Introdução: Apesar de controverso, questiona-se um papel deletério da endometriose nos resultados de procedimentos de reprodução assistida, o que pode estar relacionado ao comprometimento da qualidade oocitária. Para que o oócito maduro esteja preparado para a fertilização, é necessário que o fuso meiótico mantenha a sua integridade e funcionabilidade. Objetivos: Comparar a presença e localização do fuso meiótico e o estágio de maturação nuclear de oócitos com o primeiro corpúsculo polar (CP) visível de pacientes inférteis sem e com endometriose. Comparar os resultados de Injeção Intracitoplasmática de espermatozóides (ICSI) entre os oócitos em telófase I e metáfase II, e entre aqueles com e sem fuso celular visível, nos grupos analisados. Metodologia: Estudo prospectivo e controlado com pacientes inférteis, submetidas à estimulação ovariana para realização de ICSI, selecionadas consecutivamente e divididas em dois grupos: Controle (fator tubário e/ou masculino) e Endometriose (subdividido em endometriose mínima e leve I/II versus moderada e severa III/IV). Os oócitos com extrusão do primeiro CP foram avaliados pela microscopia de polarização imediatamente antes da realização da ICSI e caracterizados quanto à presença/localização do fuso celular em relação ao primeiro CP e ao estágio de maturação nuclear (telófase I ou metáfase II). Foram analisados as taxas de fertilização, clivagem, número de embriões de boa qualidade no segundo (D2) e terceiro (D3) dia de desenvolvimento oriundos dos oócitos em telófase I versus metáfase II, e metáfase II com fuso visível versus sem fuso visível, nos grupos controle, endometriose, endometriose I/II e endometriose III/IV. Resultados: Foram analisados 441 oócitos, sendo 254 do grupo controle e 187 do grupo endometriose (115 do grupo endometriose I/II e 72 do grupo endometriose III/IV). Não observamos diferença significativa entre a percentagem de oócitos em metáfase II com fuso celular visível e não visível (88,6%, 91,3%, 88,2%, respectivamente, nos grupos controle, endometriose I/II e endometriose III/IV) e entre a percentagem de oócitos com fuso celular nas diferentes localizações nos grupos avaliados. Entre os oócitos aparentemente maduros, observamos um aumento significativo de oócitos em telófase I no grupo endometriose III/IV (5,6%) quando comparado ao grupo endometriose I/II (0%). Observamos uma tendência a menores taxas de fertilização dos oócitos injetados em telófase I quando comparados aos em metáfase II, nos grupos controle (p=0,08), endometriose (p=0,05) e endometriose III/IV (p=0,09). Comparando-se os oócitos com e sem fuso celular visível, não observamos diferença significativa nos resultados de ICSI entre os grupos analisados. Conclusão: Não observamos diferença significativa entre os grupos analisados quanto à visualização e localização do fuso celular em oócitos maturados in vivo com o primeiro CP visível. Todavia, observamos um aumento significativo de oócitos em telófase I nas portadoras de endometriose moderada e severa, sugerindo um retardo ou comprometimento na conclusão da meiose I. Considerando que os oócitos injetados em telófase I apresentam piores taxas de fertilização do que os injetados em metáfase II, este achado poderia justificar o comprometimento dos resultados de reprodução assistida em mulheres inférteis com endometriose moderada e severa, além de ser utilizado com ferramenta prognóstica pós-ICSI. / Introduction: Although it has been a controversial issue for decades, a deleterious role of endometriosis on assisted reproductive techniques (ART) outcomes is questioned, which may be related to oocyte quality. For a mature oocyte be prepared for fertilization is necessary that the meiotic spindle keeps its integrity and its function. Objectives: To compare the presence and localization of the meiotic spindle and the oocyte nuclear maturation with the visible first polar body of infertile patients with and without endometriosis. To compare ICSI outcomes between oocytes on telophase I and metaphase II, and the ones with and without visible meiotic spindle, on those two groups. Methodology: A prospective and controlled study with infertile patients who underwent ovarian stimulation for purposes of ICSI, selected consecutively and divided into two groups: control (tubal and/or male factor) and endometriosis (subdivided in minimum and mild stage I/II versus moderate and severe stage III/IV). The oocytes with the first polar body extruded (in vivo matured oocytes) were imaged using a polarization microscopy immediately before ICSI and characterized according to the presence and localization of meiotic spindle and its relation to the first polar body and the nuclear maturation stage (telophase I and metaphase II). We have analyzed the fertilization rates, clivage, number of good quality embryos on the second (D2) and third (D3) day of development from oocytes on telophase I versus the ones on metaphase II, and metaphase II visible spindle versus the non-visible ones, on the control groups, endometriosis, endometriosis stage I/II and endometriosis stage III/IV. Results: A total of 441 oocytes were analyzed, 254 oocytes form the control group and 187 from the endometriosis one (115 from endometriosis stage I/II and 72 from endometriosis stage III/IV). No significant differences between the percentage of metaphase II with visible and non-visible meiotic spindle were found (88,6%, 91,3%, and 88,2%, in the control, endometriosis I/II and endometriosis III/IV groups, respectively). Among the apparently matured oocytes, we have observed a significant increase of oocytes on telophase I on the endometriosis III/IV group (5,6%) when compared with the endometriosis I/II group (0%). We have observed a tendency to fewer fertilization rates from the injected oocytes on telophase I when compared with the ones on metaphase II, on the control group (p=0,08), endometriosis (p=0,05) and endometriosis III/IV group (p=0,09). When we compared oocytes with and without visible meiotic spindle, we found no significant difference on ICSI outcomes among the studied groups. Conclusions: We have found no significant difference among the studied groups regarding the visualization and localization of the meiotic spindle from in vivo matured oocytes with a visible first polar body. However, we have observed a significant increase on the number of oocytes on telophase I from patients with moderate and severe endometriosis, suggesting a delay or an impairment in the completion of meiosis I. Since the injected oocytes on telophase I present a worse fertilization rates than the ones injected on metaphase II, this finding could explain the impairment on the outcomes of ART in infertile women with moderate and severe endometriosis, besides it could be used as a prognosis tool after ICSI procedures.

Made available in DSpace on 2014-08-20T14:37:48Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertacao_daniel_savio.pdf: 201214 bytes, checksum: f8921438dab6324aed14b7b44d06de38 (MD5) Previous issue date: 2011-12-15 / The use of artificial insemination (AI) with heterospermic doses (Het) in swine may benefit reproductive performance by diluting individual differences among boars. However, such practice may also mask the true reproductive potential of some individuals, which can be measured through homospermic AI (Hom). This study evaluated boar reproductive performance after AI with Hom and Het doses. Ejaculates were collected from 4 boars and combined in 10 treatments: 4 with Hom doses (boars A, B, C and D) and 6 with Het doses (AB, AC, AD, BC, BD and CD) all having concentration of 3 billion spermatozoa in 80 mL doses with equal contribution of each boar. The in vitro analyses of sperm quality were: sperm membrane, DNA and acrossome integrity; mitochondrial functionality; and in vitro oocyte penetration. Thereafter, 511 females having parities from 1 to 6 were inseminated and the farrowing rate (FR) and total litter size (TB) were recorded. Both FR (Hom = 90.5% and Hem = 89.9%), and TB (Hom = 12.4 ± 0.4 and Het = 12.7 ± 0.7) did not differ (P>0,05). Some differences were observed among treatments, such as: the maximum FR (98.0%) for treatment AC and the minimum (87.0) for boar B; and a difference of two piglets among the maximum (for the CD treatment) and the minimum observed value (for the AC treatment). The only difference observed on the in vitro evaluations (P<0.05), occurred for the in vitro oocyte penetration by sperm from boars B (56.4%) and C (29.0%). No differences were detected in reproductive performance after AI using homospermic and heterospemic doses. / A utilização de inseminação artificial (IA) com doses heterospérmicas (Het) pode ser benéfica para a suinocultura, por diluir deficiências individuais entre o desempenho reprodutivo de machos. No entanto, esta prática pode mascarar o potencial reprodutivo de outros reprodutores, o que poderia ser avaliado com o uso de inseminação artificial com doses homospérmicas (Hom). Este trabalho avaliou o desempenho reprodutivo de machos suínos após IA com doses Hom e Het. Ejaculados colhidos de 4 machos foram combinados em 10 tratamentos: 4 com doses Hom (machos A, B, C e D) e 6 com doses Het (AB, AC, AD, BC, BD, e CD), todos com concentração de 3 bilhões de espermatozóides em doses de 80 mL, com contribuição igual de cada macho. Realizaram-se testes para analise de integridade da membrana, do DNA espermático e do acrossoma, da funcionalidade da mitocôndria e da penetração ovocitária in vitro. Foram inseminadas 511 fêmeas de ordem de parto de 1 a 6. A taxa de parição (TP) e o número total de leitões nascidos por parto (TN) foram registrados. Tanto a TP (Hom = 90,5% e Het = 89,9%), quanto o TN (Hom = 12,4 ± 0,4 e Het = 12,7 ± 0,7), não diferiram (P>0,05). Foram observadas algumas diferenças entre os tratamentos, como a TP máxima ocorrendo para o tratamento AC (98.0%) e uma TP mínima de 87.0% para o macho B (P<0.05). Quanto ao TN, uma diferença de 2,0 leitões foi observada entre o valor máximo (tratamento CD) e o mínimo (tratamento AC). Quanto às avaliações in vitro, foram observadas diferenças apenas quanto ao teste de penetração in vitro (P<0,05), entre os machos B (56,4%) e C (29,2%). Não foram detectadas diferenças no desempenho reprodutivo com IA com doses homo e heterospérmicas.

Made available in DSpace on 2014-08-20T14:37:52Z (GMT). No. of bitstreams: 1 tese_jorgea_pradiee.pdf: 964026 bytes, checksum: e100969ef5fb9f72ec9bf73b616695fd (MD5) Previous issue date: 2013-02-22 / In an attempt to diminish the structural damage to the plasma membrane, due to free radicals and reactive oxygen species (ROS), the antioxidants β-mercaptoethanol (BME) and cysteine (CIS) were tested for semen cryopreservation and in vitro maturation (IVM) and culture (IVC) of ovine embryos. Semen samples from four rams of the Crioula Lanada breed were collected with artificial vagina twice weekly (n = 23). Samples of four rams were pooled and split in six treatments: T1, control without antioxidant, T2, with 2mM BME, T3, with 5mM BME, T4, with 2mM BME and 5mM cysteine; T5, with 5 mM BME and 5mM cysteine, and T6 with 5 mM cysteine. Semen was diluted in tris-egg yolk-glycerol and stored in straws of 0.25 mL containing 100 x 106 spermatozoa. Cooling and freezing were performed using a TK3000 and thawing was performed at 37°C for 20 s. Sperm motility, membrane integrity and mitochondrial activity and acrosome, before freezing and after thawing, did not differ between treatments (P> 0.05). Quantification of ROS and total antioxidant activity after thawing were similar between treatments (P> 0.05). At the tested concentrations, the inclusion of BME, and cysteine did not affect sperm viability after thawing. In the first experiment of IVP, the inclusion of 20 mM of BME in IVM and IVC of embryos was compared to a control treatment without antioxidants. There was no deleterious effect of antioxidant on the cleavage rate (control: 70.0%; BME: 69.8%). However, the rate of development to the blastocyst stage with BME (5.2%) was lower (P <0.001) than with the control (16.9%). In the second experiment, we tested the association of 50 mM BME and 600 mM of CIS in IVM and IVC. There was no difference between control and BME/CIS (P> 0.05), for cleavage (60.3% and 64.3%, respectively) and embryonic development rates (33.6% and 36.6 %, respectively). The addition of 20 mM of isolated BME in IVM and IVC sheep embryos was associated with decreased embryonic development to blastocyst. However, the addition of antioxidants BME, and cysteine in combination, did not affect the rates of cleavage and embryo development to blastocyst. Therefore, the combination of antioxidants and CIS BME used in freezing ram semen and PIV, did not improve the treatments that have been added, albeit at different concentrations. / Na tentativa de diminuir os danos estruturais na membrana plasmática, devido aos radicais livres e espécies reativas de oxigênio (ROS), os antioxidantes β-mercaptoetanol (BME) e cisteína (CIS) foram testados na criopreservação de sêmen e na maturação (MIV) e cultivo (CIV) in vitro de embriões de ovinos. Amostras de sêmen de quatro carneiros da raça Crioula Lanada foram coletadas com vagina artificial, duas vezes por semana (n = 23). As amostras dos quatro machos foram combinadas em pool e divididas em seis tratamentos: T1, Controle, sem antioxidante; T2, com 2mM BME; T3, com 5mM BME; T4, com 2mM BME e 5mM de cisteína; T5, com 5mM BME e 5mM de cisteína; e T6 com 5mM de cisteína. O sêmen foi diluído em tris-gema-glicerol e estocado em palhetas de 0,25 mL contendo 100 x 106 espermatozoides. O resfriamento e o congelamento foram realizados em máquina TK3000 e o descongelamento foi realizado a 37ºC por 20 s. A motilidade, a integridade da membrana espermática e do acrossoma e a atividade mitocondrial, antes do congelamento e após o descongelamento, não diferiram entre os tratamentos (P> 0,05). A quantificação de ROS e da atividade antioxidante total pós-descongelamento foram semelhantes entre os tratamentos (P> 0,05). Nas concentrações testadas, a inclusão de BME e cisteína não influenciou a viabilidade espermática pós-descongelamento. No primeiro experimento de PIV, a inclusão de 20 μM de BME na MIV e CIV de embriões foi comparada a um tratamento controle sem antioxidantes. Não houve efeito deletério do antioxidante sobre a taxa de clivagem (Controle: 70,0%; BME: 69,8%). Porém, a taxa de desenvolvimento até o estágio de blastocisto no tratamento BME (5,2%) foi inferior (P<0,001) à do controle (16,9%). No segundo experimento, foi testada a associação de 50 μM de BME e 600 μM de CIS, na MIV e CIV. Não houve diferença entre os tratamentos controle e BME/CIS (P>0,05), quanto às taxas de clivagem (60,3% e 64,3%, respectivamente) e de desenvolvimento embrionário (33,6% e 36,6%, respectivamente). A adição isolada de 20 μM de BME na MIV e CIV de embriões ovinos foi associada com redução no desenvolvimento embrionário até blastocisto. Porém, a adição dos antioxidantes BME e cisteína, em associação, não afetou as taxas de clivagem e desenvolvimento embrionário até blastocisto. Assim, a associação dos antioxidantes BME e CIS usados no congelamento de sêmen ovino e na PIV, não promoveu melhora dos tratamentos em que foram adicionados, ainda que em concentrações diferentes.

Made available in DSpace on 2014-08-20T14:37:58Z (GMT). No. of bitstreams: 1 dissertacao_gissele_rambo.pdf: 235931 bytes, checksum: a4e2ca4dc38eed3295f04e66a374e019 (MD5) Previous issue date: 2008-11-24 / The evaluation of the efficiency of semen cryopreservation is critical to make the use of frozen semen feasible in artificial insemination programs in swine. This study compared the efficiency of two non-penetrating cryoprotectants (dimetilacetamide-DMA or glycerol) on parameters of post-thawing semen quality and in vitro fertility with frozen swine semen. The sperm-rich fractions of 28 ejaculates from four boars were frozen with either DMA or glycerol. The efficiency of semen freezing was evaluated through parameters of post-thawing semen quality and in vitro penetration (IVP) of swine oocytes and embryo production. For samples frozen with DMA, sperm motility (38.1%) and membrane integrity (39.9%) were greater (P < 0.05) than those for glycerol (21.9% and 13.0%, respectively). Both the IVP rate and the number of spermatozoa per oocyte were greater (P < 0.05) for DMA (27.9% and 29.2, respectively) than for glycerol (13.6% and 20.7, respectively). The cleavage rate with DMA and glycerol samples (13.0% and 15.6%, respectively) were similar (P > 0.05). The embryo development rate did not differ (P < 0.05) for DMA (15.8%) and glycerol (22.0%). Therefore, when compared to glycerol, DMA was associated with improved post-thawing semen quality and in vitro fertility. / A avaliação da eficiência da criopreservação do sêmen é uma importante ferramenta para viabilizar o uso de sêmen congelado na inseminação artificial em suínos. Um experimento foi realizado a fim de identificar qual crioprotetor interno (dimetilacetamida-DMA ou glicerol) seria associado com melhores indicadores de qualidade seminal pós-descongelamento e fertilidade in vitro com sêmen suíno congelado. A fração espermática rica em espermatozóides de 28 ejaculados provenientes de quatro machos foi congelada com DMA ou glicerol. Para estimar o sucesso da criopreservação do sêmen foram utilizados parâmetros de qualidade seminal pós-descongelamento, teste de penetração in vitro (TPIV) de ovócitos suínos e produção in vitro de embriões. Para amostras congeladas com DMA, a motilidade (38,1%) e a integridade da membrana espermática (39,9%) foram superiores (P < 0,05) às observadas com glicerol (21,9% e 13,0%, respectivamente). A taxa de TPIV e o número de espermatozóides por ovócito também foram superiores (P < 0,05) para a DMA (27,9% e 29,2, respectivamente) do que para o glicerol (13,6% e 20,7, respectivamente). A taxa de clivagem alcançada com a DMA (13,0%) foi similar (P > 0,05) à obtida com glicerol (15,6%). A taxa de desenvolvimento embrionário não diferiu (P > 0,05) entre DMA e glicerol (15,8% e 22,0%, respectivamente). Portanto, considerando o conjunto de todos os testes, em comparação com o glicerol, a DMA foi associada com melhores indicadores de qualidade seminal e fertilidade in vitro.

Made available in DSpace on 2014-08-20T13:32:51Z (GMT). No. of bitstreams: 1 tese_milton_carvalho_macedo_junior.pdf: 497444 bytes, checksum: 51c0892c0419a147e202b85034bef566 (MD5) Previous issue date: 2007-01-30 / The knowledge of the reproductive potential of a male is of economic and reproductive importance, mainly if used in programs of artificial insemination. The conventional tests for semen quality evaluation do not have the capacity to measure the fertilizing potential of a sample, although they indicate if that one is fertile or not. The in vitro penetration test, appears in this context as an alternative laboratorial test to categorize of males capacity of fecundation, as mimics in vitro what happens in vivo. However this test has its use limited for for difficult execution and high cost. With the objective to simplify the test, the present work evaluated alternatives for reduction of the execution time, use of cryopreserved oocytes in different methods and its association with in vivo fertility through heterospermic insemination and following diagnostic fertility. It was concluded that: 1) It is possible to use the incubation system BOTTLE, to replace the conventional incubation system, eliminating the need for using expansive CO2 incubator; 2) Oocytes can be cryopreserved in CRIOVIAL, together with the medium of fecundation and mineral oil, eliminating the use of stereoscopic lupa to manipulate oocytes in the day of the execution of the test; 3) It is viable to reduce co-incubation time of oocytes and sperm for 6 hours, if sperm concentration is of 2 X 106 per ml of way of used fecundation; 4) The paternity diagnosis disclosed that when inseminating females swine with one pool of semen of four males, using a dose of 2,8 X 109 spermatozoa, all the males had the same participation in the paternity of the produced pigs / O conhecimento do potencial reprodutivo de um macho é de importância econômica e reprodutiva, principalmente se ele é utilizado em programa de inseminação artificial. Os testes convencionais que avaliam a qualidade seminal não possuem a capacidade de medir o potencial fertilizante de uma amostra e, apenas indicam se a mesma é fértil ou não. O teste de penetração espermática in vitro, aparece neste contexto como um teste laboratorial alternativo para categorizar os machos férteis, quanto a sua capacidade de fecundação, pois mimetizam in vitro o que acontece in vivo. No entanto, este teste tem seu uso limitado por ser de difícil execução e por utilizar equipamentos de alto custo. Com o objetivo de simplificar o teste, o presente trabalho avaliou alternativas para diminuição do tempo de execução, utilização de oócitos criopreservados de diferentes maneiras e sua associação com fertilidade in vivo através de inseminação heterospérmica e diagnóstico de paternidade dos leitões nascidos. Foi concluído que: 1) É possível utilizar o sistema de incubação FRASCO, em substituição ao sistema de incubação convencional, eliminando a necessidade de uso da onerosa incubadora de CO2; 2) Pode-se congelar oócitos em CRIOTUBO, juntamente com o meio de fecundação e óleo mineral, eliminado a utilização de lupa esteriomicrocópica para manipular oócitos no dia da execução do teste; 3) É viável reduzir o tempo de co-incubação de oócitos e espermatozóides para 6 horas, desde que a concentração espermática utilizada seja de 2 X 106 espermatozóide para cada ml de meio de fecundação utilizado; 4) O diagnóstico de paternidade revelou que ao inseminar fêmeas suínas com um pool de sêmen de quatro machos, utilizando dose inseminante de 2,8 X 109 espermatozóides, todos os machos tiveram participação semelhante na taxa de paternidade dos leitões nascidos

L'ovocyte se développe au sein d'un follicule, en contact étroit avec des cellules d'origine somatique, les cellules de cumulus (CC). Ces deux types cellulaires communiquent entre eux via des jonctions intercellulaires, permettant ainsi la régulation et la coordination du métabolisme pendant le développement et la maturation de l'ovocyte. Notre hypothèse est que l'expression et la régulation des gènes dans les CC joue un rôle crucial dans des fonctions essentielles pour la croissance de l'ovocyte et l'acquisition de sa compétence. Mes travaux de thèse comportent deux parties. Dans la première partie nous avons utilisé le séquençage haut débit pour examiner le répertoire des microARN (communément appelés miRNA) dans les cellules de cumulus et dans l'ovocyte. Les miRNA, séquences d'ARN non codantes dont la longueur varie entre 19 et 25 nucléotides, ont émergé récemment comme régulateurs majeurs de nombreux processus biologiques, dont le vieillissement. Nous avons identifié 32 miRNA spécifiquement dans les cellules de cumulus humains et seulement 3 dans l'ovocyte MII. Dans la seconde partie de nos travaux, nous avons analysé l'impact de l'âge maternel sur l'expression des gènes dans les cellules de cumulus. Alors qu'une baisse de la compétence de l'ovocyte avec l'avancement de l'âge maternel est bien établie, les bases moléculaires de ce phénomène demeurent peu connues. Dans une première étape pour aborder cette question, nous avons utilisé des puces à ADN pour analyser les profils d'expression des gènes des CC en fonction de l'âge maternel. De façon remarquable l'âge maternel impacte significativement l'expression de gènes qui sont critiques pour la maturation de l'ovocyte tels que les gènes impliqués dans l'angiogenèse, les voies de signalisation de TGF-ß et de l'insuline. Par l'utilisation d'outils bioinformatiques, nous avons aussi identifié des miRNA potentiels régulateurs de gènes impliqués dans des processus ou des voies impactés par l'âge ; ils pourraient constituer de nouveaux biomarqueurs pour prédire un vieillissement ovarien prématuré ainsi que la qualité et la compétence de l'ovocyte. / The oocyte develops into a follicle where it is in close contact with cumulus cells (CCs), of somatic origin. The two cell types undergo a bidirectional communication via gap junctions, which results in the regulation and coordination of the metabolism during oocyte development and maturation. We assume that gene expression and regulation in the CCs play a crucial role in functions that are essential for oocyte growth and competence acquisition. The present study may be subdivided in two parts. In the first part we used deep sequencing to investigate the repertoire of miRNAs in the cumulus cells and the oocyte. MicroRNAs that are noncoding RNA sequences whose length is approximately 19-25 nucleotides have emerged as important regulators in many biological processes including aging. Our data showed that 32 miRNAs were specifically expressed in human cumulus cells while only 3 miRNAs were identified in MII human oocyte. The impact of maternal age on gene expression in cumulus cells was addressed in a second part of my thesis work. While the correlation of oocyte competence decline with advancing maternal age is well established, little is known on its molecular basis. In a first attempt to address this issue, we used microarrays to study gene expression profiles of human cumulus cells according to maternal age. Remarkably, maternal age greatly impacted expression of genes that are critical for oocyte maturation such as genes involved in angiogenesis, TGF-β signaling, and insulin signaling pathways. Also, using bioinformatic tools, we identified miRNAs that potentially target some of the genes involved in the aging-impacted processes and pathways; this could candidate them as new biomarkers to predict premature ovarian aging and oocyte quality and competence.

L'ovaire est au cœur de la physiologie de la reproduction féminine. Il est à la fois à l'origine des ovocytes nécessaires à la fécondation et acteur des régulations endocrines du système reproducteur. Les ovocytes de l'ovaire fœtal sont groupés en amas bordés de cellules somatiques et d'une membrane basale, formant les cordons ovariens. Ces cordons ovariens se fragmentent pour former les follicules ovariens: un ovocyte bordé de cellules somatiques et d'une membrane basale. Cette fragmentation se déroule sur une courte période (/in utero/ chez la femme et juste après la naissance chez les rongeurs) et fait intervenir une vague de mort cellulaire programmée touchant les ovocytes pendant leur méiose et un remodelage de la membrane basale. La formation des follicules est une période cruciale du développement ovarien puisque le stock de follicules formés à l'issue de ce processus est non renouvelable. Son altération peut donc être à l'origine de troubles de la fonction de reproduction chez le futur adulte. Il existe une fragile homéostasie œstrogénique en place au moment de la formation folliculaire: chez la femme, l'ovaire se développe /in utero/, sous l'influence des œstrogènes circulants maternels et la production ovarienne fœtale. Chez les rongeurs, les follicules se forment lors de la levée de l'imprégnation hormonale maternelle au moment de la naissance. Nous avons souhaité comprendre comment le 17b-œstradiol (E2), œstrogène endogène, pouvait contribuer à la mise en place des follicules. Pour cela, des rattes Sprague-Dawley ont été traitées pendant la période de formation des follicules avec de l'E2 à différentes doses entre 0.01 et 10 µg/jour. Nos travaux démontrent que le traitement de rattes par des œstrogènes entre leur naissance et 3 jours induit une réduction dose-dépendante de leur nombre d'ovocytes. Bien que le traitement entrave le développement normal du système de détoxication hépatique et ovarien, l'animal est capable d'accroître ses capacités d'élimination des œstrogènes. Ces capacités sont toutefois insuffisantes pour bloquer les effets du traitement. Quelle que soit la dose d'E2 utilisée (0.1 ou 10 µg/jour), la puberté est plus précoce chez les femelles exposées mais toutes sont fertiles, au moins transitoirement. Cependant le traitement induit une dégradation rapide des capacités reproductives. L'E2 modifie la dynamique folliculaire chez l'adulte, longtemps après l'arrêt du traitement. Si une forte dose d'E2 réduit la survie des ovocytes lors de la formation des follicules et conduit à une infertilité secondaire due à un dysfonctionnement général du tractus reproducteur, une dose faible n'affecte pas la survie des ovocytes à court terme mais conduit à une sénescence reproductive précoce vraisemblablement d'origine ovarienne. L'origine de ces troubles pourrait résider dans les effets précoces de l'exposition à E2 : cette molécule altère le transcriptome ovarien et induit de nombreuses lésions de l'ADN des cellules ovariennes. / The ovary is not solely the unique source of oocytes necessary for fertilization but also a crucial conductor of endocrine regulations of the reproductive system. In the fetal ovary, oocytes grouped in clusters are surrounded by somatic pre-granulosa cells, altogether delineated by a basement membrane and constituting ovarian cords. The formation of the definitive ovarian functional units requires their fragmentation into follicles formed by a single oocyte surrounded by granulosa cells and delineated by a basement membrane. This partitioning occurs within a tiny period and is dependent on the correct timing of the meiotic process, on an apoptotic wave that specifically targets oocytes and the remodelling of the basement membrane. Follicle formation is a crucial event of ovarian development because the follicle stock formed at the end of this process is non-renewable. Therefore, any disturbance of this process can lead to reproductive abnormalities in adulthood. Recent data on endocrine disruptors displaying estrogenic activity have involved the fragile estrogenic homeostasis in the process. We aimed at better understanding how the endogen estrogen 17b-estradiol (E2) contributes to follicle formation. To assess it, Sprague-Dawley rats were treated with E2 at different doses during follicle formation, /i.e./ in the 3 days following birth. We show that although this treatment impairs the development of the hepatic and ovarian detoxification systems, the female neonate is able to increase its estrogen clearance capabilities. Nevertheless, E2 treatment within this critical period triggers a dose-dependent decrease of oocyte number per ovary. Regardless of the E2 dose, puberty is advanced. All treated females are at least transiently fertile, yet these reproductive capabilities rapidly decline. A high (10 µg/day) dose of E2 leads to a secondary infertility characterized by anovulation that probably result from a dysfunction of the whole reproductive tract. By contrast, a lower (0.1 µg/day) dose of E2, that does not significantly modify neonatal oocyte survival, leads to a progressive reproductive senescence likely due to ovarian failure. Long-term troubles may originate from precocious E2 impact on the ovary since it disturbs ovarian transcriptome and produces many lesions on ovarian cell DNA.

Les nouvelles pratiques d’aide médicale à la procréation, notamment celle qu’on appelle « le don d’ovocyte » bouleverse le sens de la parentalité. Elle oblige chacun d’entre nous à expliciter ses conceptions de la vie, à énoncer ses priorités, mais elle oblige aussi la collectivité à prendre conscience d’elle-même et de ce qui peut être acceptable. Est-il moralement satisfaisant qu’une femme donne ses ovocytes pour qu’une autre ait un enfant ?En interrogeant 50 donneuses d’ovocytes, ce travail a cherché à mieux comprendre la signification d’un tel geste.La procréation par don, défie nos habitudes et nos manières de penser. Elle nous réinterroge sur notre capacité de fraternité comme réponse d’un appel de l’un pour l’autre, elle cherche à donner une juste place à ce tiers-donneur qui s’insinue (presque malgré lui) dans un arbre généalogique. Elle bouleverse notre rapport à l’enfant qui se pose comme « un ayant droit à connaître ses origines ». En définitive, ce n’est pas tant la question de l’anonymat du don qui nous importe que ce qu’il en est de l’homme, de son altérité et de ses responsabilités / Reproductive technology, in particular oocyte or egg donation, upsets the meaning of parenthood and raises questions about the circumstances surrounding those who decide to have a child by means of this technology. A woman using egg donation must come to grips with questions such as the meaning of life, and what it means to be a mother. But it also requires that society become aware of what is morally acceptable. Is it morally acceptable for the egg donor to give her eggs to anotherwoman who wants to have a child? We would like to gloss over these issues by the power of love or by the growth of the uterus, but these issues will remain in the minds of everyone and will circulate in the subconscious. The purpose of this essay is to grapple with these issues. Reproduction by gift, it challenges our habits and ways of thinking. It causes us to re-examine the companionship among two people, it creates a role for the egg donor who, almost despite herself, inserts herself into the family tree. It disrupts the relationship being the parents and the child who demands the right to know where they came from. Ultimately, the focus rests not on the anonymity of the egg donor but on the father, his otherness and his responsibility.

A produção in vitro de embriões é uma biotecnologia bastante difundida mundialmente. O Brasil, em 2015, foi responsável por aproximadamente 67% dos embriões bovinos produzidos in vitro no mundo (PERRY, 2014). Embora essa tecnologia seja bastante utilizada, é de grande interesse para o mercado desenvolver estratégias que levem ao maior aproveitamento dos oócitos obtidos e compreender os mecanismos, dentro do ambiente folicular, que determinam a competência oocitária. O microambiente folicular é fundamental para o crescimento e a aquisição da competência oocitária, tornando o oócito apto a desenvolver-se e manter o embrião até a transição materno embrionária. Para tanto, os componentes foliculares - células da granulosa, células do cumulus, oócito e líquido folicular - precisam trabalhar em unidade, visto que possuem uma relação de interdependência. Dentro dos mecanismos de comunicação existentes no ambiente folicular estão as vesículas secretadas por células, chamadas vesículas extracelulares, que foram descritas no líquido folicular, contendo material bioativo como proteínas, lipídios e RNAs, incluindo os microRNAs. Contudo, os componentes do ambiente folicular podem refletir na qualidade do oócito que será produzido e a hipótese geral deste trabalho é de que os miRNAs presentes no ambiente folicular regulam vias de sinalização importantes para o desenvolvimento oocitário e que os miRNAs e ou RNAs mensageiros presentes nas células foliculares podem ser explorados como importantes ferramentas para o diagnóstico da qualidade oocitária. O primeiro estudo determinou perfis transcricionais de miRNAs em células da granulosa, em complexos cumulus-oócito e em vesículas extracelulares derivadas destas células e também do fluido folicular. Além de conhecer a origem e o papel dos miRNAs no ambiente folicular, estes perfis de expressão indicaram a regulação no ambiente folicular da via de sinalização da PI3K-Akt. No segundo estudo, componentes desta via de sinalização foram então determinados em células foliculares associadas a oócitos de alta ou baixa competência ao desenvolvimento. Os resultados demonstram que a ativação da via PI3K-Akt em células foliculares correlaciona-se à maior competência oocitária; de modo oposto, a menor atividade desta via nas células foliculares está relacionada à reduzida competência oocitária. Nos estudos três e quatro, um conjunto de experimentos foram realizados para determinar o perfil de microRNAs e RNAs mensageiros em células do cumulus associadas a oócitos de alta ou baixa competência ao desenvolvimento. Buscou-se esclarecer alguns dos mecanismos responsáveis pela melhor qualidade oocitária e levar a identificação de biomarcadores de qualidade oocitária permitindo o avanço e o desenvolvimento de novas ferramentas para intensificar a produção in vitro de embriões bovinos. Por fim, estes resultados demonstram respostas integradas entre oócitos e células foliculares durante o desenvolvimento folicular e o processo de aquisição de competência oocitária e identificaram marcadores de qualidade oocitária. / In vitro embryo production of is a widespread biotechnology worldwide. In 2015 Brazil was responsible for approximately 67% of bovine embryos produced in vitro in the world (PERRY, 2014). Although widely used, to develop strategies that lead to better use of oocytes and understand the mechanisms (in follicular microenvironment) that determine oocyte competence is of great interest to national market. The follicular microenvironment is fundamental for oocyte growth and acquisition of competence, making the oocyte able to develop and maintain the embryo until the embryonic maternal transition. For this end, the follicular components - granulosa cells, cumulus cells, oocytes and follicular fluid - need to work in unity, since they have arelation of interdependence. Within the mechanisms of communication existing within the follicular environment are vesicles secreted by cells, called extracellular vesicles, which were described in follicular fluid, containing bioactive material such as proteins, lipids and RNAs, including microRNAs. The components of follicular environment may reflect the quality of the oocyte that will be produced and the general hypothesis of this work is that the miRNAs present in the follicular environment regulate signaling pathways important for oocyte development and that the miRNAs and/or messenger RNAs present in the follicular cells can be explored as important tools for the diagnosis of oocyte quality. The first study determined profiles of miRNAs in granulosa cells, cumulus-oocyte complexes and extracellular vesicles derived from these cells and also in follicular fluid. In addition, by knowing the origin and role of miRNAs in the follicular environment, the expression profiles indicated the PI3K-Akt signaling pathway regulation in the follicular environment. In the second study, components of this signaling pathway were then determined in follicular cells associated with oocytes of high or low developmental competence. The results demonstrated that the activation of the PI3K-Akt pathway in follicular cells correlates with increased oocyte competence; conversely, the lower activity of this pathway in follicular cells is related to reduced oocyte competence. In studies three and four, experiments were performed to determine the profile of microRNAs and messenger RNAs in cumulus cells associated with oocytes of high or low developmental competence. Aiming to clarify some of the mechanisms responsible for the best oocyte quality that lead to the identification of oocyte quality biomarkers, allows the advancement and development of new tools to intensify the in vitro production of bovine embryos. Finally, results obtained demonstrate integrated responses between oocytes and follicular cells during follicular development and give new insights to the study of oocyte competence acquisition process and identified oocyte quality markers.

Os mecanismos pelos quais a produção in vitro de embriões (PIVE) bovinos gera embriões com excessivo acúmulo lipídico, com elevado estresse celular e com reduzida criotolerância ainda são desconhecidos. Também permanece desconhecido quando essas alterações acontecem, se acontecem desde a maturação oocitária e o papel que as células do cumulus possuem neste mecanismo. O objetivo do presente trabalho foi estudar e comparar o metabolismo lipídico e homeostase celular, além dos perfis de miRNAs, durante a maturação oocitária e o desenvolvimento embrionário inicial in vivo e in vitro em bovinos. Para isso, o trabalho foi dividido em 4 estudos. No Estudo 1, intitulado \"A maturação in vitro gera complexos cumulus-oócitos metabolicamente desregulados e estressados em bovinos\" foram analisadas as células do cumulus e oócitos de complexos cumulus-oócitos (COCs) imaturos e maturados in vivo e in vitro. Foram realizadas análises de quantificação de lipídeos, espécies reativas de oxigênio (EROs), glutationa reduzida (GSH), razão ATP/ADP assim como expressão de mRNAs e miRNAs relacionados com as vias de metabolismo e homeostase celular. A partir dos dados obtidos neste estudo, concluímos que a maturação in vitro (MIV) provoca aumento de lipídeos no COC, diminuição de GSH e da atividade mitocondrial nos oócitos, acompanhado por uma desregulação massiva das vias relacionadas a metabolismo e homeostase nas células do cumulus da MIV. No Estudo 2, intitulado \"A proteína ligadora de ácidos graxos 3 (Fatty Acid Binding Protein 3 - FABP3) e as projeções transzonais estão envolvidas no acúmulo lipídico durante a maturação in vitro em oócitos bovinos\" foi constatado aumento do conteúdo lipídico e da expressão da FABP3 nas células do cumulus da MIV, quando comparado ao sistema in vivo. Ainda, imunolocalizamos a FABP3 dentro das projeções transzonais (TZPs) e verificamos um aumento concomitante da FABP3 e dos lipídeos oocitários nas primeiras 9 horas da MIV. Mediante a remoção das TZPs às 9 horas da MIV e consequente diminuição lipídica observada no oócito, concluímos que existe um possível transporte de ácidos graxos a partir das células do cumulus até o oócito mediante FABP3 e TZPs. No Estudo 3, intitulado \"Alterações no metabolismo lipídico e homeostase celular entre embriões bovinos produzidos in vivo e in vitro\", verificamos que, mesmo utilizando um cultivo in vitro com baixa tensão de oxigênio e sem soro, os blastocistos da PIVE possuem maiores níveis de lipídeos e EROs que aqueles produzidos in vivo. Além disso, constatamos que essas alterações nos lipídeos durante a PIVE não estão acompanhadas de alterações de expressão, porém, existe um aumento na expressão de genes relacionados com estresse. No último estudo, \"O sistema in vitro altera o perfil de miRNAs durante a maturação oocitária e desenvolvimento embrionário inicial em bovino\", constatamos as diferenças no perfil de miRNAs e nas vias reguladas por estes nas células do cumulus e oócitos maturados in vivo e in vitro e em blastocistos produzidos in vivo e in vitro. Verificamos uma maior regulação por miRNAs durante a maturação nas células do cumulus comparado ao oócito. Além do mais, tanto no COC quanto nos blastocistos, os miRNAs mostraram regular vias importantes do metabolismo, comunicação celular e vias de sinalização importantes para a maturação e desenvolvimento embrionário inicial. Conjuntamente, este trabalho permitiu elucidar as diferenças que a PIVE provoca no metabolismo e homeostase celular e na expressão de miRNAs. / The mechanism through which in vitro embryo production (IVEP) generates embryos with higher lipid accumulation, overstressed and with reduced cryotolerance is unknown. It is also unknown when these alterations take place, if occurs since the oocyte maturation and the role of cumulus cells in this mechanism are also unknown. The aim of the present work was to study and compare the lipid metabolism and cellular homeostasis, as well as the miRNAs profile during oocyte maturation and early in vivo and in vitro embryo development in bovines. For that, the present work was divided in 4 studies. In Study 1, entitled \"in vitro maturation generates metabolically disrupted and overstressed cumulus-oocyte complexes in bovines\" cumulus cells and oocytes from immature and in vivo and in vitro matured cumulus-cells complexes (COC) were analyzed. Analysis of lipid stores, oxygen reactive species (ROS), reduced glutathione and ATP/ADP ratio quantification, as well as mRNAs and miRNAs involved with metabolism and cellular homeostasis pathways were performed. From the obtained data in this study, we concluded that in vitro maturation (IVM) leads to an increase of lipids in the COC, a decrease of oocyte GSH and mitochondrial activity, as well as a massive deregulation in metabolism and homeostasis related pathways in MIV cumuls cells. In Study 2, \"Fatty Acid Binding Protein 3 and transzonal projections are involved on lipid accumulation during in vitro maturation in bovine oocytes\" we observed an increase of lipid accumulation and FABP3 expression in MIV cumulus cells when compared to the in vivo system. Furthermore, we immunolocalized the FABP3 inside the transzonal projections (TZPs) and verified a concomitant increase of FABP3 and oocyte lipids on the first 9 hours of MIV. By removing the TZPs at 9 hours of MIV and by the consequent lipid decrease observed in the oocyte, we concluded that there is a possible traffic of fatty acids from the cumulus cells to the oocyte mediated by FABP3 and TZPs. In Study 3, entitled \"Alterations in lipid metabolism and cellular homeostasis between in vivo and in vitro produced bovine embryos\", we observed that, even though under serum free and low oxygen tension used during in vitro culture was used, IVP blastocysts had higher lipid and ROS levels than the counterparts produced in vivo. Moreover, we found that these lipid alterations during IVP are not followed by corresponding genes expression alterations, however, there is an increase of the expression of stress related genes. In the last study, \"in vitro system alters miRNAs profile during oocyte maturation and early embryo development in bovines\", we observed differences in miRNAs profiles and in pathways modulated by them in in vivo and in vitro matured cumulus cells and oocytes and in in vivo and in vitro produced blastocysts. We observed an intense miRNAs regulation during maturation in cumulus cells when compared to the oocyte. Furthermore, in both COC and blastocysts, miRNAs regulated important metabolism, cellular communication pathways, as well as important signaling pathways for maturation and early embryo development. Taken together, the findings of the present work allowed us to elucidate the differences caused by IVEP on cell metabolism and homeostasis as well as on miRNAs expression.