Memoria para optar al Título Profesional de Químico Farmacéutico / Los fibroblastos cardíacos (FC), han sido denominados células centinelas del corazón, pues responden de manera variada y compleja ante cualquier elemento externo o interno a fin de mantener la homeostasis. Esta respuesta se lleva a cabo mediante una maquinaria conformada por una amplia red de receptores, entre ellos los receptores tipotoll y, en particular, el TLR4. La activación de este receptor ha mostrado mediar respuestas inflamatorias y fibróticas tanto en FC, como en otras células; en donde la expresión de proteínas de adhesión y reclutamiento de células del sistema inmune componen un eje vital en estos procesos. Por tanto se buscó determinar si la activación de TLR4 en el FC de ratas adultas genera una mayor adhesión de monocitos a través de un aumento en los niveles de E-selectina. La activación de TLR4 por LPS en FC, indujo un aumento en la expresión de Eselectina, situación que es revertida con el pre tratamiento con TAK-242 (inhibidor de TLR4). Adicionalmente, la activación de TLR4 generó un aumento en la adhesión de monocitos sobre los FC, mientras que la inhibición de TLR4 y las vías transduccionales ERK1/2, PI3K/Akt y NF-κB previo al estímulo con LPS, revirtió el aumento de adhesión de monocitos. De igual forma, el bloqueo de E-selectina, mediante el uso de un anticuerpo bloqueante, también revirtió el aumento de la adhesión, dando luces de que esta proteína de adhesión es fundamental para el reclutamiento de monocitos y por tanto para mediar la respuesta inflamatoria orquestada por el FC / Cardiac fibroblasts (CF) have been considered as sentinel cells, since they respond in a complex and diverse manner to external and internal stimulus, in orden to maintein homeostasis of the heart. This is mediated through a wide number of receptor, among then Toll-Like receptors, an particulary TLR4, play a critical role in cardiac inflammation. TLR4 activation has been involved in the regulation of inflammatory and fibrotic response both in CF and other cells; adhesion molecules and recruiment of immune cells are key elements of these process. Therefore we sought to evaluate whether TLR4 activation in CF obteined from adults rats increased monocyte adhesion trough increased levels of E-selectin. TLR4 activation by LPS in CF, induce increased in E-selectin expression, which was abolished when CF were pre treatment with TAK-242 (TLR4 inhibitor). In adittion, TLR4 activation increased monocyte adhesion to CF, whereas the inhibition of this receptor and releated signaling pathway ERK1/2, PI3K/Akt and NF-κB, previous LPS exposure reverse monocyte adhesion. Similarly, E-selectin blockade, by the use of blocking antibody, also blocked monocyte adhesion, which a yeast the importance of this adhesion molecule in monocyte recruitment and inflammatory response orchestrated by CF

Memoria para optar al título de Químico Farmacéutico / El daño ocasionado por la ocurrencia de un infarto cardiaco es complejo, generando la pérdida de viabilidad de las células cardiacas entre otros efectos deletéreos ocurridos tanto en el periodo isquémico de falta de oxígeno y nutrientes, así como también en la posterior reperfusión sanguínea. Frente a esta condición patológica los fibroblastos cardiacos (FC) son capaces de reaccionar, secretando y renovando la matriz extracelular; lo que los convierte en elementos celulares claves en la cicatrización y remodelamiento del tejido cardiaco dañado post-infarto al miocardio. Esto hace necesario el intentar regular la viabilidad de estas células para una correcta cicatrización y mantención de la función cardiaca. En relación a esto se ha reportado el efecto cardioprotector ejercido por el empleo de LPS en condiciones de daño celular causado por isquemia/reperfusión (I/R). Sin embargo, dicho efecto ha sido descrito principalmente en cardiomiocitos, por lo que su efecto en FC es aún desconocido. Nuestro trabajo estudió la capacidad cito-protectora ejercida por LPS sobre FC de ratas neonatas sometidos a un modelo de I/R in vitro e indagó las vías transduccionales implicadas en este efecto. El tratamiento de los FC con LPS (1 μg/mL) durante la isquemia y reperfusión previno la pérdida de viabilidad inducida por I/R. Sin embargo, en el pre-condicionamiento con LPS durante 24 o 16 h, y en el tratamiento con LPS durante la isquemia o reperfusión, no se observó el efecto cito-protector. En esta misma línea, demostramos que el efecto cito-protector ejercido por LPS es mediado a través del receptor TLR4 vía PI3K/Akt y ERK1/2, ya que el empleo de TAK-242, Ly29002 y PD98059, inhibidores del receptor y de las vías transduccionales respectivamente, bloquearon completamente el efecto cito-protector. La activación de TLR4 por LPS previno, además, el procesamiento de la procaspasa 8 y 3 inducido por I/R. Conjuntamente, demostramos que las vías PI3K/Akt y ERK1/2 participaban en la prevención del procesamiento de la procaspasa 8 ejercido por LPS, pero no tuvieron efecto en la activación de la caspasa 3. Nuestros resultados dan cuenta del efecto cito-protector y antiapoptótico ejercido por LPS a través de TLR4 vía PI3K/Akt y ERK1/2 frente a la muerte de FC inducida por I/R / The damage caused by a myocardial infarct is complex, causing cardiac cell viability loss, among other deleterious effects that occur during the ischemia period, such as lack of oxygen and nutrients; as well as the posterior reperfusion with blood. In this situation, cardiac fibroblasts react by secreting proteins and renewing the extracellular matrix. These properties make them a key element in the scar and remodeling process of the injured cardiac tissue. Thus, the viability of these cells are required to preserve the correct functioning of the heart. In this regard, the use of LPS as a cytoprotector agent in cardiac Ischemia/reperfusion (I/R) has been reported. However such effect has been described mostly in cardiomyocytes cells, whereas its role in cardiac fibroblasts remains unknown. Our work studied the LPS cytoprotector effect in neonate cardiac fibroblast exposed to an in vitro model of I/R, and transductional pathways involved in this process were explored. Incubation with LPS (1μg/mL) during both ischemia and reperfusion periods prevented the I/R-induced cell loss. However, LPS used only during preconditioning, ischemia or reperfusion did not induced cytoprotection. Furthermore we demonstrated that the LPS-dependent protective effects were completely abolished when TLR4 receptor (TAK-242), and PI3K/Akt and ERK1/2 (Ly29002 and PD98059, respectively) inhibitors were used. These data suggest that LPS-dependent cytoprotector effects are mediated through TLR4 receptor activation and PI3K/Akt and ERK1/2 signalling pathways. Additionally the activation of TLR4 by LPS prevented the cleave of procaspases 3 and 8 induced by I/R. Both PI3K/Akt and ERK1/2 were necessary for the prevention of the caspase 8 activation, but not of caspase 3. Our results conclude that LPS protects cardiac fibroblasts from I/R apoptosis by the activation of TLR4 and both PI3K/Akt and ERK1/2 signalling pathways / FONDECYT

Memoria para optar al título de Químico Farmacéutico / Los fibroblastos cardiacos son las principales células encargadas de la reparación y mantenimiento de la matriz extracelular del tejido cardiaco, aunque en los últimos años se ha determinado que pueden secretar y responder a citoquinas y quimioquinas pro inflamatorias. También se ha determinado que poseen el receptor TLR4, el cual es capaz de responder a PAMPS (como LPS), sugiriendo así que el fibroblasto cardiaco tiene un rol clave en el proceso inflamatorio cardiaco gatillado por un daño o patógeno. Las cininas son péptidos pro inflamatorios asociados principalmente a la vasodilatación y a la formación de edema cuando se unen a sus receptores en el sitio de injuria. Se ha demostrado que el fibroblasto cardiaco posee de forma constitutiva receptor B2 (cuyo ligando es BK), no así receptor B1 (cuyo ligando es DAKD), ya que este último es inducible en este fenotipo celular. Se ha descrito en células endoteliales que tanto LPS, así como también las cininas, son capaces de aumentar los niveles proteicos de moléculas de adhesión celular (ICAM-1 y VCAM-1), favoreciendo así la adhesión de células del sistema inmune al sitio de daño. Sin embargo, se desconoce si los fibroblastos cardiacos tratados de manera conjunta con cininas y LPS modulan la expresión de estas moléculas de adhesión. Mediante análisis de inmunowestern blot se demostró que LPS aumentó considerablemente los niveles proteicos de las moléculas de adhesión desde las 8 hasta las 48 h, mientras que no se observó efecto con BK o DAKD, sugiriendo así que el efecto pro inflamatorio de las cininas no favorecería de manera directa la adhesión de células del sistema inmune a los fibroblastos cardiacos. Por otro lado, se determinó que BK aumentó de forma significativa los niveles proteicos de TLR4 a las 72 h y a su vez que disminuyó los niveles basales de -SMA en fibroblasto cardiaco. También se determinó que el pre tratamiento por 48 h con BK moduló negativamente la acción de LPS sobre VCAM-1 a las 24 h. Estos resultados en conjunto indican que el pre tratamiento de fibroblastos cardiacos con BK es capaz de evitar la diferenciación de estos a miofibroblastos, favoreciendo así una respuesta pro inflamatoria y antifibrótica por parte de estos / Cardiac fibroblasts are the main cells responsible for the repair and maintenance of cardiac matrix. Although in the last years has been determined to be able of secreting and also respond to proinflammatory cytokines and chemokines (IL-1 and TNF-). Also it has been determined the presence of TLR4, which is able to respond to PAMPs (such as LPS), suggesting that cardiac fibroblast has a key role in cardiac inflammatory process triggered by damage or pathogen. Kinins are proinflammatory peptides mainly associated to vasodilation and edema formation when are bind to their receptors at the site of injury. It has been shown that cardiac fibroblast express constitutively B2 receptor (whose ligand is BK), not B1 receptor (whose ligand is DAKD), since the latter is inducible in this cell phenotype. It has been described that LPS and kinins are able to increase protein levels of celular adhesion molecules (ICAM-1 and VCAM-1) in endothelial cells, thus enhancing the adhesion of immune cells to the site of injury. However, it is unknown whether cardiac fibroblasts treated together with kinins and LPS modulate the expression of these adhesion molecules. Through analysis of immuno western blot it was determined that LPS is able to significantly increase the protein levels of adhesion molecules from 8 to 48 hours, not BK and DAKD, thus suggesting that the proinflammatory effect of kinins are not directly linked to the adhesion of immune system cells. Furthermore, it was determined that BK can significantly increase TLR4 protein levels at 72 hours and in turn is capable of decreasing basal levels of -SMA in cardiac fibroblast. It was also determined that pretreatment for 48 hours with BK is able to modulate negatively the action of LPS on VCAM-1 at 24 hours. These results together indicate that pretreatment of cardiac fibroblasts with BK is capable of preventing differentiation of these to myofibroblast, thus supporting a proinflammatory response from these

Memoria para optar al título de Bioquímico / Durante la inflamación de las mucosas, las células epiteliales y los macrófagos expresan el receptor de tipo Toll 4 (TLR4) y secretan citoquinas, las que potencian el cuadro. Sin embargo, hasta ahora existe escasa información acerca de la regulación de la expresión de TLR4 por la combinación de moléculas pro-inflamatorias y antiinflamatorias. Utilizando la línea celular de epitelio pulmonar, las células A549, se evaluó la expresión del TLR4 a nivel de transcrito, proteína y actividad transcripcional de mutantes con deleciones en la región promotora del receptor, posterior a la exposición al factor de necrosis tumoral á (TNFα) en presencia o ausencia del glucocorticoide sintético Dexametasona (Dex), mediante PCR en tiempo real, inmunoblot o citometría de flujo, y ensayos del gen reportero luciferasa, respectivamente. El aumento de la expresión de TLR4 inducido por TNFα, tanto a nivel del mRNA como de la proteína, es revertido por la adición de Dex. La regulación de la actividad transcripcional del promotor de TLR4 por estas moléculas fue similar a la observada a nivel de proteína, y el efecto inhibitorio de Dex estaría comandado por al menos un elemento de respuesta del receptor de glucocorticoides, GR (GRE). En conjunto, estos resultados demuestran un efecto antagónico de Dexametasona sobre la expresión de TLR4 inducida por TNFα, aparentemente por un mecanismo que involucra al menos la regulación de GR a nivel del promotor de TLR4. Se evidenció claramente en estas células los fuertes efectos antagónicos que ejercen sobre la expresión de TLR4, moléculas pro-inflamatorias como es TNFα y antiinflamatorias como los glucocorticoides

Memoria para optar al título de Químico Farmacéutico / Una consecuencia común de las enfermedades cardiovasculares es la remodelación cardíaca, que se caracteriza por cambios en el tamaño, forma y función del corazón. El infarto agudo al miocardio es la causa más común que desencadena un proceso de remodelado. El daño causado por el proceso isquémico conduce a la activación de receptores de reconocimiento de patrones moleculares asociados a daño (PRR), y de mediadores celulares y humorales de la respuesta inflamatoria en el tejido. En relación a esto, se ha reportado que el receptor tipo toll-4 (TLR-4), un tipo de PRR, tiene un papel clave en la función cardiaca luego de un infarto, mientras que el aumento en la expresión de las moléculas de adhesión intercelular 1 (ICAM-1) y vascular 1 (VCAM-1), en el tejido cardiaco se ha asociado a una mayor adhesión e infiltración leucocitaria y a un mal pronóstico de la función cardiaca. En fibroblastos cardiacos (FC) se ha demostrado que TLR-4 reconoce patrones moleculares asociados a daño y que su activación conduce a la secreción de citoquinas proinflamatorias, sin embargo los efectos sobre la expresión de moléculas de adhesión no han sido determinados. En esta memoria se estudió el rol del TLR-4 en la expresión ICAM-1 y VCAM-1 en FC de rata adulta e indagó las vías de señalización involucradas en dicha expresión. El tratamiento con lipopolisacárido (LPS) 1 μg/mL aumentó los niveles de ICAM-1 y VCAM-1 de manera tiempo dependiente, observándose en cada caso un aumento significativo a las 24 hrs. Por otra parte, LPS aumentó de forma temprana la fosforilación de NF-κB, ERK1/2, y JNK, mientras que p-38 y Akt sólo mostraron una tendencia a aumentar a partir de los 5 min. La utilización de los inhibidores TAK-242, PD98059 y SP600125, revirtieron el aumento en los niveles de ambas proteínas, mientras que los inhibidores BAY117085, LY294002 y SB202190 no lo los revirtieron. En resumen, nuestros resultados demostraron que la activación del TLR-4 en FC, gatilla un aumento en los niveles de ICAM-1 y VCAM-1 a través de las vías de señalización ERK1/2 y JNK / The cardiac remodeling is a common consequence of the ECV, and is characterized by changes in the size, shape and function. Moreover the acute myocardial infarction is the most common cause of remodeling. The damage caused by the ischemic process leading to activation of pattern recognition receptors (PRR), and humoral and cellular mediators of the inflammatory response in the tissue. In regards to this Toll like receptor-4 (TLR-4) has been described has a key mediator of cardiac function after myocardial infarction, while the increase in intercellular adhesion molecule 1 (ICAM-1) and vascular cell adhesion molecule 1 (VCAM-1) in cardiac tissue has been linked to increased adhesion and leukocyte infiltration and poor prognosis of cardiac function. In cardiac fibroblast TLR4 is capable to recognize danger associated molecular patterns and release pro-inflammatory cytokines, however their role in ICAM-1/VCAM-1 expression remain unknown. In this study we have determined the ability of TLR-4 to increased ICAM-1/VCAM-1 protein level in adult rat cardiac fibroblast and investigated the potential mechanisms underlying this induction. Treatment with LPS 1 μg/ml resulted in a time-dependent increased of ICAM-1 / VCAM-1 protein level. Furthermore, NF-κB, ERK1/2 and JNK were rapidly phosphorylated by LPS, while p-38 and Akt showed a tendency to increase from 5 min. We also found that inhibition of ERK1/2 and JNK pathways prevented LPS–induced ICAM-1 and VCAM-1 protein level, whereas NF-κB, p-38 and Akt inhibition did not. In summary, these findings demonstrate that the increased ICAM-1/VCAM-1 protein level by TLR-4 activation is regulated via the ERK1/2 and JNK pathways, in cultured cardiac fibroblasts / Fondecyt FONDAP ACCDiS

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O nosso geral objetivo foi demonstrar o efeito da interação de células dendríticas humanas e o antígeno solúvel de T. gondii e qual o envolvimento do TLR-4 na resposta imunológica contra T. gondii. Foram utilizadas células dendríticas humanas e antígeno solúvel de T. gondii. Após 48 horas da interação das células com antígeno foram avaliados marcadores de maturação e produção de citocinas como a IL-10 e IL-12. A produção de Il-12 foi também avaliada após a interação das células dendríticas com células J558(mimetizam ligação CD40-CD40L) e a expressão de IL-10, IL-12 e TFG-b foi avaliada por PCR. No primeiro artigo, portanto, demonstramos que o antígeno solúvel do parasito estimulou marcadores de maturação CD40(p<0,05), CD80(p<0,05), CD83 (p<0,01), CD86(p<0,05) e HLA-DR (p < 0,05). Produziu significativamente IL-10(p < 0,01) e IL-12(p< 0,05), mas a produção de IL-10 é superior a de IL-10/IL-12(p < 0,01). A IL-12 não foi produzida quando as células dendríticas estiveram em contato com a linhagem de células J558. A expressão de IL-10 (p < 0,01) e de IL-12 (p < 0,01) por PCR foi também observada quando as células dendríticas tiveram contato com o antígeno. A expressão de TGF-b não foi observada. No segundo artigo, no qual bloqueamos o TLR-4 nas células dendríticas a produção de IL-10 e IL-12 foram avaliadas. Foi possível demonstrar que o bloqueio deste receptor impede a produção de IL-10(p < 0,05) e IL-12(p < 0,05). Sendo assim este Toll Like é importante para a resposta inata contra o parasito, mas também é importante para a resposta regulatória demonstrada no primeiro trabalho. Neste trabalho de tese concluímos que o antígeno solúvel dos taquizoítos do parasito T. gondii é capaz de estimular resposta pró-inflamatória e anti-inflamatória através das células dendríticas e que a produção de IL-10 é superior a de IL-12. Concluímos ainda que a produção destas citocinas esta associada ao receptor Toll Like 4. / Toxoplasma gondii is an obligate intracellular parasite whose adaptive response is strongly TH1. Despite this strong TH1 response, there is strong evidence of the production of immunoregulatory mechanisms, such as IL-10 production. Besides participating in the control of adaptive response to IL-10 is produced during the innate immune response. This response is characterized by the involvement of cells such as macrophages, dendritic cells and cytokines such as IL-12 and TNF-α. The interaction between these cells and the parasite, for the production of these cytokines appears to be mediated by the innate immunity receptor Toll like, Toll like receptors. The literature does not very clear what the true role of Toll like 4 in the interaction between T. gondii and dendritic cells. Our main objective was to demonstrate the effect of the interaction of dendritic cells and human soluble T. gondii antigen and which involvement of TLR-4 in immune response against T. gondii. Human dendritic cells and soluble T. gondii antigen were used. After 48 hours the interaction of antigen with cell maturation markers were evaluated and the production of cytokines such as IL-10 and IL-12. The production of IL-12 was also evaluated after the interaction with dendritic cells J558 cells (CD40-CD40L binding mimic), and the expression of IL-10, IL-12 and b-GFR was assessed by PCR. In the first article, thus demonstrated that soluble parasite antigen-stimulated maturation markers CD40 (p <0.05), CD80 (p <0.05), CD83 (p <0.01), CD86 (p <0, 05) and HLA-DR (p <0.05). IL-10 produced significantly (p <0.01) and IL-12 (p <0.05), but IL-10 production is higher than the IL-10 / IL-12 (p <0.01). IL-12 was not produced when dendritic cells were in contact with the line of J558 cells. The IL-10 expression (P <0.01) and IL-12 (p <0.01) by PCR was also observed when dendritic cells had been in contact with the antigen. The TGF-b was not observed. In the second article, in which block the TLR-4 dendritic cells IL-10 and IL-12 were assessed. It has been shown that blockade of this receptor prevents IL-10 production (p <0.05) and IL-12 (p <0.05). Thus, this Toll like is important for the innate response against the parasite, but it is also important for the regulatory response demonstrated the first working. In this thesis work we conclude that the soluble antigens of the parasite tachyzoites of T. gondii is able to stimulate pro-inflammatory and anti-inflammatory response by dendritic cells and IL-10 production is higher than that of IL-12. We conclude that the production of these cytokines is associated with a Toll like receptor 4

Memoria para optar al título de Químico Farmacéutico / Autorizada por el autor, pero con restricción para ser publicada a texto completo hasta diciembre de 2015, en el Portal de Tesis Electrónicas. / La diferenciación de fibroblastos cardiacos (FC) a miofibroblastos cardiacos (MFC) es gatillada por TGF-β1, la cual señaliza principalmente a través de las proteínas Smad. Los MFC muestran como principal característica la presencia de microfilamentos citoplásmicos de α-SMA, estructuradas como fibras de estrés, lo que les permite la contracción. Por otro lado, LPS es un ligando del receptor TLR4, que señaliza de manera dependiente e independiente de MyD88 teniendo como principal efector el NF-κB, induciendo así la expresión de genes de citoquinas proinflamatorias. Sin embargo, aunque se ha descrito un efecto antagónico entre la señalización inducida por LPS y la señalización canónica de TGF- β, a la fecha no se ha estudiado si en FC y en MFC la expresión de α-SMA inducida por TGF-β1 es antagonizada por LPS. Para responder estas interrogantes se utilizaron FC y MFC de ratas adultas, y se determinó in vitro la capacidad de LPS de inhibir la expresión de α-SMA. Además, utilizando TAK- 242, un inhibidor de las vías intracelulares dependientes de TLR4, se determinó que los efectos gatillados por LPS ocurrían a través de este receptor. La utilización de los inhibidores PD98059, LY29002 y BAY 11-7082 permitió determinar que en FC LPS a través de la vía de señalización PI3K/Akt, disminuye la expresión de α-SMA. Por lo que nuestros resultados demuestran que LPS inhibe la expresión de α-SMA en FC, a través del receptor TLR4 mediante la activación de vía de señalización PI3K/Akt y que LPS es capaz de disminuir la expresión de α-SMA en MFC a través de TLR4 inhibiendo la mantención del fenotipo miofibroblasto / The difference between cardiac fibroblasts (CF) and cardiac myofibroblast (CMF) is triggered by TGF-β1, which mainly signals via Smad proteins. The main characteristic of CMF is cytoplasmic microfilaments of α-SMA; this are structured as stress fibers, which allow the contraction of CMF. Also, LPS is a ligand of the TLR4 receptor that signals via a dependant and independent pathway of MyD88 whose main factor is NF-κB; this induces the expression of inflammatory cytokine genes. However, despite an opposite effect has been described between the signaling induced by LPS and the canonical signaling of TGF-β, the opposite effect that LPS may have on the expression of α-SMA on CF and CMF induced by TGF-β1 has not been studied so far. In order to answer these questions, CF and CMF of adult rats were used; this showed in vitro evidence that LPS is capable of inhibiting the expression of α-SMA. Also, with the use of TAK-242, which is an inhibitor of the dependant intracellular domain of TLR4, we determined that the effects triggered by LPS occurred through said receptor. Using PD98059, LY29002 and BAY11-7082 inhibitors allowed us to determine that, via the PI3K/Akt signaling pathway, LPS decreases the expression of α-SMA in CF. Therefore, our results show that LPS inhibit the expression of α-SMA in CF through the TLR4 receptor via the activation of the PI3K/Akt signaling pathway, and that LPS is capable of decreasing the expression of α-SMA in CMF through TLR4 receptor, which inhibits the maintenance of the myofibroblast phenotype

Memoria para optar al título de Químico Farmacéutico / Los fibroblastos cardíacos (FC) son considerados células centinelas del tejido cardíaco, por su compleja y variada respuesta en la mantención de la homeostasis o frente a un evento de injuria cardíaca, como infarto al miocardio (MI). La necrosis de cardiomiocitos involucra la liberación diversos patrones moleculares asociados a daño (DAMPs), entre ellos el heparán sulfato (HS), constituyente de la matriz extracelular (MEC) de FC que ejerce sus efectos a través del receptor Tipo-Toll 4 (TLR4). La cascada inflamatoria gatilla la infiltración y adhesión de leucocitos, que se encargan de limpiar restos celulares y liberar citoquinas que favorecen la diferenciación de FC a miofibroblastos (MFC), iniciando el proceso fibrótico y formación de cicatriz. La activación crónica de MFC por citoquinas y DAMPs en esta etapa puede provocar deposición excesiva de colágeno, conocida como fibrosis cardiaca, con consecuencias como arritmias e insuficiencia cardíaca. El objetivo de este trabajo fue estudiar el efecto de HS en la expresión de proteínas de adhesión en el FC junto con la adhesión de leucocitos y sus consecuencias en la modulación del fenotipo del FC. Se demostró que en FC in vitro, HS aumenta la expresión de ICAM-1 y VCAM-1, y como consecuencia de ello, aumenta la adhesión de células mononucleares de bazo (SMC) y polimorfonucleares de médula ósea (PMN) a FC. El co-cultivo de FC con SMC generó un aumento en la expresión de alfa-actina de músculo liso (α-SMA), que es revertido al pre-tratar los FC con HS. Estos resultados dan cuenta del rol dual del HS durante las etapas de la cicatrización post-MI, permitiendo la adhesión de SMC y diferenciación de los FC a un fenotipo pro-fibrótico, pero manteniendo a la vez características pro-inflamatorias necesarias para llevar a cabo el proceso de cicatrización, y mantener la homeostasis con el fin de mantener el funcionamiento del tejido cardíaco / Cardiac fibroblasts (CF) act as sentinel cells of the heart tissue, due to its complex response in the maintenance of homeostasis or in cardiac injury events, such as myocardial infarction (MI). Cardiomyocyte necrosis involves the release of various damage-associated molecular patterns (DAMPs) including heparan sulfate (HS), constituent of the extracellular matrix (ECM), whose effects are exerted through the TLR4 receptor. The inflammatory cascade triggers the infiltration and adhesion of leukocytes, which are responsible of clearing cell debris and releasing cytokines that promote CF differentiation to myofibroblast (CMF), initiating the fibrotic process and scar formation. Chronic activation of CMF at this stage may cause excessive collagen deposition, known as cardiac fibrosis, with consequences such as arrhythmia and heart failure. The overall objective was to study the effect of HS on the expression of adhesion proteins in CF, along with leukocyte adhesion and its consequences in modulating the phenotype of CF. HS enhanced ICAM-1 and VCAM-1 expression, with increased spleen mononuclear cells (SMC) and bone marrow granulocytes (PMN) adhesion to CF. Co-culture of CF with SMC caused an increment of α-SMA expression, skewing CF towards a profibrotic phenotype, but pre-treating CF with HS partially reverted this effect. These data shows the dual role of HS during the initial stages of wound healing, allowing the adhesion of SMC and differentiation of CF to a profibrotic phenotype, while mantaining proinflammatory properties to ensure tissue homeostasis and prevent complications such as heart rupture / FONDECYT N° 1130300

Memoria para optar al Título Profesional de Químico Farmacéutico / Los fibroblastos cardíacos (FC) se encargan de mantener tanto la estructura como la mecánica y la señalización del corazón. A estas células se les conoce como células centinela, pues responden de manera variada y compleja a fin de mantener la homeostasis, jugando un rol clave dentro de este proceso. Dicha respuesta se lleva a cabo mediante una maquinaria conformada por una amplia red de receptores, entre ellos los receptores tipo-toll y, en particular, el TLR4 (del inglés toll like receptor 4). Este receptor presenta patrones de reconocimiento que le permite responder a diversos ligando, los que pueden ser exógenos como el lipopolisacárido bacteriano (LPS) o endógenos como el heparan sulfato (HS). Ambos estímulos han mostrado mediar respuestas inflamatorias y fibróticas tanto en FC, como en otros tejidos. Sin embargo, en esta memoria se abordará específicamente el rol de HS como estímulo desencadenante de estas respuestas. Como modelo experimental se usaron FC de ratas neonatas y adultas (FCN y FCA). Estudios previos demuestran que, en FC, LPS modifica los niveles proteicos de la citoquina pro inflamatoria IL-1β, así como de proteínas de adhesión celular y vascular (ICAM-1 y VCAM-1, respectivamente) y de la proteína alfa actina del músculo liso (α-SMA). Esta última proteína constituye un marcador de diferenciación de fenotipo FC-MFC (miofibroblasto cardíaco), que se expresa en estados patológicos, como ocurre luego de un infarto cardíaco. Para el caso de HS existe evidencia que indica que es un agonista del TLR4, pero no se han medido las variaciones de IL-1β, ICAM-1, VCAM-1 ni de α-SMA a nivel cardíaco; siendo uno de los objetivos del presente trabajo demostrar si esto ocurre. Para despejar tal interrogante se medirán los niveles de las proteínas mencionadas. También se evaluarán las vías de señalización PI3K/Akt, Erk1/2 y NF-κB de TLR4, comparando efectos inducidos por LPS y HS, a fin de comprobar si el aumento de VCAM-1 y la disminución de α-SMA en FC, es mediada por alguna de estas vías de señalización que involucran al receptor. En conclusión, en FCN y FCA, tanto HS como LPS inducen cambios en los niveles proteicos de IL-1β, ICAM-1, VCAM-1 y α-SMA, lo que resalta las propiedades proinflamatorias y antifibróticas de ambos estímulos tras la activación de TLR4 / Heart structure, mechanism and signaling is supported by cardiac fibroblast (CF). These cells are named sentinel cells, because they respond in complex and different manner to mantein homeostasis, playing a key role in this process. This action is due to a mechanism that involves a bread spectrum of receptors, including the toll like receptors especially TLR4 (toll like receptor 4). This receptor has recognition patterns, wich allow to answer to several stimulus, like bacterian lipopolysaccharide (LPS) and heparan sulphate (HS), exogenous and endogenous stimulus respectively. Both of them has shown to mediate fibrotics and inflamatories reponses, in CF and others tissues. However, in this study we will present the HS responses in adults and neonates animal fibroblasts (ACF and NCF). According to literature, in CF, LPS changes on IL-1β levels, a proinflamatory citoquine; ICAM-1 y VCAM-1 (intercellular and vascular adhesion molecule) and finally the α-SMA protein (α-smoth muscle actin), responsible for cardiac tissue integrity and main fibroblast-myofibroblast differentiation master, expressed in pathological stage, such as heart infarct. In relation with HS, there is evidence that it is a TLR4 agonist, but IL-1β, ICAM-1, VCAM-1 and α-SMA variations has not been determinated. In this work we will perform these experiments. Besides the analysis of these proteins, we will study the PI3K/Akt, ERK1/2 and NF-κB signaling pathways implicated in the VCAM-1 increase and α-SMA decrease in ACF, via TLR4, as well as the receptor blockade in order to demostrate if these effects are mediated by this receptor, by comparing the effects of HS and LPS. In conclusion, as HS as LPS induced changes in IL-1β, ICAM-1, VCAM-1 and α-SMA protein levels, in NCF and ACF. Therefore the antifibrotics and proinflamatories properties of the two stimulus after the activation of TLR4 are demonstrated

Os efeitos da administração de anfotericina B a camundongos suscetíveis ao P. brasiliensis foram avaliados. A L-AmB reverte o padrão de suscetibilidade para o de resistência de forma mais eficiente do que a c-AmB, como observado na quantificação de UFC, NO e IgG2b. Porém, os níveis de TNF-a, IL-12, IFN-g, GM-CSF, IgG total, IgM, IgG1, IgG2a e IgA não são significativamente alterados. Neutrófilos e macrófagos peritoneais co-cultivados com Pb e L-AmB tendem a apresentar maior capacidade fungicida, mas não maior síntese de mediadores. O melhor desempenho de L-AmB poderia se dever a sua interação com TLR4. Em TLR4-deficientes ou não, a progressão da doença é similar. A eficácia da terapia, porém, é menor nos deficientes, como observado na quantificação de UFC; os perfis leucocitários e as concentrações de NO, TNF-a, IL-12 e GM-CSF não são significativamente alterados. Logo, a droga é capaz de reverter os parâmetros micológicos, mas não os imunológicos. A interação entre TLR4, P. brasiliensis e L-AmB não parece ser importante para o estabelecimento da imunidade. / Amphotericin B effects in mice susceptible to P. brasiliensis were evaluated. L-AmB reverts the susceptibility pattern to the resistant one with more efficiency than c-AmB, as confirmed by the CFU, NO e IgG2b quantifications. However, TNF-a, IL-12, IFN-g, GM-CSF, total IgG, IgM, IgG1, IgG2a and IgA levels are not significantly altered. Neutrophils and macrophages cocultivated with Pb e L-AmB tend to present higher fungicidal ability, but not enhanced synthesis of mediators. The better performance of L-AmB could be due to its interaction with TLR4. In TLR4-deficient or sufficient mice, progression of the disease is similar. The efficiency of the therapy, however, is lower in deficient animals, as seen on CFU; leukocyte profiles and NO, TNF-a, IL-12 and GM-CSF levels are not significantly altered by L-AmB-TLR4 interaction. Therefore, the drug administration is capable of reverting mycological parameters, but not the immunological ones. Interaction between TLR4, P. brasiliensis and L-AmB does not seem to play a special role in the establishment of immunity.