Desenvolveram-se métodos bioanalíticos para determinação de anfotericina B e fluconazol em apenas 200 L de plasma e líquor (LCR) através da cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE UV-VIS). A anfotericina B foi determinada através de CLAE-VIS utilizando p-nitrofenol como padrão interno, após purificação das matrizes biológicas com acetonitrila, seguida da análise em coluna Nova Pak C18 (150 x 3,9mm, 4 micron) e fase móvel constituída por tampão acetato 0,1M pH 5,0 e acetonitrila (50:50,v/v) 0,5mL/min em 385nm; o tempo de corrida foi 15 min. Através da validação o método mostrou-se robusto com 0,2-25,0 µg/mL(linearidade, r2 0,9999), LD 0,1 µg/mL, precisão (5,4% e 6,9%), exatidão expressa através do erro sistemático (3,3% e 2,2%): intra e interdias). Os estudos de estabilidade evidenciaram 1,0% para o erro sistemático e 3% de precisão na bandeja (tempo e condição de análise por 24 h), e os ciclos de congelamento evidenciaram boa estabilidade uma vez que todos os ensaios foram realizados em Laboratório de luz amarela. O fluconazol foi determinado através de CLAE-UV utilizando carbamazepina como padrão interno, após purificação das matrizes biológicas pela extração líquido-líquido com diclorometano em meio alcalino, seguido da análise em coluna Nova Pak C18 (150 x 3,9mm, 4 micron) e fase móvel constituída por água UP e acetonitrila (70:30,v/v) 0,5mL/min em 210nm; o tempo de corrida foi 15 min. O método mostrou-se robusto com 0,2-250 µg/mL(linearidade, r2 0,9998), LD 0,1µg/mL, com boa recuperação absoluta (98%) e relativa (100%), precisão 0,5%/1,3%, exatidão expressa através do erro sistemático (1,2%). Evidenciou-se ótima estabilidade para os extratos em bandeja (tempo e condição de análise por 24 h), na longa duração (20° C, 9 meses) e através dos ciclos de congelamento. Investigaram-se 21 pacientes adultos de ambos os sexos portadores de meningite criptocócica com AIDS após internação emergencial em terapia de alta dose com anfotericina B (1mg/Kg) e fluonazol (400 mg, 12/12 horas) durante 12 semanas. O monitoramento das concentrações de anfotericina B e fluconazol no plasma e no LCR forneceram as razões que permitiram estimar a penetração dos antifúngicos no SNC. Obtiveram-se concentrações de anfotericina B, médias (IC95%): 2,30 (0,02-5,08) µg/mL no plasma e 0,30 (0,19-0,36) µg/mL no LCR. As concentrações do fluconazol, médias (IC95%) foram: 31,7 (20,1-43,3) µg/mL no plasma e 19,4 (11,1-27,7) µg/mL no LCR. Com base nos resultados obtidos conclui-se que a penetração da anfotericina B foi insuficiente (10-27%), enquanto que a do fluconazol mostrou-se adequada com valores médios (IC95%) de 67 (47-87) %. / Analytical methods were developed to determine amphotericin B and fluconazole in only 200 L of plasma and in cerebrospinal fluid (CSF) by liquid chromatography (HPLC UVVIS). Amphotericin B was determined by HPLC - VIS using p-nitrophenol as internal standard, after the purification of biological matrices using acetonitrile, followed by chromatographic analysis in a Nova Pak C18 column (150 x 3.9mm, 4 micron) and mobile phase consisting of acetate buffer 0.1M pH 5.0 plus acetonitrile (50:50,v/v) 0.5mL/min at 385nm; the run time required was 15 min. Bioanalytical method validated showed robustness, 0.2-25,0µg/mL (linearity, r2 0.9999), DL 0.1µg/mL, precision (5.4%/6.0%), accuracy expressed as systematic error (3.3%/2.2%). The stability was investigated, error systematic was 1% for the vials on the rack (time and conditions of drug analysis, 24h). Thawing cycles showed good stability after three freezing-thawing cycles. All procedures were performed under yellow light at room temperature. Fluconazole was determined by HPLC - UV using carbamazepine as internal standard, after the purification of biological matrices using liquid-liquid extraction in alkaline medium, followed by chromatographic analysis in a Nova Pak C18 column (150 x 3.9mm, 4 micron) and mobile phase consisting of purified water plus acetonitrile (70:30,v/v) 0.5mL/min at 210nm; the run time required was 15 min. Bioanalytical method validated showed robustness, 0.2-250 µg/mL(linearity, r2 0.9998), DL 0.1µg/mL. Absolute recovery was 98% and relative recovery was 100%, intra/interday precision were 0,5/-1,3%; accuracy expressed as systematic error were 1.2%/1.2%.and relative recovery was 100%. Good stability for the vials on the rack (time and conditions of drug analysis, 24h) and long term stability (at 20o C for 9 months) were demonstrated. Also thawing cycles showed good stability after three freezing-thawing cycles. Twenty one adult patients of both sex were investigated. Inpatients with meningitis by Cryptococcus neoformans with AIDS were under high dose therapy with amphotericin B 1mg/Kg plus fluonazole 400 mg, every 12h during 12 weeks. Therapeutic monitoring of amphotericin B and fluconazole in plasma and in CSF showed ratios that indicate the penetration of antifungal drugs into CNS. Mean (CI95%) data were for amphotericin B 2.30 (0.02-5.08 ) µg/mL in plasma and 0.30 (0.19-0.36) µg/mL in CSF. Fluconazole showed 31.7 (20.1-43.3) µg/mL in plasma and 19.4 (11.1-27.7) µg/mL in CSF. Based on data obtained we conclude that the penetration of amphotericin B was poor (10-27%) while fluconazole was adequate 67% (47-87%), mean (CI95%).

A lesão renal aguda LRA induzida pela anfotericina B (Anf-B), um antibiótico poliênico isolado do actiniomiceto Streptomyces nodus, ocorre após alguns dias do início da terapia medicamentosa. Os sinais clínicos característicos são acidose, hipocalemia, depleção de magnésio, sódio e poliúria, resultantes da vasoconstrição renal com redução do fluxo sanguíneo renal (FSR), da taxa de filtração glomerular (TFG) e toxicidade direta nas células epiteliais tubulares com geração de espécies reativas de oxigênio (EROs). A diosmina e hesperidina (DH) são flavonoides com propriedades antioxidantes e anti-inflamatórias. Esse estudo investigou a ação renoprotetora do pré-condicionamento com diosmina e hesperidina em ratos submetidos à toxicidade renal pela Anf-B. Foram utilizados ratos Wistar, adultos e machos distribuídos nos grupos: Salina (controle, 3ml/kg de solução fisiológica 0,9%, salina, intraperitoneal-i.p., uma vez ao dia, cinco dias); DH (50mg/kg de DH na água de bebedouro, dez dias); Anf-B (15mg/kg, i.p. uma vez ao dia, cinco dias); Anf-B+DH (pré-medicação com a solução de DH em água de bebedouro dez dias e a partir do sexto dia do protocolo, Anf-B, 1 vez dia, i.p., 5 dias,). Foram avaliadas a função renal função renal (clearance de creatinina-Clcr, método de Jaffé), as frações de excreção de sódio, potássio e magnésio-FENa, K por meio do método de eletrodo íon seletivos e Mg por Mg por método colorimétrico a lesão oxidativa (peróxidos-PU, FOX-2 e substâncias reativas com o ácido tiobarbitúrico-TBARS urinários). O tratamento com Anf-B resultou em quadro de lesão renal aguda com redução do Clcr, elevação do fluxo urinário, da FENa, da FEK e da FEMg, com elevação de PU e TBARs urinários. O pré-condicionamento com DH demostrou efeito renoprotetor por meio da elevação do Clcr e redução das FENa, FEMg e FEK, além de demonstrar proteção antioxidante confirmada pela redução de metabólitos oxidativos. / The acute kidney inury (AKI) induced by amphotericin B (Amp-B), an antibiotic polyenic group isolated of the actinomycete Streptomyces nodus, occurs after some days of the beginning of drug therapy. Clinical manifestations include acidosis, hypokalemia, magnesium and sodium wasting and polyuria, resulting from renal vasoconstriction with decrease in blood flow, glomerular filtration rate (GFR) and direct toxicity in tubular cells with liberating reactive oxygen species (ROS). Diosmin and hesperidin (DH) are flavonoids with antioxidant and antiinflamatory properties. This study investigated the renoprotective effect of DH in rats submitted to the toxicity by Amp-B. Adult male wistar rats were used and divided in the following groups: Saline (control, 3ml/kg of NaCl 0,9% intraperitoneal (i.p.), once a day, for 5 days); DH (50mg/kg in drinking water, 10 days); Amp-B (15mg/kg, i.p., once a day, 5 days); Amp-B+DH (DH in drinking water, 10 days, from the sixth day, 15mg/kg of Amp-B, i.p., 5 days). Renal function (creatinine clearance-crCl, Jaffé method), sodium, potassium and magnesium excretion fraction, (FENa, FEK,) through selective ion method and FEMg by colorimetric method, oxidative injury (urinary peroxides-FOX-2, thiobarbituric acid reactive substances-TBARS) were evaluated. Amp-B induced AKI with reduction in crCl and increment in FENA, FEK, FEMg, UP and TBARS. The pre-treatment with DH confirmed a renoprotective effect through by increasing GFR and decreasing FENa, FEK, FEMg. In addition, the antioxidant protection was confirmed by reduction of oxidative metabolites by DH.

Introdução: As leishmanioses são antropozoonoses que constituem um grave problema de saúde pública por apresentarem um complexo espectro clínico de manifestações e relevante diversidade epidemiológica. Aproximadamente 5% dos pacientes com leishmaniose cutânea não tratada adequadamente irão desenvolver a leishmaniose mucosa (LM). As principais opções terapêuticas disponíveis para esta apresentação da doença são os antimoniais pentavalentes, a pentamidina e as anfotericinas B. As formulações lipídicas da anfotericina B tem sido desenvolvidas na tentativa de melhorar a eficácia e a tolerabilidade das anfotericinas, entretanto, ainda há escassez de estudos que avaliem eficácia, dose e segurança da anfotericina B lipossomal (AFBL) no tratamento da LM. Objetivo: Relatar a experiência do ambulatório e da enfermaria de um hospital escola com medicamentos usados no tratamento da leishmaniose mucosa, comparando a eficácia e a segurança da anfotericina B lipossomal com as outras drogas. Métodos: Foram avaliados os prontuários de todos os pacientes do Ambulatório de Leishmanioses do Departamento de Moléstias Infecciosas e Parasitárias do HC-FMUSP com diagnóstico confirmado de LM e tratados no período de janeiro de 2000 a julho de 2015. Dados clínicos e epidemiológicos foram descritos, e também avaliados os efeitos adversos e os desfechos com o uso das principais drogas para LM. Resultados: Foram avaliados 71 pacientes com leishmaniose mucosa e um total de 106 tratamentos. A maioria dos pacientes era do sexo masculino (60,6%) e da Região Nordeste do Brasil (50%). Observou-se associação de flebite (46,2%) e de tremor (30,8%) com o grupo que recebeu anfotericina B complexo lipídico e maior desenvolvimento de artralgia (16%) no grupo que recebeu o antimonial. Os pacientes tratados com anfotericina B desoxicolato apresentaram a maior taxa de insuficiência renal aguda (57,10%) em relação aos demais grupos de drogas. O grupo que usou antimonial pentavalente foi o único que desenvolveu alterações nas enzimas pancreáticas (28%) e alterações eletrocardiográficas (20%). Dos pacientes que usaram anfotericina B desoxicolato, 85,7% precisaram interromper definitivamente o tratamento, o que contribuiu para a pior taxa de cicatrização final (14,3%), enquanto a AFBL apresentou a melhor taxa (81,3%) quando comparada aos demais tratamentos, OR= 4,971 [1,829-13,508] (p= 0,001). O uso de itraconazol mostrou alta taxa de recidiva (63,6%). A dose média de AFBL usada no tratamento de LM foi 1907mg e 28,91mg/kg. Quando comparadas as drogas com a AFBL, a pentamidina foi a única que não apresentou diferença estatisticamente significante em relação aos desfechos de tratamento. Conclusão: A pentamidina e a AFBL mostraram-se, neste estudo, as melhores opções terapêuticas no tratamento da LM, sendo que a AFBL foi a droga com a maior taxa de cicatrização. Com base neste estudo e em outras experiências da literatura até o momento, o intervalo de dose compreendido entre 30 e 35 mg/kg é o que parece alcançar eficácia próxima a 100%. Sugerimos, portanto, uma dose cumulativa de 30 mg/kg para o tratamento da LM. Este estudo amplia a experiência com o uso do itraconazol e da pentamidina, e é o primeiro a descrever o uso da ABCL na LM. Apresenta, ainda, a maior casuística que conhecemos na literatura com o uso da AFBL, além de ser o primeiro estudo a compará-la com as demais drogas no tratamento da LMCRO / Introduction: Leishmaniases are anthropozoonoses that constitute a severe problem of public health as they present with a complex spectrum of manifestations and relevant epidemiologic diversity. Approximately 5% of patients with untreated cutaneous leishmaniosis will develop mucosal leishmaniasis (ML). The main treatment options for this presentation are: pentavalent antimonials, pentamidine, and amphotericins B. The lipid formulations of amphotericin B have been developed to improve efficacy and tolerability, however, there are few studies that evaluate efficacy, dosage, and safety of liposomal amphotericin B (LAB) for treatment of ML. Objective: To report outpatient and inpatient experience of a hospital school with medications used for treatment of mucosal leishmaniasis by comparing the efficacy and safety of liposomal amphotericin B with other drugs. Methodology: The medical records of all patients of the Leishmaniasis Outpatient Clinic of the Department of Infectious and Parasitic Diseases of the Hospital das Clínicas of University of São Paulo were assessed. The patients had diagnosis of ML and were treated between January 2000 and July 2015. Epidemiologic and clinical data were described, as well as adverse effects and outcomes of the main drugs for treatment of ML. Results: Seventy-one patients with ML and a total of 106 treatments were assessed. The majority of the patients were male (60.6%) and from the Northeast of Brazil (50%). There was an association of phlebitis (46.2%) and tremor (30.8%) to the group that received amphotericin B lipid complex (ABLC). There was a higher development of arthralgia (16%) in the group that received the antimonial. Patients treated with deoxycholate amphotericin B presented with the highest level of acute kidney injury (57.1%) when compared to other drugs. The group who received pentavalent antimonial was the only one to develop pancreatic enzymes abnormalities (28%) and electrocardiographic abnormalities (20%). Within the patients who used deoxycholate amphotericin B, 85.7% had to discontinue the treatment, contributing to the worst healing rate (14.3%). LAB presented with the best healing rate (81.3%) when compared to the other treatments, OR = 4.971 [1,829-13,508] (p=0,001). The use of itraconazole showed high recurrence rate (63.6%). The mean dosage of LAB for the treatment of ML was 1,907 mg and 28.91 mg/kg. When LAB was compared to other drugs, pentamidine was the only one with no statistical significance related to the outcomes of the treatment. Conclusion: In this study, pentamidine and LAB were the best therapeutic options for the treatment of ML; LAB was the drug with better healing rate. Based on this study and other references in the literature, the dosage interval between 30 and 35 mg/kg appears to reach efficacy close to 100%. Therefore, our recommendation is the use of a cumulative dosage of 30 mg/kg for the treatment of ML. This study enhances the experience of itraconazole and pentamidine, and it is the first one to describe the use of ABLC for the treatment of ML. In addition, it presents the largest casuistic known in the literature with the use of LAB, and it is a pioneer in comparing this drug with other drugs in the treatment of ML

Made available in DSpace on 2017-07-21T14:13:09Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Francine Alessandra Manente.pdf: 1212792 bytes, checksum: 5c5b36ad0ca624ee36b65879663b0362 (MD5) Previous issue date: 2013-02-18 / Amphotericin B (AmB) is drug "gold standard" for the treatment of invasive fungal infections since 1960. However, amphotericin B has high toxicity, which manifests itself most commonly in the kidneys (nephrotoxicity) and less frequently in the liver (liver toxicity). It is known since 1985 that self-oxidation of amphotericin B gives different forms of reactive oxidative species and these are responsible in part by toxicity. An antioxidant, such as hesperidin and rutin, could contribute, through the reduction of oxidative stress, and to protect against renal injury generated by ischemia. This fact and the involvement of amphotericin B in the generation of free radicals make it interesting to evaluate the effect of hesperidin, rutin and amphotericin B (alone or associated) against reactive oxygen species and free radicals, as well as the study of the same models in toxicity . In testing the antifungal combination with hesperidin showed synergism. In tests oxidative systems, opposite the ABTS+, the hesperidin showed IC50= 0,0044mg/mL, rutin IC50=0,0023mg/mL and amphotericin B IC50=0,0124mg/mL (isolated), IC50=0,0003mg/mL (associated with hesperidin) and IC50=0,0014mg/mL (associated with rutin). In the DPPH assay only rutin was action. Front HOCl, hesperidin showed IC50=0,0109, rutin IC50=0,0025 and amphotericin B showed IC50=0,0056 (isolated) IC50=0,0023mg/mL (associated with hesperidin) and IC50=0,0036 (associated with rutin). In the trial with O2 the samples were not effective. In inhibition kinetics MPO/H2O2/Guaiacol only rutin promote inhibition. Front to erythrocytes, amphotericin promoted lysis in a dose-dependent manner. HUVEC cells using the associations decreased cell viability. However, in the toxicity test with Artemia salina associated samples were able to lower the toxicity of amphotericin B. To conclude, in tests with animals amphotericin B caused leukopenia, monopenia generated and renal damage, which can be reversed using hesperidin in combination. With these results, we suggest that the combination of a natural product with amphotericin B could decrease the toxicity caused by this antinfúngico, and concomitant use could be promising. / A anfotericina B (AmB) é fármaco "padrão ouro" para o tratamento de infecções fúngicas invasivas desde 1960. Entretanto, a anfotericina B apresenta elevada toxicidade, que se manifesta mais freqüentemente nos rins (nefrotoxicidade) e com menor frequência no fígado (hepatotoxicidade). É sabido, desde 1985, que a auto-oxidação da anfotericina B origina diferentes formas de espécies reativas oxidativas e estas seriam responsáveis, em parte, pela toxicidade. Agentes antioxidantes, tais como a hesperidina e rutina, poderiam contribuir, por meio do decréscimo do estresse oxidativo, para a proteção renal e contra a injúria gerada pela isquemia. Tal fato e o envolvimento da anfotericina B na geração de radicais livres tornam interessante a avaliação do efeito da hesperidina, rutina e anfotericina B (isoladamente ou associadas) frente a espécies reativas do oxigênio e radicais livres, bem como o estudo das mesmas em modelos de toxicidade. No teste antifúngico a associação com a hesperidina mostrou sinergismo. Nos testes em sistemas oxidativos, frente ao ABTS+, a hesperidina apresentou IC50= 0,0044mg/mL, a rutina IC50=0,0023mg/mL e a anfotericina B IC50=0,0124mg/mL (isolada), IC50=0,0003mg/mL (associada à hesperidina) e IC50=0,0014mg/mL (associada à rutina). No ensaio do DPPH apenas a rutina mostrou ação. Frente ao HOCl, a hesperidina apresentou IC50=0,0109, a rutina IC50=0,0025 e a anfotericina B apresentou IC50=0,0056 (isolada), IC50=0,0023mg/mL (associada com a hesperidina) e IC50=0,0036 (associada com a rutina). No ensaio com o O2 - as amostras não foram efetivas. Na inibição da cinética da MPO/H2O2/Guaiacol somente a rutina promoveu inibição. Frente aos eritrócitos, a anfotericina promoveu lise de modo dose-dependente. Utilizando as células HUVEC, as associações diminuíram a viabilidade celular. Entretanto, no ensaio de toxicidade com a Artemia salina as amostras associadas foram capazes de diminuir a toxicidade da anfotericina B. Para finalizar, nos testes com os animais a anfotericina B causou leucopenia, monopenia e gerou dano renal, o qual pode ser revertido utilizando a hesperidina em associação. Com estes resultados pode-se sugerir que a associação de um produto natural com a anfotericina B poderia diminuir a toxicidade causada por este antinfúngico, sendo que sua utilização concomitante poderá ser promissora. Palavras-chave: hesperidina, anfotericina B, rutina, estresse oxidativo, citotoxicidade, nefrotoxicidade.

In order to continue with the study of natural products from previously isolated endophytes of the Brazilian medicinal plant Lychnophora ericoides, the main goal of this work focused on the metabolic exchange of endophytic microorganisms from this plant. As it has been demonstrated during the last years, elicitation of different molecules is consequence of microbial interactions, mainly due to the need to compete, survive and establish microbial communities in shared environments. Recent mass spectrometry related approaches, such as imaging and molecular networking, in combination with purification and structural elucidation were applied to the current study of the microbial interactions of endophytes. During this study, several chemical families were identified, such as polyene macrocycles, pyrroloindole alkaloids, leupeptins, angucyclines, siderophores, amongst others. Amongst the polyene macrocycles, the well-known antifungal amphotericin B was identified as a biosynthetic product of the endophytic actinobacteria Streptomyces albospinus RLe7. When S. albospinus RLe7 interacted with an endophytic fungus, Coniochaeta sp. FLe4, a red pigmentation was observed. A new fungal compound was detected from microbial interactions. Isolation and structure elucidation of this new compound enabled to demonstrate the elicitation of fungal secondary metabolites by amphotericin B, an actinobacterial metabolite. It was also demonstrated the elicitation of griseofulvin and its analogue dechlorogriseofulvin from another endophytic fungus, FLe9, as a consequence of exposition to amphotericin B. In addition, investigation of the chemical profile of another endophytic actinobacteria, S. mobaraensis RLe3, led to reveal this strain as angucycline-derivatives producer. Besides that, coculturing of this actinobacteria against Coniochaeta sp. FLe4 also demonstrated elicitation of angucycline analogues. In conclusion, this study demonstrated elicitation of natural products from microbial interactions as well as new compounds from endophytes from L. ericoides and contributed to the identification of microbial metabolites / Com o propósito de continuar com os estudos de produtos naturais de microorganismos endofíticos da planta medicinal Brasileira Lychnophora ericoides, o principal objetivo desse trabalho focou-se no estudo da troca metabólica de microorganismos endofíticos dessa planta. Como tem sido demonstrado durante os últimos anos, a elicitação de diferentes compostos é consequência das interações microbianas, principalmente devido à necessidade de competir, sobreviver e estabelecer comunidades microbianas em diversos ambientes naturais. Abordagens recentes de espectrometria de massas, tais como imageamento e molecular networking, junto com purificação e elucidação estrutural foram aplicadas durante o estudo de interações microbianas de endofíticos. Durante este estudo, várias classes químicas foram identificadas, tais como polienos macrocíclicos, alcaloides pirroloindólicos, leupeptinas, anguciclinas, sideróforos, entre outras. Da classe química de polienos macrocíclicos, foi identificada a anfotericina B como produto da biossíntese da actinobactéria endofítica Streptomyces albospinus RLe7. Durante a interação da S. albospinus RLe7 com o fungo endofítico Coniochaeta sp. FLe4, uma pigmentação vermelha foi observada. Um novo composto de origem fúngica foi detectado a partir de interações microbianas. O isolamento e posterior elucidação estrutural do novo composto permitiu demonstrar a eliciação de metabólitos secundários fúngicos pela anfotericina B, metabólito da actinobactéria S. albospinus RLe7. Foi também demonstrada a eliciação de griseofulvina e desclorogriseofulvina a partir de outro fungo endofítico, FLe9, como consequência da exposição à anfotericina B. Adicionalmente, a investigação do perfil químico de outra actinobactéria endofítica, S. mobaraensis RLe3, evidenciou essa linhagem como produtora de compostos da classe das anguciclinas. Além disso, o cocultivo dessa actinobacteria com o fungo endofítico Coniochaeta sp. FLe4 também eliciou análogos de anguciclinas. Em conclusão, neste estudo demonstrou-se a elicitação de produtos naturais a partir das interações microbianas assim como de novos compostos de endofíticos de L. ericoides e contribuiu-se com a identificação de metabólitos microbianos

O fenômeno de amplificação gênica é um mecanismo de auto-preservação celular observado com freqüência no protozoário parasita Leishmania quando submetido a estímulos negativos como, por exemplo, a presença de drogas. A região H do genoma de Leishmania (Leishmania) major é um dos loci mais estudados que leva à amplificação em resposta a drogas não relacionadas, como a terbinafina. Foram isoladas linhagens de L. (L.) major e Leishmania (Viannia) braziliensis resistentes à terbinafina. Análises por corridas curtas de eletroforese em campo pulsado (PFGE) e Southern blotting revelaram que a resistência observada nestas linhagens não foi gerada pela amplificação do locus H. Sendo assim, a resistência ao inibidor da esqualeno epoxidase está sendo gerada por um outro mecanismo uma vez que outros loci podem estar envolvidos na resistência à terbinafina e através da análise diferencial do perfil de proteínas, os mutantes resistentes apresentaram diferenças na expressão de proteínas. O alvo inicial para a elucidação da resistência à terbinafina nas linhagens selecionadas foi a via de biossíntese de ergosterol. Foram escolhidos os genes da 3-cetoacil-CoA tiolase (ERG10), esqualeno sintase (ERG9 ou SQS1), esqualeno epoxidase (ERG1), oxidoesqualeno-lanosterol ciclase (ERG7) e lanosterol 14-demetilase (ERG11), de L. major e L. braziliensis, além do gene YIP1 de L. braziliensis. Para isso foram sintetizados oligonucleotídeos a partir das seqüências geradas pelo projeto genoma destas espécies depositadas em bancos de dados. Os genes ERG10, SQS1, ERG1, ERG7 e ERG11 de L. major e de L. braziliensis além do YIP1 de L. braziliensis amplificados por PCR foram clonados no vetor pGEM-T Easy, que possibilitou a construção de reagentes para ruptura de todos genes pela inserção da marca HYG e, com exceção do gene ERG7 de L. braziliensis, os genes foram subclonados no vetor pXG1. Fragmentos de restrição dos genes clonados no vetor pGEM-T Easy foram utilizados para analisar o nível de seus transcritos por northern blot. Também verificamos através de corridas curtas de PFGE e análises de Southern, que as linhagens em estudo não apresentam amplificação dos loci em estudo. A participação de genes da via de biossíntese de ergosterol de L. major e L. braziliensis e do gene YIP1 de L. braziliensis na resistência ou susceptibilidade à terbinafina e/ou anfotericina B foi verificada através de experimentos funcionais. Com esse objetivo, os genes YIP1, ERG10 e ERG1 de L. braziliensis foram transfectados na linhagem LB2904 de L. braziliensis, e os genes ERG10, SQS1, ERG1, ERG7 e ERG11 e a ruptura do gene ERG1 pelo cassete HYG de L. major foram transfectados na linhagem LT252 de L. major. Foram realizados experimentos para analisar a susceptibilidade à anfotericina B associada ou não à terbinafina, das linhagens selvagens de L. major e L. braziliensis, e a partir destes experimentos iniciais, foram selecionadas linhagens destas duas espécies resistentes à anfotericina B. Para analisar a possível função regulatória dos elementos RIME 5/2/6 de L. braziliensis, foi feita a amplificação por PCR da repetição invertida LbRIME 5/2/6b que permitiu a clonagem deste fragmento no vetor pGEM-T Easy e a sua ruptura pela marca SAT. A clonagem no vetor pGEM possibilitou a análise da interação de proteínas nucleares à repetição LbRIME 5/2/6b através do gel shift. / Gene amplification is a common phenomenon observed in Leishmania cell lines subjected to drug pressure. The H locus of Leishmania (Leishmania) major is normally found amplified in cell lines selected in unrelated drugs, as terbinafine. We selected cell lines of L. (L.) major and Leishmania (Viannia) braziliensis resistant to terbinafine. Short-run Pulsed Field Gel Electrophoresis (PFGE) and Southern blotting analysis showed that this resistance was not generated by H locus amplification. Resistance to squalene epoxidase inhibiter is being generated by other mechanism once others loci can be involved in the terbinafine resistance and through protein partner differential analysis, mutants resistant showed differences in protein expression. The initial target to terbinafine resistance elucidation in the cell lines selected was ergosterol biosynthesis pathway. We choose genes: 3-ketoacyl-CoA thiolase (ERG10), squalene synthase (ERG9 or SQS1), squalene epoxidase (ERG1), oxidosqualene-lanosterol cyclase (ERG7), and lanosterol 14-demethylase (ERG11), of L. major and L. braziliensis, besides YIP1 gene of L. braziliensis. For this, primers were synthesized using the sequences generated by genome project of these species inserted in gene bank. The genes ERG10, SQS1, ERG1, ERG7 and ERG11 of L. major and of L. braziliensis besides YIP1 of L. braziliensis were amplified by PCR and cloned into pGEM-T Easy vector that enabled all genes disruption by insertion of HYG cassette and, with exception of the ERG7 gene of L. braziliensis, genes were subcloned into shuttle-vector pXG1. Restrictions fragments of these genes were used in Northern analysis to verify the transcripts level. We verified through short-run PFGE and Southern analysis that the resistant cell lines do not show amplification of studied loci. The participation of ergosterol biosynthesis pathway genes of L. major and L. braziliensis and YIP1 gene of L. braziliensis in the resistance to terbinafine was verified in functional experiments. With this objective, the genes YIP1, ERG10 and ERG1 of L. braziliensis were transfected into LB2904 cell line of L. braziliensis, and the genes ERG10, SQS1, ERG1, ERG7 and ERG11 and the ERG1 gene disruption by HYG mark of L. major were transfected into LT252 cell line of L. major. Experiments that analyze the susceptibility to amphotericin B associated or not to terbinafine were performed using the wild type cell lines of L. major and L. braziliensis, and with this initials experiments, we selected cell lines of these two species resistant to amphotericin B. In order to analyze the possible regulatory function of the RIME 5/2/6 elements of L. braziliensis, the repeat LbRIME 5/2/6b was amplified by PCR and cloned into pGEM-T Easy vector and with this clone, the element was disrupted with a SAT cassette. The cloning into vector pGEM enabled to analyze the interaction of the nuclear protein with the repeat LbRIME 5/2/6b through gel shift assay.

Nesse trabalho avaliamos a sensibilidade a drogas in vitro de alguns isolados obtidos de pacientes brasileiros com leishmaniose cutânea. O microteste de MTT modificado mostrou-se eficaz para avaliação da sensibilidade in vitro de promastigotas de Leishmania e macrófagos de medula como modelo de infecção por L. (V.) braziliensis. A atividade de tamoxifeno e anfotericina B foi similar entre os isolados de Leishmania avaliados. Foi observada uma variação maior da sensibilidade ao Glucantime®, sendo que os isolados de L. (V.) braziliensis apresentaram maior sensibilidade a essa droga. Não foi observada correlação da resposta clínica dos pacientes ao tratamento com a atividade in vitro. Avaliamos também a eficácia de tamoxifeno no tratamento de camundongos BALB/c infectados com L. (V.) braziliensis. Observamos que 20 ou 30 mg/kg/dia de tamoxifeno por 15 dias resultou em redução no tamanho das lesões e carga parasitária em comparação com animais controle.Um isolado apresentou morfologia flagelar distinta daquela observada em promastigotas típicos de Leishmania. / In this work we evaluated the in vitro sensitivity to drugs of some isolates from Brazilian patients with cutaneous leishmaniasis. The modified MTT microtest was effective for evaluation of in vitro sensitivity of Leishmania promastigotes and macrophages from bone marrow as a model of infection by L. (V.) braziliensis. The activity of tamoxifen and amphotericin B was similar among isolates of Leishmania evaluated. Sensitivity to Glucantime®, was more variable with isolates of L. (V.) braziliensis presenting higher sensitivity to the drug. There was no correlation between clinical response to treatment with in vitro activity. We have also evaluated the effectiveness of tamoxifen in the treatment of BALB/c mice infected with L. (V.) braziliensis and observed that 20 or 30 mg/kg/day of tamoxifen for 15 days resulted in reduction in the size of lesions and parasite load when compared with control animals. One of the isolates presented atypical flagellar morphology.

nÃo hà / A Anfotericina B Desoxicolato (ANB-D) à uma droga que possui a capacidade de produzir muitos efeitos adversos. à uma substÃncia fungicida de escolha no tratamento da maioria das micoses sistÃmicas e uma alternativa importante para o tratamento da leishmaniose visceral. O Instituto de DoenÃas Tropicais Natan Portela à o Ãnico hospital de referÃncia para o tratamento de doenÃas infecciosas e parasitÃrias no Estado do PiauÃ. Participa da Rede Sentinela da ANVISA, e atravÃs do Sistema de FarmacovigilÃncia, monitora o uso dos fÃrmacos notificando qualquer reaÃÃo adversa a medicamentos (RAM). Partindo desse pressuposto, realizou-se este estudo, observacional, retrospectivo e quantitativo, a partir do qual foram analisados os prontuÃrios de todos os pacientes que utilizaram o fÃrmaco no perÃodo de janeiro a marÃo de 2009, um total de 60 pacientes, considerando sempre as reaÃÃes adversas a medicamentos, as queixas tÃcnicas e as interaÃÃes medicamentosas do fÃrmaco com outros medicamentos presentes nas prescriÃÃes mÃdicas. A anÃlise estatÃstica for realizadapelo programa Stata/SE 10.0 for Windows (CollegeStation, Texas, USA). Entre os pacientes analisados no presente estudo, 63,3% eram do sexo masculino. A faixa etÃria com maior nÃmero de pacientes foi a de â41 ou mais anosâ com 36%. A patologia presente na grande parte dos pacientes em uso de ANB-D foi a Leishmaniose visceral com 75,0%. 93,3% dos pacientes analisados apresentaram RAMs e 11,7% dos pacientes foram a Ãbitos, os quais apresentaram uma mÃdia de 5,6 RAMs/paciente. Evidenciou-se o maior numero de RAMs no grupo etÃrio de â21 à 40 anosâ. 6,0 RAMs/paciente foi o nÃmero mÃdio observado nos pacientes que nÃo receberam a prÃ-medicaÃÃo. Dentre as RAMs com maior freqÃÃncia estiveram: febre (76,7%), calafrios (45,0%), vÃmitos (40,0%), tosse (27,0%) e cefalÃia (25,0%). Observou-se que em um total de 221 RAMs, houve predominÃncia de RAMs de gravidade moderada (57%). Visualizou-se que nÃo houve interaÃÃo medicamentosa dos medicamentos prescritos quando utilizados em associaÃÃo à ANB-D. A maior letalidade ocorreu em pacientes com idade de 21 a 40 anos. Pacientes com AIDS tinham idade entre 21 e 40 anos principalmente. Conclui-se, portanto, que sÃo muitas as RAMs provocadas pela ANB-D. InformaÃÃes incompletas/ou ausentes sobre RAMs registradas nos prontuÃrios mostrou que pode existir subnotificaÃÃo dessas reaÃÃes. Dentre os grupos etÃrios, os que mais sofrem com o aparecimento dessas reaÃÃes sÃo adultos jovens (entre 21 e 40 anos).Acredita-se que, a maior freqÃÃncia de RAMs nos pacientes que vieram a Ãbito pode ter contribuÃdo para o agravamento do quadro clÃnico dos mesmos. Pacientes com AIDS tinham idade entre 21 e 40 anos principalmente, esta doenÃa pode ter sido a razÃo da maior letalidade. / Amphotericin B Desoxicolate (AmB-D) is a drug that possesses the capacity to produce many adverse effects. It is a fungicide substance of choice in the treatment of the majority of the systemic mycosis and an important alternative for the treatment of visceral leishmaniosis. The institute of tropical diseases Natan Portela is the only hospital of reference for the treatment of parasite and infectious diseases in the state of PiauÃ. Participate of the sentinel web ANVISA, and through the farmacovigilance system, monitors the use of drugs notifying any adverse reaction to drugs. This observing, retrospective and quantitative study, was carried out in which the records of all the patients Who used the drug between january and march 2009, a total of 60 patients were analyzed, considering at all times adverse reactions to drugs, the technical complaints and the interactions of the drug with other drugs present in the medical prescription. The statistic analysis was carried out by the program Stata/SE 10.0 for Windows (College Station, Texas, USA). Among the patients analyzed in the present study, 63,3% were male. The age group with greater number of patients was â41 or overâ with 36%.The presnet pathology in most patients using AmB-D was visceral Leishmaniosis with 75,0%. 93,3% of the patients analyzed presented RAMs and 11,7% of the patients passed away. These patients presented an average of 5,6 RAMs/pacient. It was evident the greater number of RAMs in the age group from â21 to 40 yearsâ. 6,0 RAMs/pacient was the average number observed in the patients Who did not receive pre-medication. Among the RAMs with greater frequence were: fever (76,7%), chills (45,0%), vomit (40,0%), cough (27,0%) and headache (25,0%). It was observed that in a total of 221 RAMs, there was the predominance of RAMs of moderate seriousness (57%). It was observed that there was no drug interaction of the prescribed drugs when administered in association with AmB-D. Thegreater lethality happened in patients with age between 21 and 40 years. Patients with AIDS were aged between 21 and 40 years, mainly. It was concluded, therefore, that there are many RAMs caused by AmB-D. Incomplete or absent Information about RAMs registered in the records have shown that there may exist sub-notifications of these reactions. Among the age groups, the ones who suffers most with the appearing of these reactions are Young adults (between 21 and 40 years). It is believed that, the greater frequency of RAMs in the patients who passed away could have contributed for the worsening the clinical picture of these patients. Patients with AIDS were aged between 21 and 40 years mainly, this could have been the reason of greater lethality.

A criptococose clinica foi observada por volta do primeiro dia da inoculação e a sobrevida dos animais 15 dias após-inoculação (PI). Isolamos C. neoformans no cérebro a partir do 5º dia (PI) e no pulmão a partir 11º dia (PI). No 1º dia (PI) observamos por meio do tecido cerebral que já havia um quadro inicial de infecção, presença de edema, que evoluiu durante todo o período. C. neoformans foi visualizado primeiramente nos vasos capilares, o que nos leva a sugerir que seja esta rota importante para a entrada da levedura no órgão. A meningite aguda aconteceu por volta do 7º dia quando visualizamos o microrganismo na meninge e com um discreto infiltrado inflamatório. A partir do 13º dia a doença evoluiu para crônica permanecendo até o óbito dos animais. A monoterapia com anfotericina B (AMB) reduziu a sobrevida dos animais, enquanto que, o tratamento isolado com fluconazol (FLC) prolongou a mesma. A associação AMB-FLC foi eficaz, quando iniciamos o tratamento 24 horas (PI), enquanto que, o mesmo tratamento iniciado a partir do 7º dia quando já tínhamos um quadro compatível de meningite aguda não foi satisfatório. É importante ressaltar que os resultados descritos foram referentes à inoculação com isolado sensível in vitro ao fluconazol, enquanto que, o tratamento não resultou em êxito quando empregamos isolado resistente in vitro ao fluconazol. / Clinical cryptococcosis was observed on day 1 postinoculation (PI), and the animals survived until day 15 PI. C. neoformans was isolated from brain tissue starting on day 5 PI, and from lung tissue starting on day 11 PI. On day 1 PI, signs of infection were already observed in brain tissue, with presence of edema, which evolved throughout the period. C. neoformans was first seen in the capillaries, suggesting that this is an important route for the entrance of the yeast into this organ. Acute meningitis occurred around day 7 PI, when the microorganism was observed in the meninges, along with a discrete inflammatory infiltrate. From day 13 PI onward the disease became chronic, persisting until the death of the animals. Treatment with amphotericin B (AMB) alone shortened the animals\' survival, while treatment with fluconazole (FLC) alone lengthened it. Treatment with the two drugs in association was effective when treatment was begun at 24 hours PI, however, when treatment was begun at day 7 PI, already with signs of acute meningitis, the effectiveness was unsatisfactory. It is important to emphasize that these results relate to inoculation with an isolate susceptible in vitro to fluconazole, while the treatment was not effective for an isolate resistant in vitro to fluconazole.

As leveduras de Candida spp. fazem parte da microbiota humana, entretanto podem causar tanto micoses superficiais quanto sistêmicas. As opções terapêuticas para as candidíases incluem três principais classes, os agentes poliênicos, azólicos e equinocandinas; no entanto, a maioria deles apresentam desvantagens de toxicidade e/ou farmacocinética, custos relativamente altos e aumento de isolados resistentes aos antifúngicos. A miltefosina (MFS), um composto alquilfosfocolina, é atualmente usada no tratamento de câncer de mama e de leishmanioses. Estudos prévios apontam a MFS como potencial alternativa para o tratamento das infecções fúngicas, porém possui elevada toxicidade. Dessa forma, este trabalho visa avaliar alternativas para o tratamento de candidíases. MFS e seus análogos sintéticos; nanopartículas de alginato e microemulsões como sistemas de liberação de MFS e/ou anfotericina B (AMB) foram avaliados quanto a atividade antifúngica in vitro e in vivo usando modelos de Galleria mellonella e modelo murino de candidíase vaginal. Dos análogos estruturais da MFS o composto 1 foi o mais ativo, apresentando efeito fungicida de maneira dose e tempo dependente; com a presença de ergosterol exógeno os valores de CIM de MFS e do composto 1 aumentam quando a concentração de ergosterol aumenta no meio de cultura, sugerindo que MFS e o composto 1 possam interagir com o ergosterol resultando em alteração da permeabilidade de membrana. Em ensaios de susceptibilidade in vitro a MFS livre foi mais efetiva que a MFS incorporada em nanopartículas de alginato (MFS.Alg) para todas as cepas de Candida spp. testadas. Em contrapartida, larvas de G. mellonella infectadas com C. albicans (SC 5314 ou IAL-40) foram protegidas da infecção quando tratadas com MFS.Alg (100 mg/Kg) em que houve redução das taxas de mortalidade e de morbidade, bem como redução da carga fúngica e do processo de filamentação do fungo. A AMB e a MFS foram efetivas no modelo larvário em doses de 1 e 20 mg/kg, respectivamente. Importantemente, a MFS em nanocarreador de alginato foi menos tóxica quando comparado com a sua forma livre. Adicionalmente, microemulsões (ME) foram produzidas para a incorporação de AMB e MFS. A formação de um sistema monofásico semelhante a um gel é visualizada com absorção de água após 4 horas de incubação em que agregados bem estruturados são formados indicando a fase hexagonal. Em modelo murino de candidíase vaginal as formulações de AMB e MFS em sistemas de liberação [MFS.Alg (1x), MFS-ME (3x), AMB-ME (3x)] foram comparadas com a formulação em creme [MFS-CR (6x) e AMB-CR (6x)], e todas foram capazes de reduzir a carga fúngica do tecido vaginal, porém as formulações em sistema de liberação foram as mais vantajosas comparadas com a formulação em creme tendo em vista a redução do custo e do número de aplicações levando a maior comodidade do paciente durante o tratamento da candidíase vaginal. Os resultados obtidos mostram dentre os análogos da MFS o Composto 1 foi o que melhor apresentou atividade antifúngica; e que a AMB e/ou MFS incorporadas em sistemas de liberação controlada (nanopartículas de alginato e microemulsões) foram capazes de reduzir efeitos colaterais (no caso da MFS) e de reduzir a carga fúngica nos tecidos infectados, podendo ser alternativas terapêuticas para o tratamento das candidíases. / The yeasts of Candida spp. are part of the human microbiota; however, they can cause both superficial and systemic mycoses. Therapeutic options for candidiasis include three main classes, polyenes, azoles and echinocandins; however, most of them exhibit disadvantages of toxicity and/or pharmacokinetics, relatively high costs and increase of antifungal resistant isolates. Miltefosine (MFS), an alkylphosphocholine compound, is currently used in the treatment of breast cancer and leishmaniasis. Previous studies indicate MFS as an alternative potential for the fungal infections treatment, but it has high toxicity. Thus, this study aims to evaluate alternatives for the treatment of candidiasis. MFS and its synthetic analogs; alginate nanoparticles and microemulsions such as release systems for MFS and / or amphotericin B (AMB) were evaluated for antifungal activity in vitro and in vivo using Galleria mellonella model and murine model of vaginal candidiasis. Among the analogs of MFS, compound 1 was the most active, showing a fungicidal effect in a dose-dependent manner; with the presence of exogenous ergosterol the MIC values of MFS and compound 1 increase when the concentration of ergosterol increases in the culture medium, suggesting that MFS and compound 1 may interact with ergosterol resulting in an altered membrane permeability. In vitro susceptibility assays the free MFS was more effective than the MFS incorporated in alginate nanoparticles (MFS.Alg) against all strains of Candida spp. tested. In contrast, C. albicans-infected G. mellonella larvae (SC 5314 or IAL-40) were protected from infection when treated with MFS.Alg (100 mg/kg) in which mortality and morbidity rates were reduced, as well as reduction of the fungal load and filamentation. AMB and MFS were effective in the larval model at doses of 1 and 20 mg/kg, respectively. Importantly, MFS in alginate nanocarrier was less toxic when compared to its free form. In addition, microemulsions (ME) were produced for the incorporation of AMB and MFS. The formation of a single-phase gel-like system is visualized with water absorption after 4 hours of incubation in which well-structured aggregates are formed indicating the hexagonal phase. In the murine model of vaginal candidiasis, formulations of AMB and MFS incorporated in release systems [MFS.Alg (1x), MFS-ME (3x), AMB-ME (3x)] were compared with the cream formulation [MFS-CR 6x) and AMB-CR (6x)], and all formulations were able to reduce the fungal load of vaginal tissue, but the release-system formulations were the most advantageous compared to the cream formulation in order to reduce the cost and number of applications leading to greater patient comfort during the treatment of vaginal candidiasis. The results obtained show that among the analogs of MFS, compound 1 was the one that presented the best antifungal activity; and that AMB and/or MFS incorporated in controlled release systems (alginate nanoparticles and microemulsions) were able to reduce side effects (in the case of MFS) and reduce fungal load in infected tissues, and they could be therapeutic alternatives for treatment of the candidiasis.