Nuestro grupo ha participado en el análisis de los mecanismos de acción de la Bisantraciclina WP631. Hemos comparado los efectos de la WP631 con los de la Daunorubicina en la línea Jurkat T (leucemia de linfocitos T), y con los de la Doxorubicina en las líneas MDA-MB-231 y MCF-7/VP (líneas de carcinoma mamario). Hemos demostrado que la WP631 es un agente antiproliferativo mucho más eficaz que la Daunorubicina y la Doxorubicina en las tres líneas tumorales analizadas, ya que inhibe el crecimiento celular a dosis muy reducidas (en el rango de nanomolar). En este trabajo se han analizado los mecanismos de muerte celular a través de los cuales las Antraciclinas ejercen su efecto antiproliferativo. Hemos demostrado que estas moléculas pueden inducir mecanismos distintos a la apoptosis dependiente de p53: senescencia y catástrofe mitótica, procesos que no dependen necesariamente de la funcionalidad del gen p53. Los efectos antiproliferativos de la Daunorubicina sobre las células leucémicas Jurkat T dependen de la dosis utilizada: apoptosis a dosis altas (IC75) y senescencia a dosis bajas / moderadas (IC50). La WP631 no induce apoptosis en la línea Jurkat T, sino catástrofe mitótica. El efecto antiproliferativo de la Doxorubicina y la WP631 en las líneas de carcinoma mamario MDA-MB-231 y MCF-7/VP, resistentes a la apoptosis, tiene lugar a través de la inducción de catástrofe mitótica. Nuestros resultados demuestran que la catástrofe mitótica se produce cuando las células tumorales resistentes a la apoptosis se tratan con genotóxicos, y puede ser un proceso tanto dependiente como independiente de la activación de la caspasa-2 y la caspasa-3. Mediante el uso de Macroarrays, hemos demostrado que existe una clara correlación entre las variaciones en los perfiles de transcripción génica y los efectos celulares observados en células Jurkat T tratadas con Daunorubicina o WP631. Confirmamos alguno de los cambios observados mediante RT-PCR semicuantitativa y Western blot. Comprobamos que la WP631 reduce la expresión de p53 en células Jurkat T, resultado que explica que la Bisantraciclina indujera catástrofe mitótica y no apoptosis en esta línea celular. Hemos confirmado que la WP631 compite con los factores de transcripción Sp1 y Sp3, e inhibe la transcripción dependiente de Sp1 in vivo (cultivos celulares), a las mismas concentraciones capaces de inducir la catástrofe mitótica en las células Jurkat T. Hemos demostrado que la dosis IC75 para la WP631 reduce la transcripción del gen mrp-1 en la línea celular MCF-7/VP, lo que se traduce en la reducción de la actividad de la proteína MRP-1. Este efecto podría estar mediado, también, por la interferencia de la WP631 con el factor de transcripción Sp1, que regula positivamente la expresión del gen. Dado que la sobreexpresión del gen mrp-1 está asociada a la resistencia múltiple a antitumorales, la WP631 es una molécula con interés clínico potencial en el tratamiento de tumores con fenotipo MDR (Multidrug Resistance). En definitiva, en este trabajo hemos demostrado las ventajas potenciales de la WP631 sobre la Daunorubicina y la Doxorubicina. Estas ventajas radican en sus propiedades de unión al DNA y en su capacidad de desplazar al factor de transcripción Sp1. El análisis de las frecuencias de las dianas potenciales de unión para la WP631 en diferentes promotores humanos, nos indica que es factible diseñar racionalmente moléculas de bajo peso molecular con constantes de unión al DNA del mismo orden de magnitud que la de los factores de transcripción, pudiéndose obtener fármacos cada vez más eficaces. Por otro lado, consideramos que el análisis en profundidad de los mecanismos moleculares que regulan los procesos de senescencia y catástrofe mitótica ha de constituir una herramienta muy útil para poder incrementar la eficacia en determinados tratamientos antitumorales, ya que el gen p53 se encuentra frecuentemente inactivado en tumores de origen no hematológico. ENGLISH / WP631 is a DNA-binding drug that bisintercalates into DNA. We have established that WP631 is more cytotoxic than daunorubicin and doxorubicin against Jurkat T lymphocytes and the breast carcinoma MDA-MB-231 and MCF-7/VP cell lines. Exposure of Jurkat T lymphocytes to high concentrations of daunorubicin (its IC75) resulted in immediate apoptosis, while low/moderate concentrations of daunorubicin (its IC50) caused cell senescence-like arrest and cell death. In contrast, WP631 induced mitotic catastrophe in Jurkat T cells, a different mode of death than apoptosis, which does not require functional p53. After treatment with doxorubicin or WP631, MDA-MB-231 and MCF-7/VP cells were committed to die through mitotic catastrophe. Our results indicate that cells dying through mitotic catastrophe can use both caspase-dependent and independent pathways. We used cDNA Macroarrays to asses gene expression profiles in Jurkat T cells treated with daunorubicin or WP631. Gene expression profiles and time-dependent response of Jurkat T lymphocytes to cell death were correlated clearly. Treating cells with WP631 inhibited the transcription of the p53 gene, resulting in a decrease of the protein levels. Our findings suggest that suppression of the p53 expression produced limited apoptosis and induced mitotic catastrophe in Jurkat T cells treated with WP631. Our results show that WP631, used at the same concentration that induces mitotic catastrophe in Jurkat T cells, specifically inhibits Sp1-dependent transcription in vivo (cell culture). Overexpression of the MRP-1 protein confers resistance to several chemotherapeutic agents. The mrp-1 promoter contains a Sp1 binding site, which is involved in the regulation of its gene transcription. We aimed to determine whether WP631 directly inhibits the expression of mrp-1 in MCF-7/VP cells. We have demonstrated that when MCF-7/VP cells were incubated with the IC75 for WP631, the expression of the mrp-1 gene decreased, resulting in the circumvention of the drug pump efflux, and cell death. We have also studied the frequencies with which potential WP631-binding sites are found in human gene promoters. Our results indicate that sequences of 6-8 pb in length occur only once in some promoters, and may be specific therapeutic targets.

La via Ras-Raf-MAPK regula funcions cel·lulars com la proliferació, la transformació o l'apoptosi. En càncer sol presentar mutacions activants en algun dels tres gens que codifiquen per a Ras (KRAS, HRAS y NRAS) i en un dels gens que codifiquen per a Raf (BRAF). A més, les mutacions de Ras i Raf són events alternatius ja que mai es donen a la vegada en un mateix tumor, suggerint que aquestes mutacions activen a la mateixa via. En càncer colorectal (CCR) la mutació puntual de BRAF V600E s'associa significativament als casos que presenten inestabilitat de microsatèl·lits (MSI) que solen presentar mutacions per inserció o deleció a seqüències repetitives.En aquesta tesi hem volgut determinar possibles associacions moleculars o clínico-patològiques de la mutació V600E que permetin explicar l'alta capacitat tumorogènica d'aquesta mutació en aquest tipus específic de tumor. Així, en càncer gàstric, que en MSI presenta un patró mutacional molt semblant al colorectal, no hem detectat mutacions de BRAF, ni en casos estables (MSS) ni en MSI, mentre que si que hem confirmat l'associació d'aquesta mutació a MSI en CCR. Sorprenentment, les mutacions de KRAS en càncer gàstric també s'associen significativament a MSI, mentre que en CCR es troben a ambdós fenotips (MSS i MSI). Per un altre costat, en CCR MSI esporàdic, que sol estar provocat per l'hipermetilació del gen MLH1, no hem trobat cap associació de BRAF-V600E amb mutacions als gens KRAS, APC ni p53. En canvi, si que hem detectat una clara associació de V600E amb l'hipermetilació de MLH1. A més, analitzant els mateixos tumors per la metilació dels gens p16, p14, RASSF1A, APC, MGMT i THBS1 hem associat BRAF-V600E i l'hipermetilació de MLH1 a un estat d'hipermetilació genòmica. D'una altra banda, no hem trobat cap associació de BRAF amb cap característica clínico-patològica a excepció de la localització ja que BRAF-V600E es detecta significativament en els casos proximals. També hem analitzat casos de CCR de pacients HNPCC, que tenen MSI per mutacions germinals enlloc de per metilació. No hem detectat cap mutació V600E de BRAF en aquests tumors, tant si tenen mutacions germinals a MLH1, MSH2 o MSH6 o no tenen mutació coneguda però compleixen criteris clínics com els d'Amsterdam o els de Bethesda més estrictes. Això confirma que V600E no es dóna específicament als casos MSI sinó en els casos amb hipermetilació de MLH1, i que aquests solen tenir més metilació genòmica que la resta de tumors.Apart, també hem analitzat KRAS en casos de CCR MSS, MSI esporàdics amb i sense hipermetilació de MLH1 i HNPCC. Així, la freqüència de mutacions a KRAS és més alta si no hi ha hipermetilació de MLH1, independentment del seu origen esporàdic o hereditari. No obstant, en els casos esporàdics aquestes mutacions afecten sobretot al codó 12 mentre que en els casos hereditaris afecten al codó 12 i al 13 equitativament. A més, els casos HNPCC amb mutació a MLH1 tenen una freqüència de mutacions a KRAS menor que si la mutació germinal té lloc a MSH2 o MSH6. Finalment, les diferències mutacionals de KRAS i BRAF en CCR esporàdic i hereditari suggereixen una modulació diferent de la via Ras-Raf-MAPK així com una possible activació d'altres vies moleculars alternatives depenent de l'estat en que es trobi el fons genètic i epigenètic del tumor. A més, l'absència total de la mutació V600E de BRAF a HNPCC la converteix en una eina fiable, ràpida i de baix cost per al diagnòstic molecular com a criteri d'exclusió de càncer familiar. / The Ras-Raf-MAPK pathway regulates functions such as cell proliferation, transformation and apoptosis. In cancer activating mutations are present in the three Ras genes (KRAS, HRAS and NRAS) and in one Raf gene (BRAF). Moreover, Ras and Raf mutations hardly ever are found together in the same tumor suggesting that they activate the same pathway. In colorectal cancer (CRC) the BRAF hotspot mutation V600E is associated to microsatellite instability (MSI), which is characterised by insertion/deletion mutations in repetitive sequences. Here we have determined possible molecular or clinico-pathological associations of V600E to understand its higher tumorogenic capabilities in this subset of tumors.We found that BRAF was not mutated in gastric cancer with MSI or without (MSS), although gastric and colorectal MSI tumors presented the same mutational patterns. Interestingly, gastric cancer only presented KRAS mutations in MSI tumors. Furthermore, in sporadic MSI CRC (which is usually caused by MLH1 hypermethylation) BRAF-V600E was not associated to KRAS, APC or p53 mutations but it was to MLH1 hypermethylation and to genomic hypermethylation after analysing p16, p14, RASSF1A, APC, MGMT and THBS1. In addition, V600E was associated significantly to tumors located in the proximal colon. Moreover, tumors from HNPCC (a hereditary form of MSI cancer caused by germline mutations in mismatch repair genes) never had V600E mutations.We have also analysed KRAS in CRC showing MSS, sporadic MSI with or without MLH1 hypermethylation and HNPCC. We found that KRAS mutation frequency is higher if MLH1 is not hypermethylated, independently of its sporadic or hereditary origin. And although in sporadic tumors these mutations are located in codon 12, in the hereditary ones they are located in codons 12 or 13 equally. Furthermore, HNPCC tumors carrying germline MLH1 mutations have less KRAS mutations than tumors with germline mutations in MSH2 or MSH6. Finally, we concluded that KRAS and BRAF differences in sporadic and hereditary CRC suggest a different Ras-Raf-MAPK modulation and possible alternative activation pathways depending on the genetic and epigenetic background of the tumor. Moreover, V600E is a reliable, fast and cheap tool for HNPCC diagnosis to exclude a hereditary origin.

Les mutacions germinals en el gen APC són les responsables de la majoria de casos de poliposi adenomatosa familiar. APC participa en diferents processos cel·lulars que inclouen la regulació del cicle cel·lular, l'apoptosi, l'adhesió cel·lular, la migració cel·lular, la transducció de senyals, l'acoblament de microtúbuls i la segregació dels cromosomes. Encara que tots aquests processos estan potencialment lligats amb el càncer, sembla que la funció supressora tumoral del gen resideix en la seva capacitat per regular de manera acurada els nivells intracel·lulars de la β-catenina, component central de la via de Wnt. Aquesta via és important en el desenvolupament embrionari per determinar llinatges cel·lulars específics i en l'homeòstasi cel·lular de determinats teixits com la mucosa intestinal. A part del seu paper clau en la via de Wnt, APC participa en la inestabilitat cromosòmica del càncer colorectal, encara que els mecanismes concrets a través dels quals actua són encara desconeguts en bona part. Els resultats descrits en els tres capítols d'aquesta tesi donen lloc al concepte global que és en les lesions benignes del còlon, els adenomes, ja siguin de pacients de FAP com de càncer colorectal esporàdic, on s'acumulen gran nombre d'alteracions genètiques que afecten a mecanismes molt diversos del funcionament cel·lular, essent especialment importants aquelles alteracions que afecten a la via de Wnt. Totes les alteracions detectades permeten la progressió tumoral ja que afecten a la proliferació, mitosi i moltes altres funcions importants per la cèl·lula. El coneixement de les alteracions moleculars que afecten als adenomes és important per proporcionar més evidències dels mecanismes moleculars i cel·lulars implicats en els primers estadis de la progressió tumoral i donar lloc a noves estratègies de diagnòstic precoç i teràpies preventives, tan importants en la lluita contra el càncer. / Classical Familial Adenomatous Polyposis (FAP) syndrome is caused by APC germline mutations. APC plays important roles in different cellular processes such as cell cycle regulation, apoptosis, cellular adhesion, cellular migration, signal transduction, microtubule binding and chromosome segregation. Although all these processes are potentially related to cancer, it seems that the main tumoral suppressor activity is mediated by its capacity to accurately regulate the β-catenin intracellular levels, which is a central member of the Wnt signalling pathway. This pathway is important in the embryonic development and in cellular homeostasis in certain tissues such as intestinal mucosa. In colorectal cancer, APC is not only believed to be playing a key role in Wnt signalling, but also it is important in chromosomal instability (CIN), although the mechanisms in which APC is participating are still largely unknown.The results presented in this thesis and divided in 3 chapters give us the general idea that in the benign lesions of the colon, called adenomas, in FAP and in sporadic colorectal cancer patients, is where a great number of genetic alterations are accumulated affecting different functional mechanisms in the cell. Those aberrations that alter the Wnt signalling pathway are especially important in the process of tumorigenesis. All the reported alterations enable the tumoral progression because they target proliferation, mitosis and other important functions of the cell. A better understanding of the molecular defects in adenomas is crucial to discover all the molecular and cellular mechanisms operating in the early stages of colorectal cancer and give clues for early diagnosis and prevention.

Les mutacions germinals d'elevada penetrància del gen APC que originen una proteïna truncada són les responsables de la majoria de casos de poliposi, mentre que les variants missense, que canvien un aminoàcid de la proteïna, es detecten en una minoria dels casos. S'han identificat diverses variants missense en el gen APC, però el seu potencial patogènic és encara motiu de controvèrsia, el què limita la utilitat de la seva detecció en el consell genètic. L'estudi de la presència de les variants en la població control i en les diferents poblacions de càncer colorectal (CCR) esporàdic i hereditari, juntament amb la realització d'anàlisis funcionals, podrien ajudar a conèixer l'impacte de les variants del gen APC en el desenvolupament del CCR. El nostre objectiu és determinar el significat funcional de les variants identificades en el gen APC en pacients afectes de poliposi adenomatosa familiar en relació al risc de desenvolupar CCR tant esporàdic com hereditari.L'anàlisi molecular de la regió codificant del gen APC realitzat en 138 famílies amb poliposi adenomatosa familiar clàssica (n= 98) i poliposi adenomatosa familiar atenuada (n= 40) ha permès la identificació de deu variants missense del gen APC: G101E, K957N, N1026S, L1129S, I1307K, E1317Q, D1822V, A2274V, G2502S i P2681L. En el nostre estudi s'han caracteritzat amb diferent profunditat set d'aquestes deu variants: G101E, N1026S, L1129S, D1822V, A2274V, G2502S i P2681L. La variant APC G101E, identificada en una família de poliposi clàssica, no s'associa a la malaltia ni sembla tenir cap funció modificadora del fenotip de poliposi. L'efecte biològic de les variants APC A2274V i APC P2681L, identificades en dues famílies de poliposi, és encara desconegut. La variant APC G2502S és un polimorfisme que no sembla tenir rellevància clínica. La variant APC L1129S, identificada en dues famílies de poliposi, no altera la interacció de la proteïna APC 4x15 amb la beta-catenina. La variant APC D1822V és un polimorfisme que incrementa el risc de desenvolupar CCR en pacients amb història prèvia d'adenomes i no s'associa amb la història familiar de CCR. La variant APC N1026S, que està present de forma exclusiva en una família de poliposi adenomatosa familiar atenuada, disminueix la unió d'APC amb beta-catenina i activa moderadament la transcripció mitjançada pel complex beta-catenina/Tcf-4. Aquests resultats indiquen que la variant APC N1026S és patogènica i és la mutació responsable del desenvolupament de la poliposi atenuada a la família on es va identificar.La caracterització funcional de les variants del gen APC és de gran importància per conèixer la seva contribució en el desenvolupament de la poliposi i facilitar l'assessorament genètic. / Truncating germline mutations in the APC gene are responsible for the majority of Familial Adenomatous Polyposis (FAP) cases, while in a minority of cases missense mutations, leading to single amino acid changes, are detected. Germline missense variants in the APC gene have been reported although their contribution to FAP is controversial, limiting their use in genetic counseling. The aim of this thesis is to determine the functional relevance of the variants identified in the APC gene in FAP patients in order to establish its pathogenicity.The molecular analysis of the APC gene was performed in 138 classical (n= 98) and attenuated (n= 40) FAP families and allowed the identification of ten missense variants. In this thesis, seven out of these ten APC variants have been characterised: G101E, N1026S, L1129S, D1822V, A2274V, G2502S and P2681L. The APC G101E variant, identified in a classical FAP family, is not associated with the disease. The biological effect of APC A2274V and APC P2681L variants, identified in two FAP families, remains unknown. The APC G2502S variant is a polymorphism without clinical relevance. The APC L1129S variant, identified in two FAP families, does not modify the interaction of the APC 4x15 protein with beta-catenin. The APC D1822V variant is a polymorphism associated with an increased risk of adenoma transformation and does not associate with family history of colorectal cancer. The APC N1026S variant, identified for the first time in an attenuated FAP family, diminishes beta-catenin binding to APC and moderately activates beta-catenin/Tcf-4-mediated transcription. These findings strongly support a pathogenic role of the APC N1026S variant in the AFAP phenotype.In summary, functional characterization of APC variants is crucial to elucidate their contribution to FAP and improve genetic counseling.

Tot i que la hipometilació global i regional del DNA va ser la primera alteració epigenètica detectada en tumors, les dificultats en el seu estudi, així com la manca de metodologies específiques que en permetin un anàlisi detallat, han fet que desconeguem en gran mesura els efectes que aquest fenomen té per a la cèl·lula tumoral. En aquesta tesi ens vàrem proposar realitzar estudis globals i específics que permetessin establir possibles associacions entre la hipometilació i la inestabilitat genètica en tumors primaris humans. En primer lloc es va dur a terme la caracterització dels patrons de metilació globals en una sèrie de tumors colorectals. Aquest anàlisi ens va permetre observar una correlació positiva entre el grau de desmetilació dels tumors primaris i el nombre d'alteracions cromosòmiques que aquests acumulen. Per a continuar aprofundint en l'estudi de la hipometilació en tumors, i donada la manca de metodologies específiques per a realitzar aquesta mena d'estudis, ens vàrem proposar desenvolupar una nova metodologia d'anàlisi de la metilació, centrada en l'anàlisi dels elements repetitius dispersos Alu, els quals contenen una fracció important de la metilació del DNA en humans. Així es com va sorgir la nova metodologia Amplification of UnMethylated Alu (AUMA), recollida en el segon treball. L'aplicació d'AUMA a una sèrie de tumors colorectals ens ha permès identificar elements repetitius Alu desmetilats al llarg de tot el genoma i també ens ha permès identificar elements Alu amb alteracions de la metilació en tumors. Un anàlisi bioinformàtic paral·lel ens ha permès complementar els resultats obtinguts experimentalment. En aquest treball hem desenvolupat també una nova metodologia de quantificació d'elements Alu desmetilats, la qual hem anomenat Quantification of UnMethylated Alu (QUMA) i de la qual no hi ha cap precedent en la literatura. De l'estudi d'una de les alteracions de la metilació detectades en patrons AUMA n'ha sorgit el tercer treball d'aquesta tesi. En aquest cas hem fixat la nostra atenció en un element repetitiu MIR desmetilat en teixit normal, el qual s'hipermetila en tumors amb una elevada freqüència. L'estudi de l'estat de metilació de les illes CpG dels gens adjacents a aquest element MIR ens ha conduït a la identificació de 8 noves illes CpG hipermetilades en tumors i línies cel·lulars de càncer colorectal. L'anàlisi de les modificacions d'histones associades al silenciament d'aquests gens ens ha permès identificar patrons de cromatina molt semblants als descoberts recentment en cèl·lules mare embrionàries, connectant així la biologia de les cèl·lules mare amb el desenvolupament del càncer. / Although hypomethylation was the first tumor-associated DNA methylation alteration in tumors to be discovered, its role in tumorigenesis has remained basically unexplored, mainly due to the lack of specific methodologies of study. In the first work, we performed a global analysis of DNA methylation and genetic alterations in a series of colorectal tumors. Results indicate that a positive correlation exists between the degree of DNA hypomethylation and the number of genetic alterations that a tumor cell accumulates. In order to gain insight into the role that DNA hypomethylation might play in tumor development, we proposed to develop new methodologies that would allow performing both global and specific analyses of DNA hypomethylation, constituting the second work in this thesis. The new methodology mainly targets Alu repeats, which have been previously found to be heavily methylated in most somatic tissues, and has been therefore named Amplification of unMethylated Alu (AUMA). AUMA application to a series of primary colorectal tumors allowed the genome-wide identification of multiple unmethylated Alu elements in normal tissues, as well as Alu elements with altered methylation patterns in tumors. We also aimed to develop a quantification method, which was named Quantification of UnMethylated Alu (QUMA). Both AUMA and QUMA experimental results were complemented using a bioinformatic approach, which indicated that there is a stronger pressure to methylate younger Alu elements, among which there are elements able to retrotranspose. In a third work, we focused on the specific analysis of an AUMA target. A MIR element unmethylated in normal colorectal mucosa was found to undergo extensive hypermethylation in a large proportion of tumors. DNA methylation analysis of promoter CpG methylation of genes around the MIR element allowed the identification of 8 clustered genes whose CpG islands become hypermethylated in colorectal tumors and cell lines. Histone modification profiling across the promoters of the DNA methylated genes identified chromatin profiles that closely resemble those found in embryonic stem cells, therefore linking stem cells biology with cancer development.

Resum:Les síndromes de càncer colorectal (CCR) hereditari representen entre un 3% i un 5% de tots els casos de CCR i inclouen tots aquells individus amb un elevat grau d'agregació familiar. La més freqüent és la síndrome de Lynch, causada per la presència de mutacions en els gens reparadors del DNA, majoritàriament MLH1 i MSH2. La poliposi adenomatosa familiar (FAP) és la segona en incidència, es caracteritza per l'aparició de pòlips precursors a la neoplàsia colorectal i la seva causa principal és la presència de mutacions en el gen supressor tumoral APC. En els últims anys s'ha descobert que els grans reordenaments d'aquests gens són responsables de la malaltia en una part de les famílies que pateixen aquestes síndromes. A més, estudis d'expressió d'aquests gens en línia germinal han demostrat l'existència de desequilibris al·lèlics tant en famílies portadores de mutacions com en famílies on no es detecten mutacions en el DNA. L'objectiu d'aquesta tesi és l'estudi de la dosi en la dels gens MLH1, MSH2 i APC, implicats en la síndrome de Lynch i la FAP. D'aquesta forma, hem analitzat la dosi tant a nivell de DNA (grans reordenaments) com a nivell d'RNA (expressió específica d'al·lel), sempre treballant amb línia germinal de pacients. Els resultats aquí recollits permeten millorar l'estratègia de diagnòstic molecular de les famílies amb síndrome de Lynch i FAP que són ateses al nostre centre, al mateix temps que la comprensió del procés tumorogènic. / Hereditary colorectal cancer (CRC) syndromes represent about 3% to 5% of all cases of CRC and include all those individuals with high familiar aggregation. The most frequent syndrome is Lynch syndrome, caused by the presence of mutations in the mismatch repair (MMR) genes, mostly MLH1 and MSH2. Familiar adenomatous polyposis (FAP) is the second in incidence, is characterized by precursor polyps and its mainly caused by mutations in the tumoral suppressor gene APC. Recently, it has been discovered that gross rearrangements of these genes are responsible of these two syndromes. Also, expression analyses of these genes in the germline have demonstrated the existence of allelic imbalances in both families carrying pathogenic mutations and families without detected mutations. Our aim was to study de dose of MLH1, MSH2 and APC genes in the germline of Lynch syndrome and polyposis families, respectively. To that end, we analyzed the dose at DNA level (gross rearrangements) and at RNA level (allele-specific expression) of these patients. The results summarized in this thesis permit improving the molecular diagnostic strategy in Lynch syndrome and FAP families, and also improve the knowledge of the tumorogenic process.

El linfoma de células del manto (LCM) es una entidad heterogénea tanto en sus aspectos biológicos como en su comportamiento clínico. La existencia de pacientes con mala respuesta al tratamiento sugiere que, de manera análoga a otros síndromes linfoproliferativos crónicos, existen alteraciones en los mecanismos de citotoxicidad inducida por fármacos. La heterogeneidad clínica del LCM queda reflejada, entre otros, por la variabilidad en la presentación de expresión hemoperiférica e infiltración del sistema nervioso central (SNC), dos complicaciones controvertidas y no suficientemente estudiadas. La hipótesis planteada en la presente tesis fue que la heterogeneidad observada en el LCM podría ser debida a la existencia de alteraciones en los mecanismos de apoptosis en un subgrupo de pacientes y se relacionaría con el pronóstico de éstos. Por otro lado, el análisis exhaustivo de los pacientes con expresión hemoperiférica o infiltración del SNC permitiría establecer cuáles son las características clínicas y biológicas que determinan la aparición de estas complicaciones en determinados enfermos. Para confirmar esta hipótesis nos planteamos los siguientes objetivos: 1) estudiar las bases moleculares de la regulación de la apoptosis en el LCM, tanto en líneas celulares como en células primarias de pacientes afectos; 2) analizar la incidencia y el impacto pronóstico de la expresión hemoperiférica en los enfermos con LCM mediante citología y citometría de flujo y 3) estudiar la incidencia y los factores determinantes de la infiltración del SNC en pacientes afectos de esta hemopatía.Para el estudio de las bases moleculares de la apoptosis en el LCM se analizaron cuatro líneas celulares portadoras de la t(11;14)(q13;q32), característica de esta entidad, y células primarias de 10 pacientes con LCM. El análisis de la viabilidad celular mediante marcaje con anexina V y yoduro de propidio, la detección de la pérdida de potencial de membrana y la producción de ROS, la determinación de caspasa 3 activa y de los cambios de conformación de BAX y BAK se llevaron a cabo mediante citometría de flujo (CMF). El análisis de diversas proteínas de la familia de BCL-2 se realizó mediante "Western blot". El estudio del ciclo celular se efectuó asimismo mediante CMF. El análisis de las alteraciones cromosómicas existentes en los LCM leucemizados se realizó mediante hibridación genómica comparada (CGH). Las diferencias entre subgrupos de pacientes se analizaron mediante la prueba exacta de Fisher y la t de Student. El análisis de supervivencia se llevó a cabo mediante el método de Kaplan y Meier y las diferencias observadas en términos de supervivencia se analizaron con el "log-rank test". El análisis de variables dependientes del tiempo se efectuó mediante el método de Mantel y Byar. Los resultados obtenidos en el primer trabajo demuestran que la citotoxicidad inducida por mitoxantrona en las células del LCM fue debida a la activación de la vía mitocondrial de apoptosis, y tiene lugar, probablemente, de manera dependiente de la integridad de los sensores de daño al ADN. Los resultados del segundo trabajo permiten concluir que la expresión hemoperiférica detectada mediante CMF se observa en la mayoría de los pacientes con LCM, incluso en aquellos con recuentos linfocitarios normales. Aunque la leucemización morfológica no se asoció en nuestro estudio con ninguna alteración citogenética específica detectable mediante CGH, los casos con linfocitosis >/5 x 10(9)/L presentaron anomalías citogenéticas diferenciales y un peor pronóstico. Los resultados del tercer trabajo demuestran que la infiltración del SNC se presenta fundamentalmente en pacientes con LCM blastoide, índice proliferativo elevado, niveles de LDH sérica elevados e IPI de riesgo intermedio/alto o alto, en general en el contexto de recidivas o progresiones sistémicas. / "BIOLOGICAL AND CLINICAL PROGNOSTIC FACTORS IN MANTLE CELL LYMPHOMA"TEXT:Mantle cell lymphoma (MCL) is characterized by the presence of translocation t(11;14)(q13;q32), an aggressive clinical course and poor response to chemotherapy. Few data concerning drug-induced apoptosis in MCL have been reported. The aim of the first study that constitutes the present thesis was to analyze the mechanisms of drug-induced apoptosis in MCL. Four cell lines carrying the t(11;14) and primary cells of 10 patients with MCL were incubated in vitro with several drugs currently used in the treatment of lymphoproliferative disorders and drug-induced cell death was characterized. Our results support that MCL cells have functional apoptotic machinery but require the integrity of functional DNA-damage response genes for its activation. From a clinical standpoint, extranodal involvement is a well-known feature in patients with MCL. Relatively few studies to date have focused on the peripheral blood (PB) involvement and the incidence of leukemic expression in MCL varies highly in different studies. The objective of our second study was to analyze the incidence, and the biological and clinical significance of leukemic involvement in patients with MCL. We investigated the incidence of PB involvement by both morphologic and flow cytometry (FC) analyses. Clinical features, genetic abnormalities detected by comparative genomic hybridization (CGH) and patient outcome were also determined. Leukemic expression at diagnosis detected by FC was a highly common feature, even in patients with a normal lymphocyte count. Although morphologically apparent leukemic expression was not associated with specific chromosomal alterations detected by CGH, a lymphocyte count >/ 5 x 10(9)/L was correlated with particular genetic abnormalities and a poor outcome.The incidence of central nervous system (CNS) involvement in patients with MCL is also highly variable in different studies, and predicting factors and outcome of CNS infiltration in these patients have not been thoroughly investigated. The aim of our study was to assess the incidence and factors for CNS involvement in MCL. In addition, we analyzed the clinical features, therapy and outcome of patients with MCL once CNS infiltration was detected. Our results suggest that, in most cases, CNS involvement occur late in the course of the disease, as part of a generalized relapse or progression. Blastoid histology, high proliferative index, high serum LDH and high-risk IPI are the variables associated with a higher risk to develop this complication.

ANTECEDENTES: El diagnóstico precoz del carcinoma hepatocelular es la única opción para poder aplicar tratamientos radicales potencialmente curativos. Por este motivo es necesario desarrollar diferentes técnicas que permitan realizar el diagnóstico precoz.HIPÓTESIS: La vascularización predominantemente arterial del CHC determina un patrón vascular específico caracterizado por intensa captación de contraste en fase arterial seguida de lavado de contraste en fase venosa. De acuerdo a unos criterios propuestos por la AASLD y basados en opinión de expertos, es posible realizar el diagnóstico concluyente de CHC sin necesidad de confirmación histológica si se objetiva este patrón vascular mediante técnicas de imagen dinámicas (RM, TC y eco con contraste (US-C)). En el caso de nódulos entre 1 y 2 cm se recomienda demostrar este patrón de forma coincidente en dos pruebas dinámicas. OBJETIVOS: Determinar la capacidad diagnóstica de la RM de última generación y US con contrastes de segunda generación para el diagnóstico de lesiones con un tamaño < 2 cm en pacientes con cirrosis hepática, con especial énfasis en el diagnóstico diferencial con el colangiocarcinoma intrahepático. Asimismo, como segundo objetivo se evaluará el valor de la captación de contraste para determinar la respuesta tumoral tras la aplicación de tratamientos locorregionales.METODOLOGÍA: Estudio observacional prospectivo en el que se incluirán pacientes cirróticos con función hepática conservada y sin historia previa de CHC en los que se detecta un nódulo único de 5-20 mm por ecografía de screening. Se realizará de forma basal una RM dinámica, US-C, determinación de marcadores tumorales y una biopsia, que se repetirá en caso de diagnóstico negativo. En caso de ausencia de malignidad, se realizará un seguimiento mediante US-C/3m y RM/6m; ante la detección de crecimiento o cambio de vascularización se realizará nueva biopsia. En la segunda parte del estudio se evaluará de forma retrospectiva la respuesta tumoral de una cohorte de pacientes afectos de CHC tratados mediante tratamientos locorregionales (ablación percutánea o quimioembolización) teniendo en cuenta criterios convencionales (medición de diámetros; criterios RECIST) o evaluando la extensión de necrosis reconocida como áreas sin captación de contraste.RESULTADOS: El diagnóstico de CHC puede establecerse en nódulos <20 mm sin necesidad de una biopsia positiva si US-C y RM muestran de forma coincidente hipercaptación en fase arterial seguido de lavado en fase venosa. La presencia de lavado de contraste permite el diagnóstico diferencial con el colangiocarcinoma intrahepático (ICC). Los criterios RECIST evalúan erróneamente la eficacia de los tratamientos locorregionales e infraestiman los beneficios de los tratamientos locorregionales.

Made available in DSpace on 2013-08-07T19:03:39Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000444737-Texto+Completo-0.pdf: 628352 bytes, checksum: c24f3ccf9b1b08feecb9e9c2a2e72134 (MD5) Previous issue date: 2005 / Cancer is one of the leading causes of morbidity and mortality in Brazil and worldwide, and surgery is very often its primary treatment. Manganese-dependent superoxide dismutase (SOD 2) is one of the main intracellular antioxidant enzymes, participating directly in the protection of the cell against oxidative reactions, which are thought to be pivotal in carcinogenesis. Diminished expression of SOD 2 is found in a number of different neoplasms, and in some of them is correlated to an adverse prognosis. The present study was designed to correlate SOD 2 genetic polymorphism with postoperative morbidity and mortality in patients submitted to oncologic surgery at a university hospital, and to characterize the postoperative complications observed.We performed a prospective, observational study of 88 adult patients submitted to oncologic surgeries. Mean + SD age was 61 + 7. 4 years; 59% of patients were male. Some co-morbidity was present in 76% of patients in the preoperative evaluation, of which the most common was arterial hypertension (47. 7%). Most surgeries were performed in the gastrointestinal tract (85. 2%), in most cases approaching the stomach or colon. Adenocarcinoma of the gastrointestinal tract was the most commonly found histological tumor type (80. 7%). In 30. 7 of patients, there was lymph node involvement. Postoperative complications occurred in 57% of patients, with sepsis (27. 3%) and bronchopneumonia (11. 4%) being the most frequent. Operative mortality (up to 30 postoperative days) was of 21. 6%; the main cause of death was sepsis (63. 2%). Allelic frequencies of SOD 2 genetic polymorphisms were: allele A 54% and allele B 45%. Genotypic frequencies observed were: genotype AA 34. 1%, genotype BB 25%, and genotype AB 40. 9%. There was no statistically significant association between preoperative variables and SOD 2 genetic polymorphism.The only postoperative variable associated to SOD 2 genetic polymorphism was urinary tract infection, which occurred exclusively in AA genotype patients (P = 0. 002). When we evaluated the association between the presence of the A allele (genotypes AA and AB) of SOD 2 and preoperative variables, there was a positive correlation with diabetes mellitus (P = 0. 04). There was no association between the presence of the A allele (genotypes AA and AB) and postoperative variables. When we evaluated the association of the presence of the B allele (genotypes AB and BB) of SOD 2 and preoperative variables, there was a positive correlation with cardiovascular disease (P = 0. 01). When we evaluated the association of the presence of the B allele (genotypes AB and BB) of SOD 2 and postoperative variables, there was a positive correlation with urinary tract infections (P = 0. 001) and stroke (P = 0. 04). There was a borderline association between the presence of the B allele (genotypes AB and BB) of SOD 2 enterocutaneous fistula (P = 0. 1).The present study implies that SOD 2 gene polymorphism does not seem to significantly influence postoperative morbidity and mortality in patients submitted to oncologic surgery. / O câncer é uma das principais causas de morbi-mortalidade nos dias de hoje no Brasil e no mundo, e seu tratamento inicial é cirúrgico em grande parte das situações. A superóxido dismutase dependente de manganês (SOD 2) é a principal enzima antioxidante intracelular, participando ativamente na defesa da célula contra reações oxidativas, potenciais causadoras do processo de carcinogênese. A expressão reduzida da SOD 2 é verificada em diversas neoplasias, sendo correlacionada com prognóstico adverso em alguns tumores. O presente estudo objetivou correlacionar o polimorfismo do gene da SOD 2 e a morbi-mortalidade pósoperatória nos pacientes submetidos a cirurgias oncológicas em um hospital universitário, bem como caracterizar as frequências das complicações pósoperatórias destes pacientes.Foi realizado um estudo prospectivo, observacional, com 88 pacientes adultos submetidos a cirurgias oncológicas. A média das idades dos pacientes foi de 61 + 7,4 anos; 59% dos pacientes eram do gênero masculino. Dos operados, 76% apresentavam alguma co-morbidade no pré-operatório, dentre as quais a hipertensão arterial sistêmica foi a mais comum (47,7%). A maioria das cirurgias foi realizada no trato gastrintestinal (85,2%), na maior parte dos casos abordando estômago e cólon. O adenocarcinoma do trato gastrintestinal foi o tipo histológico mais frequentemente encontrado (80,7%). Comprometimento linfonodal pela neoplasia foi verificado em 30,7% dos pacientes. Complicações pós-operatórias ocorreram em 57% dos pacientes, sendo que as mais frequentes foram sépsis (27,3%) e broncopneumonia (11,4%). A mortalidade operatória (até 30 dias) foi de 21,6%; a principal causa de óbito foi sépsis (63,2%). As frequências alélicas dos polimorfismos da SOD 2 foram: 54% para o alelo A e 45% para o alelo B. As frequências genotípicas observadas foram: 34,1% com genótipo AA, 25% com genótipo BB, e 40,9% com genótipo AB. Não foi observada correlação estatística entre variáveis pré-operatórias e o polimorfismo do gene da SOD 2.Apenas uma das variáveis pós-operatórias avaliadas (infecção do trato urinário, a qual ocorreu somente entre os pacientes com genótipo AA) demonstrou associação com o polimorfismo do gene da SOD 2 (P = 0,002). Ao analisarmos a associação entre a presença do alelo A (genótipos AA e AB) da SOD 2 e os aspectos pré-operatórios observamos uma associação entre a mesma e a presença de diabete mélito (P = 0,04). Não houve associação entre a presença do alelo A (genótipos AA e AB) e variáveis pós-operatórias. Ao avaliarmos a associação entre a presença do alelo B (genótipos AB e BB) da SOD 2 e variáveis pré-operatórias, observamos uma correlação positiva entre a mesma e doenças cardiovasculares (P = 0,01). Ao avaliarmos a associação entre a presença do alelo B (genótipos AB e BB) da SOD 2 e variáveis pós-operatórias, verificamos a associação entre a mesma e a ocorrência de infecção do trato urinário (P = 0,001) e acidente vascular cerebral (P = 0,04). Apresentou significância limítrofe a associação entre a presença do alelo B (genótipos AB e BB) da SOD 2 e a ocorrência de fístula êntero-cutânea (P = 0,1).O presente estudo permite concluir que o polimorfismo do gene da SOD 2 não parece influenciar de maneira significativa a ocorrência de morbi-mortalidade pósoperatória em pacientes submetidos a cirurgias oncológicas.

Made available in DSpace on 2013-08-07T19:04:11Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000424761-Texto+Completo-0.pdf: 969784 bytes, checksum: 096741a9b7c46edcefe360a98fe1cf59 (MD5) Previous issue date: 2010 / Justificative: The current therapeutic decision in breast cancer is the evaluation product of several variables. Such fact corroborates the heterogeneity of the disease as well as the greater tendency of the treatment individualization. The neoadjuvant chemotherapy is a very efficient treatment modality for a great number of situations, including the locally advanced inflammatory tumors. The neoadjuvant chemotherapy, besides yielding the complete tumor resection in many cases in which very extensive procedures would be necessary, also allows the observation of the tumor sensitivity to the chemotherapeutic treatment. Thus, this therapeutic modality can be understood as an important response model and be used as a disease free interval marker and of global survival. The discovery of new biological markers which allow the response prediction to certain drugs, in the same way the expression of hormonal receptors or Her-2 nowadays, is detrimental to the treatment individualization of breast cancer. The neoadjuvant context is the most adequate to test these biomarkers, given the rapid response of this therapeutic modality. Among the innumerous candidates to response predictors, are proteins responsible for cell survival, for apoptosis and transcription factors that activate the cell cycle. In the present work we evaluate the expression of Survinine, Cyclin D1, Bcl-2, PDEF and ETS1 in patients with breast cancer submitted to neoadjuvancy with a standard chemotherapic scheme. Methods: Patients with Clinic Stages II and III received pre-operatory chemotherapy with AC-T protocol (doxorrubicina 60mg/m2D1 and Cyclophosphamide 600 mg/m2 D1 for 4 cycles of 21 days, followed by Docetaxel 75 mg/m2 D1 again, for 4 cycles of 21 days). The breast surgery was performed approximately 30 days later. Survinine, Cyclin D1, Bcl-2, PDEF and ETS1 expression levels were evaluated by the immunohistochemistry technique through direct visualization in tumor samples obtained in the diagnosis biopsy. The Fisher Exact Test, Cox Regration and Mann Witney Test were used to associate the levels of each molecular marker with full pathologic response. Results: 45 patients were studied. Two patients (4. 44%) presented irresectable disease. The average age was 47. 24 (25 – 70). The staging, according to TNM, presented the following distribution: : IIA n=13 (29%), IIB n=10 (22%), IIIA n=13 (29%), IIIB n=4 (9%) and IIIC n=4 (9%). Three patients (7. 14%) received a full pathologic response. The Survinine Expression average was 3. 99 (0 to 11). The average of the remaining markers was 7. 67 (0 to 15) for ETS1, 8. 72 (2. 33 to 15) to Bcl2, 2. 24 (0 to 15) for PDEF and 2. 35 (0 to 9) for Cyclin D1. The average level of Survinine was significantly higher (P = 0,01) in the patients with complete response (9. 33) than in those without complete response (3. 42). The remaining markers were of no significance. Conclusions: Survinine is a potential response marker of neoadjuvant therapeutics in breast cancer and consequently of global survival and disease free interval. / Introdução: A decisão terapêutica em câncer de mama atualmente é o produto da avaliação de diversas variáveis, o que corrobora a heterogeneidade da doença e a tendência cada vez maior da individualização do tratamento. A quimioterapia neoadjuvante é uma modalidade de tratamento bastante eficiente em diferentes situações, incluindo os tumores inflamatórios e localmente avançados. A quimioterapia neoadjuvante, além de permitir a ressecção completa do tumor em muitas situações em que seriam necessários procedimentos muito extensos, também possibilita observar a sensibilidade tumoral ao tratamento quimioterápico. Desta forma, esta modalidade terapêutica também pode ser compreendida como um importante modelo de resposta podendo ser utilizada como marcador de intervalo livre de doença e sobrevida global. A descoberta de novos marcadores biológicos que permitam a predição de resposta a certas drogas, da mesma forma que a expressão de receptores hormonais ou de Her-2 o fazem atualmente, é detrimental para a melhora da individualização do tratamento do câncer de mama. O contexto da neoadjuvância é o mais adequado para se testar estes biomarcadores, dada a rapidez de resposta que esta modalidade terapêutica confere. Entre os inúmeros candidatos a preditores de resposta, encontram-se proteínas responsáveis pela sobrevivência celular, pela apoptose e fatores de transcrição que ativam o ciclo celular. No presente trabalho avaliamos a expressão de Survivina, Ciclina D1, Bcl-2, PDEF e ETS1 em pacientes com câncer de mama submetidas a neoadjuvância com um esquema quimioterápico padrão.Métodos: Pacientes com câncer de mama Estágios Clínicos II e III receberam quimioterapia pré-operatória com protocolo AC-T (doxorrubicina 60mg/m2 D1 e Ciclofosfamida 600 mg/m2 D1 por 4 ciclos de 21 dias, seguidos de Docetaxel 75 mg/m2 D1 por 4 ciclos de 21 dias). A cirurgia da mama foi realizada, aproximadamente, 30 dias após. Níveis de expressão de Survivina, Ciclina D1, Bcl-2, PDEF e ETS1 foram avaliados pela técnica de imunoistoquímica por visualização direta em amostras de tumor obtidas na biópsia do diagnóstico. Foram associados 8 os níveis de cada marcador molecular com a resposta patológica completa, para tal utilizamos: Teste Exato de Fisher, Regressão de Cox e Teste de Mann Witney. Resultados: Foram estudadas 45 pacientes. Duas pacientes (4,44%) apresentaram doença irressecável. A idade média foi de 47,24 (25 à 70). O estagiamento conforme TNM apresentou a seguinte distribuição: IIA n=13 (29%), IIB n=10 (22%), IIIA n=13 (29%), IIIB n=4 (9%) e IIIC n=4 (9%). Três pacientes (7,14%) obtiveram resposta patológica completa. A média da expressão de Survivina foi de 3,99 (0 à 11). A média da expressão dos demais marcadores foi de 7,67 (0 à 15) para ETS1, de 8,72 (2,33 à 15) para Bcl2, de 2,24 (0 à 15) para PDEF e de 2,35 (0 à 9) para Ciclina D1. O nível médio de Survivina foi significativamente maior (P=0,01) naquelas pacientes com resposta completa (9,33) do que naquelas sem resposta completa (3,42). Os demais marcadores não tiveram significância. Conclusões: A Survivina é potencial marcador de resposta à terapêutica neoadjuvante em câncer de mama e consequentemente de sobrevida global e intervalo livre de doença.