Introdução. A enzima iodotironina desiodase tipo 2 (D2) converte o pró-hormônio T4 em sua forma ativa, T3, um passo essencial no metabolismo da tiróide. O polimorfismo Tre92Ala no gene que codifica a D2 foi associado com resistência à insulina em algumas populações. Interessantemente, um estudo recente relatou que o polimorfismo D2 Tre92Ala interage com o polimorfismo Pro12Ala, no gene que codifica o fator de transcrição PPARγ2, na modulação da síndrome metabólica em indivíduos nãodiabéticos, sendo que os portadores do genótipo D2 Ala/Ala e do alelo PPARγ2 12Ala apresentam os piores fenótipos de síndrome metabólica e pressão arterial sistólica e diastólica. Objetivos. Avaliar o efeito isolado ou combinado dos polimorfismos D2 Tre92Ala e PPARγ2 Pro12Ala na modulação da resistência à insulina em pacientes com diabetes mellitus tipo 2 (DM2). Material e Métodos. Os polimorfismos D2 Tre92Ala e PPARγ2 Pro12Ala foram genotipados em 711 pacientes com DM2 brancos, utilizando-se a técnica de discriminação alélica por PCR em tempo real. Todos os pacientes incluídos no estudo foram submetidos a um exame físico completo e a exames laboratoriais padrões. A resistência à insulina foi avaliada através do cálculo do índice HOMA (Homeostasis Model Assessment) em um subgrupo de 215 pacientes sem uso de insulina e com creatinina sérica < 1,5mg/dL. Resultados. As frequências dos alelos D2 92Ala e PPARγ2 12Ala foram 0,32 e 0,076, respectivamente, e suas frequências genotípicas estavam em equilíbrio de Hardy- Weinberg (p > 0,05). Pacientes com o genótipo D2 Ala/Ala apresentaram níveis mais altos de insulina plasmática no jejum e índice HOMA quando comparados com pacientes portadores dos genótipos Tre/Ala ou Tre/Tre (p = 0,015 e p = 0,001; respectivamente). Além disso, um efeito sinérgico significativo foi observado entre os polimorfismos D2 Tre92Ala e PPARγ2 Pro12Ala na modulação do índice HOMA: portadores do genótipo D2 Ala/Ala e do alelo PPARγ2 12Ala apresentaram valores mais elevados de HOMA (mediana 8,5 [valor máximo 28,2 - valor mínimo 1,3]) do que os pacientes portadores das outras combinações genotípicas destes polimorfismos (4,0 [17,6-0,3] no grupo de pacientes com os genótipos D2 Tre/Tre - PPARγ2 Pro/Pro, 5,8 [35,2-0,9] no grupo D2 Ala/Ala - PPARγ2 Pro/Pro e 3,5 [17,2-0,5] no grupo D2 Tre/Tre- PPARγ2 12Ala), após ajuste para sexo, idade e índice de massa corporal (p da interação = 0,010). Conclusões. Pacientes com DM2 portadores dos genótipos D2 Ala/Ala e PPARγ2 12Ala apresentam níveis mais severos de resistência à insulina quando comparados aos pacientes com outras combinações genotípicas dos polimorfismos D2 Tre92Ala e PPARγ2 Pro12Ala. Isso sugere que esses dois polimorfismos interagem na modulação da resistência à insulina em indivíduos brancos, o que pode constituir um alvo terapêutico potencial.

A linhagem S1M29 de Penicillium echinulatum é um fungo filamentoso cujo sistema celulolítico tem potencial para aplicação em processos de degradação de materiais lignocelulósicos visando a obtenção de produtos com interesse biotecnológico, como o etanol de segunda geração. A abundância de biomassas lignocelulósicas associada à busca por alternativas aos combustíveis fósseis faz aumentar o interesse em estudos que envolvam a elucidação dos mecanismos de secreção de enzimas lignocelulolíticas. Neste estudo, o P. echinulatum S1M29 foi crescido em condições de indução para a produção de endoglicanases, celobiohidrolases, β-glicosidases, xilanases e swoleninas. Foram avaliados os perfis enzimáticos em géis de poliacrilamida e o padrão de expressão gênica para estas proteínas. Observou-se que a produção enzimática foi favorecida pela presença de celulose Celufloc E® e bagaço de cana-de-açúcar (BCA) no meio de cultivo em comparação à glicose, sendo que o uso de resíduo de biomassa proporcionou a obtenção dos melhores rendimentos. Resultado semelhante foi atingido na análise dos perfis de secreção enzimática em gel de poliacrilamida, sugerindo ainda, a presença de uma endoglicanase constitutiva de aproximadamente 80 kDa. O estudo de qRT-PCR revelou a presença de quatro genes para endoglicanases com padrão de expressão distintos, destacando-se um acúmulo de transcritos 9779,19 vezes superior à amostra calibradora do gene egl1 em 24 h de cultivo no meio formulado com celulose Celufloc E®. Este mesmo gene gerou 1257,58 vezes mais transcritos acumulados que a amostra calibradora em meio suplementado com BCA. Na avaliação da expressão relativa do gene para celobiohidrolase obteve-se expressão superior no meio formulado com BCA em 48 h em relação ao meio com celulose Celufloc E® em 24 h, correspondendo, respectivamente, a 6464,49 e 3093,26 vezes mais transcritos acumulados que a amostra calibradora. O gene para β-glicosidase expressou-se em meio formulado com BCA no início do cultivo, embora a atividade desta enzima tenha ocorrido ao final do cultivo. A expressão de xilanases foi mais significativa com o uso de celulose Celufloc E® no meio de cultivo. Já o gene para swolenina apresenta um perfil de expressão com valores semelhantes em comparação ao uso de celulose Celufloc E® e BCA no meio de cultivo, apesar da presença de BCA ter proporcionado uma expressão mais tardia. Para todos os genes avaliados foram verificados valores muito reduzidos de expressão quando a glicose foi utilizada como fonte de carbono para o P. echinulatum. Observou-se ainda uma expressão coordenada de genes codificadores de endoglicanases, celobiohidrolase, β-glicosidase e swolenina. / Submitted by Ana Guimarães Pereira (agpereir@ucs.br) on 2016-01-27T12:06:29Z No. of bitstreams: 1 Tese Denise Zampieri.pdf: 4586084 bytes, checksum: be5eb9fbb555f957a4e737205334ac6d (MD5) / Made available in DSpace on 2016-01-27T12:06:30Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tese Denise Zampieri.pdf: 4586084 bytes, checksum: be5eb9fbb555f957a4e737205334ac6d (MD5) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico, CNPq. / The strain S1M29 of Penicillium echinulatum is a filamentous fungus that presents a cellulolytic system with potential for application in the degradation process of lignocellulosic materials to obtain products of biotechnological interest, such as second-generation ethanol. The availability of lignocellulosic biomass associated with the search for alternatives to fossil fuels increases the interest in studies that involve understanding the secretion mechanisms of lignocellulolytic enzymes. In this study, P. echinulatum S1M29 was grown under inducing conditions for the production of endoglucanases, cellobiohydrolases, β-glucosidases, xylanases and swollenins. The enzyme secretion profiles were evaluated in polyacrylamide gels and the pattern of gene expression for these proteins was also assessed. It was observed that enzyme production was enhanced in the presence of cellulose Celufloc E® and sugar cane bagasse (SCB) in the culture medium compared to glucose, with the use of biomass residue providing the best yields. A similar result was obtained analyzing enzyme secretion profiles in polyacrylamide gels, suggesting the presence of constitutive endoglucanases of approximately 80 kDa. Studies with qRT-PCR revealed the presence of four genes encoding endoglucanases with distinct expression patterns, standing out an accumulation of transcripts from egl1 gene 9779.19 times higher than the calibrator sample in 24 h of growth in medium formulated with cellulose Celufloc E®. The same gene generated 1257.58 more accumulated transcripts than the reference sample in medium supplemented with SCB. Evaluation of gene expression for cellobiohydrolase yielded higher expression levels in the medium formulated with SCB in 48 h, in comparison to the medium containing cellulose Celufloc E® in 24 h, corresponding, respectively, to 6464.49 and 3093.26 more accumulated transcripts than the reference sample. The β-glucosidase gene was expressed in medium formulated with SCB at the beginning of growth, as opposed to that seen for activity of this enzyme, which occurred at the end of cultivation. The xylanase expression was more significant with the use of cellulose Celufloc E® in the culture medium. On the other hand, the gene for swollenin presents an expression profile with similar values compared to using cellulose Celufloc E® and SCB in the culture medium, although the presence of SCB has provided a later expression. Very low values of gene expression have been found for all genes evaluated when glucose was used as carbon source for P. echinulatum. A coordinated expression of endoglucanases, cellobiohydrolase, β-glucosidase and swollenin was was also verified.

A linhagem S1M29 de Penicillium echinulatum é um fungo filamentoso cujo sistema celulolítico tem potencial para aplicação em processos de degradação de materiais lignocelulósicos visando a obtenção de produtos com interesse biotecnológico, como o etanol de segunda geração. A abundância de biomassas lignocelulósicas associada à busca por alternativas aos combustíveis fósseis faz aumentar o interesse em estudos que envolvam a elucidação dos mecanismos de secreção de enzimas lignocelulolíticas. Neste estudo, o P. echinulatum S1M29 foi crescido em condições de indução para a produção de endoglicanases, celobiohidrolases, β-glicosidases, xilanases e swoleninas. Foram avaliados os perfis enzimáticos em géis de poliacrilamida e o padrão de expressão gênica para estas proteínas. Observou-se que a produção enzimática foi favorecida pela presença de celulose Celufloc E® e bagaço de cana-de-açúcar (BCA) no meio de cultivo em comparação à glicose, sendo que o uso de resíduo de biomassa proporcionou a obtenção dos melhores rendimentos. Resultado semelhante foi atingido na análise dos perfis de secreção enzimática em gel de poliacrilamida, sugerindo ainda, a presença de uma endoglicanase constitutiva de aproximadamente 80 kDa. O estudo de qRT-PCR revelou a presença de quatro genes para endoglicanases com padrão de expressão distintos, destacando-se um acúmulo de transcritos 9779,19 vezes superior à amostra calibradora do gene egl1 em 24 h de cultivo no meio formulado com celulose Celufloc E®. Este mesmo gene gerou 1257,58 vezes mais transcritos acumulados que a amostra calibradora em meio suplementado com BCA. Na avaliação da expressão relativa do gene para celobiohidrolase obteve-se expressão superior no meio formulado com BCA em 48 h em relação ao meio com celulose Celufloc E® em 24 h, correspondendo, respectivamente, a 6464,49 e 3093,26 vezes mais transcritos acumulados que a amostra calibradora. O gene para β-glicosidase expressou-se em meio formulado com BCA no início do cultivo, embora a atividade desta enzima tenha ocorrido ao final do cultivo. A expressão de xilanases foi mais significativa com o uso de celulose Celufloc E® no meio de cultivo. Já o gene para swolenina apresenta um perfil de expressão com valores semelhantes em comparação ao uso de celulose Celufloc E® e BCA no meio de cultivo, apesar da presença de BCA ter proporcionado uma expressão mais tardia. Para todos os genes avaliados foram verificados valores muito reduzidos de expressão quando a glicose foi utilizada como fonte de carbono para o P. echinulatum. Observou-se ainda uma expressão coordenada de genes codificadores de endoglicanases, celobiohidrolase, β-glicosidase e swolenina. / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico, CNPq. / The strain S1M29 of Penicillium echinulatum is a filamentous fungus that presents a cellulolytic system with potential for application in the degradation process of lignocellulosic materials to obtain products of biotechnological interest, such as second-generation ethanol. The availability of lignocellulosic biomass associated with the search for alternatives to fossil fuels increases the interest in studies that involve understanding the secretion mechanisms of lignocellulolytic enzymes. In this study, P. echinulatum S1M29 was grown under inducing conditions for the production of endoglucanases, cellobiohydrolases, β-glucosidases, xylanases and swollenins. The enzyme secretion profiles were evaluated in polyacrylamide gels and the pattern of gene expression for these proteins was also assessed. It was observed that enzyme production was enhanced in the presence of cellulose Celufloc E® and sugar cane bagasse (SCB) in the culture medium compared to glucose, with the use of biomass residue providing the best yields. A similar result was obtained analyzing enzyme secretion profiles in polyacrylamide gels, suggesting the presence of constitutive endoglucanases of approximately 80 kDa. Studies with qRT-PCR revealed the presence of four genes encoding endoglucanases with distinct expression patterns, standing out an accumulation of transcripts from egl1 gene 9779.19 times higher than the calibrator sample in 24 h of growth in medium formulated with cellulose Celufloc E®. The same gene generated 1257.58 more accumulated transcripts than the reference sample in medium supplemented with SCB. Evaluation of gene expression for cellobiohydrolase yielded higher expression levels in the medium formulated with SCB in 48 h, in comparison to the medium containing cellulose Celufloc E® in 24 h, corresponding, respectively, to 6464.49 and 3093.26 more accumulated transcripts than the reference sample. The β-glucosidase gene was expressed in medium formulated with SCB at the beginning of growth, as opposed to that seen for activity of this enzyme, which occurred at the end of cultivation. The xylanase expression was more significant with the use of cellulose Celufloc E® in the culture medium. On the other hand, the gene for swollenin presents an expression profile with similar values compared to using cellulose Celufloc E® and SCB in the culture medium, although the presence of SCB has provided a later expression. Very low values of gene expression have been found for all genes evaluated when glucose was used as carbon source for P. echinulatum. A coordinated expression of endoglucanases, cellobiohydrolase, β-glucosidase and swollenin was was also verified.

Orientador: Renata de Oliveira Mattos-Graner / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Odontologia / Made available in DSpace on 2018-08-18T21:04:54Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Vizoto_NataliaLeal_M.pdf: 1501643 bytes, checksum: 855281de051e36237ad28b6d3f428f1b (MD5) Previous issue date: 2011 / Resumo: Streptococcus mutans é o principal patógeno da cárie dental em humanos, por ser capaz de se acumular no biofilme dentário principalmente na presença de sacarose e produzir e tolerar grandes concentrações de ácidos, os quais causam a desmineralização dos dentes. Além disto, S. mutans pode estar associado à etiologia da endocardite bacteriana, doença cuja evolução envolve a formação de biofilmes em válvulas cardíacas lesadas. S. mutans expressa diversas proteínas de superfície envolvidas na adesão e acúmulo bacteriano em biofilmes. Estas incluem as glucosiltransferases (codificadas por gtfB, gtfC e gtfD), as quais sintetizam glucanos extracelulares a partir da sacarose, e as proteínas ligantes de glucano (codificadas por gbpA, gbpB, gbpC e gbpD). Os genes gtfB/C/D, gbpB/C são controlados diretamente pela proteína reguladora CovR. Em diversas espécies patogênicas de Streptococcus, como Streptococcus pyogenes e Streptococcus agalactiae, CovR compõe o sistema regulador de transcrição de dois componentes CovRS (Cov, de control of virulence), o qual regula diversos genes de virulência. Em S. mutans, CovR foi identificado como um regulador órfão pois o gene que codifica o receptor de membrana cognato não foi identificado no mesmo locus gênico de covR. Em S. mutans, CovR regula diversos genes envolvidos na formação de biofilmes (gtfB/C, gbpC e gbpB), na biossíntese do envelope celular e na resposta a estresses. Os estímulos que ativam CovR em S. mutans ainda não são conhecidos. O presente projeto visa caracterizar a participação de CovR na resposta de S. mutans ao contato com a saliva e sangue humano. Para isto, uma cepa knock-out de covR- foi comparada com a respectiva cepa selvagem quanto ao crescimento e/ou sobrevida em saliva e sangue de voluntários saudáveis. O efeito da exposição à saliva na expressão dos genes regulados diretamente por CovR também foi avaliado / Abstract: Streptococcus mutans is the main pathogen of dental caries in humans, because it can accumulate in the biofilm in the presence of sucrose and produce and tolerate high concentrations of acids, which cause demineralization of teeth. Moreover, S. mutans is involved in the etiology of bacterial endocarditis, a disease whose evolution involves the formation of biofilms on damaged heart valves. S. mutans expresses several surface proteins involved in bacterial adhesion and accumulation in biofilms. These include the glucosiltransferases (gtfB, gtfC and gtfD), which synthesize extracellular glucans from sucrose, and glucan binding proteins (encoded by gbpA/B/C/D). The genes gtfB/C/D, and gbpB/C are directly controlled by the regulatory protein CovR. In several pathogenic species of Streptococcus, such as S. pyogenes and S. agalactiae, CovR is the transcriptional regulator that compose the two-component system CovRS (Cov for control of virulence), which regulates several virulence genes. In S. mutans, CovR was identified as an orphan regulator, because the gene encoding its cognate membrane receptor was not identified at the same locus of covR. In S. mutans, CovR regulates several genes involved in biofilm formation (gtfB/C, and gbpB/C), in biosynthesis of the cell envelope and in stress responses. The stimuli which activate CovR in S. mutans are not yet known. This project aims to characterize the participation of CovR in S. mutans response to contact with saliva and blood. To this purpose, a knock-out mutant of covR was compared with parent strain regarding growth and/or survival in human saliva and blood. The effect of exposure to saliva in the expression of genes directly by covR was also analyzed / Mestrado / Histologia e Embriologia / Mestre em Biologia Buco-Dental

Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2015-11-23T14:38:28Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1031008 bytes, checksum: 25f79f39509b18315e8a91383a38a258 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-11-23T14:38:28Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1031008 bytes, checksum: 25f79f39509b18315e8a91383a38a258 (MD5) Previous issue date: 2015-04-08 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Um dos principais desafios da biologia molecular é medir e avaliar os perfis de expressão gênica em diferentes condições com o objetivo de entender os mecanismos de transformação molecular. Para tanto, o método RNA-Seq usa o transcriptoma obtido a partir de tecnologias de sequenciamentos de nova geração (NGS), as quais são utilizadas para converter RNA em uma biblioteca de fragmentos de cDNA, e, assim, produzir milhões reads. Após a mensuração dos níveis de expressão dos genes, por meio de técnicas de mapeamento, surge a necessidade de verificar hipóteses a respeito da existência de expressão diferencial (ED) entre as condições avaliadas. Assim, faz-se necessária à descoberta e o aprimoramento de metodologias estatísticas para aperfeiçoar as análises de dados gerados em plataformas de sequenciamento de genomas. O objetivo geral desse estudo consistiu em avaliar o comportamento de três metodologias (DEGSeq, bayseq e DESeq) para verificação da expressão diferencial em longissimus dorsi (LD) do músculo de suínos da raça Piau e Comercial, em 21e 90 dias depois do coito, por meio de dados provenientes de RNA-Seq, em cenários sem repetição . De acordo com os resultados gerados nas análises e sob as condições utilizadas no desenvolver do experimento concluiu-se que, na comparação dos métodos bayseq com DEGSeq e baySeq com DESeq, respectivamente, observou-se, a partir da relação do nível de expressão (fold-change) entre as duas raças suínas (comercial e piau), que os métodos apresentaram desempenho diferentes entre si, pois apresentaram um nível de expressão desigual em ambos os métodos. No entanto, na comparação entre os métodos DESeq e DEGSeq, houve um desempenho comparável, deste modo, houve concordância entre os métodos. Como um todo, a maioria dos genes DE identificados, se deu na fase pós- natal tardia, ou seja, 90 dpc. Além disso, a maioria deles foram down na fase pré-natal inicial (21 dpc) e foram up na fase pré-natal tardia (90 dpc) relacionando as raças, comercial e piau e comparando os métodos. / One of the main challenges of molecular biology is to measure and assess the gene expression profiles in different biological tissues in order to understand the molecular mechanisms of transformation. The RNA-Seq method uses transcriptome from young generation sequencing technologies (NGS), used to convert RNA into a cDNA fragment library, and thus produce millions reads. After the measurement of levels of gene expression, the need arises to test hypotheses about the existence of differential expression (DE) between the evaluated conditions. Thus, it is necessary to the discovery and improvement of efficient statistical methods to improve data analysis generated by genome sequencing platforms. The overall objective of this study was to evaluate the behavior of three methodologies (DEGSeq, bayseq and DESeq) to verify the differential expression in longissimus dorsi (LD) muscle of the pig Piau and Commercial race in 21 and 90 days after intercourse, by using data from RNA Seq in scenarios without repetition. According to the results generated by the analysis and under the conditions used to develop the experiment it was concluded that, in comparison with the methods bayseq DEGSeq and baySeq with DESeq respectively, was observed from the relation of expression level (fold-change) between the two pig breeds (commercial and piau), the methods showed different performance between them, they showed an uneven level of expression in both methods. However, when comparing the DESeq and DEGSeq methods, there was a comparable performance thus there was agreement between the methods. As a whole, the majority of the identified genes occurred in the late post-natal period, namely 90 dpc. Moreover, most of them were down in early postnatal stage (21 dpc) were up in late postnatal period (90 dpc) relating races, commercial and piau and comparing the methods.

Orientadores: Marcelo Menossi Teixeira, Ricardo Aparicio / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-27T14:13:51Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Soares_JoseSergiodeMacedo_D.pdf: 4995080 bytes, checksum: ad3458f447f7044749e0ee6cb95f4315 (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: O agronegócio da cana de açúcar movimenta cerca de R$ 40 bilhões por ano no Brasil. A cadeia produtiva da cana de açúcar como atividade na economia é responsável por 1,5% do produto interno bruto (PIB) nacional e um dos principais componentes econômicos é a quantidade de sacarose acumulada nos colmos. No entanto, a síntese de sacarose e sua acumulação em plantas superiores é o resultado do produto de uma extensa rede de interações. Quando descarregada nas células do parênquima de armazenamento, a sacarose é metabolizada por diferentes enzimas, sendo a UDP-glucose pirofosforilase (UGPase) uma das enzimas responsáveis pela síntese de sacarose em cana de açúcar. O objetivo deste trabalho foi avaliar o padrão de expressão do gene ScUGPase-1 e os mecanismos regulatórios que controlam a atividade da proteína UGPase de cana de açúcar. Análises por RT-qPCR revelaram que a expressão do gene ScUGPase-1 diminui ao longo da maturação dos colmos e o gene é mais expresso nos entrenós em comparação com o tecido de folha. Porém, nenhuma diferença de expressão significativa foi observada entre dois cultivares contrastantes em teor de sacarose. In vivo, a localização subcelular da proteína ScUGPase-1 indicou uma associação à membrana nos tecidos de folha e colmo. Utilizando anticorpo primário fosfo-específico, observamos a fosforilação da proteína ScUGPase-1 apenas na fração solúvel e microssomal do tecido de folha. In vitro, a proteína ScUGPase-1 formou um complexo com a proteína recombinante caseína quinase 1 (CK1) e sua atividade foi afetada por agentes óxido-redutores. Para complementar os dados de óxido-redução, análises de espalhamento de luz a baixo ângulo (SAXS) forneceram o primeiro modelo estrutural do dímero da proteína ScUGPase-1 em solução, destacando que a interface de dimerização está localizada na região C-terminal. Os dados indicam que a fosforilação, interação protéica e oligomerização podem exercem um papel importante na regulação da proteína ScUGPase-1 durante a síntese de sacarose em cana de açúcar. / Abstract:The sugarcane agribusiness generates around R$ 40 billion per year in Brazil, while the entire supply chain of sugarcane is responsible for 1.5% of the gross domestic product (GDP). Sugarcane productivity is mainly determined by the accumulation of sucrose in the culms. However, the synthesis and accumulation of sucrose in plants is the result of an extensive network. When sucrose is unloaded in the storage parenchyma cells, it is metabolized by different enzymes, and UDP-glucose pyrophosphorylase (UGPase) is one of the enzymes responsible for the synthesis of sucrose in sugarcane. The objective of this work was to gain insights on the ScUGPase-1 expression pattern and the regulatory mechanisms that control protein activity. ScUGPase-1 transcript levels were negatively correlated with sucrose content in the internodes and only a slight difference in the expression pattern was observed between two cultivars that differ in their sucrose content. The intracellular localization of ScUGPase-1 indicated association with membranes in both leaves and internodes. Using a phospho-specific antibody, we observed that ScUGPase-1 was phosphorylated in vivo in the soluble and membrane fractions from leaves, but not from internodes. In vitro, the purified recombinant enzyme interacted with recombinant protein casein kinase 1 and its activity was affected by redox modification. To complement the redox data, Small-Angle X-ray Scattering provided the first structural model of the dimer of sugarcane UGPase in solution, highlighting that the dimer interface is located at the C-terminal. The data indicated that phosphorylation, protein interaction and oligomerization may play an important role in the regulation of ScUGPase-1 activity / Doutorado / Genetica de Microorganismos / Mestre em Genética e Biologia Molecular

Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2017-06-05T19:27:04Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1771019 bytes, checksum: b262604d234aeca157bb65df2932b25d (MD5) / Made available in DSpace on 2017-06-05T19:27:04Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1771019 bytes, checksum: b262604d234aeca157bb65df2932b25d (MD5) Previous issue date: 2005-09-28 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / A introdução de características agronomicamente importantes em soja pode ser realizada por transformação genética de plantas como um método alternativo ao melhoramento tradicional. Alterações nas proporções relativas dos ácidos graxos na fração óleo podem ser alcançadas por meio do silenciamento gênico de enzimas dessaturases, responsáveis pela síntese de ácidos graxos polinsaturados. Os objetivos deste trabalho foram: isolar um fragmento do gene da oleoil dessaturase de soja, construir cassete de expressão para a co-supressão deste gene e estabelecer metodologias para a extração e quantificação de ácidos graxos de embriões somáticos. A análise por RT-PCR mostrou que o gene Fad2-1 é expresso em todos os estádios de desenvolvimento da semente. A expressão desse gene aumentou a partir dos estádios iniciais de desenvolvimento e diminuiu em sementes maduras. Um fragmento de cDNA de cerca de 1 kb foi clonado nos vetores binários pCAMBIA 3301 e 1304, cujos T- DNAs apresentam genes para resistência a herbicida e antibiótico, respectivamente. A clonagem foi confirmada por meio de PCR, restrição enzimática e seqüenciamento. A construção clonada no vetor pCAMBIA 3301 foi utilizada para a transformação de soja via Agrobacterium. Embriões somáticos foram originados a partir de cotilédones imaturos cultivados na presença de 40 mg/L de 2,4-D. Agregados de embriões globulares foram transformados com suspensão bacteriana mediante sonicação e adição de acetoseringona e mantidos em meio seletivo com 3 mg/L e 5 mg/L do herbicida Finale → . A maioria dos embriões germinou normalmente em meio sem regulador de crescimento, embora alguns não tenham sido capazes de regenerar plantas. Apenas cinco plantas foram aclimatadas em casa de vegetação, mas não eram transgênicas. As análises moleculares com plântulas e/ou embriões somáticos cotiledonares permitiram a detecção de vários eventos de transformação. O conteúdo de ácidos graxos dos diferentes estádios de desenvolvimento embrionário foi determinado por cromatografia gasosa. Foram observadas mudanças na composição de ácidos graxos no estádio globular, com aumento dos conteúdos de ácido oléico (18:1) e linoléico (18:2) e diminuição de ácido linolênico (18:3). A partir do estádio torpedo, a composição de ácidos graxos não variou significativamente até o final do desenvolvimento, apresentando resultados similares aos de sementes maduras. A análise por RT-PCR mostrou um aumento no acúmulo de transcritos do gene Fad2-1 do estádio globular para torpedo. A expressão desse gene permaneceu relativamente constante até o estádio cotiledonar maduro, com redução da expressão após o processo de dessecação. Os dados quanto aos perfis de ácidos graxos de 138 embriões cotiledonares transformados foram analisados por meio de estatística descritiva para verificar a freqüência dos diferentes eventos de transformação. Oitenta e quatro embriões apresentaram conteúdo de 18:1 semelhante ao controle não transformado (13-21%), 18 apresentaram níveis inferiores (9-13%) e 36 apresentaram níveis aumentados (22-61%), provavelmente como possível conseqüência de silenciamento gênico. Em relação ao conteúdo de 18:2, 88 embriões apresentaram conteúdo semelhante ao controle não transformado (49-59%), 17 apresentaram níveis superiores (59-64%) e 33 apresentaram níveis inferiores de 18:2 (6-49%). Em 101 embriões o conteúdo de 18:3 foi semelhante ao controle não transformado (8-15%), 30 mostraram níveis superiores (15-27%) e 7 mostraram níveis inferiores (4-8%). Os resultados mostraram a existência de modificação na composição de ácidos graxos nos embriões cotiledonares analisados, mas não se pode afirmar que essas alterações sejam causadas por fenômenos de silenciamento gênico. Estes resultados podem ter sofrido a influência de variações somaclonais ou da auxina 2,4-D. / The introduction of agronomically important traits into soybean may be accomplished by genetic transformation of the plants as an alternative method to traditional breeding. Alterations in the relative proportions of the fatty acids in the oil fraction may be reached through gene silencing of desaturase enzymes that are responsible for the synthesis of the polyunsaturated fatty acids. The objectives of this work were: to isolate a fragment of the soybean oleoil desaturase gene; to construct expression cassettes for co-suppression of this gene; and to establish methodologies for the extraction and quantification of fatty acids in soybean somatic embryos. The analysis based on RT-PCR showed that the Fad2-1 gene is expressed in all developmental stages of the seed. The expression of the gene increases after the first stages of development and decreases in the dry seeds. One cDNA fragment around 1 kb was cloned in the binary vectors pCAMBIA 3301 and 1304, in which the T-DNAs harbor genes for resistance to herbicide and antibiotic, respectively. Cloning was confirmed through PCR, enzymatic restriction and sequencing. The constructs cloned in pCAMBIA 3301 were used for the soybean transformation via Agrobacterium. Somatic embryos were obtained from immature cotyledons cultivated in the presence of 2,4-D (40 mg/L). The globular embryo clusters were transformed with bacterial suspension using sonication and addition of acetosyringone and kept in selective medium with 3 mg/L and 5 mg/L of the Finale ® herbicide. Most embryos germinated in medium without growth regulator, however, some of them were not able to regenerate plants. Only five plants were acclimated in the greenhouse, but they were not transgenic. The molecular analyses of seedlings and/or cotyledone somatic embryos allowed the detection of several transformation events. Fatty acid content at different stages of the embryonic development was determined by gas chromatography. Changes in the fatty acid xcompositions at the globular stage were observed. There was an increase on oleic (18:1) and linoleic (18:2) acids contents and a decrease on linolenic acid (18:3) content. From the torpedo stage, the composition of the fatty acids did not vary significantly until the end of the development. The values obtained were similar to those of the dry seeds. The RT-PCR analysis showed an increase on the accumulation of transcripts for the Fad2-1 gene from globular to the torpedo stage. The expression of this gene remained relatively constant until the ripe cotyledonal stage, but there was a reduction on expression after the desiccation process. The data relative to the fatty acid profiles of 138 cotyledonal transformed embryos were analyzed by descriptive statistics in order to verify the frequency of the different transformation events. Eighty-four embryos showed a content of 18:1 similar to the non-transformed control (13-21%), 18 presented lower levels (9- 13%) and 36 presented increased levels (22-61%), probably a possible consequence of gene silencing. In relation to 18:2, 88 embryos presented a content similar to that of the non-transformed control (49-59%), 17 presented higher levels (59-64%) and 33 presented lower levels of 18:2 (6-49%). In 101 embryos, the content of 18:3 was similar to the non-transformed control (8-15%), 30 showed higher levels (15-27%) and 7 showed lower levels (4-8%). The results show that the cotyledonal embryos analyzed had a modified fatty acid composition, but one cannot state that these alterations were caused by the gene silencing phenomenon. These results might have been affected by the influence of either somaclonal variations or the auxin 2,4-D .

COSTA, Washington Luiz Gomes. Análise espacial e temporal da expressão de genes relacionados ao metabolismo de lipídios em sementes de pinhão manso (Jatropha curcas L.). 2013. 87 f. Dissertação (Mestrado em Bioquímica)-Universidade Federal do Ceará, Fortaleza-CE, 2013. / Submitted by Eric Santiago (erichhcl@gmail.com) on 2016-07-19T12:29:04Z No. of bitstreams: 1 2013_dis_wlgcosta.pdf: 2152820 bytes, checksum: afc16b51f6d293f4d04a7abbf8fdca67 (MD5) / Approved for entry into archive by José Jairo Viana de Sousa (jairo@ufc.br) on 2016-08-02T20:28:32Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2013_dis_wlgcosta.pdf: 2152820 bytes, checksum: afc16b51f6d293f4d04a7abbf8fdca67 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-08-02T20:28:32Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2013_dis_wlgcosta.pdf: 2152820 bytes, checksum: afc16b51f6d293f4d04a7abbf8fdca67 (MD5) Previous issue date: 2013 / The depletion of non-renewable energy such as oil, coal and natural gas, has stimulated the search for alternative sources of energy generation. In this context, physic nut (Jatropha curcas L.) has received special attention from researchers due to the presence of large amounts of oil in its seeds that can be converted into biodiesel. The objective of this study was to investigate the behavior of genes related to lipid metabolism during the development and germination of physic nut seeds. To accurately quantify the levels of gene expression by RT-qPCR, a selection of nine candidates for reference genes was performed. Our results showed that the GAPDH, UCP, ACT11, PP2A2 and CICLOF were the most stable genes during the development of the seeds. In germinating seeds, EF1-α, PP2A2, GAPDH, PUB3 and ACT11 were considered the most stable genes. To validate our findings with reference genes, we used the expression profile of the gene encoding the oleosin protein in which that was similar to those observed in the literature evaluated, indicating that they were suitable reference genes for data normalization by RT-qPCR. After obtaining these data, we performed a gene expression study by RT-qPCR of 20 genes involved in lipid metabolism. Our results revealed that the oleosin, β-ketoacyl-ACP Synthase I and II, thioesterase A and triacylglycerol lipase I genes, as well as other genes involved in lipid biosynthesis, achieved high expression levels in developing seeds. Acyl-CoA synthetase, thiolase and triacylglycerol lipase II, genes related to the degradation of lipids, showed high transcript levels in germinating seeds. The data obtained in this study contribute to the understanding of the metabolic pathways studied, providing subsidies for production of improved varieties of physic nut via genetic engineering. / O esgotamento das reservas de energia não-renovável, como petróleo, carvão e gás natural, têm estimulado a busca por fontes alternativas geradoras de energia. Neste contexto, o pinhão manso (Jatropha curcas L.) tem recebido especial atenção por parte dos pesquisadores, devido à presença de grande quantidade de óleo em suas sementes, que pode ser convertida em biodiesel. O objetivo deste trabalho foi investigar o comportamento de genes relacionados ao metabolismo de lipídios durante os processos de desenvolvimento e germinação da semente de pinhão manso. Para quantificar com exatidão os níveis de expressão gênica por RT-qPCR foi feita uma seleção entre nove candidatos a genes de referência. Nossos resultados mostraram que na análise de sementes em desenvolvimento, os genes GAPDH, UCP, ACT11, PP2A2 e CICLOF foram os mais estáveis. Para as sementes em germinação, os genes considerados mais estáveis foram EF1-α, PP2A2, GAPDH, PUB3 e ACT11. Para validar nossos resultados com genes de referência, foi utilizado o padrão de expressão do gene que codifica a proteína oleosina no qual foi observado que o mesmo foi similar aos observados em artigos científicos pesquisados, indicando que os genes de referência estavam apropriados para normalização dos dados de RT-qPCR. Após obtenção desses dados, efetuou-se um estudo da expressão por RT-qPCR de 20 genes envolvidos com o metabolismo de lipídios. Nossos resultados revelaram que os genes oleosina, β-cetoacil-ACP Sintase I e II, tioesterase A e triacilglicerol lipase I, bem como outros genes envolvidos na biossíntese de lipídios, alcançaram altos níveis de expressão no desenvolvimento da semente. Os genes acil-CoA sintetase, tiolase e triacilglicerol lipase II, relacionados com a degradação de lipídios apresentaram altos níveis de transcritos na germinação da semente. Os dados obtidos neste trabalho contribuem para o entendimento das vias metabólicas estudadas, fornecendo subsídios para a produção, via engenharia genética, de variedades melhoradas do pinhão manso.

Submitted by Reginaldo Soares de Freitas (reginaldo.freitas@ufv.br) on 2016-04-28T10:57:56Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 8375227 bytes, checksum: 55dfde271f45ab327a73b5c840bc894d (MD5) / Made available in DSpace on 2016-04-28T10:57:56Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 8375227 bytes, checksum: 55dfde271f45ab327a73b5c840bc894d (MD5) Previous issue date: 2014-02-18 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / O uso da biotecnologia, especialmente com a utilização de técnicas da cultura de tecidos, proporciona uma forma alternativa de propagação das plantas, além de ser importante ferramenta para o melhoramento e conservação dos recursos genéticos. As espécies desse estudo, bastão-do-imperador [Etlingera elatior cv. Porcelana (Zingiberaceae)] e antúrio [Anthurium andraeanum cv. Eidibel (Araceae)] têm elevada importância econômica na floricultura tropical mundial, sendo fundamentais o domínio e o aprimoramento de técnicas biotecnológicas aplicadas à propagação in vitro. Nesse tipo de propagação, de modo especial aplicada às ornamentais, prima-se pela otimização dos sistemas de propagação em larga escala. Na propagação in vitro convencional, o sistema de vedação dos frascos restringe, entre outros fatores, as trocas gasosas, além de dificultar a absorção de água e nutrientes, aumentando as perdas do material vegetal durante a aclimatização. No presente trabalho, para bastão-do-imperador, realizou-se a propagação fotoautotrófica associada ao enriquecimento da atmosfera dos frascos com CO2, com o intuito de rustificar as vitroplantas ainda em condições in vitro, com grandes benefícios à sobrevivência, com o aumento da tolerância aos estresses impostos às plantas na fase de aclimatização, aproximando-as daquelas produzidas em condições de campo. Para o antúrio, o desenvolvimento de técnicas eficientes de propagação in vitro proporcionou perspectivas novas e promissoras para o melhoramento do antúrio, capazes de ampliar a produção comercial e o abastecimento do mercado brasileiro e mundial. Dentre essas técnicas destaca-se a embriogênese somática, pois pode ser aplicada com sucesso na produção de plantas em larga escala, além de ser um modelo para estudos anatômicos, estruturais e moleculares envolvidos na aquisição de competência embriogênica e de grupos de genes especificamente expressos durante a embriogênese somática. O presente trabalho contribuiu para a geração de conhecimentos a cerca da propagação in vitro das espécies a partir das técnicas de propagação fotoautotrófica, em bastão-do-imperador, caracterizando as respostas morfofisiológicas das plantas submetidas a condições de crescimento heterotrófico, fotomixotrófico e fotoautotrófico; e da propagação in vitro do antúrio via embriogênse somática, abordando alterações estruturais e o acúmulo de reservas envolvidas durante a ontogênese dos calos embriogênicos, além de caracterizar e analisar a expressão do gene SERK nessa espécie. / The use of biotechnology, particularly with the use of tissue culture techniques, provides an alternative way of plant propagation, as well as being an important tool for breeding and genetic resources conservation. The species of this study, torch ginger [Etlingera elatior cv. Porcelana (Zingiberaceae)] and anthurium [Anthurium andraeanum cv. Eidibel (Araceae)] present a high economic importance in the global tropical floriculture, being fundamental the domain and enhancement of biotechnological techniques applied to in vitro propagation. This kind of propagation, especially applied to ornamentals, stands out for the optimization of large-scale propagation. In conventional in vitro propagation, the flasks sealing system restricts, among other things, gas exchange, and hinders water and nutrients absorption, increasing losses in the plant material during acclimatization. In the present study, with torch ginger, the photoautotrophic propagation was performed associated with CO2- enriched atmosphere flasks, with the aim of hardening the plantlets even in vitro, with great benefits to survival and increase tolerance to stresses imposed on plants during the acclimatization phase, approaching those produced in the field. To anthurium, the development of efficient in vitro propagation techniques provided new and promising perspectives for the breeding of this specie, able to expand commercial production and supply Brazilian and worldwide market. Among these techniques highlights the somatic embryogenesis, which can be successfully applied in plant production system for large- scale, besides being an ideal system for anatomical, structural and molecular studies involved in the acquisition of embryogenic competence and clusters of genes specifically expressed during somatic embryogenesis. This work contributed to the generation of knowledge about in vitro propagation of the species from photoautotrophic propagation techniques, in torch ginger, characterizing the morphophysiological responses of plants submitted to heterotrophic, photomixotrophic and photoautotrophic growth conditions; and in vitro propagation of anthurium via somatic embryogenesis, addressing structural changes and the accumulation of reserves involved during ontogeny of embryogenic callus, besides characterizing and analyze the expression of SERK gene in this species.

Orientador: Celso Eduardo Benedetti / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-11T01:25:29Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Barbosa_RosiclerLazaro_D.pdf: 3769373 bytes, checksum: ba15f76eb9d63f64834d030ffed2482a (MD5) Previous issue date: 2008 / Resumo: O gene XF0767 de Xylella fastidiosa está localizado num operon composto por mais quatro genes classificados como proteínas hipotéticas (XF0768-XF0767-XF0766-XF0765-XF0764). Este operon está conservado em uma série de bactérias associadas a plantas, incluindo Agrobacterium tumefaciens, Mezorhizobium loti e Sinorhizobium meliloti. A região upstream ao códon de iniciação deste operon possui seqüências canônicas correspondentes a sítios -35 e ¿10 de regiões promotoras reguladas por fatores sigma70. O objetivo deste trabalho foi caracterizar o sistema de regulação do operon pela proteína XF0767, nomeada BigR (biofilm growth-associated repressor), visando à compreensão deste sistema e sua importância para a bactéria. A proteína BigR se liga na seqüência repetida invertida (9-4-9) localizada na região ¿10 do promotor do operon XF0768-0764, denominada BigRbox. BigR inibe a atividade do operon reprimindo a expressão do gene repórter GFP em Escherichia coli, Agrobacterium tumefaciens e Xylella fastidiosa. Mutações no BigRbox dos promotores de Xylella e Agrobacterium afetam a ligação do repressor e abole a transcrição do gene repórter. Esses dados indicam, portanto, que BigR compete com a RNA polimerase pelo mesmo sítio de ligação ao DNA, revelando assim o mecanismo de regulação do operon. BigR apresenta similaridade com fatores transcricionais de bactérias contendo domínio HTH (helix-turn-helix) de ligação ao DNA. Apesar de BigR ter sido inicialmente classificada como uma proteína da família SmtB/ArsR, as quais regulam operons relacionados à resistência a metais, nossos dados indicam que BigR não atua como sensor de metal. A adição de cádmio, ferro e cobre na mistura de ligação causam uma aparente dissociação do complexo DNA/BigR, entretanto, estudos in vivo na presença de metais não evidenciaram nenhuma alteração na expressão do gene repórter. Mutantes deficientes em BigR também não apresentam diferença de crescimento na presença de metais. O gene XF0768 codifica uma proteína nomeada BLH (beta-lactamase-like hydrolase) por pertencer à superfamília das metalo-beta-lactamases. Dada a presença de BigR e BLH no operon de Xylella e Agrobacterium, a atividade do operon foi analisada em diferentes condições como crescimento das células repórter in planta, co-cultivo com bactérias endofíticas e deficiência nutricional. Entretanto, uma maior atividade do operon em Xylella e Agrobacterium foi detectada apenas na condição de biofilme. Células de Agrobacterium aderidas em raiz de tabaco também apresentaram maior expressão do gene repórter quando comparadas às células em suspensão. Mutantes de Agrobacterium deficientes em BigR (bigR-) apresentam maior expressão do gene repórter, confirmando que BigR age como o repressor transcricional do operon. A quantificação da formação de biofilme das células mutante e selvagem revelou uma maior densidade de biofilme no mutante bigR- em superfície de vidro e também maior quantidade de células aderidas em raiz de tabaco, indicando que o operon pode estar envolvido com o processo de adesão ou desenvolvimento do biofilme bacteriano. Do ponto de vista estrutural, foi mostrado que a proteína BigR truncada no N-terminal (?BigR) encontra-se estruturada na forma de trímero, diferindo do observado para as proteínas com domínio HTH que em geral formam dímeros e monômeros. BigR é estável termicamente, começando a perder estrutura à 74oC, mas retendo um sinal residual de a-hélice até 90oC. Tratamentos com altas concentrações de (NH4) SO 2 4 interferiram na ligação da proteína ao DNA alvo e no conteúdo de estrutura secundária sem alterar, contudo, sua estabilidade térmica. A purificação e cristalização da proteína ?BigR resultou na coleta de alguns conjuntos de dados da proteína nativa e derivada, através de soaking ou marcada com SeMet. Apesar dos dados obtidos serem de boa qualidade, até o momento, não foi possível a resolução da estrutura cristalográfica desta proteína / Abstract: The XF0767 gene from Xylella fastidiosa is located in an operon composed by a set of genes (XF0768-XF0767-XF0766-XF0765-XF0764) of unknown function. This operon is conserved in a number of plant-associated bacteria including Agrobacterium tumefaciens, Mezorhizobium loti e Sinorhizobium meliloti. The DNA region upstream of the operon has canonical sequences corresponding to ¿35 and ¿10 elements found in sigma70-regulated promoters. The aim of this work was to elucidate the biological function of the protein encoded by XF0767, named BigR (biofilm growth-associated repressor), as a transcriptional regulator and its importance to the bacteria. BigR binds to an inverted repeat sequence (9-4-9) located in the ¿10 region of the XF0768-0764 operon promoter. This sequence was named BigRbox. BigR repressed transcription of its own operon upon binding to the BigRbox in Xylella fastidiosa and Agrobacterium tumefaciens. Mutations in the BigRbox significantly affected the repressor binding and abolished transcription of the reporter gene in both bacteria, indicating that BigR compete with the RNA polymerase for the same promoter site. BigR is similar to HTH transcriptional factors of the SmtB/ArsR family, which control tolerance and detoxification of heavy metals in prokaryotes. Despite the similarities, BigR does not appear to function as a metal sensor, as initially predicted. Although binding of BigR to its target DNA was diminished in the presence of cadmium, copper and iron, operon regulation in response to metals was not demonstrated in vivo. In addition, Agrobacterium mutants deficient in BigR did not show changes in growth rates in the presence of metals. BLH is an unusual beta-lactamase-like hydrolase coded by the XF0768 gene. To gain insights into the possible function of the operon, the activity of reporter cells was observed in the presence of different compounds and conditions including in planta growth, effect of endophytic competition and nutrient deficiency. Significantly, an increased operon activity was observed in Xylella and Agrobacterium biofilms. Agrobacterium cells attached to tobacco roots also showed high levels of reporter gene expression in comparison to cells in suspension. A. tumefaciens mutants deficient in the BigR showed constitutive expression of the operon, confirming that BigR acts as a transcriptional repressor. Biofilm quantification showed increased biofilm formation in glass surfaces as well as in tobacco roots, indicating that the operon may play a role in cell adherence or biofilm development. Structurally, the truncated BigR protein (?BigR) is a trimmer in solution, as opposed to most HTH regulators known, which are usually found as dimmers or monomers. BigR is stable at high temperatures (74oC); however, treatments with high concentrations of ammonium sulfate interfere with the protein secondary structure and its DNA binding capacity, without affecting its thermal stability. Good quality X-ray diffraction data were collected for the native and derivative ?bigR protein; however, structure resolution was not possible probably due to problems with the crystals / Doutorado / Genetica de Microorganismos / Doutor em Genetica e Biologia Molecular