Submitted by Fabiana Gonçalves Pinto (benf@ndc.uff.br) on 2017-05-17T19:43:15Z No. of bitstreams: 1 Livia Borsato.pdf: 4189084 bytes, checksum: 70c685cf8bd9249e6230aeb588d0bfba (MD5) / Made available in DSpace on 2017-05-17T19:43:15Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Livia Borsato.pdf: 4189084 bytes, checksum: 70c685cf8bd9249e6230aeb588d0bfba (MD5) Previous issue date: 2014 / Mestrado Profissional em Enfermagem Assistencial / O estudo tem como objeto os saberes e práticas dos enfermeiros na orientação da alta hospitalar ao paciente transplantado renal. A pesquisa objetivou descrever os saberes e práticas dos enfermeiros no momento da alta hospitalar ao paciente transplantado renal; caracterizar as orientações de enfermagem na alta hospitalar ao paciente transplantado renal; avaliar a percepção do paciente transplantado renal sobre as orientações de enfermagem fornecidas no momento da alta hospitalar; e elaborar cartilha educativa de orientação de enfermagem para alta hospitalar ao paciente transplantado renal. Trata-se de um estudo descritivo, com abordagem qualitativa, tendo como cenário o Centro de Diálise e Transplante do Hospital Universitário Antônio Pedro (HUAP), localizado na cidade de Niterói, Rio de Janeiro. Os sujeitos foram os 6 enfermeiros lotados no Centro de Diálise e 5 pacientes em pós-operatório de transplante renal com enxerto funcionante. Foi utilizada a técnica de entrevista semiestruturada, com roteiro prévio de perguntas abertas e fechadas, em que também se identificou o perfil sociocultural dos sujeitos do estudo, observando-se os aspectos éticos, segundo a Resolução 466/2012-CNS, com aprovação do CEP parecer número 655.193. A análise dos dados se deu através da análise de conteúdo de Bardin. Os dados foram agrupados em quatro categorias, duas para as entrevistas realizadas aos enfermeiros: 1- Saberes e práticas dos enfermeiros acerca das orientações para alta hospitalar ao paciente transplantado renal; 2-Educação em saúde para alta ao paciente transplantado renal: universo multifacetado de práticas; e duas categorias para as entrevistas realizadas com os pacientes: 1- Vida: história e perspectivas; 2- Transplantei e agora? Os resultados revelaram que os enfermeiros possuem os saberes necessários referentes ao transplante renal, porém vários são os fatores que dificultam a prática de orientações de enfermagem ao paciente, como falta de tempo, de pessoal, de padronização da assistência e de comunicação entre equipe médica e de enfermagem. Quanto às categorias formadas após as entrevistas com os pacientes, observou-se a ausência de noções sobre o transplante renal por parte do paciente no momento da internação. No momento da alta hospitalar, as informações sobre como se cuidar em casa e preservação do enxerto eram fornecidas pela enfermagem de maneira assistemática. A cartilha como Tecnologia Educacional com orientações de enfermagem para a alta hospitalar do paciente transplantado renal servirá de instrumento para suprir as necessidades de informação específicas acerca dos cuidados no domicílio para prevenção de agravos e promoção da saúde a esses pacientes. A utilização da cartilha, que é o produto deste estudo, na alta do paciente transplantado, não solucionará os outros problemas que foram evidenciados para a prestação de uma assistência de enfermagem plena. Contudo, é um passo inicial para incentivar e estimular novos olhares nesse cuidado prestado nesta instituição ao paciente transplantado renal. O estudo não se finaliza aqui por necessitar de validação desta cartilha com a implementação de mudanças efetivas para melhorar a qualidade da assistência de enfermagem prestada ao paciente transplantado renal / This study aims the knowledge and practices of nurses in guiding the hospital discharge to the renal transplanted patient. The research aimed to describe the knowledge and practices of nurses in hospital discharge to renal transplanted patients; characterize the nursing instructions at hospital discharge to renal transplanted patients; assess the perception of renal transplanted patients about the nursing guidance provided at the hospital discharge; and develop educational booklet of nursing orientation for hospital discharge to renal transplanted patients. This is a descriptive study with a qualitative approach, with the Dialysis and Transplant Center of the University Hospital Antonio Pedro (HUAP) as scenery, located in the city of Niterói, Rio de Janeiro. The subjects were 6 nurses of the Dialysis Center and 5 patients in the postoperative of renal transplantation with a functioning graft. The semi-structured interview technique was used, with a previous script of open and closed questions, which also identified the sociocultural profile of the study subjects, observing the ethical aspects, according to Resolution 466/2012-CNS, with the approval of CEP opinion number 655,193. Data analysis was done through the Bardin content analysis. Data were grouped into four categories, two for the interviews performed to nurses: 1-Knowledge and practices of nurses about the guidelines for hospital discharge to renal transplanted patients; 2-Health education of hospital discharge to the renal transplanted patient: multifaceted universe of practices; and two categories for interviews performed with patients: 1- Life: history and perspectives; 2- I transplanted, and now? The results showed that nurses have the necessary knowledge for the renal transplant, but there are several factors that hinder the practice of patient nursing guidelines, such as lack of time, lack of staff, standardization of care and communication between medical and nursing staff. Concerning the categories formed after the interviews with the patients, there was a lack of ideas about renal transplantation by the patient at hospitalization. At the time of hospital discharge, nursing provided the information about how to take care at home and preservation of the graft in an unsystematic way. The booklet as Educational Technology with nursing guidelines for the hospital discharge of renal transplanted patients, will serve as a tool to supply the specific information needs about home care for disease prevention and health promotion to these patients. The use of the booklet, which is the product of this study, at the hospital discharge of the transplanted patient, will not solve the other problems that were highlighted for providing full nursing care. However, it is an initial step to encourage and stimulate new looks in this care provided in this institution to renal transplanted patients. The study does not finish here needing validation of this booklet with the implementation of effective changes to improve the quality of nursing care provided to renal transplanted patients. The study does not finish here need validation of this primer with the implementation of effective changes to improve the quality of nursing care provided to renal transplant patients

Une attention particulière doit être accordée aux jeunes patients transplantés du rein, qui sont prioritaires en France dans l’attribution de greffon rénal. Les objectifs de cette thèse étaient 1) d’étudier la dynamique du risque instantané de la perte du greffon en fonction de l’âge courant après la transplantation chez les jeunes ; 2) de réaliser un revue systématique des modèles de prédiction de perte du greffon rénal tout âge confondu; et 3) de développer et valider un modèle de prédiction adapté à cette jeune population. Pour répondre aux objectifs 1 et 3, nous avons utilisé les données des registres nationaux français REIN et CRITAL qui incluent de manière exhaustive tous les patients transplantés rénaux pédiatriques. Pour l’Objectif 1, une méthode statistique en deux étapes a permis de mettre en évidence une augmentation accrue du risque instantané de perte du greffon au moment de l’adolescence. Pour l’Objectif 2, une revue systématique des articles publiés entre 2005 et 2015 a montré qu’aucun outil prédictif de la perte du greffon n’avait été spécifiquement proposé pour les patients pédiatriques, ni aucun outil de prédiction dynamique tout âge confondu. Pour l’Objectif 3, nous avons développé et validé par validation croisée interne un modèle de prédiction dynamique de perte du greffon pour les jeunes transplantés, à partir d’un modèle conjoint à effets aléatoires partagés. Ce modèle incluait des prédicteurs classiques à l’inclusion défini par le 90ième jour après la transplantation (des caractéristiques du receveur (sexe, âge à la transplantation, durée de dialyse pré-greffe, maladie rénale initiale, nadir du DFGe entre la transplantation et J90), du donneur (âge, type), et de la transplantation (durée d’ischémie froide, nombre d’incompatibilités HLA, statut donneur/receveur pour sérologie CMV)). Le modèle incluait également la trajectoire du DFG estimé après la transplantation, en supposant que le risque instantané de perte du greffon dépendait à la fois du niveau courant du DFG mais aussi de sa pente courante. Nos résultats indiquent que ce modèle avait de bonnes performances prédictives (AUC à 5 ans variant de 0.75 à 0.86 selon les temps de prédiction après la transplantation), bien meilleures que le modèle de Cox classique ne tenant compte que des prédicteurs à l’inclusion (AUC à 5 ans variant de 0.56 à 0.62). Ce modèle permettant la mise à jour à chaque visite clinique après la transplantation, du risque futur de la perte du greffon en fonction de toutes les valeurs observées précédentes du DFG, devra être validé sur d’autres populations que la population française. Nous pensons en effet qu’un tel outil pourrait à terme être utile dans le suivi clinique des jeunes patients transplantés rénaux. / Particular attention should be paid to young patients transplanted from the kidney, which have priority in France in the assignment of renal graft. The objectives of this thesis were 1) to study the dynamics of the hazard of graft failure by current age after transplantation in young people; 2) to carry out a systematic review of prediction models for renal graft failure at all ages; and (3) to develop and validate a prediction model for this young population. To achieve Objectives 1 and 3, we used data from the French national registries REIN and CRISTAL, which included all pediatric renal transplant patients. For Objective 1, a two-stage statistical method revealed an increase in the hazard of graft failure during adolescence. For Objective 2, a systematic review of articles published between 2005 and 2015 showed that no predictive tool for graft failure has been specifically proposed for pediatric patients, as well as no dynamic predictive model for any age. For Objective 3, we developed and validated using internal cross-validation a dynamic prediction model of graft failure for young transplanted patients, using a joint model with shared random effects. This model included standard baseline predictors at the 90th day after transplantation (characteristics of the recipient (sex, age at transplantation, pretrasplant dialysis duration, primary renal disease, nadir of eGFR at J90), the donor (age and type), and transplantation (duration of cold ischemia, number of HLA incompatibilities, donor/recipient cytomegalovirus (CMV) serology status). The model also included the trajectory of GFR estimated after transplantation, assuming that the hazard of graft failure depended on both the current value of eGFR and its current slope. Our results indicate that this model had good predictive performances (AUC at 5 years ranging from 0.75 to 0.86 according to the time at prediction after transplantation), which were much better than the standard Cox model accounting for baseline predictors only (5-year AUC variant from 0.56 to 0.62). This model which allows the prediction of graft failure to be updated at each clinical visit after transplantation based on all previous observed values of eGFR, should be validated on populations other than the French population. We believe that such a tool could ultimately be useful in the clinical follow-up of young kidney transplanted patients.

La transplantation est la meilleure alternative en cas d'insuffisance rénale terminale. Face à la pénurie de greffons, les équipes de transplantation se sont tournées notamment vers les donneurs décédés par arrêt circulatoire (DDAC) non contrôlés. Ces greffons soumis à une période d'ischémie chaude sont plus fragiles. Des méthodes de reconditionnement chez le donneur par refroidissement in situ (RIS) et circulation régionale normothermique (CRN) se sont développées afin de réduire les lésions d'ischémie-reperfusion. Le choix de la méthode est laissé à l'appréciation de chaque équipe et il existe une grande hétérogénéité des pratiques. Après prélèvement, l'utilisation des machines de perfusion hypothermique (MPH) est généralement recommandée. L'optimisation de ces phases de reconditionnement chez le donneur et de conservation hypothermique apparait comme un enjeu majeur de santé publique. Concernant l'optimisation du mode de reconditionnement, la mise au point d'un modèle préclinique porcin parfaitement reproductible a permis de mettre en évidence une supériorité de la CRN sur le RIS. Une durée de CRN de 4 heures minimum sans dépasser 6 heures paraît optimale. Concernant la conservation hypothermique, les MPH permettent le maintien du niveau d'expression des gènes retrouvé en fin de CRN. L'ajout d'une oxygénation active en MPH ou de curcumine en solution statique améliore le devenir du greffon à court et long termes dans un modèle préclinique d'autogreffe. Ce travail pourrait s'étendre à l'étude d'autres organes, d'autres durées d'ischémie chaude et aux DDAC contrôlés afin d'élargir encore le nombre d'organes éligibles à la transplantation. / Transplantation is the best alternative to end-stage renal disease. The shortage of grafts led the transplant teams to consider uncontrolled deceased donors after circulatory death (DCDs). These grafts suffered from a period of warm ischemia and are more vulnerable. Reconditioning methods in the donor by in situ cooling (ISC) and normothermic regional perfusion (NRP) have been developed to reduce the ischemia-reperfusion injuries. Each team has the choice as to the method and there are many different practices. After removal of kidneys, the use of hypothermic perfusion machines (HPM) is generally recommended. The optimization of reconditioning in the donor and hypothermic preservation appears as a major public health challenge. About optimization of the reconditioning method, the development of a high reproducible preclinical porcine model allowed to highlight the superiority of RNP over ISC. NRP duration of 4 hours minimum without exceeding 6 hours seems optimal. About hypothermic preservation, HPM allows to maintain the level of expression of the genes found at the end of RNP. The addition of active oxygenation to HPM or curcumin in static solution improves the graft outcomes in the short and long terms in a preclinical model of auto transplantation. This work could be extended to the study of other organs, other durations of warm ischemia and to controlled DCDs in order to further increase the number of transplantable grafts.

Die Nierentransplantation ermöglicht Patienten die Wiederherstellung der Nierenfunktion. Aufgrund der begrenzten Verfügbarkeit an Organen nimmt dabei die Zahl der Transplantationen von einem lebenden Spender stetig zu. Zudem ermöglichen die präzisen und genauen Vorbereitungen und Abläufe bei Lebendnierenspenden eine bessere 5-Jahres-Überlebensrate als bei Kadaverspenden. Die genetische Verschiedenheit zwischen Spender und Empfänger bedingt jedoch eine lebenslange immunsuppressive Therapie, um Abstoßungsreaktionen und damit das Scheitern einer Organtransplantation zu verhindern. An den Universitätskliniken Leipzig und Halle/Saale besteht diese Therapie aus einer Dreifachkombination von Tacrolimus, Mycophenolat-Mofetil und Prednisolon, wobei mögliche Nebenwirkungen wie opportunistische Infektionen, kardiovaskuläre und metabolische Erkrankungen sowie Tumore in Kauf genommen werden. Zudem besteht für den immunsupprimmierten Organismus die ständige Gefahr einer Abstoßungsreaktion. Diese Aspekte führen bei den Empfängern zu einer massiven Einschränkung der Gesundheit und Lebensqualität. Inwieweit die ausgeprägte Immunsuppression notwendig ist, bleibt unklar und muss individuell festgelegt werden. Bisher existiert kein geeignetes Verfahren für ein Immunmonitoring, weshalb in vielen Fällen eine umfangreiche und überdosierte Immunsuppression in Kauf genommen wird. Im Rahmen dieser Arbeit wurde ein geeignetes Testverfahren, der Elispot-Assay, für die Expression der beiden proinflammatorischen Zytokine IFN-γ und IL-17 erstellt. Dafür wurden die PBMC der Spender und Empfänger aus Vollblut separiert, um sie anschließend sowohl separat als auch in einer Lymphozytenmischreaktion zu untersuchen. Die Darstellung von IL-17 konnte nur aufgrund einer zusätzlichen Stimulation mit OKT3 gelingen, während der IFN-γ-Elispot sowohl im Leerwert als auch unter Stimulation mit IL-2 zu ausreichenden Spotanzahlen führte. Die Spotanzahlen der Spender-PBMC wurden mit Hilfe von γ-Strahlung signifikant reduziert (IFN-γ: p=0,047 | IFN-γ + IL-2: p=0,007 | IL-17: p = 0,001), um in den Lymphozytenmischreaktionen die alleinige Zytokinausschüttung der Empfänger-PBMC messen zu können. Die Spender- PBMC fungierten dabei nur als Antigene. Insgesamt konnten zwischen 2009 und 2012 zwölf von siebzehn Patientenpaaren in die Studie eingeschlossen werden. Die Spotanzahlen der Paare wurden dabei sowohl im IFN-γ- als auch im IL-17-Elispot-Assay zu vier unterschiedlichen Zeitpunkten gemessen (vor Transplantation | 21±3 d postoperativ | 28±3 d postoperativ | 75±15 d postoperativ). In den meisten Fällen zeigte sich vor Transplantation eine erhöhte Spotanzahl im Vergleich zu den drei postoperativen Werten. Zudem stiegen die Spotanzahlen sowohl für IFN-γ als auch für IL-17 nach niedrigen Messergebnissen kurz nach der Transplantation im postoperativen Verlauf wieder an und erreichten in einigen Fällen die Spotanzahl der präoperativen Ausgangswerte. Ein signifikanter Unterschied konnte aufgrund der geringen Fallzahl nicht erreicht werden. Die kurzfristige Reduktion der Spotanzahlen postoperativ ist dabei aller Wahrscheinlichkeit nach auf die hohen Dosen an immunsuppressiven Medikamenten zurückzuführen. Insgesamt zeigten die Verläufe der IFN-γ- und der IL-17- Elispot-Assays ähnliche Verläufe. Daraus lässt sich schlussfolgern, dass der IL-17-Elispot- Assay in Bezug auf mögliche Abstoßungsreaktionen eine ähnliche Aussagekraft besitzen könnte wie der bereits vielfach untersuchte IFN-γ-Elispot-Assay. Weiterhin wurden die Messergebnisse mit der Serumkreatininmolarität verglichen. Diese zeigte präoperativ höhere Molaritäten als postoperativ, wobei die postoperativen Molaritäten im Verlauf, im Gegensatz zu den Elispot-Messungen, abnahmen, was das Einsetzen der Nierenfunktion widerspiegelt. Unter den zwölf Patientenpaaren gab es keine einzige nachgewiesene akute Abstoßungsreaktion, der Verlauf der Serumkreatininmolaritäten war bei allen zwölf Empfängern vergleichbar. Demzufolge konnten die Werte der Elispot-Assays nicht herangezogen werden, um an ihnen eine Abstoßungsreaktion der transplantierten Nieren erkennen zu können. Das präoperative Abschätzen einer möglichen Abstoßungsreaktion anhand der Elispot-Assays konnte aufgrund fehlender Abstoßungsreaktionen ebenfalls nicht untersucht werden. Zusätzlich wurde bei den Patienten eine HLA-Typisierung vorgenommen, wobei der Bereich von optimalen bis maximal ungünstigen Konstellationen reichten (HLA-Mismatch: 0-0-0 bis 2-2-2). Auch hier konnten die Ergebnisse nicht mit möglichen Abstoßungsreaktionen verglichen werden. In der vorliegenden Arbeit wurden zahlreiche Varianten untersucht, die das Abschätzen einer Immunreaktion nach Nierentransplantation (Immunmonitoring) ermöglichen könnten. Aufgrund fehlender Abstoßungsreaktionen bei den Empfängern konnte das Testverfahren nicht an den klinischen Verläufen validiert werden. Mit dem in dieser Arbeit entwickelten Messverfahren kann jedoch eine neue und größer angelegte Studie erfolgen, die in Zukunft ein Immunmonitoring bei Patienten nach Nierentransplantation ermöglicht. / Introduction Since the first kidney transplantation in the 1950ies, kidney transplantation is still being challenged by graft dysfunction and complete graft failure. Permanent immunsuppressive treatment is mandatory to avoid an unfavourable outcome. The treatment with Prednisolone, Tacrolimus and Mycophenolat-Mofetil may cause toxic side effects resulting in Diabetes mellitus, hypertension, infections and cancer. In the present study we tried to demonstrate that the amount of spots in the Enzyme linked immunospot assay (Elispot-Assay) of IFN-γ and IL-17 correlates with the probability of graft dysfuction and complete graft failure. We also compared the results to clinical parameters. Methods Between the years 2009 and 2012, twelve pairs of related living kidney transplantations were included in this study. From each pair blood samples were taken at four time points (before transplantation, and at 21±3, 28±3 and 75±15 days after kidney transplantation, respectively). After establishing the technique of IFN-γ- and IL-17-Elispot-Assays, we separated the periphale blood mononuclear cells (PBMC) and performed follow up examinations at the four time points mentioned above. The PBMC of each donor and each recipient were examined separatly, and in addition together in a lymphocyte mixed reaction. We stimulated the PBMC of the IFN-γ-Elispot with Interleukin-2 (IL-2) and the PBMC of the IL-17-Elispot with OKT3 to get significant characteristics. PBMC of the donors were irradiated with 30 Gy before mixing them with the PBMC of the recipients. We also took the HLA-matches and serum creatinine molarity to compare important clinical parameters with the results of the Elispot-Assays. Results Sufficient spots were measured using the unstimulated and stimulated IFN-γ-Elispot and the stimulated IL-17-Elispot. Radiation was significant at all three tests (IFN-γ: p=0,047 | IFN-γ + IL-2: p=0,007 | IL-17: p = 0,001). All twelve recipients showed a high number of spots before transplantation in both types of Elispot-Assays and most of them an increasing number of spots after a minimal turning point three weeks after transplantation. Due to the small number of cases, no significant results could be obtained at follow up. Non recipient developed a graft rejection as proven by biopsy or graft failure. The molarity of serum creatinine was permanently reduced whereas it was high before transplantation. Because of the abscence of any rejection episodes, HLA matches could not be compared. Discussion Due to the absence of rejection episodes or graft failure, no prediction for rejection by the IFN-γ- and IL-17-Elispot was possible. The low number of cases of living related kidney transplantation demonstrated the challange of the investigation of living related kidney transplantation. Although we could prove a significant effect of the irradiation of PBMC, there was no significant result in the follow up investigations. A higher number of cases are needed in future investigations. The established method of the IFN-γ- and IL-17-Elispot can be used in a future study with an extended number of cases and a longer follow up of time.

Le potentiel régulateur des lymphocytes B (LB), largement associé avec la production d’interleukine-10 (IL-10), a été mis en évidence dans des modèles murins de pathologies spécifiques d’Ag. Les cellules B transitionnelles (Tr.) CD24fortes CD38fortes ont été décrites comme régulatrices, au travers de la production d’IL-10, de l’inhibition de la prolifération T, ainsi que de la suppression de la réponse inflammatoire des cellules T. Les LB transitionnels représentent un stade de développement central dans la maturation des cellules B, en faisant le lien entre les cellules immatures de la moelle osseuse et celles matures situées dans les organes lymphoïdes secondaires. Dans une première étude, nous montrons que cette population est hétérogène, et composée de LB Tr. de type 1 (T1), T2, T3 et Tr. CD27+. Les LB T3 anergiques semblent jouer un rôle dans la tolérance périphérique en limitant la prolifération des lymphocytes T (LT) CD4+, tandis que les LB Tr. CD27+ IL-10+ nouvellement décrits inhibent la différenciation des LT CD4+ en cellules productrices d’IFN-γ et de TNF-α. Notons que les LB T1 et Tr. CD27+ se différencient rapidement en cellules productrices d’Ac suite à la reconnaissance de signaux de l’immunité innée. La production d’IL-10 est en partie dépendante des signaux perçus, provenant du microenvironnement. Nous avons décrit dans un second travail que les LB s’adaptent aux cellules avec lesquelles ils sont cultivés. En effet, les cellules B régulent spécifiquement les LT CD4+ mémoires (et non naïfs), en limitant leur prolifération avant d’induire une mort cellulaire. Ces caractéristiques fonctionnelles pourraient être associées avec une modification du programme transcriptionnel, permise par la plasticité des cellules B, qui se polarisent en LB régulateurs (Breg) de façon ciblée. L’expression des gènes PRDM1 et IL10 serait associée avec une signature Breg spécifique en culture mixte autologue, en opposition avec celle des gènes NFκB1 et BCL6. La transplantation rénale est un excellent modèle physiopathologique, pour étudier l’importance de certaines populations de LB dans la tolérance immunologique. L’étude BHL (B lymphocytes in humoral rejection and alloimmunisation) nous a permis de confirmer que les LB Tr. ont probablement un rôle important dans cette tolérance du greffon. La présence d’anticorps spécifiques du donneur (DSA) semble limiter l’émergence des LB Tr., même si le pourcentage de cellules B CD24fortes CD38fortes n’est a priori pas associé avec la capacité du compartiment lymphocytaire B à réguler la prolifération des cellules T des patients alloimmunisés. / Regulatory B cells (Breg) were first reported to be interleukine-10 (IL-10) producing B cells in mice. The almost concurrent discovery of Breg cells drew interest toward potential links with transitional B cells because of phenotypic and functional similarities. In addition with IL-10 production, CD24high CD38high transitional B cells limit the proliferation of T cells and the polarization of CD4+ T cells into Th1 cells. Transitional B cells represent a central developmental stage in B-cell maturation, linking generation in the bone marrow with differentiation in periphery. In a first study, we reveal for the first time that human transitional B cells encompass not only transitional type 1 and type 2 B cells, but also distinct anergic type 3 B cells, as well as IL-10-producing CD27+ transitional B cells. Interestingly, the latter two subsets differentially regulate CD4+ T-cell proliferation and polarization toward Th1 effector cells. Additional experiments showed that type 1 and CD27+ transitional B cells are capable to differentiate into antibody secreting cells after toll-like receptor 9 engagement. In a second work, we wanted to explore the ability of B cells to target T-cell populations. We demonstrate that B cells can be suppressive cells. B cells are capable to target CD4+ memory T-cell, limiting the proliferation and inducing the death of this T-cell population. At the opposite, B cells seem to be effector of CD4+ naïve T-cell functions. These properties are probably associated with a specific transcriptional program. Thus, we observed that suppressive B cells overexpress PRDM1 and IL10, whereas effector B cells preferentially express BCL6 and NFκB1 in in vitro mixed culture. In the last part, we worked on B-cell phenotype and functions in transplanted patients. BHL (B lymphocytes in humoral rejection and alloimmunisation) is a clinical study that aims to better understand the role of B cells in the alloimmunisation and the chronic rejection occurring after renal transplantation. Donor specific antibodies (DSA) seem to limit the expansion of transitional B cells, which are probably not associated with the ability of B cells to regulate T-cell proliferation in DSA+ patients.

Le syndrome d'ischémie-reperfusion (IR), inhérent à la transplantation rénale, est caractérisé par un infiltrat leucocytaire important et des lésions tissulaires graves dont les signaux initiateurs restent à ce jour peu décrits. Postulant que la libération d'alarmines par les cellules en nécrose est décisive dans ce processus, l'objectif principal du présent travail a été d'étudier la contribution de l'alarmine IL-33 dans la genèse des lésions tissulaires dans un modèle murin d'IR rénale. Nos résultats montrent que l'IL-33 est rapidement libérée du rein après IR comme protéine circulante, dès une heure de reperfusion. Les souris IL-33gt/gt, déficientes en IL-33, sont moins sensibles aux lésions induites par l’IR, comme l'attestent le maintien de la fonction rénale et des lésions histologiques atténuées avec un recrutement de polynucléaires neutrophiles (PNN) diminué par rapport aux souris contrôles. Ceci est associé à la perte du recrutement de cellules iNKT productrices d'IFN-γ/IL-17A. Parallèlement, les souris Jα18KO, déficientes en cellules iNKT et protégées contre les lésions d'IR, possèdent également des niveaux élevés d'IL-33 circulante. Nous proposons donc que l'IL-33 endogène contribue aux lésions d'IR en favorisant le recrutement de cellules iNKT, conduisant ainsi à un recrutement amplifié de PNN au niveau du rein lésé. Notre étude, en identifiant l'alarmine IL-33 comme un médiateur précoce de la réponse immunitaire innée induite par l'IR rénale, mettant en jeu les cellules iNKT, contribue à la compréhension des mécanismes impliqués dans la genèse des lésions associées à la greffe rénale et permet de proposer de nouvelles stratégies thérapeutiques. / Ischemia-reperfusion (IR) injury in renal transplantation is characterized by leukocyte infiltration and tissue damage. However, the signals that initiate these events remain poorly understood. Assuming that alarmin release by necrotic cells during IRI is critical, the main objective of the present study was to investigate the role of alarmin IL-33 in kidney injury using a mouse model of renal IR. We observed release of IL-33 shortly after kidney IR concomitantly with an increase in plasma levels of IL-33 within one hour of reperfusion. IL-33 deficient mice (IL-33gt/gt) exhibited reduced renal IR-induced injury, as attested by function preservation, reduced histological change and attenuation of neutrophil recruitment compared to control mice. This was associated with the loss of IFN-γ/IL-17A-producing iNKT cell recruitment. In the meantime, iNKT cell-deficient (Jα18KO) mice, also protected against IRI, have increased levels of circulating IL-33.These findings lead us to propose that endogenous IL-33 contributes to kidney IRI by promoting iNKT cell recruitment and cytokine production, thereby promoting amplified neutrophil recruitment to the injured kidney. The present study identifies the nuclear alarmin interleukin (IL)-33 as an important and early mediator of innate immune response, involving iNKT cells, following experimental kidney ischemia-reperfusion in mice. Our findings contribute to a better understanding of IR-induced injury and may lead to new therapeutic insights into renal-induced injury associated with renal transplantation.

Made available in DSpace on 2014-12-17T15:32:30Z (GMT). No. of bitstreams: 1 AdrianaGA_TESE.pdf: 950866 bytes, checksum: c8ffb7409c37936ff546c9f7cffeb2d8 (MD5) Previous issue date: 2012-02-29 / The present study evaluated the influence of non-surgical periodontal treatment on the levels of C- reactive protein (hsCRP) in patients with chronic renal failure (CRF) in pretransplant. We conducted a controlled and randomized trial to evaluate the periodontal condition and plasma concentrations of hsCRP, albumin and transferrin in 56 dialysis patients divided into two groups: experimental and control. The study was conducted at the dental clinic of Family and Community Health s Unit (USFC), located in Onofre Lopes University Hospital (HUOL), Federal University of Rio Grande do Norte (UFRN), from December 2010 to November 2011. Severe periodontitis was the type of periodontal disease more common, affecting 78.6% of patients. Periodontal conditions, evaluated through the means of probing depth, clinical attachment level, bleeding index and plaque index, proved to be uniform for both groups at the initial examination. There were no differences in levels of inflammatory markers between the two groups. The analysis of the concentrations of hsCRP allowed classifying study participants as at high risk of developing cardiovascular disease. After completion of periodontal treatment in the experimental group, there was a statistically significant reduction of the mean of all periodontal parameters assessed; however this improvement of periodontal health was not accompanied by changes in the levels of hsCRP, albumin and transferrin in the evaluation time. Given this, the periodontal treatment did not promote the reduction of systemic inflammatory burden and risk of cardiovascular complications in patients with CRF / O presente estudo se prop?s a avaliar a influ?ncia do tratamento periodontal n?o cir?rgico sobre os n?veis da prote?na C reativa (PCR-US) em indiv?duos com Insufici?ncia Renal Cr?nica (IRC) em fase de pr?-transplante. Realizou-se um ensaio cl?nico, controlado e randomizado para avaliar as condi??es periodontais e as concentra??es plasm?ticas de PCRUS, albumina e transferrina em 56 pacientes dial?ticos com doen?a periodontal divididos em dois grupos: Experimental e Controle. O estudo foi realizado no ambulat?rio odontol?gico da Unidade de Sa?de Familiar e Comunit?ria (USFC), localizada no Hospital Universit?rio Onofre Lopes (HUOL), Universidade Federal do Rio Grande do Norte (UFRN), no per?odo de dezembro de 2010 a novembro de 2011. A periodontite severa foi o tipo de doen?a periodontal mais frequente, acometendo 78,6% dos pacientes. As condi??es periodontais, avaliadas atrav?s das m?dias da profundidade de sondagem, n?vel de inser??o cl?nica, ?ndice de sangramento e ?ndice de biofilme se mostraram uniformes para os dois grupos no exame inicial. Tamb?m n?o foram encontradas diferen?as nos n?veis dos marcadores inflamat?rios entre os grupos. A an?lise inicial das concentra??es da PCR-US permitiu classificar os participantes do estudo como de alto risco para o desenvolvimento de doen?as cardiovasculares. Ap?s a realiza??o do tratamento periodontal no grupo Experimental, houve redu??o estatisticamente significante das m?dias de todos os par?metros periodontais avaliados, entretanto esta melhora das condi??es de sa?de periodontal n?o foi acompanhada pela altera??o dos n?veis da PCR-US, albumina e transferrina no tempo de avalia??o da pesquisa. Diante disto, o tratamento periodontal n?o promoveu a redu??o da carga inflamat?ria sist?mica e o risco de desenvolvimento de complica??es cardiovasculares nos indiv?duos com IRC

Les alloanticorps anti-HLA sont dirigés vis-à-vis de différents épitopes des molécules du système HLA. Cette immunisation survient lors d'une transplantation d'organe, de transfusions sanguines ou d'une grossesse. On retrouve aussi ces anticorps, lorsque les techniques de détection sont sensibles, en l'absence de tout évènement immunisant. En transplantation d'organe, rénale en particulier, la présence d’anticorps anti-HLA, du fait des lésions de rejet humoral qu'ils induisent, constitue une des premières causes de perte de fonction des greffons à moyen et long terme. Néanmoins, les cellules lymphocytaires qui sont la source de ces anticorps anti-HLA demeurent mal identifiées.Dans la première partie de ce travail, nous avons étudié, dans une cohorte de patients en attente de transplantation rénale, la distribution des différentes sous-populations lymphocytaires B circulantes par cytométrie de flux en relation avec la nature des évènements immunisants vis-à-vis du système HLA, la présence et la diversité des anticorps anti-HLA. Nous avons étudié en parallèle les concentrations sériques de BAFF ("B cell activating factor belonging to the TNF family"), principal facteur impliqué dans la survie et la différenciation des lymphocytes B matures. Nous avons retrouvé une association entre la présence et la diversité des anticorps anti-HLA, et l'augmentation de la proportion de lymphocytes B naïfs activés Bm2, par rapport aux autres sous-populations lymphocytaires B, et indépendamment de l'existence d'évènements immunisants. Les concentrations sériques de BAFF étaient également associées positivement à la présence et à la diversité des anticorps anti-HLA. Ces données suggèrent que l'augmentation des lymphocytes B naïfs activés et des concentrations sériques de BAFF favorise le développement des anticorps anti-HLA à la suite d'un événement immunisant. A l'instar du mécanisme évoqué en auto-immunité, BAFF pourrait intervenir en présence de l'alloantigène en favorisant la survie de clones B alloréactifs.Dans la deuxième partie de notre travail, nous nous sommes intéressés plus particulièrement à l'implication des lymphocytes B mémoire alloréactifs dans la réponse humorale anti-HLA. Pour détecter les lymphocytes B mémoire circulants, nous avons utilisé un test de stimulation polyclonale permettant leur différenciation en plasmablastes puis nous avons recherché et étudié la spécificité des anticorps anti-HLA produits dans les surnageants de culture. Un premier résultat important a été la possibilité de détecter, chez les patients présentant des anticorps anti-HLA, des lymphocytes B mémoire alloréactifs circulants plusieurs années après un événement immunisant. En deuxième lieu, la présence de ces lymphocytes B mémoire était associée au nombre d'évènements immunisants. En effet, les patients ayant développé, en l'absence d'événement immunisant des anticorps anti-HLA - dont nous montrons par ailleurs le caractère potentiellement pathogène - n'ont pas présenté de lymphocytes B mémoire alloréactifs circulants. Enfin, à l'aide du logiciel HLAMatchmaker, nous avons montré que les anticorps produits par les lymphocytes B mémoire étaient dirigés contre un nombre restreint d'épitopes partagés par plusieurs antigènes HLA, ce qui suggère une oligoclonalité du contingent B mémoire alloréactif. Chez les mêmes patients, les anticorps anti-HLA circulants présentaient une diversité de spécificité plus large, étant dirigés contre de multiples épitopes HLA. Ces résultats suggèrent l'existence d'au moins deux types de réponse humorale vis-à-vis des alloantigènes HLA : l'une aboutissant à la production de lymphocytes B mémoire et de plasmocytes à la suite d'une réaction de centre germinatif T-dépendante, l'autre impliquant seulement des plasmocytes, possiblement issus de réponses extra-folliculaires. Les facteurs orientant vers l’un ou l’autre type de réponse sont encore mal définis mais pourraient impliquer la dose et la voie d'exposition aux alloantigènes. / Anti-HLA antibodies are directed against various epitopes of HLA molecules. They develop during organ transplantations, red cell transfusions or pregnancies. But anti-HLA antibodies are also detected with sensitive assays in the absence of any sensitizing event. In renal transplantation, anti-HLA antibodies, through the development of antibody-mediated rejection, represent the first cause of late allograft loss. Nevertheless, the mechanisms and the exact nature of B cells involved in anti-HLA antibodies synthesis are poorly understood.In a first part, we studied by flow cytometry in patients awaiting kidney transplantation the distribution of the different peripheral B cell subsets in relation with immunizing events, titer and diversity of anti-HLA antibodies. We also studied the serum levels of BAFF ("B cell activating factor belonging to the TNF family"), the main factor involved in survival and differentiation of mature B cells. We found an association between the presence and the diversity of anti-HLA antibodies, and the proportion of activated naive Bm2 B cells, at the expense of other subsets, independently of immunizing events. BAFF serum levels were also positively associated with the presence and the diversity of anti-HLA antibodies. These data suggest that the increase in activated naive B cells and in BAFF levels facilitate the development of anti-HLA antibodies, following an immunizing event. Similarly to what is observed in autoimmunity, BAFF could help to the positive selection of alloreactive B cell clones, in the presence of alloantigen.In a second part, we focused on the role of circulating alloreactive memory B cells in anti-HLA humoral response. To detect those alloreactive memory B cells, we used a polyclonal stimulation assay allowing the differentiation of memory B cells into plasmablasts and we studied the specificity of anti-HLA antibodies recovered from culture supernatant. A first important result was the detection, decades after an imunizing event, of specific alloreactive memory B cells, even in the absence of the antigen. The detection of those circulating alloreactive memory B cells was related to the strength of immunizing events, i.e. the number of different immunizing events in the history of patients. Indeed, patients with anti-HLA antibodies with no history of immunizing event had no circulating alloreactive memory B cells. Eventually, with HLAMatchmaker software, we showed that antibodies produced by memory B cells were directed against a limited number of epitopes shared by HLA antigens, which suggests an oligoclonality of the alloreactive memory B cell population. By comparison, serum antibodies displayed a greater diversity, with multiple epitopic specificities. These results suggest two distinct cellular arms of humoral response towards HLA epitopes: medullar plasma cells, involved in long term HLA antibodies synthesis, and memory B cells waiting for a recall response in the presence of the antigen. The factors involved in the choice of those two cellular fates are poorly understood but may involve dose and route of exposition to the alloantigen.

Afin de mieux connaitre puis d'optimiser les trajectoires suivies par les patients arrivés au stade terminal de leur insuffisance rénale chronique, il a été nécessaire de mettre au point des outils permettant de modéliser ces trajectoires complexes. Les différentes modalités de traitement n'ont pas été comparées une à une mais une approche globale a été privilégiée tenant compte d'une vision intégrée où les modalités de traitement sont considérées comme complémentaires et non concurrentielles. Ce travail de modélisation a utilisé des modèles à compartiments avec prise en compte de risque concurrents et un modèle de mélange pour données de survie avec fraction non à risque. Les paramètres des modèles ont été estimés à partir des données du registre du Réseau Épidémiologie et Information en Néphrologie (REIN). L'outil de prédiction développé a également pu être alimenté par les données de remboursement de l'assurance maladie (SNIIRAM) sur l'année 2009. Cette première version de l'outil a permis d'évaluer les conséquences en termes d'espérance de vie restreinte à 15 ans et de coût moyen par mois de différentes stratégies simulées de prise en charge des patients en IRCT dans le cadre d'une analyse médico-économique, en partenariat avec la Haute Autorité de Santé. L'objectif final de ce travail sera de proposer des outils d'aide à la décision reposant sur des stratégies de prise en charge les mieux adaptées aux besoins des patients. A terme, les outils développés lors de ce travail pourraient également servir de base à une plateforme de simulation afin d'accompagner les décideurs publics lors de la réflexion sur les schémas d'organisation sanitaire / In order to better understand and then optimize the trajectories followed by end-stage renal disease patients, it was necessary to develop tools to model these complex trajectories. The different treatment modalities were not compared but a comprehensive approach was preferred taking into account an integrated vision where treatment modalities are considered complementary and non-competitive. We used compartments models which took into account competitive risk and a mixture model for survival with fraction not at risk. The model parameters were estimated from the data from the Renal Epidemiology and Information Network registry. Reimbursement data from the national health insurance (SNIIRAM) were also used. The prediction tool developed was used to evaluate the consequences in terms of expected 15- years restricted lifetime and average cost per month for different strategies in a medicoeconomic analysis, in partnership with the Haute Autorité de Santé. The final aim of this work is to offer decision support tools based on strategies best adapted to patients’ needs. The tools developed in this work could also serve as a basis for a simulation platform to accompany public decision-makers in their reflection on health organization

Die Nierentransplantation ermöglicht Patienten die Wiederherstellung der Nierenfunktion. Aufgrund der begrenzten Verfügbarkeit an Organen nimmt dabei die Zahl der Transplantationen von einem lebenden Spender stetig zu. Zudem ermöglichen die präzisen und genauen Vorbereitungen und Abläufe bei Lebendnierenspenden eine bessere 5-Jahres-Überlebensrate als bei Kadaverspenden. Die genetische Verschiedenheit zwischen Spender und Empfänger bedingt jedoch eine lebenslange immunsuppressive Therapie, um Abstoßungsreaktionen und damit das Scheitern einer Organtransplantation zu verhindern. An den Universitätskliniken Leipzig und Halle/Saale besteht diese Therapie aus einer Dreifachkombination von Tacrolimus, Mycophenolat-Mofetil und Prednisolon, wobei mögliche Nebenwirkungen wie opportunistische Infektionen, kardiovaskuläre und metabolische Erkrankungen sowie Tumore in Kauf genommen werden. Zudem besteht für den immunsupprimmierten Organismus die ständige Gefahr einer Abstoßungsreaktion. Diese Aspekte führen bei den Empfängern zu einer massiven Einschränkung der Gesundheit und Lebensqualität. Inwieweit die ausgeprägte Immunsuppression notwendig ist, bleibt unklar und muss individuell festgelegt werden. Bisher existiert kein geeignetes Verfahren für ein Immunmonitoring, weshalb in vielen Fällen eine umfangreiche und überdosierte Immunsuppression in Kauf genommen wird. Im Rahmen dieser Arbeit wurde ein geeignetes Testverfahren, der Elispot-Assay, für die Expression der beiden proinflammatorischen Zytokine IFN-γ und IL-17 erstellt. Dafür wurden die PBMC der Spender und Empfänger aus Vollblut separiert, um sie anschließend sowohl separat als auch in einer Lymphozytenmischreaktion zu untersuchen. Die Darstellung von IL-17 konnte nur aufgrund einer zusätzlichen Stimulation mit OKT3 gelingen, während der IFN-γ-Elispot sowohl im Leerwert als auch unter Stimulation mit IL-2 zu ausreichenden Spotanzahlen führte. Die Spotanzahlen der Spender-PBMC wurden mit Hilfe von γ-Strahlung signifikant reduziert (IFN-γ: p=0,047 | IFN-γ + IL-2: p=0,007 | IL-17: p = 0,001), um in den Lymphozytenmischreaktionen die alleinige Zytokinausschüttung der Empfänger-PBMC messen zu können. Die Spender- PBMC fungierten dabei nur als Antigene. Insgesamt konnten zwischen 2009 und 2012 zwölf von siebzehn Patientenpaaren in die Studie eingeschlossen werden. Die Spotanzahlen der Paare wurden dabei sowohl im IFN-γ- als auch im IL-17-Elispot-Assay zu vier unterschiedlichen Zeitpunkten gemessen (vor Transplantation | 21±3 d postoperativ | 28±3 d postoperativ | 75±15 d postoperativ). In den meisten Fällen zeigte sich vor Transplantation eine erhöhte Spotanzahl im Vergleich zu den drei postoperativen Werten. Zudem stiegen die Spotanzahlen sowohl für IFN-γ als auch für IL-17 nach niedrigen Messergebnissen kurz nach der Transplantation im postoperativen Verlauf wieder an und erreichten in einigen Fällen die Spotanzahl der präoperativen Ausgangswerte. Ein signifikanter Unterschied konnte aufgrund der geringen Fallzahl nicht erreicht werden. Die kurzfristige Reduktion der Spotanzahlen postoperativ ist dabei aller Wahrscheinlichkeit nach auf die hohen Dosen an immunsuppressiven Medikamenten zurückzuführen. Insgesamt zeigten die Verläufe der IFN-γ- und der IL-17- Elispot-Assays ähnliche Verläufe. Daraus lässt sich schlussfolgern, dass der IL-17-Elispot- Assay in Bezug auf mögliche Abstoßungsreaktionen eine ähnliche Aussagekraft besitzen könnte wie der bereits vielfach untersuchte IFN-γ-Elispot-Assay. Weiterhin wurden die Messergebnisse mit der Serumkreatininmolarität verglichen. Diese zeigte präoperativ höhere Molaritäten als postoperativ, wobei die postoperativen Molaritäten im Verlauf, im Gegensatz zu den Elispot-Messungen, abnahmen, was das Einsetzen der Nierenfunktion widerspiegelt. Unter den zwölf Patientenpaaren gab es keine einzige nachgewiesene akute Abstoßungsreaktion, der Verlauf der Serumkreatininmolaritäten war bei allen zwölf Empfängern vergleichbar. Demzufolge konnten die Werte der Elispot-Assays nicht herangezogen werden, um an ihnen eine Abstoßungsreaktion der transplantierten Nieren erkennen zu können. Das präoperative Abschätzen einer möglichen Abstoßungsreaktion anhand der Elispot-Assays konnte aufgrund fehlender Abstoßungsreaktionen ebenfalls nicht untersucht werden. Zusätzlich wurde bei den Patienten eine HLA-Typisierung vorgenommen, wobei der Bereich von optimalen bis maximal ungünstigen Konstellationen reichten (HLA-Mismatch: 0-0-0 bis 2-2-2). Auch hier konnten die Ergebnisse nicht mit möglichen Abstoßungsreaktionen verglichen werden. In der vorliegenden Arbeit wurden zahlreiche Varianten untersucht, die das Abschätzen einer Immunreaktion nach Nierentransplantation (Immunmonitoring) ermöglichen könnten. Aufgrund fehlender Abstoßungsreaktionen bei den Empfängern konnte das Testverfahren nicht an den klinischen Verläufen validiert werden. Mit dem in dieser Arbeit entwickelten Messverfahren kann jedoch eine neue und größer angelegte Studie erfolgen, die in Zukunft ein Immunmonitoring bei Patienten nach Nierentransplantation ermöglicht.:I Inhaltsverzeichnis................................................................I II Bibliographische Beschreibung....................................................................IV III Abkürzungsverzeichnis...................................................................................V 1 Einleitung...........................................................................................................01 1.1 Die T-Zell-vermittelte Immunität..................................................................01 1.1.1 Die verschiedenen Klassen der T-Lymphozyten................................ 01 1.1.2 Interferon-gamma als proinflammatorisches Zytokin......................... 04 1.1.3 Interleukin-17............................................................................................. 04 1.2 Die Nierentransplantation........................................................................... 05 1.2.1 Einführung.................................................................................................. 05 1.2.2 Besonderheiten der Lebendnierenspenden........................................ 06 1.3 Therapeutika bei Lebendnierenspenden................................................. 07 1.3.1 Calcineurininhibitoren............................................................................... 07 1.3.2 Prednisolon.................................................................................................. 08 1.3.3 Mycophenolat-Mofetil................................................................................. 09 1.4 Komplikationen bei Transplantationen....................................................... 10 1.4.1 Opportunistische Infektionen..................................................................... 10 1.4.2 Kardiovaskuläre und metabolische Erkrankungen................................ 11 1.4.3 Maligne Tumore.............................................................................................11 1.5 Transplantatrejektion........................................................................................ 12 1.5.1 Akute Abstoßungsreaktion............................................................................12 1.5.2 Chronische Transplantatnephropathie......................................................13 1.6 Zielsetzung der Arbeit.......................................................................................15 I2 Materialien und Methoden................................................................................. 16 2.1 Studiendesign.................................................................................................... 16 2.2 Materialien.......................................................................................................... 17 2.3 Methoden............................................................................................................ 19 2.3.1 Blutentnahmen................................................................................................ 19 2.3.2 Lymphozytenseparation.................................................................................19 2.3.3 Bestimmung der Zellzahl............................................................................... 20 2.3.4 Kryokonservierung der Zellen...................................................................... 20 2.3.5 Auftauen von kryokonservierten Zellen...................................................... 20 2.3.6 Bestrahlung von Zellen...................................................................................21 2.3.7 Stimulanzien.................................................................................................... 21 2.3.8 Durchflusszytometrie...................................................................................... 22 2.3.9 Elispot-Assay.................................................................................................... 23 3 Ergebnisse............................................................................................................... 29 3.1 Charakteristika der Patienten............................................................................ 29 3.2 Medikamentöse Therapieschemata nach Nierentransplantationen.......... 32 3.3 Versuche zur Etablierung des Elispot-Verfahrens......................................... 33 3.3.1 Vorversuche zum Nachweis von IFN-γ........................................................ 34 3.3.2 Vorversuche zum Nachweis von IL-17........................................................ 36 3.3.3 Versuche mit FKS-freiem Medium.................................................................37 3.3.4 Vitalitätsmessung in der Durchflusszytometrie.......................................... 38 3.4 Vergleich von Buffy Coats mit Patientenproben im Elispot-Assay..............38 3.5 Elispot-Assays der Spender-Empfänger-Paare............................................ 39 3.5.1 Ergebnisse der Elispot-Assays zum Nachweis von IFN-γ........................40 3.5.2 Ergebnisse der Elispot-Assays zum Nachweis von IL-17....................... 45 II3.6 Elispot-Ergebnisse unter Berücksichtigung der HLA-Kompatibilität........49 4 Diskussion............................................................................................................... 50 4.1 Bewertung der Methoden.................................................................................. 51 4.1.1 Patientenauswahl und -akquirierung........................................................... 51 4.1.2 Durchflusszytometrie....................................................................................... 51 4.1.3 Elispot-Assay..................................................................................................... 52 4.2 Vitalitätsmessung................................................................................................. 53 4.3 Elispot-Ergebnisse............................................................................................... 53 4.3.1 Vergleich der unbestrahlten und bestrahlten Elispot-Assays................... 53 4.3.2 Elispot-Assays der Patienten.......................................................................... 54 4.3.2.1 IFN-γ-Elispot-Assay........................................................................................ 54 4.3.2.2 IL-17-Elispot-Assay.........................................................................................56 4.3.2.3 IFN-γ-Elispot-Assay und IL-17-Elispot-Assay im Vergleich.................... 57 4.4 HLA-Merkmale und Serumkreatininmolarität...................................................58 4.5 Schlussfolgerung und Ausblick...........................................................................59 5 Zusammenfassung...................................................................................................62 6 Abstract...................................................................................................................... 65 7 Literaturverzeichnis................................................................................................. 67 8 Tabellenverzeichnis.................................................................................................83 9 Abbildungsverzeichnis........................................................................................... 84 10 Erklärung über die eigenständige Verfassung der Arbeit............................. 85 11 Lebenslauf..............................................................................................................86 12 Danksagung.......................................................................................................... 87 / Introduction Since the first kidney transplantation in the 1950ies, kidney transplantation is still being challenged by graft dysfunction and complete graft failure. Permanent immunsuppressive treatment is mandatory to avoid an unfavourable outcome. The treatment with Prednisolone, Tacrolimus and Mycophenolat-Mofetil may cause toxic side effects resulting in Diabetes mellitus, hypertension, infections and cancer. In the present study we tried to demonstrate that the amount of spots in the Enzyme linked immunospot assay (Elispot-Assay) of IFN-γ and IL-17 correlates with the probability of graft dysfuction and complete graft failure. We also compared the results to clinical parameters. Methods Between the years 2009 and 2012, twelve pairs of related living kidney transplantations were included in this study. From each pair blood samples were taken at four time points (before transplantation, and at 21±3, 28±3 and 75±15 days after kidney transplantation, respectively). After establishing the technique of IFN-γ- and IL-17-Elispot-Assays, we separated the periphale blood mononuclear cells (PBMC) and performed follow up examinations at the four time points mentioned above. The PBMC of each donor and each recipient were examined separatly, and in addition together in a lymphocyte mixed reaction. We stimulated the PBMC of the IFN-γ-Elispot with Interleukin-2 (IL-2) and the PBMC of the IL-17-Elispot with OKT3 to get significant characteristics. PBMC of the donors were irradiated with 30 Gy before mixing them with the PBMC of the recipients. We also took the HLA-matches and serum creatinine molarity to compare important clinical parameters with the results of the Elispot-Assays. Results Sufficient spots were measured using the unstimulated and stimulated IFN-γ-Elispot and the stimulated IL-17-Elispot. Radiation was significant at all three tests (IFN-γ: p=0,047 | IFN-γ + IL-2: p=0,007 | IL-17: p = 0,001). All twelve recipients showed a high number of spots before transplantation in both types of Elispot-Assays and most of them an increasing number of spots after a minimal turning point three weeks after transplantation. Due to the small number of cases, no significant results could be obtained at follow up. Non recipient developed a graft rejection as proven by biopsy or graft failure. The molarity of serum creatinine was permanently reduced whereas it was high before transplantation. Because of the abscence of any rejection episodes, HLA matches could not be compared. Discussion Due to the absence of rejection episodes or graft failure, no prediction for rejection by the IFN-γ- and IL-17-Elispot was possible. The low number of cases of living related kidney transplantation demonstrated the challange of the investigation of living related kidney transplantation. Although we could prove a significant effect of the irradiation of PBMC, there was no significant result in the follow up investigations. A higher number of cases are needed in future investigations. The established method of the IFN-γ- and IL-17-Elispot can be used in a future study with an extended number of cases and a longer follow up of time.:I Inhaltsverzeichnis................................................................I II Bibliographische Beschreibung....................................................................IV III Abkürzungsverzeichnis...................................................................................V 1 Einleitung...........................................................................................................01 1.1 Die T-Zell-vermittelte Immunität..................................................................01 1.1.1 Die verschiedenen Klassen der T-Lymphozyten................................ 01 1.1.2 Interferon-gamma als proinflammatorisches Zytokin......................... 04 1.1.3 Interleukin-17............................................................................................. 04 1.2 Die Nierentransplantation........................................................................... 05 1.2.1 Einführung.................................................................................................. 05 1.2.2 Besonderheiten der Lebendnierenspenden........................................ 06 1.3 Therapeutika bei Lebendnierenspenden................................................. 07 1.3.1 Calcineurininhibitoren............................................................................... 07 1.3.2 Prednisolon.................................................................................................. 08 1.3.3 Mycophenolat-Mofetil................................................................................. 09 1.4 Komplikationen bei Transplantationen....................................................... 10 1.4.1 Opportunistische Infektionen..................................................................... 10 1.4.2 Kardiovaskuläre und metabolische Erkrankungen................................ 11 1.4.3 Maligne Tumore.............................................................................................11 1.5 Transplantatrejektion........................................................................................ 12 1.5.1 Akute Abstoßungsreaktion............................................................................12 1.5.2 Chronische Transplantatnephropathie......................................................13 1.6 Zielsetzung der Arbeit.......................................................................................15 I2 Materialien und Methoden................................................................................. 16 2.1 Studiendesign.................................................................................................... 16 2.2 Materialien.......................................................................................................... 17 2.3 Methoden............................................................................................................ 19 2.3.1 Blutentnahmen................................................................................................ 19 2.3.2 Lymphozytenseparation.................................................................................19 2.3.3 Bestimmung der Zellzahl............................................................................... 20 2.3.4 Kryokonservierung der Zellen...................................................................... 20 2.3.5 Auftauen von kryokonservierten Zellen...................................................... 20 2.3.6 Bestrahlung von Zellen...................................................................................21 2.3.7 Stimulanzien.................................................................................................... 21 2.3.8 Durchflusszytometrie...................................................................................... 22 2.3.9 Elispot-Assay.................................................................................................... 23 3 Ergebnisse............................................................................................................... 29 3.1 Charakteristika der Patienten............................................................................ 29 3.2 Medikamentöse Therapieschemata nach Nierentransplantationen.......... 32 3.3 Versuche zur Etablierung des Elispot-Verfahrens......................................... 33 3.3.1 Vorversuche zum Nachweis von IFN-γ........................................................ 34 3.3.2 Vorversuche zum Nachweis von IL-17........................................................ 36 3.3.3 Versuche mit FKS-freiem Medium.................................................................37 3.3.4 Vitalitätsmessung in der Durchflusszytometrie.......................................... 38 3.4 Vergleich von Buffy Coats mit Patientenproben im Elispot-Assay..............38 3.5 Elispot-Assays der Spender-Empfänger-Paare............................................ 39 3.5.1 Ergebnisse der Elispot-Assays zum Nachweis von IFN-γ........................40 3.5.2 Ergebnisse der Elispot-Assays zum Nachweis von IL-17....................... 45 II3.6 Elispot-Ergebnisse unter Berücksichtigung der HLA-Kompatibilität........49 4 Diskussion............................................................................................................... 50 4.1 Bewertung der Methoden.................................................................................. 51 4.1.1 Patientenauswahl und -akquirierung........................................................... 51 4.1.2 Durchflusszytometrie....................................................................................... 51 4.1.3 Elispot-Assay..................................................................................................... 52 4.2 Vitalitätsmessung................................................................................................. 53 4.3 Elispot-Ergebnisse............................................................................................... 53 4.3.1 Vergleich der unbestrahlten und bestrahlten Elispot-Assays................... 53 4.3.2 Elispot-Assays der Patienten.......................................................................... 54 4.3.2.1 IFN-γ-Elispot-Assay........................................................................................ 54 4.3.2.2 IL-17-Elispot-Assay.........................................................................................56 4.3.2.3 IFN-γ-Elispot-Assay und IL-17-Elispot-Assay im Vergleich.................... 57 4.4 HLA-Merkmale und Serumkreatininmolarität...................................................58 4.5 Schlussfolgerung und Ausblick...........................................................................59 5 Zusammenfassung...................................................................................................62 6 Abstract...................................................................................................................... 65 7 Literaturverzeichnis................................................................................................. 67 8 Tabellenverzeichnis.................................................................................................83 9 Abbildungsverzeichnis........................................................................................... 84 10 Erklärung über die eigenständige Verfassung der Arbeit............................. 85 11 Lebenslauf..............................................................................................................86 12 Danksagung.......................................................................................................... 87