to increased MMP-2 gelatinase activity. Both ChIP and iRNA experiments and specific MMP-2 inhibitor demonstrated a functional link between ERM/ETV5 overexpression and MMP-2 activation. Orthotopically implanted overexpressing ERM/ETV5 tumors presented a more aggressive and infiltrative pattern of myometrial invasion. The specific localization of ERM/ETV5 and MMP-2 at the invasive front of myometrial infiltrating human EEC reinforced the hypothesis of a role for ERM/ETV5 in the early steps of endometrial dissemination.To understand the role of ETV5 during myometrial infiltration, we analysed by 2D-DIGE technology those proteins whose expression was altered in endometrial cell lines stably over-expressing ERM/ETV5. Pathway analysis pointed to actin regulation and TGF-beta and progesterone signalling as processes regulated by ERM/ETV5. We characterized the specific up-regulation of the nuclear dehydrogenase/reductase Hep27, its ERM/ETV5-dependent mitochondrial localization, and functional studies demonstrated a link with oxidative stress.Overall, the ETV5-related proteomic approach performed in the Hec-1A cell line reinforces a role of this transcription factor in the regulation of the migratory and invasive tumour behaviour, and points to a modulated response to oxidative stress associated with the promotion of invasion in endometrial cancer. To date, the identification of proteins involved in endometrial carcinoma invasion has been essentially conducted by immunohistochemical methods, without a global perception on the invasive front. In this work we attempted a proteomic approach to characterise specific components of the invasive front or reactive stroma by comparing the invasive area of an endometrial carcinoma with the non¬invasive superficial area and normal tissue from the same patients. This led us to identify proteins involved in cellular morphology, assembly and movement, differentially expressed at the invasive front, as well as pathways like cell-to-cell signalling and interaction and a modulated response to oxidative stress as events related to endometrial carcinoma invasion. In conclusion, we describe a novel proteomic approach that specifically deals with endometrial carcinoma invasion front, allowing the identification of new players of myometrial infiltration.

Malignant melanoma is the most lethal skin cancer with no effective therapeutic treatment in its metastatic stages. RAS and PI3K pathways have been shown to play a critical role in melanoma development and progression. In this study, we assessed the in vitro and in vivo inhibition potential of a BRAF inhibitor (Sorafenib, Bayer) and a PI3K/mTOR inhibitor (PI-103, PIramed-Genentech) in primary melanoma cell lines. We used primary cell lines isolated from spontaneous melanomas obtained in the UV induced HGF transgenic melanoma mouse model.Although PI-103 and sorafenib inhibited melanoma in vitro cell proliferation and viability, the inhibition of RAS pathway was more effective. The combination of the two drugs showed a synergistic effect inhibiting RAS and PI3K pathways and in vitro melanoma cell proliferation in a cell line dependent manner. However, the combined treatment of orthotopic xenographs in immunocompetent FVB mice did not cooperate blocking tumor growth. Surprisingly, the in vivo treatment with PI-103 enhanced tumor growth. Our results also revealed that PI-103 caused immunosuppression inducing thymus atrophy and upregulating the intratumoral transcriptional levels of inmunosuppressors. In addition, PI-103 induced the antiapoptotic BH3 family proteins Mcl-1, Bcl-2 and BclXL, which correlated with the lower apoptotic rate observed within the PI-103 treated tumors. These data indicates that due to melanoma heterogeneity, some precautions should be taken when using these inhibitors for treatment. Moreover, these results certainly make an argument for investigating unexpected effects of rational drug combinations on immunocompetent animal models before conducting clinical studies.

Els nucleòsids poden ser modificats estructuralment amb l'objectiu de generar compostos farmacològicament actius en el tractament de tumors sòlids i malalties limfoproliferatives. Aquests fàrmacs són internalitzats a través dels transportadors de nucleòsids, pel que la dotació de transportadors en les cèl.lules tumorals pot determinar la seva acció citotòxica. En base a aquestes dades l'objectiu d'aquesta tesi doctoral ha estat analitzar el paper dels transportadors de nucleòsids en la sensibilitat a fàrmacs antineoplàsics derivats de nucleòsids, especialment en el tractament de malalties limfoproliferatives. La primera part de l'estudi va suposar la caracterització cinètica dels transportadors presents en la línia cel.lular derivada de leucèmia pro-limfocítica JVM-2, així com dels transportadors responsables de la captació de l'anàleg de nucleòsid fludarabina. Posteriorment, l'estudi es va estendre a la determinació dels nivells d'ARNm, proteïna i activitat dels transportadors de nucleòsids presents en cèl.lules de pacients de leucèmia limfàtica crònica. Paral.lelament, es va mesurar la seva sensibilitat a la fludarabina amb l'objectiu de determinar si existia algun tipus de correlació entre el transport i la citotoxicitat. Les dades obtingudes van demostrar que els nivells de proteïna d'hENT2 podien ser predictius de la sensibilitat a la fludarabina en la leucèmia limfàtica crònica. Per complementar els resultats obtinguts, es va realitzar un estudi equivalent amb línies cel.lulars derivades de limfoma de mantell, amb l'objectiu de comprovar el paper diferencial dels transportadors de nucleòsids equilibratius en la sensibilitat a anàlegs de nucleòsids en funció del tipus de malaltia i del fàrmac administrat. En aquest cas, va ser el transportador hENT1 el que es correlacionava amb la sensibilitat a la gemcitabina. Així doncs, atenent al paper que juguen els transportadors equilibratius en la sensibilitat a fàrmacs derivats de nucleòsids es va avaluar el paper del transportador hENT1 en la resposta transcripcional associada a la teràpia amb fluoropirimidines mitjançant la utilització de microarrays d'ADN. Com a model es va utilitzar la línia cel.lular derivada de tumor de mama MCF7, pel que inicialment es va realitzar una caracterització dels transportadors de nucleòsids presents en la línia, així com de les isoformes responsables de la captació de l'anàleg de nucleòsid 5'-desoxi-5-fluorouridina. L'avaluació del paper d'hENT1 es va realitzar mitjançant la inhibició farmacològica de la seva activitat amb NBTI. Els canvis d'expressió gènica obtinguts mitjançant els experiments de microarrays d'ADN van demostrar que la inhibició d'hENT1 bloqueja total o parcialment els canvis transcripcionals associats a l'acció del 5'-DFUR. Per tant, els resultats obtinguts demostren que els transportadors de nucleòsids equilibratius juguen un paper important en la sensibilitat a fàrmacs antineoplàsics derivats de nucleòsids. / ROLE OF EQUILIBRATIVE NUCLEOSIDE TRANSPORTERS IN SENSITIVITY TO ANTINEOPLASIC DRUGSNucleoside-derivatives are currently used in the treatment of tumours and hematological malignancies. Although intracellular events involved in the pharmacological action of these compounds have been extensively studied, the role of plasma membrane transporters in nucleoside-derived drug bioavailability and action in cancer cells has not been comprehensively addressed. We examined the expression patterns and activity of nucleoside transporters in chronic lymphocytic leukaemia (CLL) patients and correlated them with in vitro fludarabine cytotoxicity. Among the known plasma membrane transporters, we observed a significant correlation between fludarabine uptake via ENT carriers and ex vivo sensitivity of CLL cells to fludarabine. Moreover, western blot results suggested a role of hENT2 in fludarabine responsiveness in CLL patients. A similar study was performed using mantle cell lymphoma (MCL) cells. In this case we found a significant correlation between protein and mRNA levels of hENT1, drug uptake and sensitivity to gemcitabine. Finally, we addressed the question of whether equilibrative nucleoside transporters contribute to the transcriptomic response associated with nucleoside-derived drug therapy. For this reason, we used a pharmacogenomic approach to determine which are the intracellular targets of 5'-DFUR action in breast cancer cell line MCF7 and how inhibition of hENT1 function contributes to the transcriptomic response. The study identified selected gene targets of 5'-DFUR action in a breast cancer cell model, and highlighted the relevant role hENT1-mediated drug uptake plays in drug action. Therefore, the results obtained further support that equilibrative nucleoside transporters are implicated in the therapeutic response to nucleoside analogues.

La cirugía radical como único tratamiento en carcinomas escamosos de cabeza y cuello (CECC) ha sido substituida por protocolos que permiten preservar la función del órgano como la quimioradioterapia (QRT) concomitante y la quimioterapia de inducción (QTI) seguida de radioterapia (RT) / quimioradioterapia o cirugía. El objetivo general de este proyecto de tesis es identificar marcadores moleculares en biopsias pre-tratamiento de CECC localmente avanzado que permitan predecir la evolución clínica del paciente. En este sentido, hemos llevado a cabo dos estudios independientes. En el primero hemos analizado los niveles de expresión de los genes Ku70, K80 y DNA-PKcs del sistema de reparación no homóloga por unión de extremos en biopsias pre-tratamiento de pacientes con CECC tratados con quimioterapia de inducción seguida de RT/QRT o cirugía. En el segundo hemos realizado un estudio de microarrays de expresión para determinar que genes y procesos biológicos están implicados en la respuesta tumoral en pacientes localmente avanzados tratados con QTI seguida de RT/QRT o cirugía, o con quimioradioterapia desde un inicio. Los resultados del primer estudio muestran que los tumores con una respuesta a QTI superior al 50% presentan niveles de expresión de Ku70, tanto de mRNA como de proteína, mayores que los tumores con una respuesta inferior al 50%. Además los pacientes con tumores con niveles de expresión de Ku70 elevados tienen una supervivencia libre de recidiva local (SLRL) y una supervivencia global (SG) mayor que los pacientes con tumores que expresan bajos niveles de dicho marcador. En el segundo estudio hemos identificado tres subtipos de tumores con diferencias en la evolución clínica de los pacientes. Los pacientes con tumores del cluster 1 tienen mayor SLRL y SG que el resto de los pacientes. Su perfil de expresión muestra que presentan una mayor capacidad de migración e invasividad, características de transición epitelio mesénquima, sobre-activación de la vía secretora y un menor grado de diferenciación celular. Los pacientes con tumores del cluster 3 tienen una evolución clínica favorable, presentan una SG y SLRL mayor que el resto de los pacientes. Entre sus características destacan un menor grado de diferenciación celular y una sobre-expresión de genes localizados en las regiones cromosómica 1q21 y 19q13. Los pacientes con tumores del cluster 2 tienen una evolución clínica intermedia ya que presentan una SLRL similar a los del cluster 3 y una SG similar a los del cluster 1. Hemos identificado una serie de marcadores de mal pronóstico (tirosina sulfotransferasa, trombospondina 1, liprina-beta1, fibronectina IIIB y alfa1-prolil-4-hidroxilasa) cuyo mayor expresión aumenta el riego de recidiva local a los 2 años y el riesgo de muerte a los 3 años de seguimiento. También hemos identificado una serie de marcadores de buen pronóstico (Oxidasa dual 1, LYPD3 y GTPasa Rab25) cuya mayor expresión disminuye el riesgo de recidiva local y muerte de los pacientes. / Induction chemotherapy (IC), followed by radiotherapy (RT) / chemoradiotherapy (CRT) or surgery, and concomitant CRT are commonly used to treat locally advanced head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC). The objective of this thesis-project is to identify molecular markers in pre-treatment HNSCC biopsies associated with clinical outcome in patients with advanced stage. We have conducted two independent studies. In the first study, we have evaluated the relationship between Ku80, Ku70 or DNA PKcs expression in pre-treatment tumor biopsies, and tumor response in patients treated with IC, followed by RT / CRT or surgery. In the second analysis, we have performed a microarray study to identify genes and biological processes associated with tumor response in patients treated with IC, followed by RT / CRT or surgery, or concomitant CRT.Results of the first study show that tumors with a response to IC higher than 50% have significantly higher mRNA and protein levels for Ku70 than tumors with a response to IC lower than 50%. Moreover, high tumor Ku70 expression was associated with significantly longer local recurrence-free survival (LRFS) and overall survival (OS).In the second microarray study we have identified three tumor subtypes with differences in patient outcome. Patients with tumor subtype1 have a shorter LRLS and OS. These tumors have a higher migration and invasiveness capacity, epithelial-mesenchymal transition, activation of the secretory pathway and lower differentiation grade. Patients with subtype 3 have a longer LRFS and OS. These tumors have a higher differentiation grade and overexpress genes located on chromosome 1q21 and 19q13.Moreover, we have identified a minimum set of genes (TPST1, THBS1, PPF1BP1, FNDC3B, P4HA1, DUOX1, LYPD3 y RAB25) associated with local recurrence and patient survival.

HIPOTESIS Y OBJETIVOS:Basándonos en estudios previos realizados en otros modelos tumorales, en los que se han demostrado la presencia de proteasas relacionadas con los mecanismos de invasión, progresión y metástasis, planteamos como hipótesis de trabajo que en la progresión del carcinoma prostático, desde las lesiones preinvasivas hasta la fase metastásica, intervienen distintas proteasas, encargadas de facilitar la invasión de la matriz extracelular. La expresión de algunas de estas proteasas puede además ser útil como factor pronóstico de la evolución del carcinoma de próstata.Para comprobar experimentalmente esta hipótesis se pretenden alcanzar los siguientes objetivos: 1) Evaluar la expresión de proteasas Catepsinas B y L, Hepsina y Maspina, así como la expresión de marcadores relevantes, como el receptor de andrógenos y el antígeno Ki-67, en los diferentes estadios de progresión del carcinoma prostático (tejido normal, PIN Alto grado, carcinoma invasivo)2) Correlacionar la expresión de dichas proteasas con parámetros clínico-patológicos ( PSA sérico previo al tratamiento, Grado de Gleason, estadio patológico, progresión...)3) Establecer las posibles utilidades diagnósticas y clínicas de la determinación de la expresión de dichas proteasas en el carcinoma de próstata, y su valor como marcadores pronósticos de la enfermedad.MATERIAL Y METODOS:El estudio se ha realizado a partir del análisis de 60 muestras compuestas por:a) 60 adenocarcinomas, obtenidos de 60 piezas de prostatectomia radical, correspondientes a tumores primarios, intervenidos en el Servicio de Urología del Hospital Clínico y Provincial de Barcelona.b) Tejido prostático normal, Hiperplasia Benigna de próstata y focos de Neoplasia Intraepitelial Prostática de Alto Grado (PIN) adyacentes a las áreas de tumor, así como dos muestras de metástasis ganglionares, fueron también estudiados con propósitos descriptivos.Se elaboraron dos matrices titulares y se procedio al estudio de expresión de las proteasas mediante técnicas de inmunohistoquímica.CONCLUSIONES:1) La catepsina B se expresa en lesiones preinvasivas y en el cáncer de próstata. La asociación entre su sobrexpresión y un elevado grado de Gleason, permiten suponer que esta protesasa es secretada profusamente por los tumores pobremente diferenciados, confiriendo mayor agresividad a los mismos.2) La sobrexpresión de CB en el compartimiento epitelial podría estar relacionada con la progresión de la enfermedad, sin embargo, su sobrexpresión en el estroma se comporta como un factor independiente de buen pronóstico, lo que puede denotar una función de defensa a la invasión tumoral en este compartimento.3) La catepsina L se expresa en el cáncer de próstata. Parece ser que su sobrexpresión podría conferir mayor agresividad a los tumores pobremente diferenciados. Su positividad en el endotelio vascular sugiere su participación en los fenómenos de angiogénesis. / INTRODUCTION:Prostate cancer progression is a stepwise process in which malignant cells have to invade the surrounding tissue, penetrate blood vessels and ultimately deposit on distant sites thus forming metastases. Invasion mechanisms include breaching the extracelullar matrix (ECM) and the basal membranes, so these cells often express proteolytic enzymes (proteases) whereby the ECM components are degraded1. Usually, the capability of the tumour cells to invade depends on the imbalance between these enzymes and their inhibitors, thus the aggressiveness of a particular tumour may be related to the preponderance of the protease over its inhibitor2.Cathepsins are lysosomal cystein proteases, thought to be involved in tumour invasion mechanisms due to their extracellular matrix-degrading properties. The aim of this study is to asses the expression of these proteases in prostate cancer and their possible association with clinical and pathological parameters of this condition.METHODS: Two Tissue microarrays comprised of 55 radical prostatectomy specimens were constructed. The expression of Cathepsin B, L, Maspin, Hepsin, Ki-67 and androgen receptor antigen was assessed in benign prostatic tissue, high grade PIN and prostate cancer using the Envision/Peroxidase immunohistochemistry technique. Chi Square, Fischer' test, T test, Kaplan-Meyer, Long Rank test and Cox proportional hazards model were used for the statistical analysis.CONCLUSIONS:Overall, Cathepsins is overespressed in prostate cancer and in the stromal compartment appears to be a tendency towards an association with a higher Gleason score and higher PSA which may suggest that these proteasas could be related to the aggressiveness of these poorly differentiated tumours.

INTRODUCCIÓEls tumors malignes són la primera causa de mort als països desenvolupats. El càncer colorectal (CCR) és la neoplàsia del tub digestiu més freqüent. Es diagnostiquen 20.000 nous casos de CCR a Espanya a l'any, i afecta a un de cada 10.000 espanyols. Mostra una incidència creixent i suposa el 15% dels nous diagnòstics de càncer. Els esforços investigadors es centren en la prevenció i cerca de noves possibilitats terapèutiques.Sembla evident el paper què els processos de proliferació, diferenciació i destrucció cel·lular juguen en el desenvolupament de les neoplàsies i en el disseny de futures estratègies diagnòstiques i terapèutiques. Pocs articles en la literatura han demostrat interès per l'estudi de la proliferació cel·lular i la mort cel·lular programada de les lesions preneoplàsiques del còlon.En la última dècada alguns treballs han investigat el paper que diversos oncogens, gens supressors de tumor, marcadors de proliferació cel·lular i inhibidors de la mateixa juguen en el desenvolupament de lesions canceroses a partir d'un pòlip adenomatós colorectal preexistent. De tots ells destaca per les seves possibles aplicacions diagnòstiques i terapèutiques els dedicats a l'estudi citomètric del contingut d'ADN en la seqüència adenoma-càncer colorectal, encara que la seva importància no ha estat demostrada de forma concloent. L'establiment definitiu del paper que juga la inhibició de l'apoptosi en l'esmentada seqüència podria condicionar el maneig clínic futur dels pacients amb pòlips adenomatosos colorectals.Aquest treball pretén valorar de forma simultània la influència del contingut d'ADN i la inhibició de la mort cel·lular programada en la seqüència adenoma càncer colorectal, i fer una correlació d'ambdues amb variables clinicodemogràfiques i antomopatològiques. HIPÒTESIS1. L'estudi del contingut d'ADN i proliferació cel·lular per citometria de flux pot ser un indicador important per al diagnòstic precoç de transformació maligna dels pòlips colorectals.2. El fracàs o inhibició de l'apoptosi pot conduir a la formació de pòlips colorectals i a la seva transformació maligna.MATERIAL I MÈTODESEstudio retrospectiu. Mostres: 134 vàlides obtingudes a partir de blocs parafinats procedents de pòlips colorectals extrets per polipectomia endoscòpica des de 1996 fins 2001 (22 adenomatosos, 94 tubulovellosos, 18 vellosos). En 33 pòlips es va detectar adenocarcinoma intramucós (16) o invasor (17). Controls: 128 biòpsies endoscòpiques de mucosa normal que es corresponen als quatre segments d'intestí gros (36 a còlon ascendent, 32 a còlon transvers, 31 a còlon descendent, 29 a recte-sigma). Processament i anàlisi per citometria de flux del contingut d'ADN i fases del cicle cel·lular, amb tècnica de Hedley modificada. Contatge mitjançant un citòmetre de flux EPICS PROFILE I. Estudi d'apoptosi: protocol de tinció sobre talls de 4 &#61549;m amb el mètode TUNEL modificat; contatge cel·lular segons criteris predeterminats, i càlcul de l'índex d'apoptosi (IA). Els resultats obtinguts es van correlacionar amb variables clinicodemogràfiques i anatomopatològiques.En les mostres en les quals coincidien una porció adenomatosa i una altra neoplàsica en el mateix pòlip es van diferenciar ambdues seccions.RESULTATS-Mucosa normal: al recte-sigma vam trobar el menor índex de proliferació cel·lular (p<0,001) i en aquesta mateixa localització en el terç superior glandular és on existeix major índex d'apoptosi (p=0,009).-Pòlips sense càncer focal: els pòlips amb diploidia són els que presenten major índex d'apoptosi (p=0,05). De forma global l'I.A. és major en la zona superior glandular i disminueix de forma progressiva fins a ser mínim en la zona inferior (p<0,001). La major distribució de l'apoptosi correspon a la zona superior dels pòlips amb displàsia moderada i a la zona inferior dels pòlips d'entre 1 i 2 cm. (p=0,02).-Pòlips amb càncer focal: en menors de 65 anys presenten major índex d'apoptosi (p=0,02). De forma global el IA és major en la zona inferior (p=0,014).No hi ha relació entre la distribució de l'apoptosi i les variables clinicodemogràfiques i anatomopatològiques tan en la porció adenomatosa com en la porció tumoral dels pòlips amb càncer focal.Al comparar la porció adenomatosa i la tumoral, el major índex de proliferació (major % fase S) correspon a la porció tumoral dels pòlips amb càncer focal invasor (p=0,039); no hi ha diferències significatives en la distribució i l'índex d'apoptosi.Els pòlips amb càncer focal intramucós amb histologia túbulo-vellosa són els que tenen major IA (p=0,035). En els pòlips amb càncer focal invasor els majors índexs d'apoptosi s'observen en els d'histologia túbulo-vellosa (p=0,03), grandària menor d'1cm (p=0,002) i menors de 65 anys (p=0,02).-Comparació mucosa normal versus pòlips sense i amb càncer focal: el major índex de proliferació s'obté en el grup de pòlips amb càncer focal i els subgrups intramucós i invasor tan en les seves porcions adenomatoses com tumorals (p<0,001). L'índex d'apoptosi total, per zones, i la distribució de l'apoptosi per zones són majors en el grup de pòlips sense càncer focal (p<0,001).-Comparació mucosa normal versus pòlips sense càncer focal: els pòlips sense càncer focal tenen major índex de proliferació, essent una variable predictiva independent (p<0,001). La distribució de l'apoptosi per zones i l'índex d'apoptosi total i per zones també és major en els pòlips sense càncer focal però en aquest cas només té valor predictiu independent en els terços mig (p<0,001) i inferior (p=0,001).-Comparació mucosa normal versus pòlips amb càncer focal: els pòlips amb càncer focal tenen major índex de proliferació, tan en la porció adenomatosa com tumoral, que el grup de mostres normals, amb valor predictiu independent (p=0,003). La distribució i l'índex d'apoptosi, ambdós per zones, són majors en la zona superior del grup de mostres normals (p=0,007) i en la zona inferior del grup de pòlips amb càncer focal (p=0,007). Les esmentades variables tenen valor predictiu independent.-Comparació pòlips adenomatosos versus pòlips amb càncer focal: els segons presenten major percentatge d'aneuploidia (p<0,001), sense diferències a l'índex de proliferació.El IA total és superior en el grup de pòlips sense càncer focal (p<0,001), de la mateixa manera que la distribució i IA en els terços superior i mig (p<0,001), amb valor predictiu independent tan si es considera la part adenomatosa com la part tumoral dels pòlips amb càncer focal. La menor apoptosi en el terç superior dels pòlips amb càncer focal pressuposa transformació maligna.Al comparar els pòlips sense càncer focal amb la part adenomatosa dels pòlips amb càncer focal, les variables grandària major de 2 cm (p=0,027), displàsia severa (p=0,036) i presència d'aneuploidia (p=0,043) tenen valor predictiu independent, i suggereixen la presència de transformació maligna.Al comparar els pòlips sense càncer focal amb la part tumoral dels pòlips amb càncer focal només les variables grandària major de 2 cm (p=0,017) i presència d'aneuploidia (p=0,005) tenen valor predictiu independent per indicar transformació maligna. CONCLUSIONSEl major percentatge de cèl.lules en fase S junt amb l'aneuploidia constitueixen un indicador precoç, amb valor predictiu independent, de transformació maligna dels pòlips colorectals.Els pòlips amb càncer focal, intramucós o invasor, presenten un índex d'apoptosi major en la zona inferior glandular, essent una variable amb valor predictiu independent de transformació maligna.Les variables grandària > 2 cm., displàsia severa, aneuploidia i major índex d'apoptosi en la zona inferior glandular, totes elles amb valor predictiu independent, permeten diferenciar entre els pòlips amb i sense càncer focal.La inhibició de l'apoptosi afavoreix el creixement dels pòlips colorectals així com la seva transformació maligna. / INTRODUCCIÓNLos tumores malignos son la primera causa de muerte en los países desarrollados. El cáncer colorrectal (CCR) es la neoplasia más frecuente del tubo digestivo. Se diagnostican 20.000 nuevos casos de CCR en España cada año, y afecta a uno de cada 10.000 españoles. Muestra una incidencia creciente, y supone el 15% de los nuevos diagnósticos de cáncer. Los esfuerzos investigadores se centran en la prevención y la búsqueda de nuevas posibilidades terapéuticas.Parece evidente el papel que los procesos de proliferación, diferenciación y destrucción celular juegan en el desarrollo de las neoplasias y en el diseño de futuras estrategias diagnósticas y terapéuticas. Pocos artículos en la literatura han demostrado su interés por el estudio de la proliferación celular y la muerte celular programada de las lesiones preneoplásicas del colon.Durante la última década algunos trabajos investigan el papel que diversos oncogenes, genes supresores de tumor, marcadores de proliferación celular e inhibidores de la misma juegan en el desarrollo de lesiones cancerosas a partir de un pólipo adenomatoso colo-rectal preexistente. De todos ellos destacan por sus posibles aplicaciones diagnósticas y terapéuticas los dedicados al estudio citométrico del contenido de ADN celular en la secuencia adenoma-cáncer colorrectal, aunque su importancia no se ha demostrado de forma concluyente. El establecimiento definitivo del papel que juega la inhibición de la apoptosis en dicha secuencia podría también condicionar el manejo clínico futuro de los pacientes afectos de pólipos adenomatosos colo-rectales.El presente trabajo pretende valorar de forma simultánea la influencia del contenido de ADN celular y la inhibición de la muerte celular programada en la secuencia adenoma-cáncer colorrectal, correlacionando ambaos con variables clínico-demográficas y anatomopatológicas.HIPÓTESIS1. El estudio del contenido de ADN y proliferación celular por citometría de flujo puede ser un indicador importante para el diagnóstico precoz de transformación maligna de los pólipos colorrectales.2. El fracaso o inhibición de la apoptosis puede conducir a la formación de pólipos colorrectales así como a su transformación maligna.MATERIAL Y MÉTODOSEstudio retrospectivo. Muestras: 134 válidas obtenidas a partir de bloques parafinados procedentes de pólipos colorrectales extraídos por polipectomía endoscópica desde 1996 hasta 2001 (22 adenomatosos, 94 túbulo-vellosos, 18 vellosos). En 33 pólipos se detectó adenocarcinoma intramucoso (16) o invasor (17). Controles: 128 biopsias endoscópicas de mucosa normal correspondientes a los cuatro segmentos de intestino grueso (36 a colon ascendente, 32 a colon transverso, 31 a colon descendente, 29 a recto-sigma). Procesado y análisis mediante citometría de flujo del contenido de ADN y fases del ciclo celular, con técnica de Hedley modificada. Contaje mediante un citómetro de flujo EPICS PROFILE I. Estudio de apoptosis: protocolo de tinción sobre cortes de 4 &#61549;m con método TUNEL modificado; contaje celular siguiendo criterios predeterminados, y cálculo del índice de apoptosis (IA). Los resultados obtenidos se correlacionaron con variables clínico-demográficas y anatomopatológicas.En las muestras en las que una porción adenomatosa y otra neoplásica coincidían en el mismo pólipo se diferenciaron ambas secciones.RESULTADOS-Mucosa normal: en recto-sigma encontramos el menor índice de proliferación celular (p<0,001) y en esa misma localización en el tercio superior glandular es donde existe mayor índice de apoptosis (p=0,009).-Pólipos sin cáncer focal: los pólipos con diploidia son los que presentan mayor índice de apoptosis (p=0,05). Globalmente el I.A es mayor en la zona superior glandular y disminuye de forma progresiva hasta ser mínimo en la zona inferior (p<0,001). La mayor distribución de la apoptosis corresponde a la zona superior de los pólipos con displasia moderada y a la zona inferior de los pólipos de entre 1 y 2 cm. (p=0,02).-Pólipos con cáncer focal: en menores de 65 años presentan mayor índice de apoptosis (p=0,02). Globalmente el IA es mayor en la zona inferior (p=0,014).No hay relación entre la distribución de la apoptosis y las variables clínico-demográficas y anatomopatológicas tanto en la porción adenomatosa como en la porción tumoral de los pólipos con cáncer focal.Al comparar entre sí la porción adenomatosa y la tumoral, el mayor índice de proliferación (mayor % fase S) corresponde a la porción tumoral de los pólipos con cáncer focal invasor (p=0,039); no hay diferencias significativas en la distribución y el índice de apoptosis.Los pólipos con cáncer focal intramucoso con histología túbulo-vellosa son los que tienen mayor IA (p=0,035). En los pólipos con cáncer focal invasor los mayores índices de apoptosis se observan en aquellos con histología túbulo-vellosa (p=0,03), tamaño menor de 1cm (p=0,002) y menores de 65 años (p=0,02).-Comparación mucosa normal versus pólipos sin y con cáncer focal: el mayor índice de proliferación se obtiene en el grupo de pólipos con cáncer focal y los subgrupos intramucoso e invasor tanto en sus porciones adenomatosas como tumorales (p<0,001). El índice de apoptosis total, por zonas, y la distribución de la apoptosis por zonas son mayores en el grupo de pólipos sin cáncer focal (p<0,001).-Comparación mucosa normal versus pólipos sin cáncer focal: los pólipos sin cáncer focal tienen mayor índice de proliferación, siendo ésta una variable predictiva independiente (p<0,001). La distribución de la apoptosis por zonas y el índice de apoptosis total y por zonas también es mayor en los pólipos sin cáncer focal pero en este caso sólo tienen valor predictivo independiente en los tercios medio (p<0,001) e inferior (p=0,001).-Comparación mucosa normal versus pólipos con cáncer focal: los pólipos con cáncer focal tienen mayor índice de proliferación, tanto en porción adenomatosa como tumoral, que el grupo de muestras normales, con valor predictivo independiente (p=0,003). La distribución y el índice de apoptosis, ambos por zonas, son mayores en la zona superior del grupo de muestras normales (p=0,007) y en la zona inferior del grupo de pólipos con cáncer focal (p=0,007). Dichas variables tienen valor predictivo independiente.-Comparación entre pólipos adenomatosos versus pólipos con cáncer focal: los segundos presentan mayor porcentaje de aneuploidia (p<0,001), sin diferencias en cuanto al índice de proliferación.El IA total es superior en el grupo de pólipos sin cáncer focal (p<0,001), al igual que la distribución e IA en los tercios superior y medio (p<0,001), con valor predictivo independiente tanto si se considera la parte adenomatosa como la parte tumoral de los pólipos con cáncer focal. La menor apoptosis en el tercio superior de los pólipos con cáncer focal presupone transformación maligna.Al comparar los pólipos sin cáncer focal con la parte adenomatosa de los pólipos con cáncer focal, las variables tamaño mayor de 2 cm (p=0,027), displasia severa (p=0,036) y presencia de aneuploidia (p=0,043) tienen valor predictivo independiente, sugiriendo la presencia de transformación maligna.Al comparar los pólipos sin cáncer focal con la parte tumoral de los pólipos con cáncer focal sólo las variables tamaño mayor de 2 cm (p=0,017) y presencia de aneuploidia (p=0,005) tienen valor predictivo independiente para indicar transformación maligna. CONCLUSIONESEl mayor porcentaje de células en fase S junto con la aneuploidia constituyen un indicador precoz, con valor predictivo independiente, de transformación maligna de los pólipos colorrectales.Los pólipos con cáncer focal, intramucoso o invasor, presentan un índice de apoptosis mayor en la zona inferior glandular, convirtiéndose en una variable con valor predictivo independiente de transformación maligna.Las variables tamaño > 2 cm., displasia severa, aneuploidia y mayor índice de apoptosis en la zona inferior glandular, todas ellas con valor predictivo independiente, permiten diferenciar entre los pólipos con y sin cáncer focal.La inhibición de la apoptosis favorece el crecimiento de los pólipos colorrectales así como su transformación maligna. / INTRODUCTIONMalignant tumors are the first cause of death in developed countries. Colon cancer is the most frecuent tumor of digestive tract. 20.000 colorectal cancer new cases are diagnosed in Spain every year and the problem involves one over 10.000 people. Colonic cancer shows and increasing incidence and causes about 15% of new diagnostics of tumor. Investigation efforts are focused on prevention and discovery of new treatment lines.Cell proliferation, differentiation and destruction mechanisms are fundamental for tumor growth and for development of new diagnostic and therapeutic methods.A few works have shown interest in the study of cellular proliferation and programmed cellular death mechanisms in preneoplasic colonic injures.During last decade some works tried to find out the paper that oncogenes, tumor growth supressor genes, cell growth proliferation markers and inhibitors issues have in the outcome of malignant injures on a previous adenomatous colorectal polyp. Of all of them, those measuring cellular DNA content by flow cytometry in the colorectal adenoma- colorectal cancer secuence are important because of their diagnostic and therapeuthic applications, but they-re not conclusive. To stablish definitly the paper of apoptosis inhibition in that process could conditioning the clinical practise on the patient with adenomatous colo-rectal polyps in the future.The present study pretends measuring both the influence of cellular-DNA content and the programmed cellular death on the adenoma-colorectal cancer secuence, and their correlation with clinical, demographical and anatomopathological items.HYPOTHESIS1. The study of DNA content and cell proliferation rate measured by flow citometry can be a good indicator of malignant tranformation in colonic polyps.2. Apoptosis inhibition can induce colonic polyps´ growth and their malignant tranformation. MATERIAL AND METHODSRetrospective study. Specimens: 134 colorectal polyps obtained by endoscopic polypectomy between 1996 and 2001 (22 adenomatous, 94 tubulovillous and 18 villous polyps). Controls: 128 specimens obtained by endoscopical resection of normal mucosa in colonic tract (36 in ascending colon, 32 in transverse colon, 31 in descending colon and 29 in sigmoid colon and rectum). Specimens were prepared using a modification of the method described by Hedley et al. and DNA content was messured by flow analysis. Flow citometry was carried out on EPICS PROFILE I cell sorter.Identification of apoptosis: 4 &#61549;m slides of tissue samples were treated with a modification of TUNEL method. We described the labeling pattern and apoptosis index.Obtained results were related to clinical-demographical and histopathological items.When adenomatous and malignant sections were found together in the same polyp sample, both of them were treated as independent sections.RESULTS-Normal mucosa: the lowest cell proliferation index is found in rectal and sigmoid location. There, in the upper crypt section we found the higher apoptosis index (p=0,009).-Non malignant polyps: diploid polyps present the highest apoptosis index (p=0,005). Apoptosis index is higher in upper crypt section and it decrease to be minimun in lower crypt section (p>0,001). Apoptotic cells are mainly located in the upper zone of mild displasic polyps and lower zone of polyps being between 1 and 2 cm sized (p=0,02).-Malignant polyps: apoptosis index is higher in people being under 65 year-old (p=0,02) and in lower crypt section (p=0,014). It doesn-t exist a relation between apoptosis distribution and clinical, demographical or anatomopathological items nor in the adenomatous or the tumoral sections of malignant polyps.Malignant section in malignant polyps shows the highest proliferation rate (p=0,039), if we compare adenomatous and malignant sections. It doesn´t exist a significative difference on apoptosis distribution or index. Intramucosal malignant tubulovillous polyps show the higher AI (p=0,035).-Comparison between normal mucosa and polyps: the highest proliferation index is obtained in adenomatous and neoplasic sections of malignant polyps (p<0,001). Apoptosis index and apoptotic cells rate are higher in non malignant polyps (p<0,001).-Comparison between normal mucosa and non malignant polyps: non malignant polyps have a higher proliferation rate with an independent predictive value (p<0,001). Apoptotic cells rate and apoptosis index is higher in non malignant polyps. Both of them have independent predictive value when messured in medium (p<0,001) and lower (p=0,001) crypt sections.-Comparison between normal mucosa and malignant polyps: malignant polyps have higher proliferation index than normal mucosa, in both adenomatous and tumoral sections with an independent predictive value (p=0,003).Apoptosis distribution and index are higher in the upper crypt section of normal mucosa (p=0,007) and in the lowest crypt section of malignant polyps (p=0,007); both of them with independent predictive value.-Comparison between adenomatous polyps and malignant polyps: malignant polyps present higher aneuploidy rate (p<0,001) with no differences in proliferation rate. AI is higher in non malignant polyps (p<0,001) as well as apoptotic cells rate and AI in upper ad medium crypt sections (p<0,001) with independent predictive value, both in adenomatous and neoplasic sections of malignant polyps. The lowest apoptosis rate is found in upper crypt section in malignant polyps and it correlates with potencial malignant transformation .If we compare non malignant polyps and adenomatous section of malignant polyps, the items size higher than 2 cm (p=0,027), severe displasia (p=0,036) and aneuploidy (p=0,043) have independent predictive value showing a malignant transformation.If we compare non malignant polyps and neoplasic section of malignant polyps, only size higher than 2cm (p=0,017) and aneuploidy (p=0,005) have independent predictive value to shown a malignant transformation. CONCLUSIONSHigher cell proliferation rate and aneuploidy are a predictive item of malignant transformation in colorectal polyps, with independent value.Lower crypt section in malignant polyps presents a higher apoptosis index, with independent predictive value, showing malignant transformation.Items size higher than 2 cm, severe displasia, aneuploidy and higher apoptosis index in lower crypt section, all of them with independent predictive value, are useful to discriminate between malignant and no malignant polyps.Apoptosis inhibition promoves growing in colorectal polyps, as well as their malignant transformation.

D’aquestes hem escollit la glicoproteïna Zinc-α2 (ZAG) i el sistema activina A-folistatina donada la seva relació fora de la gestació amb el metabolisme glucídic. A més a més, degut al seu potencial paper sobre la resistència a la insulina i el metabolisme lipídic, que podrien afectar el desenvolupament antropomètric fetal. Per això, també hem valorat la contribució de la ZAG i el sistema activina A-folistatina en el creixement fetal. Per últim donat el dimorfisme sexual en el creixement fetal, hem volgut estudiar si el sexe pot influir en els nivells de multímers d’adiponectina afectant el creixement fetal. Hem pogut objectivar l’associació dels nivells circulants de ZAG amb un perfil metabòlic favorable en dones gestants, però la ZAG no ha demostrat ser una adipoquina útil com a marcador de la DMG. Els baixos nivells de ZAG detectats en sang del cordó umbilical i la seva relació amb l’edat gestacional, fan pensar que pot tenir un paper en el desenvolupament fetal. També hem observat que la folistatina circulant s’associa de forma inversa amb la resistència a la insulina durant la gestació i es troba disminuïda en les pacients amb DMG, el que suggereix la seva implicació potencial en la patogènesi de la DMG. A més a més, els nivells de folistatina materna s’associen de forma positiva amb paràmetres de creixement fetal i d’adipositat neonatal el que podria implicar un potencial paper de folistatina en el desenvolupament fetal. Per últim, els nivells dels multímers d’adiponectina del cordó umbilical s’associen amb la velocitat de creixement fetal i amb l’adipositat neonatal de forma diferent depenent del sexe del recent nascut. / En los últimos años existe un especial interés en conocer la contribución de algunas adipoquinas, producidas por el tejido adiposo y la placenta, a la fisiopatología de la Diabetes Mellitus Gestacional (DMG), dado su papel modulador en la resistencia a la insulina. En estos trabajos hemos estudiado el papel de alguna de estas nuevas proteínas en la fisiopatología de la DMG. Entre ellas, hemos escogido la glicoproteina Zinc-α2 (ZAG) y el sistema activina A-follistatina dada su relación fuera de la gestación con el metabolismo glucídico. Además, por su potencial papel sobre la resistencia a la insulina y el metabolismo lipídico podrían afectar al desarrollo antropométrico fetal. Por ello, también hemos valorado la contribución de ZAG y del sistema Activina A-Follistatina al crecimiento fetal. Por último dado el dimorfismo sexual en el crecimiento fetal hemos querido estudiar si el sexo puede influir en los niveles de los multímeros de adiponectina afectando al crecimiento fetal. Hemos podido objetivar la asociación de los niveles circulantes de ZAG con un perfil metabólico favorable en mujeres gestantes, pero ZAG no se ha mostrado una adipoquina útil como marcador de la DMG. Los bajos niveles de ZAG detectados en sangre de cordón y su relación con la edad gestacional, hacen pensar que puede tener un papel en el desarrollo fetal. También hemos observado que la folistatina circulante se asocia de forma inversa con la resistencia a la insulina en la gestación y se halla disminuida en las pacientes con DMG, lo que sugiere su implicación potencial en la patogénesis de la DMG. Además, los niveles de folistatina materna se asocian de forma positiva con parámetros de crecimiento fetal y adiposidad neonatal, lo que podría implicar un potencial papel de folistatina en el desarrollo fetal. Por último, los niveles de los multímeros de adiponectina en cordón umbilical se asocian con la velocidad de crecimiento fetal y la adiposidad neonatal de forma diferente dependiendo del sexo del recién nacido. / In recent years, there is growing interest in the potential involvement of some adipokines produced by adipose tissue and placenta in the pathophysiology of gestational diabetes, through its modulatory role in insulin resistance. In the studies included in this work, we have studied the role of some new adipokines in the pathogenesis of GDM. We have chosen Zinc α2-Glycoprotein (ZAG) and the activin A-follistatin system due to their implication in glucose metabolism out of pregnancy. Furthermore, through their role in insulin resistance and lipid metabolism may also modulate fetal anthropometric development. Therefore, we have also evaluated the contribution of ZAG and the activin A-follistatin system in fetal growth. Finally, given that fetal growth shows gender dimorphism, we decided to study whether umbilical adiponectin multimers were associated with sex differences in fetal growth. We have observed that maternal serum ZAG concentrations during pregnancy are associated with a healthier metabolic profile, but ZAG has not appeared as useful biomarker in GDM. In cord blood, ZAG levels are lower than in maternal serum and correlated with gestational age suggesting a role in fetal development. We have also described that serum follistatin concentrations are lower in GDM compared with normal pregnant women and negatively associated with insulin resistance, suggesting a potential role in GDM pathogenesis. Also, the maternal follistatin levels are associated with fetal growth and neonatal adiposity suggests a potential role in fetal development. And finally, we have reported that the association observed between adiponectin multimeric forms with fetal growth velocity and neonatal adiposity differs according to newborn sex.