Le muscle strié squelettique est un tissu richement vascularisé. Cependant, les vaisseaux ne sont pas seulement des pourvoyeurs d'oxygène et de nutriments, mais participent activement à l'homéostasie tissulaire en interagissant avec les cellules souches musculaires. La Dystrophie Musculaire de Duchenne (DMD) est une pathologie associée à un dommage musculaire, des cycles de nécrose/régénération, un remodelage tissulaire et une plasticité vasculaire. Nous avons en effet, démontré par des études in vivo un défaut d'organisation du réseau vasculaire en 3D grâce au croisement entre une souris mdx et une souris Flk1-GFP (modèle murin de la DMD fluorescente pour les cellules endothéliales), ainsi qu'une atteinte histologique du réseau vasculaire (analyse quantitative et morphométrique des vaisseaux) incluant un défaut de vascularisation des fibres musculaires. L'atteinte histologique est associée à un défaut de perfusion du muscle que nous avons démontré en RMN (résonnance magnétique nucléaire), une technique sophistiquée et non invasive nous permettant d’étudier à la fois la perfusion et le métabolisme énergétique. Dans le modèle du muscle strié squelettique, qui régénère complètement après une lésion, l'angiogenèse et la myogenèse sont concomitantes. Notre hypothèse générale est que le couplage entre myogenèse et angiogenèse est altéré dans les myopathies dégénératives mais leurs mécanismes cellulaires et moléculaires restent mal connus. Nos travaux ont mis en évidence l'existence d'un couplage cellulaire et moléculaire fonctionnel entre la myogenèse et l'angiogenèse en utilisant des modèles in vitro et in vivo dans lesquels les cellules endothéliales (ECs) et les cellules précurseurs myogéniques (MPCs) sont associées. Nos résultats montrent que MPCs et ECs s'attirent réciproquement, suggérant la sécrétion de facteurs chimiotactiques spécifiques. Les ECs stimulent fortement l'entrée des cellules souches du muscle dans le programme de différenciation myogénique (prélude indispensable à la formation des structures multinucléées et contractiles). Nous avons également démontré, grâce à une technique de coculture en 3 dimensions, que les MPCs présentent un potentiel pro-angiogénique important, permettant la formation de structures vasculaires différenciées. Ces résultats ont été validés in vivo (angiogenèse en plug sous-­‐cutanés) et démontrent ainsi que la myogenèse et l'angiogenèse sont des processus couplés au cours de la régénération musculaire. Nous avons identifié trois déterminants moléculaires mis en jeu, suite à l’analyse d’un transcriptome des cellules souches musculaires et des cellules endothéliales, isolées à partir du muscle à différents temps au cours de la régénération. Ces données indiquent que l'environnement vasculaire contrôle le destin des cellules souches musculaires, qui en retour, interagissent sur leur environnement proche. Par ces interactions, les cellules vasculaires jouent donc un rôle central dans le remodelage tissulaire après un phénomène destructif. Ce travail montre pour la première fois que l'organisation et la fonction des vaisseaux sont altérées au cours des pathologies musculaires dégénératives et l'importance des interactions entre cellules souches du parenchyme et cellules endothéliales des vaisseaux dans la régulation de l'homéostasie tissulaire, et ouvrent une réflexion sur la prise en compte du processus d'angiogenèse associé étroitement à la réparation tissulaire – ici la myogenèse – dans une perspective thérapeutiques. / Skeletal muscle is highly vascularized and has the outstanding capacity to regenerate ad integrum after an injury. Beyond oxygen and nutriment supply, new functions for vessels have been recently identified, through the interactions vessel cells establish with muscle stem cells. Duchenne Muscular Dystrophy is characterized by the lack of dystrophin, a sarcolemma anchoring protein, and by cycles of necrosis/regeneration, tissue and vessel remodeling that lead to progressive loss of muscle force. In this severe context, our aim was to decipher alterations of the vascular network structural organization and better understand the functional repercussions on the muscle tissue. We performed a confrontation between morphological and functional approaches using a non-invasive protocol. Histology and morphometry were performed using Flk1GFP/+ crossed with mdx mice (model for the human DMD where all blood vessels express GFP). Multiparametric and functional nuclear magnetic resonance consisted in simultaneous acquisition of arterial spin labelling imaging of perfusion and 31P spectroscopy of phosphocreatine kinetic. We demonstrated for the first time that the vascular system displayed marked alterations in 12 month--‐old mdx mice, more specifically at the capillary scale. Histological results confirmed these observations showing strong perturbations of the microvascular network that are directly linked to the muscle lesions. In parallel, we analyzed the repercussions of these disruptions on skeletal muscle physiology. Our results demonstrated that after a hypoxic stress, blood perfusion was decreased in mdx mouse. During skeletal muscle regeneration, myogenic precursor cells (MPCs) interact with neighboring cells to expand and differentiate. Among them, endothelial cells (ECs) have to be considered. Their close proximity suggests that myogenesis and angiogenesis take place together during muscle regeneration. Our aim was to investigate the existence of such a coupling and to identify the underlying molecular mechanisms. We demonstrated a functional interplay between the two cell types as both cells attracted each other, suggesting the secretion of specific attractive factors. ECs strongly stimulated MPC differentiation and using 3D co-cultures, we revealed that MPCs promoted angiogenesis. These results were validated in vivo using matrigel plug assay. By analyzing transcriptomic from ECs and MPCs sorted at different time points during muscle regeneration, we evidenced and validated the role of the 3 novel molecules regulating angiogenesis/myogenesis coupling: Apelin, Oncostatin M and Periostin, that each plays specific roles during early and late phases of muscle regeneration. Thus, interactions between vessel cells and MPCs seem to play a central role in the tissue remodeling after an injury. Collectively our results point out, for the first time, strong perturbations of the vascular network with functional repercussions on muscle tissue perfusion in dystrophinopathic muscle. In light of our results evidencing the coupling between myogenesis and angiogenesis during skeletal muscle regeneration, due to the specific interactions between ECs and MPCS, it is likely that, coupling between myogenesis and angiogenesis could be affected in pathological context.

A esclerose múltipla (EM) é doença desmielinizante do sistema nervoso central com vários sinais e sintomas, dentre eles a paralisia muscular. Essa paralisia foi estudada neste trabalho utilizando um modelo animal (camundongo) de EM, a Encefalomielite Autoimune Eperimental (EAE). Comparando a controles, os animais EAE, além da paralisia muscular, apresentaram diminuição da massa corporal e do músculo extensor longo dos dedos (ELD). Isolado com ou sem o nervo isquiático, o ELD mostrou decréscimo das contrações indiretas e diretas, tanto isoladas como tetânicas, e maior resistência à fadiga muscular. No ELD, o bloqueador neuromuscular pancurônio mostrou potência semelhante sobre contrações indiretas isoladas, em animais EAE e controles, enquanto as contrações indiretas tetânicas foram mais resistentes ao pancurônio, em animais EAE. A área de secção transversa das fibras musculares foi menor e houve troca (shift) de tipos de fibras de IIB para IIA, em animais EAE. Concluiu-se que as alterações nos animais EAE são tanto da transmissão neuromuscular como do músculo. / Multiple sclerosis (MS) is a demielinating disease of the Central Nervous System with a number of signs and symptoms, among them muscle paralysis. In this work this paralysis was studied using an animal (mouse) model of MS: the experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE). Compared to controls, the EAE animals, besides muscle paralysis, had a lower body and extensor digitorum longus (EDL) muscle mass. Isolated with or without the sciatic nerve, the indirect and the direct isolated contractions of the EDL were smaller and the muscle fatigue was lower, in EAE animals. The neuromuscular blocker pancuronium was equally potent on indirect isolated contractions, in control and EAE animals, while the tetanic contractions were more resistant to pancuronium, in EAE animals. Compared to controls, the area of the transverse section of the muscle fibers was smaller and there was a shift from the IIB to the IIA type of fiber in EAE animals. It is concluded that the alterations in EAE animals result from changes in the process of neuromuscular transmission and in the muscle.

Nesta tese é proposto um modelo fenomenológico eletromecânico com relação constitutiva variacional para representar numericamente a resposta ativa/passiva do tecido muscular esquelético, a fadiga muscular de diferentes tipos de fibras e a combinação de contrações. Na literatura não são encontrados modelos que representem esses comportamentos combinados. Para atingir este objetivo são definidos conjuntos de variáveis auxiliares e variáveis internas para desencadear e mapear a evolução das principais características do tecido muscular esquelético. É considerado que o tecido se contrai localmente, através da propagação de um potencial de ação elétrico advindo do sistema nervoso através de uma ou mais unidades motoras. A proposta de propagação do potencial de ação é construída com a criação de critérios de malha e discretização temporal, eliminando o erro dentro desses limites. Com a propagação do potencial de ação é informado ao modelo constitutivo se localmente o tecido está ativo, através de uma variável de acoplamento binária. A relação constitutiva mecânica utiliza este parâmetro para iniciar a contração muscular, que depende da evolução de uma variável interna. A evolução dessa variável substitui a função de ativação encontrada em outros modelos. Também é utilizado um segundo potencial dissipativo para representar a eficiência metabólica do tecido resultando na representação da fadiga muscular. Um conjunto de potenciais elásticos e dissipativos são utilizados para representar diferentes níveis de forças após combinações de contração do tipo isométrica-concêntrica-isométrica e isométrica-excêntrica-isométrica para diferentes velocidades e alterações de comprimento. A proposta é verificada frente ao ajuste de parâmetros de experimentos reais, obtendo boa representação. Através da implementação no método de elementos finitos é possível observar o comportamento do modelo proposto em geometrias tridimensionais. / In this thesis an electromechanical phenomenological model with variational constitutive relation is proposed to numerically represent the active/passive response of skeletal muscle tissue, muscle fatigue of different types of fibers and contraction combination. In the literature there are no models that represent these combined behaviors. To achieve this goal, sets of auxiliary variables and internal variables are defined to trigger and map the evolution of the main characteristics of skeletal muscle tissue. The tissue is considered to contract locally by propagating an electrical action potential from the nervous system through one or more motor units. The proposed propagation of the action potential is defined with the creation of mesh criteria and temporal discretization, eliminating the error within these limits. With the propagation of the action potential it is informed to the constitutive model if the tissue is locally active, through a binary coupling variable. The mechanical constitutive relation uses this parameter to initiate muscle contraction, which depends on the evolution of an internal variable. The evolution of this variable replaces the activation function found in other models. A second dissipative potential is also used to represent the metabolic efficiency of the tissue resulting in the representation of muscle fatigue. A set of elastic and dissipative potentials are used to represent different levels of forces after isometric-concentric-isometric and isometric-eccentric-isometric contraction combinations for different velocities and length changes. The proposed model capabilities are verified with the parameters adjustment to reproduce real experiments, obtaining good representation. The implementation in the finite element method allows to observe the behavior of the proposed model in three-dimensional geometries.

INTRODUÇÃO: Sepse é a resposta inflamatória sistêmica secundária a um processo infeccioso de alta incidência e elevada mortalidade. A miopatia esquelética, causada pela sepse, gera atrofia muscular e fraqueza generalizada que estão relacionadas a disfunção mitocondrial, produção exacerbada de espécies reativas de oxigênio e aumento da degradação proteica. Exercício físico regular, especialmente de predominância aeróbica, tem mostrado efeito protetor ao músculo esquelético contra uma variedade de estressores e em várias patologias. A hipotése testada neste estudo foi de que o treinamento físico, prévio à indução da sepse, melhora o metabolismo aeróbico e o sistema antioxidante, reduz o estresse oxidativo, diminui a degradação proteica, minimizando a fraqueza e a perda de massa muscular e, por conseguinte, atenuando a miopatia esquelética na sepse. OBJETIVO: Avaliar os efeitos do treinamento físico aeróbico sobre a miopatia esquelética em modelo experimental de sepse induzida através da técnica de ligação e punção cecal (CLP). MÉTODOS: Ratos machos Wistar, inicialmente distribuídos em dois grupos: Não-Treinado e Treinado. O grupo Treinado foi submetido a protocolo de treinamento físico (TF), de predominância aeróbica, com duração de oito semanas, em esteira rolante (60 minutos, 5 dias por semana, a 60% da velocidade máxima encontrada em teste de esforço máximo). Ao final do protocolo de TF o grupo Não-Treinado foi dividido em grupo Sham (falsa cirurgia) e CLP (indução da sepse por ligação e punção cecal); e o grupo Treinado da mesma maneira: ShamT e CLPT, totalizando quatro grupos experimentais. Os quatro grupos foram submetidos aos procedimentos cirúrgicos e após dois dias sacrificados sendo coletado sangue e retirados os músculos: tibial anterior, sóleo, plantar e diafragma para as análises morfológicas, metabólicas, estresse oxidativo, sistema antioxidante e de degradação proteica. RESULTADOS: Os animais não treinados induzidos a sepse através da CLP apresentaram alterações na musculatura esquelética, na maioria das variáveis relacionadas a miopatia esquelética. O TF prévio a indução de sepse propiciou a manutenção da força muscular, da massa muscular e da área de secção transversa das fibras musculares; a atividade das enzimas metabólicas aeróbicas também foram mantidas, e no sóleo, houve uma tendência forte a aumento nas enzimas do ciclo de Krebs. A atividade da enzima creatinaquinase foi mantida nos músculos diafragma e sóleo e diminuiu no plantar. O TF foi eficiente para evitar o estresse oxidativo em lipídios e proteínas nos três músculos estudados, porém houve aumento da atividade enzimática da superóxido dismutase somente no músculo sóleo. O TF foi capaz de manter a atividade do 26S-proteassoma e diminuir a expressão gênica de Atrogin-1 no sóleo, porém não proporcionou diferenças significativas na expressão gênica de MuRF-1 nos três músculos estudados. CONCLUSÃO: Treinamento físico prévio a CLP atenuou os efeitos deletérios da sepse sobre a musculatura esquelética nesse modelo experimental / INTRODUCTION: Sepsis is a systemic inflammatory response secondary to an infectious process of high incidence and mortality. Skeletal myopathy caused by sepsis generates muscular atrophy and generalized weakness that are related to mitochondrial dysfunction, exacerbated production of reactive oxygen species and increase in protein degradation. Regular physical exercise, especially the predominantly aerobic type, has shown a protective effect on skeletal muscle against a variety of stressors and in various pathologies. The hypothesis tested in this study was that physical training before the induction of sepsis, would improve aerobic metabolism and the antioxidant system, reduce oxidative stress, diminish protein degradation, thereby minimizing weakness and loss of muscle mass, consequently attenuating skeletal myopathy in sepsis. OBJECTIVE: To evaluate the effects of aerobic exercise training on skeletal myopathy in an experimental model of sepsis induced by cecal ligation and perforation (CLP). METHODS: Male Wistar rats, were initially divided into 2 groups: Trained and Untrained. The Trained group was submitted to an aerobic exercise training protocol (ETP), on a treadmill, lasting eight weeks (60 minutes, 5 days a week, 60% of the maximum running speed obtained in the graded treadmill test). At the end of the ETP the Untrained group was divided into Sham group (sham surgery) and CLP (sepsis induced by cecal ligation and perforation) and the Trained group was subjected in the same way to: ShamT and CLPT, resulting in four experimental groups. The four groups were submitted to surgical procedures and two days after surgery, the animals were euthanized. Blood was collected and anterior tibialis, soleus, diaphragm and plantaris muscles were harvested for the morphological, metabolic, oxidative stress, antioxidant system and protein degradation analysis. RESULTS: In the untrained animals, sepsis induced by CLP showed alterations in skeletal muscle variables related to skeletal myopathy. The ETP before induction of sepsis led to the maintenance of muscle strength, muscle mass and cross-sectional area of muscle fiber. Activity of aerobic metabolic enzymes was also retained, and in the soleus there was a strong tendency towards increase in enzymes of Krebs cycle. Creatine kinase enzyme activity in the diaphragm and soleus muscles was maintained, and was decreased in the plantaris muscle. ETP was effective in preventing oxidative stress in lipids and proteins in the three muscles studied, however there was increase in superoxide dismutase activity only in the soleus muscle. ETP was capable of maintaining 26Sproteasome activity and decreasing Atrogin-1 gene expression in the soleus muscle, however, revealed no significant differences in MuRF-1 gene expression in the three muscle studied. CONCLUSION: Physical training before CLP attenuated the deleterious effects of sepsis on skeletal muscle in this experimental model

Parece ser consenso na literatura que as crianças asmáticas apresentam capacidade física reduzida, mas existem poucos estudos comparando a capacidade aeróbia de crianças asmáticas com não asmáticas. Além disto, estudos com pacientes pneumopatas crônicos têm demonstrado que eles apresentam fraqueza da musculatura periférica que parece contribuir para a redução na capacidade de exercício. Até o presente momento desconhecemos estudos que tenham avaliado força muscular periférica em crianças asmáticas. Em vista disto, o objetivo deste estudo foi avaliar a força e a resistência muscular periférica assim como a capacidade aeróbia em crianças com asma persistente leve e grave. Foram avaliadas 60 crianças com idade entre 8 e 15 anos, divididas em 3 grupos: asma persistente leve (APL), asma persistente grave (APG) e não asmáticas (controle) (n=20 cada). Estudo transversal e controlado que avaliou a força (teste de 1RM) e a resistência muscular periférica (teste com 50% de 1RM), a capacidade aeróbia máxima (VO2pico), a função pulmonar e fatores de saúde relacionados à qualidade de vida. A força e a resistência muscular foram avaliadas utilizando os exercícios de leg-press (perna), chest-press (peitorais) e remada (dorsais). Nossos resultados mostraram que os 3 grupos eram similares com relação à idade e IMC (p>0,05). As crianças com asma persistente leve e grave apresentaram menor função pulmonar quando comparadas com grupo controle (p<0,01). O grupo com asma persistente grave apresentou menor capacidade aeróbia (VO2pico) e resistência muscular de membros inferiores somente quando comparado ao grupo Controle (p<0,05). A força nos 3 grupos musculares avaliados (perna, peitoral e dorsal) foi similar. A resistência muscular da perna estava reduzida no grupo APG (p<0,05), porém não foram encontradas diferenças nos músculos peitorais e dorsais. Foi avaliada a associação da perda na resistência muscular de membros inferiores com a capacidade aeróbia e com o consumo de corticóides inalatórios e não foi verificada qualquer relação (p>0,05). Nossos resultados sugerem que crianças com asma persistente grave apresentam redução da resistência muscular de pernas e da capacidade aeróbica e que isto deve ser considerado na elaboração de um programa de condicionamento físico para estes pacientes / It has been assumed in the literature that asthmatic children have lower exercise capacity, however there are few studies comparing aerobic capacity of asthmatic children with non-asthmatic. Beside that, studies in patients with chronic pulmonary disease have showing that they present a peripheral muscle weakness and it seems to contribute to patients exercise intolerance. Until the present moment we are not aware of any study evaluating peripheral muscle strength in asthmatic children. The present study aimed to evaluate strength and endurance of peripheral muscle, as well as aerobic capacity, of children with mild and severe persistent asthma. Forty children with mild or severe persistent asthma (n=20 each) and 20 non-asthmatic (Control group) were evaluated. The present transversal controlled study evaluated muscle peripheral strength (1RM) and endurance (50%1RM), aerobic capacity (VO2peak), pulmonary function and factors related to quality of life. The muscular strength and endurance was evaluated through the exercises of leg-press (lower muscle), chest-press and row (upper muscle). Our results show that age and IMC were similar in 3 groups (p>0.05). Patients with persistent asthma (mild and severe) had lower pulmonary function than Control group (p<0.01). The severe persistent asthma group presented lower peakVO2 and leg muscle endurance only when compared with Control group (p<0.05). Upper and lower muscle strength was preserved in children either with mild or severe asthma. Muscle endurance was reduced in leg in group APG (p<0.05), but not in pectoral and dorsal muscles. At last, we observed that the lower muscle endurance weakness was not associated with either reduction in peakVO2 or corticosteroid consumption in asthmatics patients. Our results suggest that severe persistent asthmatic children have reduced leg muscle endurance and lower aerobic capacity and we understand that it must be considered in the elaboration of a program of physical conditioning for these patients

O aumento mundial na incidência da obesidade está associado com um aumento significante com os custos com a saúde. Somente nos Estados Unidos, os gastos com os tratamentos associados a obesidade superam 9% dos custos anuais com a saúde, em torno de $147 bilhões de dólares por ano. Os efeitos da obesidade no músculo esquelético estão relacionados com o desenvolvimento da resistência à insulin (IR), diabetes e piora da qualidade de vida. Trabalhos rescentes tem demonstrado que a dieta hiperlipídica (DHL) diminui a capacidade do músculo esquelético responder a sinais de crescimento. Este efeito negativo relacionado a diminuição na ativação da via Akt/mTOR e aumento nd estresse de retículo endoplasmático (ERE) é denominado de resistência anabólica. Por outro lado, estudos têm demonstrado um possível efeito benéfico da suplementaçãoo com o ácido graxo polinsaturado ômega 3 (Ag-w3) e do treinamento físico aeróbico em diversos parâmetros como, melhora da capacidade oxidativa, sistema imunológico, síntese proteica e degradação em saudáveis ou com alguma patologia associada. Dessa maneira, o presente trabalho demonstra que 8 semanas de DHL contribuíram para o desenvolvimento da obseidade. Por outro lado, o protocolo de TA promoveu um efeito protetor ao ganho de peso nos animais obesos. A suplementação com o AG-w3 foi capaz de prevenir alguns parametros analisados e a associação do óleo de peixe não foi capaz de potencializar os efeitos benéficos encontrados com o TA. / There is a worldwide increase in the incidence of obesity that is associated with significant increases in medical costs. In the United States alone, treatment of obesity related health problems accounts for up to 9% of the total annual cost of healthcare, an estimated $147 billion per year. The effects of obesity on skeletal muscle are correlated with insulin resistance (IR), diabetes and decreased of quality of life. Recent work has demonstrated that a high fat diet (HFD) decreases the ability of skeletal muscle to hypertrophy in a model of increased mechanical load. This negative effect on muscle growth is correlated with a decrease in activation of the Akt/mTOR signaling pathway and an increase in endoplasmic reticulum stress.

O câncer é considerado uma das principais causas de morte no mundo. Para o tratamento dessa doença, frequentemente são utilizadas estratégias farmacológicas baseadas na intervenção quimioterápica, no qual a doxorubicina (DOX) é largamente utilizada. Visto que, o músculo esquelético possui importante papel na captação de glicose, o objetivo do presente trabalho foi investigar o efeito da DOX na intolerância à glicose. Para isso foram utilizados ratos Wistar, os quais receberam uma dose única de DOX ou salina intraperitoneal (15mg/kg). Avaliamos a expressão de proteínas envolvidas na sensibilidade à insulina e captação de glicose. Os ensaios captação de glicose foram realizados em cultura de miócitos, no qual foi utilizado o agonista de AMPK. O tratamento com DOX causou resistência à insulina e hiperglicemia. No músculo EDL e em miócitos houve menor expressão de GLUT-4 e de AMPk. Em conclusão, o tratamento com DOX causou intolerância à glicose e redução da expressão de AMPk e GLUT-4. A utilização do agonista de AMPk foi capaz de recuperar à intolerância à glicose. / The cancer is considered a major cause of death worldwide. For the treatment of this disease, with frequency are used pharmacological strategies based in chemotherapeutic intervention, in which doxorubicin (DOX) is widely used. Since the skeletal muscle plays an important role in glucose uptake, the aim of this study was to investigate the effect of DOX in glucose intolerance. For this Wistar rats which received a single dose of DOX or saline intraperitoneally (15mg / kg). We evaluated the expression of proteins involved in insulin sensitivity and glucose uptake. The glucose uptake assays were performed on culture myocytes, which was used in the agonist of AMPK. The treatment with DOX caused insulin resistance and hyperglycemia. In the EDL muscle myocytes and there was less expression of GLUT4 and AMPK. In conclusion, treatment with DOX caused impaired glucose tolerance and reduction of expression of AMPK and GLUT-4. The use of AMPK agonist was able to recover glucose intolerance.

Considerando-se que o papel das proteínas de choque térmico (HSPs) na melhoria da resposta regenerativa da musculatura esquelética de camundongos idosos ainda não é bem conhecido, e que o tratamento com O-(3-piperidino-2-hydroxy-1-propyl) nicotinic amidoxime (BGP-15), um indutor de HSPs, atenua a fibrose muscular em animais com Distrofia de Duchenne, a hiperexpressão de HSPs no músculo esquelético através do tratamento com BGP-15 e do uso de camundongos transgênicos que hiperexpressam a proteína de choque térmico 70 kDa induzível (HSP70) poderia melhorar o processo regenerativo muscular por meio da atenuação da fibrose do tecido muscular em regeneração de animais idosos. Portanto, o objetivo deste trabalho foi investigar a influência das HSPs na resposta regenerativa muscular em camundongos idosos através da análise dos efeitos do tratamento com o fármaco BGP-15 e da hiperexpressão da HSP70 induzida por transgenia em aspectos estruturais, celulares, moleculares e funcionais. Em 10 dias após a criolesão de músculos tibialis anterior (TA), o tratamento com BGP-15 (15 mg/kg) atenuou a sarcopenia e a redução do tamanho das fibras musculares em regeneração de camundongos idosos, e induziu a recuperação da densidade de área do tecido conjuntivo em músculos não lesados de camundongos idosos, e da expressão de FGF em músculos lesados de camundongos idosos. Além disso, o BGP-15 proporcionou atenuação da queda da força do músculo extensor digitorum longus em regeneração (EDL) após lesão em camundongos jovens. Além do efeito benéfico do BGP-15 em atenuar a sarcopenia, este fármaco (1&#956;M) também atenuou a perda de miotubos C2C12 expostos às citocinas inflamatórias interferon-&#947; e TNF-&#945; Houve prevenção do déficit na diferenciação inicial e tardia de mioblastos oriundos de animais idosos que hiperexpressam HSP70. Em paralelo, verificamos que o silenciamento de HSP70 em mioblastos C2C12 acarreta na redução da expressão do gene MyoD e do miR-326 no início do processo de diferenciação muscular. Portanto, nossos resultados demonstram que a hiperexpressão de HSPs, induzida por BGP-15, melhora a regeneração muscular em camundongos idosos, pois acelera a recuperação do tamanho da fibra muscular em regeneração. Experimentos in vitro sugerem que esse efeito é mediado pela atenuação do déficit na diferenciação de células precursoras miogênicas. Paralelamente, este trabalho demonstra que a HSP70 participa do início da diferenciação muscular por meio de mecanismo envolvendo MyoD e o miR-326. Além do efeito benéfico do indutor de HSPs, BGP-15, sobre a regeneração muscular de animais idosos, este atenuou a sarcopenia e a perda de miotubos expostos ao modelo de atrofia muscular in vitro induzido por interferon-&#947; e TNF-&#945;. Este último efeito é mediado pela redução na expressão de Atrogin-1. / Considering that the role of heat shock proteins (HSPs) on the skeletal muscle regenerative response of aged mice is still not well known, and that the treatment with O- (3-piperidino-2-hydroxy-1-propyl ) nicotinic amidoxime (BGP-15), an HSP inducer, attenuates muscle fibrosis in animals with Duchenne Muscular Dystrophy; the overexpression of HSPs in skeletal muscle induced by BGP-15 treatment and the use of inducible 70 kDa heat shock protein (HSP70) overexpressing transgenic mice could improve the muscle regenerative process through attenuation of fibrosis of regenerating muscle tissue in old mice. Therefore, the aim of this study was to investigate the influence of HSPs on muscle regenerative response in aged mice by analyzing the effects of BGP-15 treatment and HSP70 overexpression induced by transgenesis in structural, cellular, molecular and functional aspects of regenerating muscles from aged mice. At 10 days after cryolesion of the tibialis anterior (TA), BGP-15 treatment (15 mg / kg) attenuated sarcopenia, reduced the cross sectional area of regenerating myofiber from aged mice and recovered the connective tissue density and the expression of FGF in injured muscles from aged mice. Moreover, BGP-15 attenuated the force decrease in extensor digitorum longus (EDL) after injury in young mice. In addition to the beneficial effect of BGP-15 on attenuation of sarcopenia, this drug (1&#956;M) also attenuated the loss of C2C12 myotubes exposed to the inflammatory cytokines interferon-&#947; and TNF-&#945;. There was a prevention of the deficit in the initial and late differentiation of myoblasts from aged animals that overexpress HSP70. In parallel, we observed that the silencing of HSP70 in C2C12 myoblasts reduced the gene expression of MyoD and miR-326 at the beginning of the muscle differentiation process. Therefore, our results suggest that the overexpression of HSPs improves muscle regeneration in aged mice, since it accelerates the size recovery of regenerating myofibers. This effect is mediated by the attenuation of the deficit in the differentiation of myogenic precursor cells. In parallel, we demonstrated that HSP70 participates in the beginning of muscle differentiation probably through a mechanism mediated by MyoD and miR-326. In addition to the beneficial effect of the HSP inducer BGP-15 on muscle regeneration of aged animals, it attenuated sarcopenia and loss of myotubes exposed to interferon-&#947; and TNF-&#945;. This latter effect is mediated by the reduction of Atrogin-1 expression.

A proposta deste trabalho é a padronização do método de eletroporação direta (utilizando eletrodos) em músculo sóleo de ratos wistar. Deste processo físico, pudemos variar a voltagem, o número de pulsos e duração do pulso. O objetivo principal foi à busca de um parâmetro ideal onde deveria haver a menor lesão tecidual com a maior quantidade de expressão do GFP. Métodos de análise (fluorescência e histologia) foram utilizados para a determinação da eficiência de transferência de genes, onde se considerou a razão entre as fibras musculares sadias emissoras fluorescência e o número total de fibras sadias. Como resultado, atingimos a taxa de eficiência de (50,3 ± 20%) em transferência de genes, utilizando a voltagem de 25 V, trem de 8 pulsos com duração de 20ms e freqüência de 1Hz. A possibilidade de interferir na função deste músculo abre a perspectiva de se estudar o papel de certos genes na plasticidade muscular esquelética, especialmente no crescimento muscular longitudinal. / The use of electrical pulses for gene transfer has been successfully used to reach significant levels of gene expression in vitro and in vivo. Therefore electroporation can be considered an important device to get further insight on biological mechanisms and also to treatment. The aim of the present work is to achieve a high level of gene transfer throughout electroporation in the soleus muscle of Wistar rats. The muscle was surgically accessed, injected with Hyaluronidase and subsequently injected with a plasmid expressing GFP (Green Fluorescence Protein). Observation of fluorescence produced in situ and also HE (Hematoxilin-eosin) preparations revealed that the best gene transfer efficiency (50, 3 ± 20%) was achieved with 25 V and 8 pulses (1Hz) lasting 20ms. These results point to a potential use of electroporation as a tool for investigating cellular and molecular aspects of skeletal muscle plasticity, especially those that can be approached only in soleus muscle, such as longitudinal growth.

A la suite d’un criblage pangénomique, nous avons montré que l’inhibition d’un miARN de la famille let-7, miR-98, entraîne une forte accélération de la différenciation musculaire avec hypertrophie des myotubes. Lors de ma thèse, j’ai cherché à comprendre comment miR-98 retarde la différenciation du muscle strié squelettique. Des analyses transcriptomiques dans des myoblastes où ce miARN a été inhibé ont montré la perturbation de l’expression d’environ 240 gènes. Parmi eux, j’ai montré que le répresseur transcriptionnel E2F5 est important pour la régulation de la différenciation musculaire via miR-98, et est directement ciblé par ce miARN. L’inhibition de E2F5 permet de rétablir un niveau de différenciation normal malgré l’inhibition de miR-98. E2F5 est un régulateur important du cycle cellulaire. Sa fonction dans le muscle n’avait pas encore été explorée. Mes résultats montrent que E2F5 accélère le processus de différenciation musculaire. J’ai ensuite montré que E2F5 peut réguler directement des gènes répresseurs de la différenciation musculaire, comme ID1 et HMOX1, et indirectement des répresseurs de la voie TGF-β, expliquant son action sur la différenciation. Au final, miR-98 régule la différenciation du muscle strié squelettique en agissant directement sur l’expression de E2F5, et indirectement sur ses multiples cibles. Mes résultats ont ainsi mis en évidence une nouvelle voie de régulation de la différenciation musculaire : la voie let-7 – E2F5. / A genome-wide screen had previously shown that knocking-down miR-98, a miRNA of let-7 family, leads to a dramatic increase of terminal myogenic differentiation, with myotube hypertrophy. My PhD project aimed to understand how miR-98 delays skeletal muscle differentiation. Transcriptomic analysis of human myoblasts with knocked-down miR-98 revealed that approximately 240 genes were sensitive to miR-98 depletion. Among these potential targets, I have identified the transcriptional repressor E2F5, which turned out to be important for miR-98 regulation of muscle differentiation. Knocking down E2F5 and miR-98 simultaneously had almost fully restored normal differentiation. I have subsequently shown that E2F5, an important cell cycle regulator, is a direct target of miR-98 in muscle, where its function had never been investigated before. My results show that E2F5 is a positive regulator of the muscle differentiation process. E2F5 can directly repress inhibitors of muscle differentiation, such as ID1 and HMOX1, and indirectly regulate TGF-β pathway family members. In conclusion, miR-98 regulates skeletal muscle differentiation by directly regulating E2F5 expression, and thus controlling the expression of multiple E2F5 targets. My results have highlighted a new regulatory pathway of muscle differentiation: the let-7 – E2F5 pathway.