A acidez do solo é um dos principais fatores limitantes à produção vegetal. Apesar da toxicidade por alumínio ter sido extensamente investigada, pouca atenção tem sido dada ao estresse causado pelo baixo pH em si. Existem diferenças marcantes entre células quanto à sensibilidade ao pH baixo que dependem do seu estado de crescimento e desenvolvimento celular e que devem ser exploradas para se entender o que determina a sensibilidade e tolerância a pH baixo. Em alguns casos, a suscetibilidade a pH baixo está relacionada a desarranjos na parede de células em crescimento, chegando a causar o rompimento da célula, como já foi demonstrado em pêlos radiculares em expansão. Por outro lado, o metabolismo oxidativo e a geração de espécies reativas de oxigênio (ROS) na parede podem influenciar neste processo por romper ou criar ligações dentro ou entre cadeias de polissacarídeos, modulando assim a extensibilidade da parede celular. Em células de tabaco (Nicotiana tabacum) cv. BY-2, há um aumento acentuado na sensibilidade ao pH baixo no final da fase lag da cultura, que ocorrre entre 12 e 24 h de cultivo. Os objetivos deste trabalho foram: a) Investigar se a mudança na sensibilidade pH baixo ocorre durante a retomada do ciclo celular e determinar, com o uso de inibidores do ciclo celular, o período do ciclo em que isto ocorre; b) verificar se o aumento da sensibilidade a pH baixo está relacionado com a expansão celular ou com alterações no potencial osmótico da célula; c) examinar o efeito da aplicação de H2O2 ou ascorbato sobre a resposta de células sensíveis a pH baixo; d) testar a hipótese de que a sensibilidade a pH baixo pode ser revertida por meio de um choque hipo-osmótico prévio; e) avaliar o possível papel da modulação oxidativa da parede celular na reversão de sensibilidade das células a pH baixo expostas ao choque hipo-osmótico. A retomada do ciclo celular é necessária para que ocorra a alteração de sensibilidade a pH baixo, pois a remoção de auxina (2,4-D) ou a adição de bloqueadores de canais de K+ impediu ou atrasou, respectivamente, a alteração na sensibilidade a pH baixo. O uso de inibidores do ciclo celular demonstrou que as células de BY-2 se tornam mais sensíveis a pH baixo durante o final da fase G1 mas antes do ponto de checagem da transição G1/S do ciclo celular. A aplicação de H2O2, diminuiu a suscetibilidade das células a pH baixo, ao contrário da aplicação de ascorbato. Foi demonstrado que a aplicação prévia de tratamento hipo-osmótico por 60 min reverteu a sensibilidade de células a pH baixo. A aplicação de inibidores de NAPDH oxidase da membrana plasmática e de peroxidases revelou a participação destas enzimas na reversão de sensibilidade das células a pH baixo, indicando a possibilidade de geração de ROS e de modulação oxidativa da parede. Embora já tenha sido descrito que ocorre uma explosão oxidativa com choque hipo-osmótico, ainda não havia sido demonstrado a conseqüência disto. Este trabalho fornece indícios de que uma explosão oxidativa poderia modificar a parede tornando-a mais resistente e a célula menos suscetível a pH baixo / Soil acidity is a major factor limiting plant growth worldwide. Although aluminum toxicity, which occurs only at low pH, has been extensively studied, little attention has been given to stress caused by low pH. There are marked differences in the sensitivity of cells to low pH which are contingent on the growth and developmental stage of the cells. These differences should be explored to further the understanding of the factors governing sensitivity and tolerance to low pH. In at least some cases, the susceptibility of cells to low pH is related to derangements in the wall of growing cells, which can cause ruptures or bursting of the cells, as has been clearly demonstrated in expanding root hairs. On the other hand, the oxidative metabolism and generation of reactive oxygen species (ROS) can modulate cell wall extensibility by breaking or making bonds within and between cell wall polymers. In tobacco (Nicotiana tabacum) cv. BY-2 cells, there is a sharp increase in sensitivity to low pH at the end of the lag phase of the cell culture, which occurs between 12 and 24 h of subculture. The objectives of this study were: a) determine if the changes in sensitivity to low pH occurred during the restart of the cell cycle and, by employing cell cycle inhibitors, at which points of the cycle does this occur; b) examine if the changes in sensitivity to low pH are related to cell expansion or changes in osmotic potential of the cell; c) examine how the application of H2O2 or ascorbate affects the response of cells to low pH; d) test the hypothesis that sensitivity of cells to low pH can be reverted by the previous application of a hypo-osmotic shock; e) evaluate the possible role of oxidative modulation of the cell wall in hypo-osmotic-induced reversal of the sensitivity of cells to low pH. The restart of the cell cycle was shown to be necessary for the change in sensitivity to low pH occur, since the absence of auxin (2,4-D) or the addition of K+ channel blockers prevented or delayed this change, respectively. The use of cell cycle inhibitors demonstrated that BY-2 cells become sensitive to low pH at the end of G1 but before the G1/S transition restriction point of the cell cycle. Exogenous H2O2, but not ascorbate, reduced the effect of low pH on sensitive cells. Sensitive cells submitted to 60 min hypo-osmotic treatment became insensitive to low pH. This reversal of sensitivity depended on the activity of plasma membrane NADPH oxidase and peroxidase, as evidenced by the use of DPI and SHAM, inhibitors of these enzymes, respectively. This suggests that ROS is generated and that oxidative modifications of the cell wall occur. Although hypo-osmotic treatments have been shown to generate an oxidative burst, its purpose or implication has not yet been shown. This study provides evidence that an oxidative burst might modify and strengthen the cell wall, making cells less susceptible to low pH

Electrophoretic microsystems (EM) are powerful tools for the separation of species of microsystems analyzes which can easily be combined with electrochemical detection (ECD) and therefore making it ideal for a method of detection. However, the influence of high voltage at the working electrode used for the separation is a problem to be overcome due to the increased signal/noise ratio and possible damage of the electrode and/or the potentiostat. Thus, it was proposed in this thesis one EM hybrid PDMS / glass configuration with dual-channel potentiostat coupled to an electrically isolated in order to minimize the influence of high potential in the separation channel and improve the separation efficiency of the species and subsequently, improve detection limits. The EM contains two separate parallel channels 200 microns and a channel separation and another reference, and each containing a platinum electrode 15 or 50 μm placed about 1 to 4 μm in the channel. An electrode served as the working electrode, positioned in the separation channel, and another electrode as reference electrode, placed in the reference channel. This configuration associated with the electrically isolated potentiostat allowed the amperometric signals were measured without any change or potential interference arising from the high voltage applied separation. Aiming to evaluate the effectiveness of the methodology proposed in this thesis, samples nitrite, tyrosine and peroxynitrite (reactive nitrogen species – RNS), hydrogen peroxide (reactive oxygen species – ROS), ascorbic acid, glutathione and cysteine were injected into the channel containing the working electrode, while simultaneously boric acid buffer pH 11 containing TTAB was injected into the reference channel containing the reference electrode. From this configuration, we obtained a significant reduction in noise level (about 0.94 pA) and a relative improvement in the resolution ratified by electropherograms, compared with using single channel configuration. The limits of detection (LOD) for the chemical species mentioned above were 0.58 μM, 0.14 μM, 0.75 μM, 0.21 μM, 0.82 μM, was not obtained for cysteine and 1.63 μM, respectively. The efficiency can also be seen by analyzing nitrite performed on samples of perfusate blood of sheeps and rats, where have been detected a concentration of 68.05 μM and 22.04 μM, respectively, by the proposed method. It was also proposed in this thesis, microfabrication and evaluation of a PMMA electrophoretic microsystem with single channel configuration coupled to a base made of the same material to fix the microchip with electrochemical detection using a carbon paste electrode. The purpose of the construction of the base was to obtain, by fixing, reproducibility of events. And the microfabrication of PMMA EM aimed the viability of its use in analysis perspective as having the lowest cost per unit made due to the use of CO2 laser for microfabrication, which has a value considerably lower, compared with photolithographic processes. The evaluation of this system was performed through the analysis standards of serotonin and acetaminophen, which proved that the microfabrication of this system showed good reproducibility and repeatability of events, making it viable processing. / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Os microssistemas eletroforéticos (MSE) são ferramentas poderosas para a separação de espécies em microssistemas de análises, onde pode ser facilmente combinada com detecção eletroquímica (DEQ) e tornando-se, portanto, um método de detecção ideal. No entanto, a influência da alta tensão no eletrodo de trabalho utilizada para a separação é um problema a ser contornado devido o aumento da relação sinal/ruído e possíveis danificações do eletrodo e/ou do potenciostato. Assim, foi proposto nesta tese um MSE híbrido de PDMS/vidro com configuração de duplo-canal acoplado a um potenciostato eletricamente isolado com objetivo de minimizar a influência do elevado potencial no canal de separação e melhorar a eficiência de separação das espécies e, subsequentemente, melhorar os limites de detecção. O MSE contém dois canais paralelos separados 200 μm, sendo um canal de separação e outro de referência, e cada um deles contendo um eletrodo de platina de 15 ou 50 μm colocados cerca de 1 a 4 μm dentro do canal. Um eletrodo serviu como eletrodo de trabalho, posicionado no canal de separação, e o outro eletrodo como eletrodo de referência, posicionado no canal de referência. Essa configuração associado ao potenciostato eletricamente isolado permitiu que os sinais amperométricos fossem medidos sem qualquer mudança de potencial ou de interferência oriunda da alta tensão de separação aplicada. Objetivando avaliar a eficiência da metodologia proposta nessa tese, amostras de nitrito e peroxinitrito (espécies reativas de nitrogênio – ERN), tirosina, peróxido de hidrogênio (espécie reativa de oxigênio – ERO), ácido ascórbico, glutationa e cisteína foram injetadas no canal contendo o eletrodo de trabalho, enquanto que simultaneamente o tampão de ácido bórico contendo TTAB pH 11 foi injetado no canal de referência contendo o eletrodo de referência. A partir desta configuração, obteve-se uma significativa diminuição no nível de ruído (cerca de 0,94 pA) e uma relativa melhora na resolução ratificadas pelos eletroferogramas, se comparado com a configuração que utiliza canal único. Os limites de detecção (LOD) para as espécies químicas supracitados foram de 0,58 μM, 0,14 μM, 0,75 μM, 0,21 μM, 0,82 μM, não foi obtida para a cisteína, e 1,63 μM, respectivamente. A eficiência também pode ser vista através das análises de nitrito realizadas em amostras de perfusato de sangue de ovelhas e ratos, onde foram detectados uma concentração de 68,05 μM e 22,04 μM, respectivamente, através da metodologia proposta. Foi proposto também nessa tese, a microfabricação e avaliação de um microssistema eletroforético de PMMA com configuração de canal único acoplado a uma base feita do mesmo material para fixar o microchip, com detecção eletroquímica usando eletrodo de pasta de carbono. O objetivo da construção da base foi obter, através da fixação, reprodutibilidade de eventos. E a microfabricação do MSE de PMMA objetivou a viabilidade do seu uso em análises tendo como perspectiva o baixo custo por unidade confeccionada devido ao uso de laser de CO2 para a microfabricação, o qual possui um valor agregado consideravelmente menor, se comparado com os processos fotolitográficos. A avaliação desse sistema foi feita através das análises de padrões de serotonina e acetaminofeno, onde comprovou-se que a microfabricação desse sistema apresentou boa reprodutibilidade e repetitividade de eventos, tornando-se viável o seu processamento.

Dissulfeto isomerase proteica como a PDIA1 tem sido implicada na progressão do câncer, porém os mecanismos envolvidos ainda não foram claramente identificados. Previamente, nós demonstramos um importante efeito da PDIA1 induzindo a superexpressão da Nox1 NADPH oxidase, associada à geração de espécie reativas de oxigênio (ROS). Uma vez que a perda na regulação de ROS envolve o crescimento tumoral, nós propusemos que a PDIA1 atua como um mecanismo regulador proximal na produção de ROS em tumores. No presente estudo, nós focamos no câncer colorretal (CRC) com distintos efeitos na ativação de KRas. Resultados provenientes de bancos de dados de RNAsec e validação direta, indicam um significante aumento na expressão de PDIA1 em CRC com alta ativação constitutiva da Kras (HCT116) vs. ativação intermediária (HKE3) ou basal (Caco2). A PDIA1 sustenta a produção de superóxido dependente da Nox1 em CRC; entretanto, observamos pela primeira vez uma ação dupla da PDIA1 correlacionada ao nível de ativação da Ras: em células Caco2 e HKE3, experimentos de perda de função indicam que o PDIA1 sustenta a produção de superóxido dependente de Nox1; no entanto, em células HCT116, PDIA1 limita a produção de superóxido pela Nox1. Este comportamento da PDIA1 é associado ao aumento da expressão / atividade da Rac1. A transfecção do mutante constitutivamente ativo Rac1G12V em células HKE3 faz com que a PDIA1 se torne restritiva a produção de superóxido dependente de Nox1, paralelamente, em células HCT116 tratadas com inibidor da Rac1, PDIA1 se torna favorável à produção de superóxido. Um screening em importantes vias de sinalização celular em HKE3 mostrou que a perda de função da PDIA1 promove inativação da GSK3? em paralelo à diminuicão da ativacção de Stat3; em HCT116 em estado basal, GSK3beta é inativada enquanto Stat3 está ativa, já o silenciamento da PDIA1 não resulta em nenhum efeito adicional. As implicações funcionais do silenciamento da PDIA1 incluíram uma diminuição da proliferação e migração celular em HKE3, não detectável em HCT116. Além disso, a PDIA1 parece sustentar a transição epitélio-mesenquimal (EMT), uma vez que após o silenciamento da PDIA1, observamos um aumento da expressão da E-caderina em HKE3 e uma diminuição em HCT116. Assim, a superativação da Ras se associa a uma alteração no padrão de regulação da Nox1 pela PDIA1. A supressão do efeito regulador da PDIA1 pela Kras é provavelmente devido a uma ativação sustentada da Rac1. Portanto, PDIA1 pode exercer um papel redox-dependente adaptativo crucial relacionado à progressão tumoral / Protein disulfide isomerases such as PDIA1 have been implicated in cancer progression, but the underlying mechanisms are unclear. We showed previously important PDIA1 effects enabling vascular Nox1 NADPH oxidase expression and associated generation of reactive oxygen species (ROS). Since deregulated ROS production underlies tumor growth, we proposed that PDIA1 acts as an upstream regulatory mechanism of tumor-associated ROS production. We focused on colorectal cancer (CRC) with distinct levels of KRas activation. Our results from RNAseq databanks and direct validation indicate significant increase in PDIA1 expression in CRC with constitutive high (HCT116) vs. moderate (HKE3) or basal (e.g. Caco2) Ras activity. PDIA1 supported Nox1-dependent superoxide production in CRC; however, we observed for the first time a dual effect correlated with Ras level activity: in Caco2 and HKE3 cells, loss-of-function experiments indicate that PDIA1 sustains Nox1-dependent superoxide production; however, in HCT116 cells, PDIA1 restricted Nox1-dependent superoxide production. This PDIA1 behavior in HCT116 is associated with increased Rac1 expression/activity. Transfection of Rac1G12V active mutant into HKE3 cells induced PDIA1 to become restrictive of Nox1-dependent superoxide; accordingly, in HCT116 cells treated with Rac1 inhibitor, PDIA1 became supportive of superoxide production. Screening of cell signaling routes affected by PDIA1 silencing showed induced GSK3beta inactivation and parallel decrease of active Stat3 in HKE3 cells; in baseline HCT116 cells, GSK3beta was inactivated and Stat3 active, whereas PDIA1 silencing had no further effect. Functional implications of PDIA1 silencing included a decrease of cell proliferation and migration in HKE3, not detectable in HCT116 cells. Also, PDIA1 may support epithelial-mesenchymal transition (EMT), since after PDIA1 silencing, E-cadherin expression increased in HKE3 and decreased in HCT116. Thus, Ras overaction associates with a switched in PDIA1 pattern regulation of Nox1. Ras-induced PDIA1 bypass may involve direct Rac1 activation. Therefore, PDIA1 may be a crucial regulator of redox-dependent adaptive processes related to cancer progression

Made available in DSpace on 2017-07-10T18:08:15Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Diego Ricieri Manenti.pdf: 2926963 bytes, checksum: 74aa89bdde44c5ef6942846129864678 (MD5) Previous issue date: 2011-02-25 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The aim of this work was to study the performance of the photo-Fenton process using both the artificial UV and solar sources on the textile effluent treatments. Preliminary photo-Fenton experiments for mineralization and degradation of organic and inorganic pollutants as well as of synthetic dyes were carried out in order to assess the best experimental conditions by photo-Fenton process. As synthetic textile effluent a mixture of six dyes: Solophenyl orange TGL (C25H33ClN6O6S2), Solophenyl blue 71 (C40H23N7Na4O13S4), Solophenyl scarlet BNLE (C44H32N10Na4O16S4), Solophenyl yellow ARL (C48H26N8Na6O18S6), Solophenyl black FR (C44H32N13Na3O11S3) e Navy Blue 98 (C38H24N5Na3O13S3) that contained 50 mg L-1 concentration was prepared and diluted in distillated water. The photo-Fenton experiments by using a set of high-pressure mercury lamps and solar light as artificial and natural UV irradiation sources were performed in laboratory scale. As reactor operational parameters to be optimized by a 33 full factorial experimental design: hydrogen peroxide and divalent iron ion as well as the initial solution pH were chosen as variables, keeping constant a reaction time of 120 min that was enough to warrant the maximum (chemical oxygen demand) COD and color removal. The efficiency of photo-Fenton process applied in the treatment of synthetic and real effluents, was evaluated based on the parameters: values of COD, color, turbidity, total organic carbon (TOC), absorbance at a wavelength of maximum absorption for the dyes and simple aromatic compounds and conjugated reductions, as well as behavior analysis of the evolution the sulfate, nitrate inorganic, organic nitrogen and ammonia concentrations. Second-degree models for the COD and color removal percents were proposed to model the photo-Fenton experiments data in order to reduce the cost of running such a photo-Fenton experiment as well as to obtain optimum values of the reactor operating parameters. Second-degree models were also validated by ANOVA. Predicted yields showed good validation with experimental yields. The values of the optimized reactor operational parameters were 3.0, 6.0 g L-1, and 0.05 g L-1 for initial pH, hydrogen peroxide and divalent iron concentrations, respectively, for both photo-Fenton processes. Based on this optimized experimental conditions, almost 100% removals of physico-chemical parameter such as COD, color, turbidity and COT for real textile effluents. The aromatics compounds were showed more resistant to reaction, persisting for longer. It can be noticed that the degradtion of the organic and inorganic matters were verified by the nitrification process and, the sulfates formation and reduction. The process presented similar efficiencies with both solar and artificial irradiation, thus suggesting the use of solar photo-Fenton, as it proved to be an efficient alternative besides using a source of clean and renewable energy. / O objetivo deste trabalho é avaliar o desempenho do processo foto-Fenton, utilizando energia solar e artificial como fontes de irradiação UV, no tratamento de efluentes têxteis. Foram realizados experimentos preliminares para avaliar a eficiência do processo foto-Fenton na mineralização e degradação dos poluentes orgânicos e inorgânicos, bem como dos corantes sintéticos. Para tanto, foi preparado o efluente têxtil sintético pela mistura de seis corantes: Laranja TGL (C25H33ClN6O6S2), Azul FGLE (C40H23N7Na4O13S4), Escarlate BNLE (C44H32N10Na4O16S4), Amarelo ARLE (C48H26N8Na6O18S6), Preto FR (C44H32N13Na3O11S3) e Marinho BLE (C38H24N5Na3O13S3), em água destilada, com concentração de 50 mg L-1. Os experimentos foram realizados em reatores de escala laboratorial utilizando fontes de irradiação UV natural e artificial. Os parâmetros operacionais dos reatores: pH inicial e a concentração dos reagentes H2O2 e Fe2+, foram otimizados baseados nos valores da demanda química de oxigênio (DQO) e descoloração, a partir de um planejamento fatorial 33 completo com o tempo de irradiação constante em 120 minutos. A eficiência do processo foto-Fenton, aplicado no tratamento dos efluentes sintético e real, foi avaliada baseada nos parâmetros: redução dos valores da DQO, cor, turbidez, carbono orgânico total (COT), absorvância nos comprimentos de onda de máxima absorção relativos aos corantes e aos compostos aromáticos simples e conjugados, além da análise do comportamento da evolução das concentrações de sulfato, nitrato inorgânico, nitrogênio orgânico e amoniacal. Para auxiliar na obtenção das condições ótimas dos parâmetros operacionais do reator e redução dos custos do processo foto-Fenton, as respostas experimentais para a redução da DQO e da cor foram ajustados por um modelo previsto de segunda ordem, o qual apresentou uma boa modelagem dos dados, validado pela ANOVA. Os valores ótimos operacionais do reator, para ambos os processos foto-Fenton no tratamento do efluente real, foram: pH = 3,0, concentração de H2O2 = 6,0 g L-1 e concentração de Fe2+ = 0,05 g L-1. Nestas condições, foram obtidos valores próximos a 100% de redução dos parâmetros físico-químicos DQO, cor, turbidez e COT. Os compostos aromáticos se mostraram mais resistentes a reação, persistindo por mais tempo. A degradação da matéria orgânica e inorgânica foi verificada analisando a evolução do processo de nitrificação e a formação ou redução de sulfatos. Os processos apresentaram eficiências similares tanto com irradiação solar como artificial, desta forma, sugere-se a utilização do processo foto-Fenton solar, pois mostrou ser uma alternativa eficiente além de utilizar uma fonte de energia limpa e renovável.

Made available in DSpace on 2016-08-17T14:53:17Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Freud Sebastian Bach Carvalho Lima.pdf: 1668786 bytes, checksum: 953b0905b2e9bcd1cefb5702b8c6b362 (MD5) Previous issue date: 2011-07-29 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / In activated sludge systems, the dissolved oxygen is used by microorganisms to decompose organic matter and treatment of wastewater. In these systems the dynamics of dissolved oxygen has been seen as the main source of information to obtain online information about the treatment process. Thus, the development of an appropriate model for the dynamics of dissolved oxygen and estimation of the parameters of this model can improve the quality of the estimates of process parameters and, consequently, the measurement system. In this study, a model of the bench-scale reactor is developed considering the dynamics associated with the operation of the aeration system and the dissolved oxygen sensor. The aeration system consists of air pumps with two operating states: on or off, and dissolved oxygen measurement is made by electrochemical cell based on Clark. Approach was used identification systems in continuous time and state variable filters with the least squares estimator for estimating the parameters of the model developed. Simulations and experimental results, using a bench scale reactor developed in the laboratory, are presented to illustrate the proposed model. / Em sistemas de lodo ativado, o oxigênio dissolvido é utilizado por microorganismos para decomposição de matéria orgânica e tratamento de água residuárias. Nestes sistemas, a dinâmica de oxigênio dissolvido tem sido vista como a principal fonte de informação para obtenção de informações online sobre o processo de tratamento. Com isso, o desenvolvimento de um modelo apropriado para dinâmica do oxigênio dissolvido e a estimação dos parâmetros deste modelo, pode melhorar a qualidade das estimativas dos parâmetros do processo e, consequentemente, do sistema de medição. No presente trabalho, um modelo do reator em escala de bancada é desenvolvido considerando as dinâmicas relacionadas com a operação do sistema de aeração e com o sensor de oxigênio dissolvido. O sistema de aeração é composto por bombas de ar com dois estados de operação: ligada ou desligada, e a medição de oxigênio dissolvido é realizada por sensor eletroquímico baseado em célula de Clark. Usa-se abordagem de identificação de sistemas em tempo contínuo e filtros de variável de estado junto com o estimador dos mínimos quadrados para estimação dos parâmetros do modelo desenvolvido. Simulações e resultados experimentais, utilizando um reator em escala de bancada desenvolvido no laboratório, são apresentados para ilustrar o modelo proposto.

β2-glicoproteína I (β2GPI) é encontrada (200µg/mL) no plasma, 60% livre e 40% em lipoproteínas. Esta proteína de fase aguda, com afinidade por superfícies negativas pode ser clivada pela plasmina. Fragmentos são purificados como dímeros ou multímeros de β2GPI. Formas monomérica e dimérica de β2GPI foram purificadas de soro humano e identificadas por SDS-PAGE, imunoblot e ELISA Somente a forma monomérica foi detectada no teste ELISA Os efeitos de ambas as formas sobre o burst respiratório de polimorfonucleares humanos (PMN), estimulados in vitro com zymosan opsonizado, foram estudados por quimioluminescência amplificada por luminol ou lucigenina e citometria de fluxo, pela oxidação do OCFH. A forma monomérica inibiu a quimioluminescência amplificada por luminol (-43.6 x -7.33 AEU/s), mas não por lucigenina, e aumentou a oxidação de DCFH e a produção de Óxido Nítrico (•NO). É provável que o •No, via peroxinitrito, medeie os efeitos de β2GPI sobre o burst respiratório de PMN. / Circulating blood contains approximately 200µg/mL of β 2-glycoprotein I (β2GPI), either free (60%) or lipoprotein bound (40%). This acute phase protein, with affinity for negative surfaces, can be cleaved by plasmin. Fragments purify as dimeric or multimeric (β2GPI. Both (β2GPI forms were purified from human sera and identified by SDS-PAGE, immunoblotting and ELISA. ELISA reactivity was dependent on the monomeric status of (β2GPI. The effects of dimeric and monomeric (β2GPI upon respiratory burst of human polimorphonuclear neutrophils (PMN) stimulated in vitro with opsonized zymosan were studied. Respiratory burst was evaluated by luminol- or lucigenin-amplified chemiluminescence, or by DCFH oxidation (flow-cytometry assay). The monomeric, but not the dimeric form, inhibited the luminol chemiluminescence of zymosan-stimulated PMNs (-43.6 x -7.33 AEU/s). Lucigenin chemiluminescence was insensitive to (β2-GPI. Monomeric (β2GPI increases both DCFH oxidation and nitric oxide production. Nitric oxide, probably through peroxynitrite reactions, mediates (β2GPI effects upon PMNs respiratory burst.

Para otimizar um modelo experimental para o estudo do desbalanço redox em porfirias relacionadas ao acúmulo de ácido 5-aminolevulínico-(ALA), via inibição da ALA desidratase-(ALA-D), ratos foram tratados com o éster metílico de succinilacetona-(SAME), um catabólito da tirosina que inibe fortemente a ALA-O, mimetízando o estado metabólico observado nos portadores de portirias e tirosinemias. Estabeleceram-se modelos de tratamento agudo por 36 e 18 h. No primeiro, os animais receberam 3 injeções de SAME (10, 40 ou 80 mg/kg, grupos Ali-IV). No segundo, os animais receberam 3 injeções de 40 mg/kg de SAME, ALA ou éster metílico de ALA (grupos BII-IV), ALA:SAME (30: 10 mg/kg, grupo BV), ou 10 mg/kg SAME (grupo BVI). Paralelamente, avaliou-se se os sintomas neurológicos característicos das portirias decorriam de danos oxidativos mitocondriais. Para isso, aplicou-se uma tecnologia óptica para medidas da difusão da depressão cortical que determinou a oxigenação e o estado redox do cit c em mitocôndrias do córtex cerebral de ratos submetidos ao tratamento crônico com ALA (40 mg/kg), SAME (10 e 40 mg/kg) e ALA:SAME (30: 1O mg/kg), a cada 48 h, durante 30 dias. Tratamento agudo/36 h: Os níveis de ALA no plasma, fígado, cérebro e urina e o clearance renal do ALA aumentaram nos grupos tratados. A atividade de ALA-D e a coproporfirina urinária reduziram. A marcação para proteínas carboniladas, ferro e ferritina aumentou no fígado e cérebro dos grupos tratados, especialmente no All. Os níveis de malondialdeído hepático aumentaram no grupo AIV. A razão GSH/GSH+GSSG e a atividade de GPx cerebrais aumentaram nos grupos AIV e AIII, respectivamente. Consistentemente com estes dados indicando um desbalanço oxidativo induzido pelo SAME, alterações mitocondriais e citosólicas ultraestruturais foram reveladas, especialmente no fígado. Tratamento agudo/18 h: Os níveis de ALA plasmáticos aumentaram nos grupos tratados, exceto em BIV. O grupo BII mostrou aumento dos níveis hepáticos de ALA. Interessantemente, a inibição da atividade de ALA-D não foi evidenciada. O conteúdo de ferro plasmático aumentou no grupo BII. Para os grupos tratados com 10 e 40 mg SAME/kg, a atividade de SOD hepática reduziu ~50% com a extensão do tratamento de 18 para 36 h, sugerindo que este último é mais efetivo em promover danos oxidativos induzidos pelo ALA. Tratamento crônico/30 dias: Embora nenhuma alteração tenha sido evidenciada no estado redox dos animais tratados, o tratamento com ALA reduziu o fluxo sanguíneo cerebral (CBF) e o consumo de oxigênio-(CMRO2), sugerindo uma vasoconstrição mediada pelo ALA, efeito este confirmado por ensaios de reatividade vascular conduzidos em anéis de aorta de ratos incubados com ALA. O tratamento com ALA:SAME restaurou os níveis de CBF e CMRO2. Interessantemente, a disponibilidade do radical superóxido-(O2•-) estava reduzida nos anéis de aorta incubados com ALA. Juntos, estes dados: a)validam o modelo de tratamento agudo/36 h para o estudo bioquímico e dos possíveis efeitos fisiológicos induzidos pelo ALA, e b)sugerem que as alterações mediadas pelo ALA exógeno levam à vasoconstrição. / To optimize an experimental model for studying redox imbalance in porphyrias related to 5-aminolevulinic acid (ALA) accumulation through the inhibition of ALA dehydratase (ALA-D), rats were treated with methyl ester of succinylacetone (SAME), a tyrosine catabolite that strongly inhibits ALA-D, what mimics the metabolic state observed in patients suffering from porphyrías and tyrosinemias. Models of acute treatment were established during 36 and 18 h. In the first model, animals received 3 injections of SAME (10, 40 or 80 mg/kg, groups Ali-IV). In the second model, animals received 3 injections of 40 mg/kg SAME, ALA or methyl ester of ALA (groups BII-IV), ALA:SAME (30:10 mg/kg, group BV), or 10 mg/kg SAME (group BVI). Concomitantly, we evaluated if the neurologic symptoms characteristics of porphyrias were a consequence of the oxidative mitochondrial impairment. For this, an optical technology for the measurement of cortical spreading depression was applied. This techonology determined the cerebral oxygenation and the redox state of cit c in mitochondria of the cerebral cortex of rats submitted to a chronic treatment with ALA (40 mg/kg), SAME (10 and 40 mg/kg) and ALASAME (30:10 mg/kg), alternate days, during 30 days. Acute treatment/36 h: ALA levels in plasma, liver and urine and clearance of renal ALA increased in treated groups. ALA-D activities and urinary coproporphyrin were found to be decreased. Liver and brain proteins carbonyl, iron and ferritin were higher in the liver of treated groups, especially in All. Liver malondialdehyde levels were higher in group AIV. Cerebral GSH/GSH+GSSG ratio and GPx activities increased in groups AIV and AIII, respectively. Consistently with these data indicating SAME-induced oxidative imbalance, mitochondrial and cytosolic ultrastructural changes were revealed, especially in the liver. Acute treatment/18 h: Plasma ALA levels increased in all treated groups but BIV. Group BII showed increased hepatic ALA levels. Interestingly, inhibition in ALA-D activities was not evidenced. Plasma iron content increased in group BII. For the groups treated with 10 and 40 mg SAME/kg, liver SOD activities reduced ~50% by extending the treatment from 18 to 36 h, suggesting that the latter is more effective in ALA-induced oxidative damage. Chronic treatment /30 days: Despite no changes in the redox state of treated animals were observed, the treatment with ALA reduced the cerebral blood flow (CBF) and the consumption of oxygen (CMRO2), suggesting a vasoconstriction mediated by ALA. This effetc was confirmed by vascular reactivity assay performed in aortic rings of rats incubated with ALA. The treatment with ALA:SAME recovered the CBF and CMRO2 levels. Interestingly, the availability of superoxide radical (O2•-) was reduced in the aortic rings incubated with ALA. Altogether, these data a) validate the model of acute treatment/36 h for studying biochemical and possibly physiological effects induced by ALA, and b)suggest that the changes mediated by exogenous ALA lead to vasoconstriction.

Submitted by Nadir Basilio (nadirsb@uninove.br) on 2015-07-20T18:01:54Z No. of bitstreams: 1 Suely Tomimura.pdf: 1781054 bytes, checksum: acaac7dbd088721fbe65530e5cd96c5f (MD5) / Made available in DSpace on 2015-07-20T18:01:54Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Suely Tomimura.pdf: 1781054 bytes, checksum: acaac7dbd088721fbe65530e5cd96c5f (MD5) Previous issue date: 2013-12-17 / Due to the increasing numbers of Systemic Arterial Hypertension (HBP) patients in population and its senescence, steadily increased from 600 million in 1980 to 1.2 billion in 2008. The World Health Organization (WHO) in 2009 attributed to high blood pressure (BP) was the death cause for 9.5 million people worldwide. Currently, the hypertension has become a serious public health problem. This entity is an important risk factor for congestive heart failure, cerebrovascular disease, acute myocardial infarction, nephropathy, retinopathy and peripheral vascular insufficiency. Studies have suggested that laser photobiomulation, employing a low power, acts into the inflammatory and proliferative phases of tissue repair, by modulating the inflammatory mediators synthesis as same as the Reactive Oxygen Species (ROS). According scientific publications indicate that the inflammation component is closely related to systemic arterial hypertension as well as possibly to the oxidative stress, both participates in the Hypertension genesis. The aim of this study was to verify the long-term effects of Low Level Laser Therapy (LLLT) application in Spontaneously Hypertensive Rats-SHR (Spontaneously Hypertensive Rats) through on cardiovascular autonomic modulation and oxidative stress in the blood. The experiment consisted in 3 phases: Phase I – LLLT irradiation on SHR: The experiment's phase I consisted of animal’s irradiation, when the laser group received three times LLLT applications weekly for a 7 weeks total; the sham group received three times per week of LLLT simulation for 7 weeks and a total of 21 applications. Prospective, randomized, controlled study, with 16 SHR approximately 2 months age, randomly divided into 2 groups : Sham (n = 8) and Laser (n = 8). The animals were irradiated in a prompt, onto the tail’s dorsal area, using a Diode Laser (MMOptics, São Carlos, SP, Brazil) with a wavelength (λ) of 780 ± 2 (nm), output power at 40 mW, with a 0.04 cm2 beam area, dose of 30 J/cm2 power density of 1W/cm2 and irradiation time of 90 s. In Phase II - Hemodynamic and autonomic cardiovascular evaluation: for a period of 7 weeks, consisted in the cannulation procedure, collecting and analysis. The animals were cannulated, evaluated hemodynamically and analyzed the cardiovascular autonomic modulation. Phase III - Oxidative stress analysis, were analyzed: a) protein damage; b) cell membrane damage; c) antioxidant enzyme activity; d) nitrite concentrations. Data from phase II and III were collected and statistically analyzed applying One Way ANOVA test, followed by post hoc Student - Newman Keulls and considering the significance level of p < 0.05, equivalent to an error α 0.05. The results demonstraded hemodynamic parameters of group LLLT treated showed a BP reduction, when compared with the Sham group. In laser group the diastolic arterial pressure (DAP) showed a reduction of -14 mmHg (± 143 * 4 x 157 ± 3 mmHg Sham) and mean arterial pressure (MAP) - 13mmHg (169 ± 4 * x 182 ± 4 mmHg Sham) there were statistically significant difference. Although the value of systolic arterial pressure (SAP) (196 ± 5 x 207 ± 4 mmHg) showed no differences. There was a decreased in resting HR with a statistically significant difference in the laser group compared to Sham (312 ± 14 vs. 361 ± 13 bpm sham). The spectral reviews in the field of time and frequency showed that the Laser group decreased sympathetic activity on the heart and blood vessels while compared to the Sham group. The heart rate variation was analyzed using the DP-PI ( standard deviation of the pulse interval) VAR-PI components (pulse interval variability) and it demonstrated that LLLT was effective in diminishing variation in heart rate (HR) and sympathetic activity in heart, inducing a substantial fall in blood pressure. Lasertherapy presented a rise in spectral low-frequency component in the pulse interval (LF - IP action of the sympathetic at heart), though the sham group showed up exaggeratedly decreasing (6.77 ± 4:35 and 2:31 ± 0:16 ms ² Sham) as a function of saturation variation. Thus, there was a significant reduction in sympathetic activity after LLLT using. A high-frequency band on interval pulse HF-IP (parasympathetic activity) showed no statistically significant differences between the groups and Laser Sham group. The baroreceptor sensitivity, assessed by the alpha index, signalized a significant increase in the Laser (1:07 ± 0:23 vs. 0:45 ± 0:20 ms / mmHg Sham) group, presenting an improvement in the receptors sensitivity. The baroreflex results were associated with other relevant data, the VAR - SAP (49.55 ± 15.94 * vs 70.51 ± 13:55 mmHg² Sham) and SD -SAP (6.94 ± 1.21 * vs 8.68 ± 1.11 mmHg Sham) that proved to be diminished in the laser group, indicating baroreflex improvement sensitivity concomitantly to the positive SAP variation reduction of. There were no significant differences in baseline SAP (196 ± 5 vs. 207 ± 4 mmHg Sham) between the two groups. The results in the oxidative stress and autonomic analysis demonstrated an association between increased NO production (nitrite 0:36 ± 0:03 vs 0:26 ± 0:03 nm / mg Sham) and decreased in the vascular sympathetic (LF - SAP 7.28 ± 1.63 * vs 9.86 ± 0.47 Sham), both leading to a profound vasodilatation then a significant fall in of blood pressure. Lasertherapy shown to alter the plasma parameters such as oxidative nitrite, revealing an NO increased metabolism, as described above and, moreover, accounted for a significant reduction in carbonyl plasma concentration (vs 3.93 ± 0.24, 4.75 ± 0:26 * nm / mg Sham). Our experimental study indicate that LLLT was able to reduce the oxidative stress parameters through diminishing the damage to the proteins. The enzymatic defense was analyzed by the enzyme SOD concentration in blood plasma, denoted that no significant differences (4:42 ± 0:10 4:25 ± 0:06 vs usod / mg) between groups. Thus, low level laser therapy has shown to improve cardiovascular autonomic activity as well as oxidative parameters which resulted in steadily staggeringly reduce the blood pressure of hypertensive animals. / Em razão do aumento populacional e a senescência, o número de indivíduos com Hipertensão Arterial Sistêmica (HAS) cresceu de 600 milhões em 1980 para 1,2 bilhões (OMS 2011). Lim (2012) atribuiu que a pressão arterial (PA) elevada fosse a causa mortis de 9,5 milhões de indivíduos ao redor do mundo. Atualmente, a HAS tornou-se um grave problema de saúde pública. A hipertensão é um importante fator de risco para insuficiência cardíaca congestiva, doenças cerebrovasculares, infarto agudo do miocárdio, nefropatia, insuficiência vascular periférica e retinopatia hipertensiva. Considerando publicações científicas que demonstram que o componente da inflamação e do estresse oxidativo estão intimamente relacionados à gênese da hipertensão arterial sistêmica (HAS), e que o laser com potência baixa tem efeito positivo no estresse oxidativo e apresenta ação antiinflamatória eficaz, desta forma buscamos estudar a resposta da Laserterapia na HAS. Inúmeros estudos vêm sugerindo, ao longo de décadas, que a fotobiomulação pelo laser empregado uma potência baixa, atua durante as fases inflamatórias e proliferativas da reparação tissular, modulando síntese de mediadores inflamatórios e espécies reativas de oxigênio (ROS). O objetivo deste estudo foi analisar os efeitos da aplicação do laser de baixa intensidade em ratos espontaneamente hipertensos SHR (Spontaneously Hypertensive Rats) em longo prazo na modulação autonômica cardiovascular e no estresse oxidativo sangúineo. Estudo prospectivo, randomizado e controlado com 16 ratos SHR, divididos aleatoriamente em 2 grupos: Sham (n=8) e Laser (n=8).O experimento foi dividido em três fases: Fase I – Irradiação dos animais: constituiu-se na irradiação com laser nos animais SHR, onde o grupo Laser recebeu três aplicações semanais de LBI durante sete semanas; já no grupo Sham foram realizados três simulações de aplicação semanais de Laser de Baixa Intensidade (LBI) durante 7 semanas, totalizando 21 aplicações de LBI. Os animais foram irradiados pontualmente, na região dorsal da cauda, utilizando um Laser Diodo (MMOptics, São Carlos, SP, Brasil) com comprimento de onda de λ = 780 ± 2 (nm); potência de 40 mW, área do feixe de 0,04 cm2, densidade de energia de 30 J/cm2, densidade de potência de 1W/cm2, tempo total de irradiação de 90 s de exposição. Fase II – Avaliação hemodinâmica e autonômica cardiovascular: constituiu-se nos procedimento de canulação, registro de dados e coleta de material, teve inicio após sete semanas de irradiação. Os animais canulados foram avalidados de forma hemodinâmica, bem como analisada a modulação autonômica cardiovascular. Fase III – Análises do estresse oxidativo, foram analisadas: a) danos à proteína; b) danos à membrana celular; c) atividade enzimática; d) concentração de nitrito. Os dados da fase II e III foram coletados e analisados estatisticamente através dos testes Anova One Way, seguido de Post Hoc de Student Newman-Keulls, considerando-se o nível de significância p < 0,05, equivalendo a um erro α de 0.05. Os resultados hemodinâmicos do grupo tratado com LLLT denotaram um decréscimo significativo da PA quando comparado com o grupo Sham. A pressão arterial diastólica (PAD) do grupo Laser revelou uma redução de -14 mmHg (143± 4*vs157±3 mmHg Sham) e a pressão arterial média (PAM) -13mmHg (169±4*vs182±4 mmHg Sham), a frequência cardíaca (FC) em repouso (312±14*vs361±13 bpm Sham) revelando uma diferença estatisticamente significante, porém o valor da pressão arterial sistólica(PAS) não mostrou (196±5 x 207±4 mmHg) alterações entre os grupos. As avaliações espectrais no domínio do tempo e da frequencia demostraram que o grupo Laser reduziu a atividade simpática sobre o coração e vasos sanguíneos quando comparados ao grupo Sham. A variação frequência cardíaca foi analisada através dos componentes VAR-IP (variabilidade do intervalo de pulso) e o DP-IP (desvio do intervalo de pulso) que evidenciaram que o LBI foi eficaz no decréscimo variação da FC e da atividade simpática no coração, induzindo assim a queda das pressões arteriais. A laserterapia mostrou um incremento no componente espectral baixa frequência no intervalo de pulso (BF-IP ação do simpático no coração), porém o grupo Sham apresentou-se exacerbadamente diminuído (6.77 ± 4.35 e 2.31±0.16 ms² Sham) em função da saturação da variação desse componente que foi reduzido. Desta forma, houve um importante decréscimo da atividade simpática com o uso do LBI, significando uma importante diminuição dos níveis pressóricos. A banda de alta frequência (AF-IP atividade parassimpática cardíaca) não mostrou diferenças estatísticas significantes entre os grupos Laser e grupo Sham. A sensibilidade dos barorreceptores, avaliada pelo índice alfa, demonstrou um significativo incremento da resposta no grupo Laser (1.07 ± 0.23 vs 0.45 ± 0.20 ms/mmHg Sham), revelando uma melhora na sensibilidade destes receptores. Os resultados dos barorreflexos encontravam-se associados a outro dado relevante, o componente VAR-PAS (49.55 ± 15.94* vs 70.51 ± 13.55 mmHg² Sham) e DP-PAS (6.94 ± 1.21* vs 8.68 ± 1.11 mmHg Sham) que mostrou-se diminuído no grupo Laser, indicando que a melhora da sensibilidade barorreflexa ocorreu, concomitantemente, à redução positiva da variação da PAS. Não houve diferenças estatísticas significantes na PAS basal (196±5 vs 207 ± 4 mmHg Sham) entre os dois grupos. Já os resultados encontrados na análise do estresse oxidativo e autonômica demonstraram uma associação entre o incremento da produção do óxido nitrico (NO) (nitrito 0.36 ± 0.03 vs 0.26 ± 0.03 nm/mg Sham) e redução do simpático vascular (BF-PAS 7.28 ± 1.63* vs 9.86 ± 0.47 Sham), ambos levando a uma vasodilatação com consequente queda dos níveis pressóricos arteriais. A laserterapia mostrou alterar parâmetros oxidativos como as espécies reativas de nitrogênio (RNS reactive nitrogen species), o nitrito plasmático, revelando um aumento do metabolismo do NO, como já descrito anteriormente e denotou uma diminuição significativa da concentração de carbonilas plasmáticas (3.93 ± 0.24 * vs 4.75 ± 0.26 nm/mg Sham). A defesa enzimática foi analisada através da concentração da enzima SOD no plasma sanguíneo, que não apontou diferenças significativas (4.42 ± 0.10 vs 4.25 ± 0.06 usod/mg) entre os grupos. Evidenciamos que o LBI foi capaz de reduzir este parâmetro oxidativo, reduzindo os danos às proteínas decorrente do estresse. Desta forma, concluímos que a laserterapia demonstrou resposta positiva ao melhorar a atividade autonômica cardiovascular e parâmetros oxidativos que resultaram na redução dos níveis pressóricos dos animais hipertensos.

O remodelamento vascular é um determinante fundamental do lúmen em doenças vasculares, porém os mecanismos envolvidos não estão completamente elucidados. Nós investigamos o papel da chaperona redox residente do retículo endoplasmático Dissulfeto Isomerase Proteica (PDI) e sua fração localizada na superfície celular (peri/epicelular=pecPDI) no calibre e arquitetura vascular durante reparação à lesão. Em artérias ilíacas de coelho submetidas à lesão in vivo, houve importante aumento do mRNA e expressão proteica (~25x aumento 14 dias pós-lesão vs. controle) da PDI. O silenciamento da PDI por siRNA (cultura de órgãos) acentuou o estresse do retículo e apoptose, diferentemente da inibição da pecPDI com anticorpo neutralizante (PDI Ab). Bloqueio in vivo da pecPDI por aplicação de gel perivascular contendo PDI Ab no 12° dia após lesão, com análise após 48 h, promoveu ca.25% redução no calibre vascular analisado por arteriografia e diminuição similar na área total do vaso detectada por tomografia de coerência óptica. Neste processo, não ocorreu alteração no tamanho da neoíntima, indicando assim, que PDI Ab acentuou remodelamento constrictivo. Neutralização da pecPDI promoveu importantes alterações na arquitetura da matriz de colágeno e citoesqueleto, resultando em fibras com orientação invertida e desorganizadas. Diminuição na produção de espécies reativas de oxigênio e óxidos de nitrogênio também ocorreu. Análise de propriedades viscoelásticas nas artérias indicou redução na ductilidade vascular, evidenciada pela menor distância para ruptura. As alterações subcelulares no citoesqueleto observadas in vivo após PDI Ab foram recapituladas em um modelo de estiramento cíclico em células musculares lisas vasculares, com importante redução na formação das fibras de estresse. Em modelo de migração randômica de células musculares lisas, a exposição a PDI Ab reduziu a resiliência de regulação da polaridade. Embora a neutralização da pecPDI não tenha afetado a atividade global de RhoA, ela promoveu alterações no padrão de marcação em resposta ao estiramento, na redistribuição de RhoA na superfície celular e na associação com regiões contendo caveolina. Além disso, em aterosclerose nativa em humanos, a expressão da PDI correlacionou-se inversamente com remodelamento constrictivo. Dessa forma, PDI é fortemente expressa após a lesão e sua fração peri/epicelular remodela a arquitetura da matriz e citoesqueleto, promovendo um efeito anti-remodelamento constrictivo / Whole-vessel remodeling is a critical lumen caliber determinant in vascular disease, but underlying mechanisms are poorly understood. We investigated the role of endoplasmic reticulum chaperone Protein Disulfide Isomerase(PDI) and cell-surface PDI(peri/epicellular=pecPDI) pool in vascular caliber and architecture during vascular repair after injury(AI). After rabbit iliac artery balloon injury, there was marked increase in PDI mRNA and protein (25-fold vs. basal at day 14AI), with increase in both intracellular and pecPDI. Silencing PDI by siRNA (organ culture) induced ER stress augmentation and apoptosis, contrarily to pecPDI neutralization with PDI-antibody(PDI Ab). PecPDI neutralization in vivo with PDIAb-containing perivascular gel from days 12-14AI promoted ca.25% decrease in vascular caliber at arteriography and similar decreases in total vessel circumference at optical coherence tomography, without changing neointima, indicating increased constrictive remodeling. PecPDI neutralization promoted marked changes in collagen and cytoskeleton architecture, with inverted fiber orientation and disorganization. Decreased ROS and nitrogen oxide production also occurred. Viscoelastic artery properties assessment showed decreased ductility, evidenced by decreased distance to rupture. Subcellular cytoskeletal disruption by PDI Ab was recapitulated in vascular smooth muscle cell stretch model, with marked decrease in stress fiber buildup. Also, PDI Ab incubation promoted decreased regulation resilience of vascular smooth muscle migration properties. While pecPDI neutralization did not affect global RhoA activity, there was altered RhoA redistribution to the cell surface and association with caveolin-containing clusters, which mislocalized after stretch. In human coronary atheromas, PDI expression inversely correlated with constrictive remodeling. Thus, strongly-expressed PDI after injury reshapes matrix and cytoskeleton architecture to support an anticonstrictive remodeling effect

A migração de células musculares lisas (VSMC) da camada média do vaso para a íntima é essencial para vasculogênese e contribui para o processo de aterosclerose e estenose após lesão por cateter-balão, caracterizando-se como um importante alvo terapêutico. Diversos trabalhos já demonstraram que fatores de crescimento (como PDGF e FGF) estimulam a migração de VSMC, inclusive, muitos desses fatores de crescimento induzem sinalização redox associadas à geração de espécies reativas de oxigênio (ROS) (ex. Nox1 NADPH oxidase). Nosso grupo já descreveu interações físicas e regulação funcional da NADPH oxidase por uma chaperona redox do retículo endoplasmático, a Dissulfeto Isomerase Protéica (PDI). Contudo, tanto a relevância fisiológica como os mecanismos desta interação ainda não estão claros. O objetivo geral do presente trabalho é investigar por meio de experimentos de perda e ganho de função da PDI, a importância da PDI na migração celular associada à ativação do complexo NADPH oxidase, bem como possíveis mecanismos envolvidos na interação entre a PDI e esse complexo enzimático durante a migração celular. Os objetivos específicos são: i) avaliar o efeito do silenciamento da PDI, bem como da expressão forçada de PDI wild type na migração de VSMC in vitro; ii) analisar o efeito da transfecção de siRNA da PDI atividade e expressão de distintas isoformas da NADPH oxidase vascular e produção de ROS induzida por PDGF; iii) investigar o envolvimento de RhoGTPases na regulação do complexo NADPH oxidase pela PDI. No presente trabalho, mostramos que o PDGF induz redistribuição da PDI e aumento da produção de ROS. O silenciamento da PDI inibe a produção de ROS e a expressão do mRNA da Nox1, sem alterar a expressão do mRNA da Nox4. Mais ainda, o silenciamento da PDI reduz a migração celular induzida por PDGF, em diferentes modelos de migração, enquanto a super-expressão da PDI induz aumento espontâneo da migração na condição basal. Análise utilizando métodos de Biologia de Sistemas de redes de interação física proteína-proteína em bancos de dados e técnicas de análise de centralidade, topologia e ontologia gênica indicou forte convergência entre PDI e proteínas da família das pequenas RhoGTPases e seus reguladores. Em VSMC com silenciamento da PDI, a presença do PDGF induziu uma redução na atividade de Rac1 e RhoA, sem alterar a expressão total destas proteínas. Estudos mostraram que a PDI colocaliza com Rac1 na região perinuclear e co-imunoprecipita com Rac1 e RhoA, tanto na presença como na ausência de PDGF. Além disso, ocorreu a interação entre PDI e o regulador de GTPases RhoGDI (inibidor da dissociação da guanina) na condição basal (por microscopia confocal e co-imunoprecipitação), diminuída após estimulo com PDGF. O silenciamento da PDI induziu ainda alterações em estrutura de citoesqueleto: desorganização das fibras de estresse, e redução no número e tamanho de adesões focais e vesículas de adesão marcadas por RhoGDI e Rac1. Assim, os dados apresentados no presente trabalho sugerem que a PDI sustenta a migração de VSMC dependente de sinalização redox e RhoGTPases. Além disso, RhoGTPases podem ser um alvo proximal importante mediando a convergência entre PDI e o complexo NADPH oxidase / Vascular Smooth Muscle Cell (VSMC) migration into vessel neointima is a therapeutic target for atherosclerosis and post-injury restenosis. NADPH oxidase-derived oxidants synergize with growth factors to support VSMC migration. We described interaction between NADPH oxidases and the endoplasmic reticulum redox chaperone Protein Disulfide Isomerase (PDI) in many cell types. However, physiological implications as well as mechanisms of such association are yet unclear. The aim of the present work was to investigate, througth experiments of gain or loss of PDI function, the importance of PDI in VSMC migration associated to NADPH oxidase. The specific aims were: i) to evaluate effects of PDI silencing or PDI overexpression in VSMC migration in vitro; ii) to evaluate effects of PDI silencing on PDGF-induced NADPH oxidase isoform expression and ROS production; iii) to evaluate the involvement of RhoGTPases on NADPH oxidase regulation by PDI. We show here that PDGF promoted subcellular redistribution of PDI concomitant to ROS production and that siRNA-mediated PDI silencing inhibited such ROS production, while near-totally suppressing the increase in Nox1 expression, with no change in Nox4. Furthermore, PDI silencing inhibited PDGF-induced VSMC migration assessed by distinct methods, while PDI overexpression increased spontaneous basal VSMC migration. To address possible mechanisms of PDI effects, we searched for PDI interactome by PPPI networks, which indicated convergence with small GTPases and their regulator RhoGDI. PDI silencing decreased PDGF-induced Rac1 and RhoA activities, without change in their expression. PDI displayed small detectable points of perinuclear co-localization with Rac1 and co-immunoprecipitated with Rac1 and RhoA in a PDGF-independent way. Moreover, there was PDI association with RhoGDI at baseline (confocal and co-immunoprecipitation), decreased after PDGF. Of note, PDI silencing promoted strong cytoskeletal changes: branched stress fiber disorganization, markedly decreased number of focal adhesions and reduced number of RhoGDI-containing vesicular recycling adhesion structures. Overall, these data suggest that PDI is required to support redox and GTPase-dependent VSMC migration. Moreover, RhoGTPases are a potential upstream target mediating the convergence between PDI and NADPH oxidase