This thesis deals with the detection, segmentation and classification of lesions on sonography. The contribution of the thesis is the development of a new Computer-Aided Diagnosis (CAD) framework capable of detecting, segmenting, and classifying breast abnormalities on sonography automatically. Firstly, an adaption of a generic object detection method, Deformable Part Models (DPM), to detect lesions in sonography is proposed. The method uses a machine learning technique to learn a model based on Histogram of Oriented Gradients (HOG). This method is also used to detect cancer lesions directly, simplifying the traditional cancer detection pipeline. Secondly, different initialization proposals by means of reducing the human interaction in a lesion segmentation algorithm based on Markov Random Field (MRF)-Maximum A Posteriori (MAP) framework is presented. Furthermore, an analysis of the influence of lesion type in the segmentation results is performed. Finally, the inclusion of elastography information in this segmentation framework is proposed, by means of modifying the algorithm to incorporate a bivariant formulation. The proposed methods in the different stages of the CAD framework are assessed using different datasets, and comparing the results with the most relevant methods in the state-of-the-art / Aquesta tesi es centra en la detecció, segmentació i classificació de lesions en imatges d'ecografia. La contribució d'aquesta tesi és el desenvolupament d'una nova eina de Diagnòstic Assistit per Ordinador (DAO) capaç de detectar, segmentar i classificar automàticament lesions en imatges d'ecografia de mama. Inicialment, s'ha proposat l'adaptació del mètode genèric de detecció d'objectes Deformable Part Models (DPM) per detectar lesions en imatges d'ecografia. Aquest mètode utilitza tècniques d'aprenentatge automàtic per generar un model basat en l'Histograma de Gradients Orientats. Aquest mètode també és utilitzat per detectar lesions malignes directament, simplificant així l'estratègia tradicional. A continuació, s'han realitzat diferents propostes d'inicialització en un mètode de segmentació basat en Markov Random Field (MRF)-Maximum A Posteriori (MAP) per tal de reduir la interacció amb l'usuari. Per avaluar aquesta proposta, s'ha realitzat un estudi sobre la influència del tipus de lesió en els resultats aconseguits. Finalment, s'ha proposat la inclusió d'elastografia en aquesta estratègia de segmentació. Els mètodes proposats per a cada etapa de l'eina DAO han estat avaluats fent servir bases de dades diferents, comparant els resultats obtinguts amb els resultats dels mètodes més importants de l'estat de l'art

Medical imaging refers to several different technologies that are used to view the human body in order to diagnose, monitor, or treat medical conditions. Each type of technology gives different information about the area of the body being studied depending on the radiation used to illuminate de body. Nowadays there are still several lesions that cannot be detected with the current methods in a curable stage of the disease. Moreover they present some drawbacks that limit its use, such as health risk, high price, patient discomfort, etc. In the last decades, active microwave imaging systems are being considered for the internal inspection of light-opaque materials thanks to its capacity to penetrate and differentiate their constituents based on the contrast in dielectric properties with a sub-centimeter resolution. Moreover, they are safe, relatively low-cost and portable. Driven by the promising precedents of microwaves in other fields, an active electromagnetic research branch was focused to medical microwave imaging. The potential in breast cancer detection, or even in the more challenging brain stroke detection application, were recently identified. Both applications will be treated in this Thesis. Intensive research in tomographic methods is now devoted to develop quantitative iterative algorithms based on optimizing schemes. These algorithms face a number of problems when dealing with experimental data due to noise, multi-path or modeling inaccuracies. Primarily focused in robustness, the tomographic algorithm developed and assessed in this thesis proposes a non-iterative and non-quantitative implementation based on a modified Born method. Taking as a reference the efficient, real-time and robust 2D circular tomographic method developed in our department in the late 80s, this thesis proposes a novel implementation providing an update to the current state-of-the-art. The two main contributions of this work are the 3D formulation and the multi-frequency extension, leading to the so-called Magnitude Combined (MC) Tomographic algorithm. First of all, 2D algorithms were only applicable to the reconstruction of objects that can be assumed uniform in the third dimension, such as forearms. For the rest of the cases, a 3D algorithm was required. Secondly, multi-frequency information tends to stabilize the reconstruction removing the frequency selective artifacts while maintaining the resolution of the higher frequency of the band. This thesis covers the formulation of the MC tomographic algorithm and its assessment with medically relevant scenarios in the framework of breast cancer and brain stroke detection. In the numerical validation, realistic models from magnetic resonances performed to real patients have been used. These models are currently the most realistic ones available to the scientific community. Special attention is devoted to the experimental validation, which constitutes the main challenge of the microwave imaging systems. For this reason, breast phantoms using mixtures of chemicals to mimic the dielectric properties of real tissues have been manufactured and an acquisition system to measure these phantoms has been created. The results show that the proposed algorithm is able to provide robust images of medically realistic scenarios and detect a malignant breast lesion and a brain hemorrhage, both at an initial stage.

The aim of this doctoral thesis was to unravel mechanisms underlying primary resistance to trastuzumab regarding a putative new breast cancer subtype with mixed basal & ErbB2+ molecular features. Using the JIMT-1 breast cancer cell line as a model, we have been able to identify several candidate mechanisms responsible for trastuzumab resistance in basal/ErbB2+ breast cancer cells: 1) overexpression of survivin, an inhibitor of apoptosis protein family member; 2) Overactivation and sub-cellular re-localization of IGF-1R, a growth factor receptor involved in cellular proliferation and metastasis; and 3) Over-representation of breast cancer cells bearing the CD44+CD24-/low mesenchymal phenotype, which are enriched with putative breast cancer stem cells (CSCs) due to the activation of epithelia-to-mesenchymal transition (EMT) phenomena / El motiu d’aquesta tesi doctoral és l’estudi dels possibles mecanismes de resistència intrínseca al trastuzumab en el marc d’un nou subtipus intrínsec de càncer de mama basal/ErbB2+. Gràcies a l’ús de la línia cel·lular de càncer de mama JIMT-1 com a model d’estudi, hem identificat els possibles mecanismes pels quals el càncer de mama basal/ErbB2+ no respon al tractament amb trastuzumab: 1) augment dels nivells de survivina (una proteïna inhibidora de l’apoptosi), 2) augment dels nivells, activació, i canvi de localització del receptor IGF-1R (receptor implicat en la proliferació cel·lular i formació de metàstasi), i 3) augment de la subpoblació de cèl·lules mesenquimals amb fenotip de cèl·lules mare tumorals CD44+CD24-/low (CMTs) generades mitjançant la transició epiteli-mesènquima (TEM)

El carcinoma basocel•lular (CBC) és la neoplàsia més freqüent en l’ésser humà. La importància d’aquest tumor rau tant en la gran morbiditat que produeix com en l’enorme despesa sanitària que ocasiona als sistemes de salut de gairebé tot el món. Malgrat que el seu tractament és essencialment quirúrgic, existeixen casos on no està indicat aquest abordatge terapèutic i seria interessant el fet de conèixer les alteracions moleculars que comporten la formació de la neoplàsia per tal d’establir possibles dianes farmacològiques. Per aquestes raons hem cregut convenient aprofundir en l’estudi d’aquest tumor, centrant-nos en la fisiopatologia i intentant cultivant-lo “in vitro”. A través de l’estudi de la síndrome de Gorlin-Goltz s’ha establert la importància de la via Sonic hedgehog (Shh) en la fisopatologia del CBC. Nosaltres, mitjançant tècniques com l’immunoblot i la immunohistoquímica (mesurant els nivells de proteïna Gli1) hem determinat que aquesta via està activada en aproximadament la meitat dels casos de CBC esporàdic, confirmant les dades que es coneixen sobre aquest tema. Analitzant vies alternatives, hem trobat mostres amb alta activitat de b-catenina sense afectació de la via Shh i això ens fa pensar que la via Wnt pot tenir un paper fonamental en aquests casos. Hem detectat per immunoblot l’acumulació de b-catenina en la meitat dels casos estudiats, relacionat-se de forma directa amb l’activitat proliferativa de la neoplasia. / El carcinoma basocelular (CBC) es la neoplasia más frecuente en el ser humano. La importancia de este tumor radica tanto en la gran morbilidad que produce como en el enorme gasto sanitario que ocasiona a los sistemas de salud de casi todo el mundo. A pesar de que su tratamiento es esencialmente quirúrgico, existen casos donde no está indicado este abordaje terapéutico y sería interesante el hecho de conocer las alteraciones moleculares que comportan la formación la neoplasia para establecer posibles dianas farmacológicas. Por estas razones hemos creído conveniente profundizar en el estudio de este tumor, centrándonos en la fisiopatología e intentando su cultivo “in vitro”. A través del estudio del síndrome de Gorlin-Goltz se ha establecido la importancia de la via Sonic hedgehog (Shh) en la fisiopatología del CBC. Nosotros, mediante técnicas como el inmunoblot y la inmunohistoquímica (midiendo los niveles de proteína Gli1) hemos determinado que esta vía está activada en aproximadamente la mitad de los casos de CBC esporádico, confirmando los datos que se conocían sobre este tema. Analizando vías alternativas, hemos encontrado muestras con alta actividad de b-catenina sin afectación de la vía Shh y esto nos hace pensar que la vía Wnt puede tener un papel fundamental en estos casos. Hemos detectado por inmunoblot la acumulación de b-catenina en la mitad de los casos estudiados, relacionándose de forma directa con la actividad proliferativa de la neoplasia. / Basal cell carcinoma (BCC) is the most common malignancy in humans. The importance of this tumor lies both in the high morbidity produced as in the high costs caused to the health systems of whole world. Although its treatment is essentially surgical, there are cases where it is not indicated this therapeutic approach, then it would be interesting to know the molecular alterations that involve the formation of this neoplasm to establish potential drug targets.For these reasons we have decided to study this tumor, focusing on the physiopathology and their culture "in vitro". Through the study of Gorlin-Goltz syndrome, the importance of the Sonic hedgehog pathway (Shh) in the pathophysiology of BCC was well established. Using techniques such as immunoblotting and immunohistochemistry (measuring protein levels Gli1), we have determined that this pathway is activated in about half of cases of sporadic BCC, confirming the previously known data. Analyzing alternative pathways, we found samples with high activity of b-catenin pathway without affecting Shh. This fact makes us think that the Wnt pathway may have a important role in these cases. We detected by immunoblot the accumulation b-catenin in half of the cases studied, interacting directly with the proliferative activity of the neoplasm.

La biopsia selectiva del ganglio centinela ha evolucionado desde los primeros estudios en carcinoma de pene y melanoma hasta su inclusión en las guías clínicas el cáncer de mama y además ha impulsado el desarrollo de la cirugía radioguiada de las lesiones mamarias. Pese a estar bien establecida continua siendo una técnica en constante desarrollo y sus aplicaciones se van ampliando día a día. Esta tesis doctoral, a través de cuatro trabajos de investigación, pretende ampliar las indicaciones de la cirugía radioguiada en el cáncer de mama y tumores ginecológicos. Se valoró el patrón de drenaje extraaxilar en el cáncer de mama en función de la localización del tumor y la vía de administración del trazador. Se observó que el drenaje extraaxilar sólo está presente si se realiza inyección profunda (intratumoral o peritumoral) del trazador, que es más frecuente en cuadrantes internos de la mama. Los ganglios centinela de la cadena mamaria interna fueron positivos en el 15% de los casos, en un caso con ganglio centinela axilar negativo, por lo que cambió la estadificación en 5 pacientes. En un segundo trabajo de investigación se valoró la resección de lesiones mamarias no palpables mediante una gammacámara portátil intraoperatoria que evaluó los márgenes de resección. En la predicción de la indemnidad de los márgenes de resección mostró una congruencia del 60% con la anatomía patológica, siendo mayor para la lesiones de hasta 1 cm (64%). Para la valoración del ganglio centinela en el cáncer de vulva se realizó primero una fase de validación que mostró una tasa de falsos negativos del 0% y un valor predictivo negativo (VPN) del 100%. Durante la fase de aplicación se obtuvo un VPN del 100%. En la valoración de la técnica en el cáncer de cérvix uterino se realizó la biopsia selectiva de ganglio centinela y la linfadenectomía pelviana y eventualmente paraaórtica mediante laparoscopia. Se obtuvo un VPN del 100% y se observó drenaje en territorios no esperados como la cadena ilíaca primitiva.Las conclusiones de este trabajo son: a) es recomendable la resección de los ganglios centinela extraaxilares en el cáncer de mama, ya que mejora la estadificación; b) el uso de una gammacámara intraoperatoria en el cáncer de mama puede predecir la indemnidad de los márgenes, aunque se encuentra en fase de validación; c) la linfogammagrafía combinada con la detección del ganglio centinela mediante radiotrazadores y colorantes disminuye la morbilidad de la cirugía en el cáncer de cérvix y vulva, con un elevado VPN. / Sentinel node biopsy (SNB) has changed since penile carcinoma studies until its inclusion in breast cancer clinical guides or the development of radioguided surgery of breast lesions. SNB is an always-evolving technique, so its indications are increasing each day. This doctoral thesis, by means of four research works, means to increase radioguided surgery indications in breast cancer and gynaecological tumours. Extra-axillary drainage was studied according to the injection site and where the primary tumour was located. Extra-axillary drainage was only seen when deep tracer injection was performed (intratumoral or peritumoral), and it was more frequent when tumour was located in the inner quadrants of the breast.Internal mammary chain sentinel nodes were positive in 15% of the cases, in one case with a negative axillary sentinel node, so it changed the staging in 5 patients. The second research work analysed the resection of occult breast lesions by means of an intraoperative portable gammacamera, that evaluated resection margins. In the prediction of margins indemnity, a congruence of 60% between gammacamera results and pathological examination was obtained, being higher for lesions up to 1 cm (64%). The evaluation of sentinel node in vulvar cancer comprises a validation phase, with a false negative rate of 0% and a negative predictive value (NPV) of 100%. In the application phase, the NPV was of 100%. For the study in cervical cancer, sentinel node biopsy was performed before laparoscopic pelvic ± paraaortic lymphadenectomy and radical hysterectomy. The NPV was 100%. Unexpected drainage was seen in such territories as primitive iliac chain.The conclusions of this work are: a) it is recommended to remove extra-axillary sentinel nodes in breast cancer because it improves staging ; b) the use of an intraoperative gammacamera in breast cancer resection can predict margins indemnity, although it is in validation phase; c) lymphoscintigraphy combined with sentinel node detection by means of radiotracers and blue dyes allows a decrease in surgery morbidity in cervical and vulvar cancer, with an elevated negative predictive value.

OBJETIVO. El objetivo de este estudio fue explorar la capacidad de la ecografía tridimensional con Power Doppler (3DPD) para discriminar los tumores benignos y malignos dentro del grupo de masas anexiales sólido-quísticas con vascularización central y definir los puntos de corte de los índices 3DPD que se deben utilizar en un entorno clínico. MÉTODOS. Un total de 143 mujeres consecutivas (edad media, 50,4 años, rango, 17-82 años) con diagnóstico de lesión sólido-quística o sólida en modo B y con vascularización central en el 2DPD fueron evaluadas con ecografía 3D PD antes de la cirugía. El 3DPD se utilizó para evaluar la vascularización en las proyecciones papilares y áreas sólidas. Los índices vasculares (índice de vascularización [VI], índice de flujo [FI], y el índice vascularization-flujo [VFI]) se calculan automáticamente. El diagnóstico histológico definitivo se obtuvo en cada caso. RESULTADOS. Un total de 113 masas (74%) eran malignas y 39 (26%) fueron benignoa. La evaluación morfológica reveló 30 uniloculares sólidas (19,7%), 43 multilocular sólidas (28,3%), y 79 masas sólidas (52%). La media VI (9,365% frente al 3,3%, P <.001), FI (34,318 versus 28,794; p <.001), y VFI (3,233 frente a 1,15; P <0,01) fueron significativamente mayores en los tumores malignos. No se encontraron diferencias en el índice de resistencia, índice de pulsatilidad, y la velocidad pico sistólica. El análisis de la curva ROC reveló un área bajo la curva de 0,77 (intervalo de confianza del 95%, 0.69-0.85), 0,71 (0.60-0.81) y 0.75 (0.66-0.83) para la VI, FI y VFI, respectivamente. Para reducir la tasa de falsos positivos en casi una tercera parte, los valores de sensibilidad para el VI (corte, 1,556%), FI (25,212), y VFI (0,323) fueron 92%, 95% y 93%, respectivamente. CONCLUSIONES. Los índices vasculares con 3DPD son útiles para reducir la tasa de falsos positivos en lesiones sólidas y sólido-quísticas con vascularización central. PALABRAS CLAVE: masa anexial; cáncer de ovario; Power Doppler, 3DPD / OBJECTIVE. The purpose of this study was to explore the role of 3-dimensional (3D) power Doppler (PD) sonography to discriminate between benign and malignant cystic-solid and solid vascularized adnexal masses and to define cutoff values for 3D PD indices to be used in a clinical setting. METHODS. A total of 143 consecutive women (mean age, 50.4 years; range, 17-82 years) with diagnoses of cystic-solid or solid vascularized adnexal masses on B-mode and 2-dimensional PD sonography were evaluated by 3D PD sonography before surgery. Three-dimensional PD sonography was used to assess vascularization within papillary projections and solid areas with a virtual organ computer-aided analysis program.Three-dimensional PD vascular indices (vascularization index [VI], flow index [FI], and vascularizationflow index [VFI]) were automatically calculated. A definitive histologic diagnosis was obtained in each case. RESULTS. A total of 113 masses (74%) were malignant, and 39 (26%) were benign. Morphologic evaluation revealed 30 unilocular solid masses (19.7%), 43 multilocular solid masses (28.3%), and 79 mostly solid masses (52%). The mean VI (9.365% versus 3.3%; P < .001), FI (34.318 versus 28.794; P < .001), and VFI (3.233 versus 1.15; P < 0.01) were significantly higher in malignant tumors. No differences were found in the resistive index, pulsatility index, and peak systolic velocity. Receiver operating characteristic analysis revealed an area under the curve of 0.77 (95% confidence interval, 0.69-0.85), 0.71 (0.60-0.81), and 0.75 (0.66-0.83) for the VI, FI and VFI, respectively. For reducing the false-positive rate by almost one-third, sensitivity values for the VI (cutoff, 1.556%), FI (25.212), and VFI (0.323) were 92%, 95%, and 93%, respectively. CONCLUSIONS. Three-dimensional PD vascular indices could be helpful for reducing the false-positive rate in cystic-solid and solid vascularized adnexal masses. KEY WORDS: adnexal mass; ovarian cancer; 3-dimensional power Doppler sonography.

Cancer is the second disease leading cause of death in industrialized countries. Although early detection and more efficient drugs are responsible of the reduction of mortality, several cancers still present difficult treatments and low survival rates. Conventional drugs only exhibit moderate therapeutic index between cancer and normal tissues but recent advances are focused to improve lesstoxic treatments. Hence, new drugs must target specific signaling pathways involved in cell growth and proliferation. Concerning this aim, two mechanism involved in cancer disease, named apoptosis (or programmed cell death) and pentose phosphate pathway, have been selected in this work to search new inhibitors to target crucial proteins of both cell routes.Overexpression of antiapoptotic genes has been correlated with tumor growth and resistance tochemotherapy, thus many efforts have been done to block the activity of XIAP and Survivin, central proteins acting in apoptosis and studied in the present work. Moreover, the two most active proteins detected in both the oxidative and nonoxidative branches of the pentose phosphate pathway, Glucose-6-Phosphate Dehydrogenase (G6PDH) and Transketolase (TKT), have been also selected in this thesis.Molecular Modeling methods, covering topics in protein and peptide recognition, molecular dynamics, pharmacophore generation, database searching, docking and scoring in virtual screening and binding free energy prediction, have been applied with success to discover new active molecules inhibitors of XIAP, Survivin, G6PDH and TKT proteins. / TÍTULO: "Ruptura del reconocimiento proteína-proteína en rutas tumorales mediante modelizaciónmolecular".TEXTO:El cáncer es el segunda causa de muerte por enfermedad en los paises industrializados. A pesar de la existencia de métodos eficaces de detección precoz y tratamientos cada vez más efectivos responsables de la reducción de mortalidad, algunos tipos de tumores presentan todavía tratamientos difíciles y bajos índices de supervivencia. Los fármacos convencionales sólo exhiben un índice terapéutico moderado, entre células sanas y tumorales, por ello los avances recientes se centran en encontrar tratamientos menos tóxicos para esta enfermedad. Así pues, los fármacos del futuro deberán incidir en rutas biológicas específicas, involucrando el crecimiento celular y laproliferación descontrolada. Siguiendo este planteamiento, en este trabajo se han seleccionado dos mecanismos biológicos involucrados en el cáncer, llamados apoptosis (o muerte celular programada) y ruta de las pentosas fosfato, con el objetivo de encontrar nuevos inhibidores de las proteínas más sensibles de ambas rutas.La sobreexpresión de genes antiapoptóticos se ha correlacionado con el crecimiento tumoral y laresistencia a los tratamientos habituales. Así, se está trabajando en entender el funcionamiento de dos proteínas importantes de esta ruta, el XIAP y el Survivin, las cuales se han seleccionado en este trabajo, debido a que todavía no existen fármacos en el mercado que actúen sobre estas dos proteínas y debido a que su interés terapéutico se ha demostrado claramente.Por otro lado, en este trabajo también se han estudiado las dos proteínas más activas detectadas en la rama oxidativa y no oxidativa de la ruta de las pentosas fosfato, la Glucosa-6-Fosfato Deshidrogenasa y la Transketolasa.El objetivo principal ha consistido en aplicar métodos de la Modelización Molecular, que cubrentópicos recientes, como el reconocimiento de péptidos y proteínas, la búsqueda en bases de datos, el anclaje y evaluación del cribado virtual de compuestos y la predicción de energías libres de unión, para encontrar nuevos inhibidores de las proteínas XIAP, Survivin, Glucosa-6-Fosfato Deshidrogenasa y Transketolasa.

Nuclear Magnetic Resonance has experienced an increasing interest in the drug discovery field that has led to its wide use on nearly every stage of drug development. For this reason, during the present thesis we propose to use some of the tools offered by NMR to target various systems related with cancer.Initially we intended to get acquainted with the NMR most outstanding methodologies for the detection and characterization of binding events; and for this goal various proteins involved in cellular apoptosis (XIAP and Bcl-XL) were used to set up both ligand and receptor based NMR experiments. First we developed two novel labeling methodologies for the selective NMR observation of Trp, which coupled to the use of receptor-based experiments provided insight in the characterization of XIAP-ligand complexes, as well as significant advantages for HTS. Later, ligand based experiments such as STD, WaterLOGSY and iLOE were applied to the screening of weak binders for Bcl-XL, and the resulting information applied to the reconstruction of dual binders in a fragment-based drug discovery approach. In a second stage the same NMR tools were applied to the development of protein-protein interaction inhibitors, in particular for the pro-angiogenic protein VEGF; and to this end two different strategies were proposed. First, a small diverse library of D-oligopeptides was screened for weak ligands using the former fragment-based strategy. A second approach consisted on the identification of active compounds in complex plant extract mixtures using a combination of methionine selective labeling schemes and receptor-based experiments. In the latter case various flavonoids were identified as VEGF binders and the information harvested from NMR experiments allowed us to propose a binding mode for this type of molecules.Lastly, in a much more classic context, we decided to attempt the characterization of a medium sized oligopeptide by NMR. In particular we focused on Kahalalide F a marine origin depsipeptide with very promising anticancer activity; and although a SAR profile would be very useful from a medicinal chemistry perspective such molecules still pose a challenge to their structural characterization particularly stemming from its intrinsic flexibility. Several media were explored including H2O, DMSO, and membrane mimics (SDS micelles); in the latter the peptide seems to adopt a preferred structure allowing us to propose a model for the monomeric insertion of Kahalalide F within membrane-like environments. Such a model supports that part of the peptide's cytotoxic activity occurs at a membrane level and that this activity is linked to the formation of a turn within its N-terminus section. / La resonancia magnética nuclear se utiliza en la actualidad en prácticamente todas las etapas del proceso de descubrimiento y caracterización de fármacos. Durante la presente tesis nos propusimos explorar estas facetas de la RMN tomando como modelo diferentes sistemas relacionados con cáncer.En primer lugar utilizamos proteínas involucradas en apoptosis (XIAP y Bcl-XL) para implementar varias metodologías de RMN para la caracterización de fenómenos de interacción intermolecular. Se pusieron a punto esquemas de marcaje selectivo de triptófano y se evaluó su aplicabilidad en procesos de cribado de compuestos. Otros experimentos de cribado masivo (STD, WaterLOGSY) se emplearon para identificar nuevos ligandos de Bcl-XL; posteriormente, estrategias de reconstrucción de fragmentos nos permitieron diseñar ligandos duales.Las mismas herramientas se utilizaron para el diseño y desarrollo de moléculas antiangiogénicas, inhibidoras de la interacción entre VEGF y sus receptores. Para este fin, se plantearon dos estrategias diferentes en la identificación de inhibidores: en primer lugar se pretendía diseñar un ligando peptídico de afinidad elevada partiendo de dipéptidos de menor afinidad y utilizando estrategias de reconstrucción de fragmentos. Una segunda estrategia consistía en la identificación de compuestos activos presentes en extractos de plantas utilizando esquemas de marcaje selectivo para VEGF, en concreto marcaje selectivo de metioninas. En este último caso se consiguieron identificar varios compuestos flavonoides capaces de interaccionar con VEGF y su modo de unión se caracterizó utilizando información derivada de experimentos de RMN.Por último se llevo a cabo la caracterización estructural de Kahalalido F mediante RMN. Este depsipéptido de origen marino se encuentra en la actualidad en fases clínicas de desarrollo contra varios tipos de cáncer, y su caracterización estructural presenta enorme interés en la comprensión de su modo de acción. Se exploraron las preferencias conformacionales del péptido en varios medios incluyendo: H2O, DMSO, y medios miméticos de membrana (micelas SDS). El péptido adopta una estructura preferente en presencia de micelas de SDS, lo que nos permiten proponer un modelo estructural para la inserción monomérica de Kahalalido F en entornos de membrana lipídica; esto sugiere que parte de su actividad citotóxica ocurre a nivel de membrana para lo cual la formación de un giro &#61538; en la sección N-terminal del péptido también parece relevante.

El cáncer gástrico presenta, en el momento actual, un pronóstico desfavorable debido a su tendencia a la recidiva tras la cirugía realizada con intención curativa si no se diagnóstica en estadíos precoces. La instauración de terapias más agresivas en pacientes seleccionados podría mejorar la supervivencia. El pronóstico de estos pacientes se basa en el análisis de toda una serie de criterios clinicopatológicos clásicos, pero en el momento actual es de sumo interés el estudio de nuevos marcadores moleculares que permitan una mejor evaluación pronóstica y la identificación de aquellos pacientes con un elevado riesgo de desarrollar recidivas. La multiplicación celular es el factor más importante para que se produzca el crecimiento y progresión de los tumores. La proteína p53 es un elemento determinante en la regulación de la multiplicación celular, tanto por su capacidad para inducir la apoptosis como por el bloqueo que ejerce sobre el ciclo celular que impide la replicación. Por otro lado, dicha multiplicación y crecimiento tumoral, también dependen en alto grado de la angiogénesis, que está mediada por distintos factores angiogénicos, entre los que destaca el VEGF por ser uno de los más potentes y específicos. Nuestra hipótesis establece que el grado de angiogénesis valorado directamente mediante la densidad microvascular e indirectamente a través de la sobreexpressión de p53 y VEGF (ambos actuando como factores promotores de dicha angiogénesis), ejerce una influencia significativa sobre la agresividad clínica del cáncer gástrico. Hemos analizado la expresión de la p53, del VEGF y de la angiogénesis tumoral en 206 pacientes intervenidos quirúrgicamente por adenocarcinoma de estómago.

L’objectiu d’aquest treball és la identificació i caracterització de les principals alteracions en metàstasi hepàtica (MH) de càncer colorectal (CCR) tant a nivell d’expressió gènica com de metilació de l’ADN. Els resultats obtinguts han de servir per millorar la comprensió del procés metastàtic i aportar nous coneixements que puguin ser aplicats en el diagnòstic molecular i en la recerca de noves opcions terapèutiques. Els resultats de la tesi estan estructurats en 2 articles: “LIVER METASTASIS SIGNATURE AS PROGNOSTIC GENES OF DISTANT DISSEMINATION IN STAGE III COLORECTAL CANCER” L’objectiu és la identificació de marcadors moleculars d’expressió gènica importants en el procés metastàtic. 19 mostres aparellades de tumor primari de còlon i MH han estat hibridades en un microarray de cDNA (Affymetrix). S’obté un llistat de 1374 sondes diferencialment expressades de forma significativa entre tumors i metàstasis. S’ha creat una signatura metastàtica (algoritme de Golub) que consta de 7 gens específics de MH: MMP3, MMP1, CYP1B1, CLCA4, MS4A12, SPP1 i CEACAM7. La capacitat de pronòstic de MH d’aquesta signatura en tumors i en mucosa normal de còlon també ha estat avaluada, mitjançant RT‐PCR quantitativa. Segons un anàlisi de regressió logística univariant, els gens MS4A12, CYP1B1 i CLCA4 estan significativament sobreexpressats en tumors metastàtics (n=61) en comparació amb els no metastàtics (n=40). L’anàlisi estadístic Random Forest, a partir dels nivells d’expressió de MS4A12 i CYP1B1 (en tumors i en còlon normal), permet pronosticar disseminació al fetge amb una probabilitat d’encerts del 80%. Ambdós gens mostren major expressió gènica en el component estromal que en el tumoral quan s’analitzen mostres de microdissecció per captura làser. D’altra banda, s’ha desenvolupat un model murí per injecció intraesplènica de línies cel∙lulars humanes de CCR (KM12C i HCT116) capaces de metastatitzar específicament a fetge reproduint així el procés de disseminació en pacients. “ALU ELEMENTS’ METHYLATION ANALYSIS IN METASTATIC COLORECTAL CANCER” L’objectiu és la identificació d’alteracions en la metilació de l’ADN específiques de MH. S’han utilitzat dues metodologies: l’AUMA (Amplification of Unmethylated Alu) i l’array de metilació. En cap cas s’han trobat diferències de metilació entre tumors primaris i MH aparellades. Tot i això, s’ha validat mitjançant seqüenciació per bisulfit i corbes de melting dues bandes d’AUMA amb canvis de metilació recurrents (28 i 33% dels casos) entre mucosa normal de còlon i tumors, anomenades banda B (19q13.32) i banda C (16p13.3). Per limitar l’àrea afectada per aquests canvis de metilació, s’ha fet seqüenciació per bisulfit de les illes CpG veïnes a les bandes B i C concloent que es tracta d’alteracions poc extenses dins el genoma. L’anàlisi transcripcional dels gens propers amb l’array d’expressió (Affymetrix) ens indica que no hi ha regulació de l’expressió gènica per metilació dins una regió de fins a 2Mb lluny de les bandes d’AUMA. Tot i la manca de significació, la línia cel∙lular HCT116 desmetilada (tractament amb AZA i TSA) ha servit per analitzar una possible correlació entre la metilació de les bandes B/C i l’expressió de gens propers. La majoria de gens analitzats estaven sobreexpressats en la línia tractada. Les conclusions principals d’aquesta tesi són dues: ‐ S’ha obtingut una signatura metastàtica de 7 gens específics de MH de CCR. Dos d’aquests gens, MS4A12 i CYP1B1, tenen capacitat per pronosticar MH, fet de gran importància clínica. ‐ No s’han trobat canvis de metilació específics de MH indicant que els canvis epigenètics succeeixen en estadis inicials de la tumorigènesis. / Colorectal cancer (CRC) is the third most common cancer worldwide being liver metastasis (LM) a significant prognostic factor and the main cause of cancer related deaths. Despite of its clinical relevance, metastatic spread process is poorly understood. The aim of this study is to clarify the mechanisms of colorectal cancer LM discovering new molecular markers (transcriptional and epigenetic ones) with significant role in the metastatic process to improve its diagnostics, treatment and prevention. The results can be classified in 2 manuscripts: 1) LIVER METASTASIS SIGNATURE AS PROGNOSTIC GENES OF DISTANT DISSEMINATION IN STAGE III COLORECTAL CANCER 19 paired subjects (colorectal tumor/LM) have been used in cDNA microarrays (Affymetrix) in order to identify specific LM genes. A metastatic signature of 7 specific liver metastasis related genes has been built: MMP3, MMP1, CYP1B1, CLCA4, MS4A12, SPP1 i CEACAM7. Two of them, MS4A12 and CYP1B1, have an important liver metastasis prognosis capability which could be very useful in clinics for CRC prognosis. 2) ALU ELEMENTS’ METHYLATION ANALYSIS IN METASTATIC COLORECTAL CANCER Specific liver metastasis (LM) epigenetic alterations would be interesting for better dissemination process understanding. Two different methodologies have been used: AUMA (Amplification of Unmethylated Alu) and methylation microarray. However, specific LM methylation changes have not been identified being, therefore, early events in adenoma‐carcinoma sequence.