Introduction: Le principal objectif de cette étude est de mesurer l’effet du GDF-5 sur l’homéostasie du cartilage. Le GDF-5 est un gène de susceptibilité de l’OA faisant partie de la famille des BMPs et qui favorise la synthèse du cartilage. Le but de notre étude a été de déterminer l’effet du GDF-5 sur le métabolisme catabolique ainsi que sur l’équilibre global des chondrocytes, principalement au niveau de l’Aggrécan. Méthode : Des chondrocytes arthrosiques canins et humains OA ont été exposés au GDF-5. L’expression des ARNm et des protéines a été analysée afin d’évaluer la production de l’Aggrécan et le ratio Col-II/Col-I au niveau des facteurs anaboliques et du phénotype. Pour le catabolisme, l’expression et l’activité des aggrécanases ADAMTS-4 et ADAMTS-5 ont été mesurées. Les épitopes NITEGE et CTX-II ont aussi été quantifiés dans le liquide synovial canin après des injections intraarticulaires de GDF-5. Résultats : Le GDF-5 provoque une augmentation de l’activité cellulaire des chondrocytes canins et humains. Pour les ARNm et l’expression protéique, le GDF-5 augmente l’expression de l’Aggrécan alors que les facteurs cataboliques le diminuent. Le phénotype reste inchangé en présence du produit, sauf à haute dose où on augmente le ColI. L’activité des aggrécanases diminue puisque l’épitope NITEGE diminue alors que le CTX-II augmente dans l’articulation. Conclusion : En somme, les facteurs anaboliques du cartilage sont favorisés, alors que les facteurs cataboliques sont diminués par le GDF-5. Cette action double permet d’illustrer l’effet du GDF-5, le classant comme un potentiel médicament modifiant la maladie de l’OA qui mérite d’être étudiée. / Purpose: The objective of this study is to assess the effect of GDF-5 on cartilage homeostasis. GDF-5 is a susceptibility gene for OA and member of the BMP super family. Studies have shown that it can increase expression of anabolic factors in chondrocytes. Therefore, our study indentifies how GDF-5 influences this metabolism and the global homeostasis of chondrocytes, aiming mainly towards Aggrecan. Methods : Osteoarthritic (OA) chondrocytes from canine and human models were exposed to GDF-5. Protein expressions, along with mRNA expression were assessed in order to investigate Aggrecan production and the ratio of Col-II/Col-I, for the anabolic phenotype markers. The aggrecanases ADAMTS-4 and ADAMTS-5 and their global activity were assed for the catabolic factors. The NITEGE and CTX-II epitope were also measured in synovial fluid of Pond-Nuki dogs that received intraarticular GDF-5 injections. Results : GDF-5 increases chondrocyte cellular activity, in our canine and human models. Both mRNA and protein expression of the chondrocytes Aggrecan were increased and the aggrecanases expression and activity were decreased. Collagen ratio did not show a phenotype, except et high dosage where the Col-I production is induced. Aggrecanase activity was lowered while CTX-II was increased. Conclusion : In conclusion, the anabolic cellular activity of OA chondrocytes increases while the catabolic factors decrease in presence of GDF-5. This double action illustrates the global effect of GDF-5, identifying it as a potential disease modifying factor of OA that should be further investigated.

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Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.

L'arthrose est une maladie articulaire dégénérative, avec une pathogenèse inconnue. Des études récentes suggèrent que l'activation du facteur de transcription du récepteur activateur de la prolifération des peroxysomes (PPAR) gamma est une cible thérapeutique pour ce maladie. Les agonistes du PPARγ inhibent l'inflammation et réduisent la synthèse des produits de dégradation du cartilage in vitro et in vivo. Cependant, des études utilisant des agonistes du PPARγ n’élucident pas les effets exacts médiés par ce gène complexe. En effet, certains de ces agonistes ont la capacité de régulariser d'autres voies de signalisation indépendantes de PPARγ, ainsi entraînant des effets secondaires graves. Afin d'obtenir une efficacité thérapeutique avec potentiellement moins de problèmes de sécurité, il est donc essentiel d'élucider, in vivo, le rôle exact de PPARγ dans la physiopathologie OA. Mon projet de thèse permettra de déterminer, pour la première fois, le rôle spécifique de PPARγ in vivo dans la physiopathologie OA. Les souris utilisées pour l’étude avaient une délétion conditionnelle du gène PPARγ dans le cartilage. Ces dernières ont été générées en employant le système LoxP/Cre. Pour tester cette hypothèse, j'ai généré deux types de souris avec une délétion au PPARγ, (a) une suppression du gène PPARγ spécifiquement dans le cartilage germinale pour l'étude de l'arthrose liée au développement et à l'âge et (b) la suppression inductible du gène PPARγ spécifiquement dans le cartilage chez la souris adulte pour les études OA. L’étude précédente dans notre laboratoire, utilisant ces souris ayant une délétion au gène PPARγ germinales, montre que ces souris présentent des anomalies du développement du cartilage. J'ai également exploré si ces souris qui présentent des défauts précoces du développement ont toutes les modifications phénotypiques dans le cartilage au cours du vieillissement. Mes résultats ont montré que les souris adultes, ayant une délétion au gène PPARγ, ont présenter un phénotype de l'arthrose spontanée associée à une dégradation du cartilage, l’hypocellularité, la fibrose synoviale. Cette étude a montré que PPARγ est un régulateur essentiel pour le cartilage, et c’est le manque (l’absence) de ce dernier qui conduit à un phénotype de l'arthrose spontanée accélérée (American Journal of Pathologie). A partir de ce but de l'étude, on n’a pas pu vérifier si ces souris présentaient l’OA spontanée en raison des défauts de développement ou à la suite de la délétion du gène PPARγ. Pour contourner les défauts de développement, j'ai généré des souris ayant une délétion du gène PPARγ spécifiquement dans le cartilage inductible avec le système Col2rTACre. Ces souris ont été soumises à modèle de la chirurgie OA (DMM: déstabilisation du ménisque médial) et les résultats révèlent que les souris PPARγ KO ont une dégradation accélérée du cartilage, une hypocellularité, une fibrose synoviale et une augmentation de l'expression des marqueurs cataboliques et des marqueurs inflammatoire. La perte de PPAR dans le cartilage articulaire est un évènement critique qui initie la dégradation de cartilage dans OA. Les études récentes suggèrent que le procès d’autophagie, une forme de survie cellulaire programmée, est altéré pendant l’OA et peut contribuer vers une protection diminuée des cellules, résultant la dégradation du cartilage. J’ai donc exploré le rôle de PPARγ dans la protection des cellules en déterminant l’effet de manque de PPARγ dans le cartilage par l’expression de mTOR (régulateur négatif principal d’autophagie) et les gènes d’autophagie durant OA. Mes résultats ont montré que les souris KO PPARγ présentent également une augmentation sur l'expression de mTOR et une diminution sur l’expression des marqueurs autophagiques en comparaison avec les chondrocytes articulaires isolés des souris contrôles OA. J'ai suggéré l'hypothèse que PPARγ contrôle la régulation de la signalisation de mTOR/autophagie, et finalement la mort des chondrocytes et l’expression des facteurs cataboliques et les facteurs inflammatoire. Pour tester cette hypothèse, j’ai fait la transfection des chondrocytes arthrosiques PPARγ-KO avec le vecteur d’expression de PPARγ pour déterminer si la restauration de l'expression de PPARγ peut sauver le phénotype des cellules PPARγ-KO OA. J'ai observé que la restauration de l'expression de PPARγ dans les cellules PPARγ-KO en présence du vecteur d'expression PPARγ, a pu considérablement régulariser négativement l'expression de mTOR et mettre en règle positivement l'expression des gènes autophagiques ainsi que le sauvetage significative de l'expression du collagène de type II et l’aggrecan et de baisser de manière significative l'expression de marqueurs cataboliques critiques et des marqueurs inflammatoires. Pour prouver que l’augmentation de la signalisation de mTOR et la diminution de l'autophagie est responsable du phénotype OA accélérée observée dans les souris PPARγ KO in vivo, j'ai généré les souris doubles KO PPARγ- mTOR inductible spécifique du cartilage en utilisant le système Col2 - rtTA -Cre et soumis ces souris à DMM modèle de l'arthrose. Mes résultants démontrent que les souris avec PPARγ- mTOR doubles KO ont été significativement protégés contre les OA DMM induites associées à une protection significative contre la destruction du cartilage, la perte de protéoglycanes et la perte de chondro-cellularité par rapport aux souris témoins. Considérant que mTOR est un répresseur majeur de l'autophagie, j'ai trouvé que l'expression de deux marqueurs de l'autophagie critiques (ULK1 et LC3B) a été significativement plus élevée dans les chondrocytes extraits les souris doubles KO PPARγ-mTOR par rapport aux souris témoins. En plus, les études de sauvetage in vitro en utilisant le vecteur d'expression PPAR et les études in vivo utilisant les souris doubles KO PPARγ- mTOR montrent que PPARγ est impliqué dans la régulation de la protéine signalant de mTOR/autophagie dans le cartilage articulaire. Ces résultats contournent PPARγ et sa signalisation en aval de mTOR/autophagie en tant que cibles thérapeutiques potentielles pour le traitement de l'arthrose. / Osteoarthritis (OA) is an age related degenerative joint disease with unknown pathogenesis. Recent studies suggest that the activation of the transcription factor Peroxisome Proliferator-Activated Receptor gamma (PPARγ) is a therapeutic target for OA. Agonists of PPARγ inhibit inflammation and reduce the synthesis of cartilage degradation products both in vitro and in vivo. However, studies using agonists of PPARγ do not elucidate the exact effects mediated by this complex gene. Indeed, some of these agonists have the ability to regulate, in vivo, various other signaling pathways independent of PPARγ, resulting in serious side effects. It is therefore vital, in order to achieve therapeutic efficacy with potentially less safety concerns, to elucidate the exact in vivo role of PPARγ in OA pathophysiology. Thus, the aim of my PhD project was to determine the specific in vivo role of PPARγ in OA pathophysiology using cartilage-specific PPARγ knockout (KO) mice and subjecting these mice to surgical model of OA. I generated two separate PPARγ KO mice harboring a (a) constitutive cartilage-specific germ-line deletion of PPARγ gene for developmental and age-related OA study and (b) inducible cartilage-specific deletion of PPARγ in adult mouse specifically for OA studies using LoxP Cre system. Previous study in my laboratory using germ-line PPARγ KO mice shows that these mice exhibit cartilage developmental defects. I further explored if these mice which exhibit early developmental defects have any phenotypic changes in the articular cartilage during ageing. My results showed that adult PPARγ KO mice exhibited a spontaneous OA phenotype associated with enhanced cartilage degradation, hypocellularity, synovial fibrosis, and increased expression of catabolic and inflammatory factors. This study showed that PPARγ is a critical regulator of cartilage health, the lack of which leads to an accelerated spontaneous OA phenotype (Vasheghani et al, 2013; American Journal of Pathology). From this aim of the study, I could not ascertain if cartilage-specific germline PPARγ KO mice exhibited spontaneous OA because of developmental defects or as a result of PPARγ deficiency. To bypass the developmental defects, I then generated inducible cartilage-specific PPARγ KO mice using Col2rTACre system and subjected these mice to destabilization of medial meniscus (DMM) model of OA surgery. My results revealed that PPARγ KO mice showed accelerated cartilage degradation, hypo-cellularity, synovial fibrosis and increased expression of catabolic and inflammatory factors during OA. Loss of chondrocyte cellularity within the articular cartilage is one of the critical events that initiate the degradation of the cartilage during OA. Recent studies suggest that the process of autophagy, a form of programmed cell survival, is impaired during OA and may contribute towards decreased chondro-protection resulting in cartilage degradation. Thus, I further explored the role of PPARγ in chondro-protection by determining the effect of PPARγ deficiency in the cartilage on the expression of mTOR (master negative regulator of autophagy) and autophagy genes during OA. My results revealed that PPARγ-deficient chondrocytes exhibit significantly enhanced expression of mTOR and decreased expression of genes that initiate autophagy process compared to chondrocytes extracted from control OA mice. I then hypothesized that PPARγ controls mTOR/autophagy signaling and ultimately the fate of chondrocytes and the expression of catabolic and inflammatory factors in the articular cartilage. To test this, I transfected PPARγ KO OA chondrocytes with PPARγ expression vector to determine if restoration of PPARγ expression can rescue the phenotype of PPARγ KO OA cells. I observed that restoration of PPARγ expression in PPARγ KO cells significantly down-regulated the expression of mTOR and up-regulate the expression of autophagy genes along with significant rescue in the expression of collagen type II and aggrecan and significant down-regulation in the expression of critical catabolic and inflammatory markers. To validate our in vitro finding that enhanced mTOR signalling and resultant decrease in autophagy is responsible for accelerated OA phenotype observed in PPARγ KO mice, I generated inducible cartilage-specific PPARγ-mTOR double KO mice and subjected these mice to DMM model of OA. My results clearly demonstrate that PPARγ-mTOR double KO mice exhibit significant protection against DMM-induced OA associated with significant protection from cartilage destruction, proteoglycan loss and loss of chondro-cellularity compared with control mice. Since mTOR is a major repressor of autophagy, I found that the expression of two critical autophagy markers (ULK1 and LC3B) was significantly elevated in PPARγ-mTOR double KO mice compared to control mice. My in vitro rescue studies using PPARγ expression vector and in vivo studies using PPARγ- mTOR double KO mice clearly show that PPARγ is involved in the regulation of mTOR/autophagy signalling in the articular cartilage. Therefore, deficiency of PPARγ upregulates mTOR signalling resulting in the suppression of autophagy and decreased chondroprotection and increased catabolic activity leading to accelerated severe OA. This study for the first time provides direct evidence on the role of PPARγ in chondroprotection by modulation of mTOR/autophagy signalling in the articular cartilage. These findings outline PPARγ and its downstream signalling by mTOR/autophagy as potential therapeutic targets for the treatment of OA.

L'arthrose (OA) est une maladie articulaire dégénérative, classée comme la forme la plus fréquente au monde. Elle est caractérisée par la dégénérescence du cartilage articulaire, l’inflammation de la membrane synoviale, et le remodelage de l’os sous-chondral. Ces changements structurels et fonctionnels sont dues à de nombreux facteurs. Les cytokines, les prostaglandines (PG), et les espèces réactives de l'oxygène sont les principaux médiateurs impliqués dans la pathophysiologie de l'OA. L'interleukine-1β (IL-1β) est une cytokine pro-inflammatoire majeure qui joue un rôle crucial dans l'OA. L'IL-1β induit l'expression de la cyclooxygénase-2 (COX-2), la microsomale prostaglandine E synthase-1 (mPGES-1), la synthase inductible de l'oxyde nitrique (iNOS), ainsi que leurs produits la prostaglandine E2 (PGE2) et l'oxyde nitrique (NO). Ce sont des médiateurs essentiels de la réponse inflammatoire au cours de l'OA qui contribuent aux mécanismes des douleurs, de gonflement, et de destruction des tissus articulaires. Les modifications épigénétiques jouent un rôle très important dans la régulation de l’expression de ces gènes pro-inflammatoires. Parmi ces modifications, la méthylation/ déméthylation des histones joue un rôle critique dans la régulation des gènes. La méthylation/ déméthylation des histones est médiée par deux types d'enzymes: les histones méthyltransférases (HMT) et les histones déméthylases (HDM) qui favorisent l’activation et/ou la répression de la transcription. Il est donc nécessaire de comprendre les mécanismes moléculaires qui contrôlent l’expression des gènes de la COX-2, la mPGES-1, et l’iNOS. L'objectif de cette étude est de déterminer si la méthylation/déméthylation des histones contribute à la régulation de l’expression des gènes COX-2, mPGES-1, et iNOS dans des chondrocytes OA humains induits par l'IL-1β. Nous avons montré que la méthylation de la lysine K4 de l'histone H3 (H3K4) par SET-1A contribue à l’activation des gènes COX-2 et iNOS dans les chondrocytes humains OA induite par l'IL-1β. Nous avons également montré que la lysine K9 de l’histone H3 (H3K9) est déméthylée par LSD1, et que cette déméthylation contribue à l’expression de la mPGES-1 induite par IL-1β dans les chondrocytes humains OA. Nous avons aussi trouvé que les niveaux d'expression des enzymes SET-1A et LSD1 sont élevés au niveau du cartilage OA. Nos résultats montrent, pour la première fois, l'implication de la méthylation/ déméthylation des histones dans la régulation de l’expression des gènes COX-2, mPGES-1, et iNOS. Ces données suggèrent que ces mécanismes pourraient être une cible potentielle pour une intervention pharmacologique dans le traitement de la physiopathologie de l'OA. / Osteoarthritis (OA) is a disabling disease classified as the most common form of arthritis worldwide. It is characterized by cartilage degeneration, synovium inflammation, and subchondral bone remodeling resulting in a loss of joint function. These structural and functional changes are due to numerous factors. Cytokines, prostaglandins (PG), and reactive oxygen species are the major mediators implicated in the pathophysiology of OA. Interleukin-1 (IL-1) is a major pro-inflammatory cytokine that plays a crucial role in OA. IL-1 induces the expression of Cyclo-oxygenase-2 (COX-2), microsomal prostaglandin E synthase-1 (mPGES-1), inducible nitric oxide synthase (iNOS), as well as their products prostaglandin E2 (PGE2) and nitric oxide (NO). These are critical mediators of the inflammatory response during OA causing pain, swelling, and joint tissue destruction. The activation of these pro-inflammatory genes results from different changes at the level of chromatin known as epigenetic modifications. Epigenetic modifications such as DNA methylation and histone modifications play a crucial role in gene expression. Among these modifications, histone methylation/demethylation is the most critical one. Histone methylation/demethylation is mediated by two types of enzymes: histone methyltransferases (HMT) and histone demethylases (HDM) which can either activate or repress transcription. It is therefore necessary to understand the molecular mechanisms which underlie the regulation of COX-2, mPGES-1, and iNOS expression. The objective of this study is to investigate whether histone methylation/demethylation can modulate COX-2, mPGES-1, and iNOS expression in IL-1 induced OA human chondrocytes. We demonstrated that histone H3 lysine K4 (H3K4) methylation by SET-1A contributes to IL-1-induced COX-2 and iNOS expression in human OA Chondrocytes. We showed also that LSD1-mediated demethylation of histone H3 lysine 9 (H3K9) contributes to IL-1β-induced mPGES-1 expression in human OA chondrocytes. We found that levels of SET-1A and LSD1 expression are elevated in OA cartilage as compared with normal cartilage. Our data demonstrates, for the first time, the implication of histone methylation/demethylation in COX-2, mPGES-1, and iNOS regulation suggesting that these mechanisms could be a potential target for pharmacological intervention in the treatment of the pathophysiology of OA.

L'arthrose est la maladie musculo-squelettique la plus commune dans le monde. Elle est l'une des principales causes de douleur et d’incapacité chez les adultes, et elle représente un fardeau considérable sur le système de soins de santé. L'arthrose est une maladie de l’articulation entière, impliquant non seulement le cartilage articulaire, mais aussi la synoviale, les ligaments et l’os sous-chondral. L’arthrose est caractérisée par la dégénérescence progressive du cartilage articulaire, la formation d’ostéophytes, le remodelage de l'os sous-chondral, la détérioration des tendons et des ligaments et l'inflammation de la membrane synoviale. Les traitements actuels aident seulement à soulager les symptômes précoces de la maladie, c’est pour cette raison que l'arthrose est caractérisée par une progression presque inévitable vers la phase terminale de la maladie. La pathogénie exacte de l'arthrose est encore inconnue, mais on sait que l'événement clé est la dégradation du cartilage articulaire. Le cartilage articulaire est composé uniquement des chondrocytes; les cellules responsables de la synthèse de la matrice extracellulaire et du maintien de l'homéostasie du cartilage articulaire. Les chondrocytes maintiennent la matrice du cartilage en remplaçant les macromolécules dégradées et en répondant aux lésions du cartilage et aux dégénérescences focales en augmentant l'activité de synthèse locale. Les chondrocytes ont un taux faible de renouvellement, c’est pour cette raison qu’ils utilisent des mécanismes endogènes tels que l'autophagie (un processus de survie cellulaire et d’adaptation) pour enlever les organelles et les macromolécules endommagés et pour maintenir l'homéostasie du cartilage articulaire. i L'autophagie est une voie de dégradation lysosomale qui est essentielle pour la survie, la différenciation, le développement et l’homéostasie. Elle régule la maturation et favorise la survie des chondrocytes matures sous le stress et des conditions hypoxiques. Des études effectuées par nous et d'autres ont montré qu’un dérèglement de l’autophagie est associé à une diminution de la chondroprotection, à l'augmentation de la mort cellulaire et à la dégénérescence du cartilage articulaire. Carames et al ont montré que l'autophagie est constitutivement exprimée dans le cartilage articulaire humain normal. Toutefois, l'expression des inducteurs principaux de l'autophagie est réduite dans le vieux cartilage. Nos études précédentes ont également identifié des principaux gènes de l’autophagie qui sont exprimés à des niveaux plus faibles dans le cartilage humain atteint de l'arthrose. Les mêmes résultats ont été montrés dans le cartilage articulaire provenant des modèles de l’arthrose expérimentaux chez la souris et le chien. Plus précisément, nous avons remarqué que l'expression d’Unc-51 like kinase-1 (ULK1) est faible dans cartilage humain atteint de l'arthrose et des modèles expérimentaux de l’arthrose. ULK1 est la sérine / thréonine protéine kinase et elle est l’inducteur principal de l’autophagie. La perte de l’expression de ULK1 se traduit par un niveau d’autophagie faible. Etant donné qu’une signalisation adéquate de l'autophagie est nécessaire pour maintenir la chondroprotection ainsi que l'homéostasie du cartilage articulaire, nous avons proposé l’hypothèse suivante : une expression adéquate de ULK1 est requise pour l’induction de l’autophagie dans le cartilage articulaire et une perte de cette expression se traduira par une diminution de la chondroprotection, et une augmentation de la mort des chondrocytes ce qui conduit à la dégénérescence du cartilage articulaire. Le rôle exact de ULK1 dans la pathogénie de l'arthrose est inconnue, j’ai alors créé pour la première fois, des souris KO ULK1spécifiquement dans le cartilage en utilisant la technologie Cre-Lox et j’ai ensuite soumis ces souris à la déstabilisation du ménisque médial (DMM), un modèle de l'arthrose de la souris pour élucider le rôle spécifique in vivo de ULK1 dans pathogenèse de l'arthrose. Mes résultats montrent que ULK1 est essentielle pour le maintien de l'homéostasie du cartilage articulaire. Plus précisément, je montre que la perte de ULK1 dans le cartilage articulaire a causé un phénotype de l’arthrose accéléré, associé à la dégénérescence accélérée du cartilage, l’augmentation de la mort cellulaire des chondrocytes, et l’augmentation de l'expression des facteurs cataboliques. En utilisant des chondrocytes provenant des patients atteints de l’arthrose et qui ont été transfectées avec le plasmide d'expression ULK1, je montre qu’ULK1 est capable de réduire l’expression de la protéine mTOR (principal régulateur négatif de l’autophagie) et de diminuer l’expression des facteurs cataboliques comme MMP-13 et ADAMTS-5 et COX-2. Mes résultats jusqu'à présent indiquent que ULK1 est une cible thérapeutique potentielle pour maintenir l'homéostasie du cartilage articulaire. / Osteoarthritis (OA) is the most common musculoskeletal disease worldwide. It is one of the leading causes of pain and disability among adults, and represents a considerable burden on the healthcare system. OA is a disease of the entire joint, involving not only the articular cartilage but also the synovium, ligaments and subchondral bone. It is characterized by the progressive degeneration of the articular cartilage, osteophyte formation, remodelling of the subchondral bone, deterioration of tendons and ligaments and various degrees of inflammation of the synovium. While current therapies and management strategies can help alleviate symptoms early in the disease process, OA is characterized by almost inevitable progression towards end-stage disease. The exact pathogenesis of OA is largely unknown but the key event in OA is the degradation of the articular cartilage. The articular cartilage is only composed of chondrocytes; cells responsible for the synthesis of the extracellular matrix (ECM) and maintenance of articular cartilage homeostasis. Chondrocytes maintain the articular cartilage matrix by replacing degraded macromolecules and respond to focal cartilage injury or degeneration by increasing local synthesis activity. Since chondrocytes exhibit low levels of turnover, they rely on endogenous mechanisms such as autophagy (a cell survival and adaptation process) to remove damaged organelles and macromolecules in order to maintain articular cartilage homeostasis. Autophagy is a lysosomal degradation pathway that is essential for survival, differentiation, development and homeostasis. It regulates maturation and promotes survival of terminally differentiated chondrocytes under stress and hypoxic conditions. Studies by us and others have shown that compromised autophagy is associated with decreased chondroprotection, increased cell death and articular cartilage degeneration. Carames et al showed that autophagy is constitutively expressed in normal human articular cartilage. However, expression of key autophagy inducers is reduced in ageing cartilage. Our previous studies have also identified a panel of key autophagy genes that are expressed in low levels in human OA cartilage as well as in the articular cartilage from mouse and dog models of experimental OA. Specifically, we identified that expression of unc-51 like kinase-1 (ULK1) is suppressed in human OA cartilage and experimental OA models. ULK1 is a serine/threonine protein kinase and is the most upstream autophagy inducer. Loss of ULK1 results in disruption of autophagy induction. Since adequate autophagy signaling is required for maintaining chondroprotection as well as articular cartilage homeostasis, we hypothesized that ULK1 is required for autophagy induction in the articular cartilage and loss of it will result in decreased chondroprotection and enhanced chondrocyte death leading to the degeneration of articular cartilage. Since the exact role of ULK1 in pathogenesis of OA is unknown, I created for the first time, an inducible cartilage- specific ULK1 knockout (KO) mice using Cre-Lox technology and subjected these mice to the destabilization of the medial meniscus (DMM) mouse OA model to specifically elucidate the specific in vivo role of ULK1 in OA pathogenesis. My results show that ULK1 is essential for maintaining articular cartilage homeostasis. Specifically I show that loss of ULK1 in the articular cartilage results in an accelerated OA phenotype; which is associated with accelerated cartilage degeneration, enhanced chondrocyte cell death, increased expression of catabolic MMP-13. Using human OA chondrocytes transfected with ULK1 expression plasmid I show that ULK1 is able to reduce the expression of mTOR (major negative regulator of autophagy) and decrease the expression of OA catabolic factors including MMP-13, ADAMTS-5 and COX-2. My results so far suggest that ULK-1 is a potential therapeutic target to maintain articular cartilage homeostasis.

L’arthrose (OA) est une maladie dégénérative très répondue touchant les articulations. Elle est caractérisée par la destruction progressive du cartilage articulaire, l’inflammation de la membrane synoviale et le remodelage de l’os sous chondral. L’étiologie de cette maladie n’est pas encore bien définie. Plusieurs études ont été menées pour élucider les mécanismes moléculaires et cellulaires impliqués dans le développement de l’OA. Les effets protecteurs du récepteur activé par les proliférateurs de peroxysomes gamma (PPARγ) dans l'OA sont bien documentés. Il a été démontré que PPARγ possède des propriétés anti-inflammatoires et anti-cataboliques. Aussi, plusieurs stimuli ont été impliqués dans la régulation de l’expression de PPARγ dans différents types cellulaires. Cependant, les mécanismes exacts responsables de cette régulation ainsi que le profil de l’expression de ce récepteur au cours de la progression de l’OA ne sont pas bien connus. Dans la première partie de nos travaux, nous avons essayé d’élucider les mécanismes impliqués dans l’altération de l’expression de PPARγ dans cette maladie. Nos résultats ont confirmé l’implication de l’interleukine-1β (IL-1β), une cytokine pro-inflammatoire, dans la réduction de l’expression de PPARγ au niveau des chondrocytes du cartilage articulaire. Cet effet coïncide avec l'induction de l’expression du facteur de transcription à réponse précoce de type 1 (Egr-1). En plus, la diminution de l'expression de PPARγ a été associée au recrutement d'Egr-1 et la réduction concomitante de la liaison de Sp1 au niveau du promoteur de PPARγ. Dans la deuxième partie de nos travaux, nous avons évalué le profil d’expression de ce récepteur dans le cartilage au cours de la progression de cette maladie. Le cochon d’inde avec OA spontanée et le chien avec OA induite par rupture du ligament croisé antérieur (ACLT) deux modèles animaux d’OA ont été utilisés pour suivre l’expression des trois isoformes de PPARs : PPAR alpha (α), PPAR béta (β) et PPAR gamma (γ) ainsi que la prostaglandine D synthase hématopoïétique (H-PGDS) et la prostaglandine D synthase de type lipocaline (L-PGDS) deux enzymes impliquées dans la production de l’agoniste naturel de PPARγ, la 15-Deoxy-delta(12,14)-prostaglandine J(2) (15d-PGJ2). Nos résultats ont démontré des changements dans l’expression de PPARγ et la L-PGDS. En revanche, l’expression de PPARα, PPARβ et H-PGDS est restée stable au fil du temps. La diminution de l’expression de PPARγ dans le cartilage articulaire semble contribuer au développement de l’OA dans les deux modèles animaux. En effet, le traitement des chondrocytes par de siRNA dirigé contre PPARγ a favorisé la production des médiateurs arthrosiques tels que l'oxyde nitrique (NO) et la métalloprotéase matricielle de type 13 (MMP-13), confirmant ainsi le rôle anti-arthrosique de ce récepteur. Contrairement à ce dernier, le niveau d'expression de la L-PGDS a augmenté au cours de la progression de cette maladie. La surexpression de la L-PGDS au niveau des chondrocytes humains a été associée à la diminution de la production de ces médiateurs arthrosiques, suggérant son implication dans un processus de tentative de réparation. En conclusion, l’ensemble de nos résultats suggèrent que la modulation du niveau d’expression de PPARγ, de la L-PGDS et d’Egr-1 au niveau du cartilage articulaire pourrait constituer une voie thérapeutique potentielle dans le traitement de l’OA et probablement d’autres formes d'arthrite. / Osteoarthritis (OA) is the most common degenerative joint disease. It is characterised by progressive destruction of articular cartilage, synovial inflammation and subchondral bone remodelling. The complete etiology of OA is still not well defined. Several studies have been carried out to elucidate the molecular and cellular mechanisms involved in OA development. The protective effects of Peroxisome proliferator-activated receptor gamma (PPARγ) in OA have been well documented. It has been demonstrated that PPARγ exhibit anti-inflammatory and anti-catabolic properties. Although many stimuli have been reported to regulate the expression of PPARγ in several cell types. However, little information is available on the exact mechanisms that govern its regulation as well as the expression profile of this recepteur during the course of the disease. In the first part of this work, we tried to elucidate the mechanisms involved in the alteration of PPARγ expression in OA. Our findings confirm that interleukin-1 beta (IL-1β), a proinflammatory cytokine, down regulate the expression of PPARγ in articular chondrocytes. This effect coincided with the induction of early growth response protein-1 (Egr-1) expression. In addition, down regulation of PPARγ expression was associated with Egr-1 recruitment to and concomitant reduction in Sp1 occupancy at PPARγ promoter. In the second part of this work, we evaluated the expression profile of this receptor in cartilage during the progression of OA. Spontaneous Hartley guinea pig model and anterior cruciate ligament transection (ACLT) dog model were used to follow the expression of three isoforms of PPARs: PPAR alpha (α), PPAR beta (β) and PPAR gamma (γ) as well as hematopoietic prostaglandin D synthase (H-PGDS) and lipocalin-type prostaglandin D synthase (L-PGDS) two enzymes involved in the production of the natural agonist PAARγ, 15-Deoxy-delta(12,14)-prostaglandin J(2) (15d PGJ2). Our reultats showed changes in the expression of PPARγ and L-PGDS. In contrast, the level of PPARα, PPARβ and H-PGDS was constant over time. The decrease in PPARγ levels in articular chondrocytes suggest that it may be a contributing factor in OA development in both animal models used in this study. Furthermore, siRNA silencing of PPARγ resulted in an enhanced production of osteoarthric mediators such as matrix metalloproteinase-13 (MMP-13) and nitric oxide (NO). Thus, confirming the anti-arthritic role of this receptor. In contrast, unlike the later, there was an increase in the expression level of L-PGDS during disease progression. The overexpression of L-PGDS in human chondrocytes was associated with reduced production of these osteoarthric mediators, suggesting its involvement in repair process. In summary, our data suggest that the modulation of PPARγ, L-PGDS and Egr-1 expression levels in articular cartilage may be a potential therapeutic approach in the treatment of OA and probably other forms of arthritis.

L’objectif de ce travail était de développer des stratégies éducatives en association avec une cure thermale à destination de patients porteurs de gonarthrose, avec un objectif non seulement d’efficacité clinique et psychologique mais aussi d’amélioration du niveau d’activité physique. Au total, 745 patients souffrants de gonarthrose ont été recrutés sur les 9 stations thermales membre du Cluster Innovatherm et répartis dans les 3 études composant ce projet. La première étude porte sur l’analyse qualitative des freins et des leviers à la pratique d’activité physique. La seconde étude a mesuré le niveau d’activité physique et analysé les facteurs influençant la régularité de la pratique. La troisième étude a évalué les effets d’un programme d’éducation à l’exercice en milieu thermal. L’analyse des résultats des 2 premières études a montré que le niveau d’activité physique des gonarthrosiques était significativement dépendant de certaines données sociodémographiques, anthropométriques (genre, indice de masse corporelle, obésité), de facteurs extrinsèques (lieu de vie, situation familiale) et de facteurs intrinsèques (motivation, bien être, « self-efficacy », fatigue, vieillissement, peur d’aggraver la gonarthrose). La troisième étude a montré que le traitement thermal associé ou non aux ateliers d’éducation à l’exercice permettait d’augmenter significativement le niveau d’activité physique, avec un effet taille moyen de 0.53 [0.28;0.77] à 3 mois. Les ateliers d’éducation à l’exercice ont un effet bénéfique significatif sur l’anxiété, la dépression et les peurs et croyances (sous item médecin du KOFBeQ), à 3 mois. Ces études confirment l’impact du traitement thermal sur les paramètres cliniques de la gonarthrose et fournissent de nouvelles données concernant ce traitement sur l’évolution du niveau d’activité physique. Cette étude argumente en faveur de l’effet cognitif et psychologique du programme d’éducation à l’exercice. / The aim of this work was to develop educational strategies in association with spa therapy treatment for patients with knee osteoarthritis, with a goal not only of clinical, psychological but also of improvement of the level of physical activity. A total of 745 patients with knee osteoarthritis were recruited from the 9 member’s thermal spa of the Innovatherm Cluster and distributed among the 3 studies building this project. The first study looked at the qualitative analysis of facilitators and barriers to physical activity. The second study on the level of physical activity and the analysis of the factors influencing the practice. The third study evaluated the effects of a self-management exercise education program in spa therapy resort. Analysis of the results of studies 1 and 2 showed the level of physical activity was significantly dependent on certain anthropometric data (gender, BMI, obesity), extrinsic factors (life situation, family situation) and intrinsic factors (motivation, well-being, self-efficacy, fatigue, aging, fear of aggravating knee osteoarthritis). Study 3 showed that spa treatment associated with or without self-management exercise program significantly increases the physical activity level, with medium effect size 0.53 [0.28; 0.77] at 3 months. Exercise education has a significant beneficial effect between groups in favor of the intervention group on anxiety, depression and fears and beliefs. These studies confirm the impact of spa therapy treatment on the clinical parameters of osteoarthritis and provide new data on the increase of the physical activity level and argue in favor of the cognitive and psychological effect of the self-management exercise program.

La « semicarbazide-sensitive amine oxidase » (SSAO) catalyse la déamination oxydative des amines primaires en aldéhyde, peroxyde d’hydrogène et ammoniac. Elle participe à la différenciation cellulaires, l’inflammation et la transmigration leucocytaire à travers l’endothélium lymphatique. Nos objectifs ont été d’étudier le rôle de la SSAO (i) dans la différenciation chondrocytaire hypertrophique, en relation avec le développement de l’arthrose en utilisant des chondrocytes de rat en culture primaire et des genoux arthrosiques de patients (ii) dans le développement de l’athérosclérose en invalidant des souris ApoE-/- qui développent naturellement l’athérosclérose pour le gène de la SSAO. Au niveau articulaire, la SSAO a été détectée dans le cartilage de rat et humain. In vitro, la SSAO (activité et expression) augmentent au cours de la différenciation terminale de chondrocytes de rat. Son inhibition par le LJP1586 entraîne un retard de différenciation chondrocytaire. La SSAO augmente également dans les zones arthrosiques du cartilage humain parallèlement à l’augmentation de l’hypertrophie. La SSAO jouerait donc un rôle dans la différenciation terminale des chondrocytes (hypertrophie) possiblement via le transport de glucose et dans le développement de la maladie. Au niveau vasculaire, les souris femelles ApoE-/-SSAO-/- de 25 semaines présentent une augmentation de la surface des plaques d’athérome par rapport aux ApoE-/-. Ceci est associée à une diminution de l’expression d’α-actine dans le média sous les plaques et de smMHC dans l’aorte abdominale (AA) sans modification ni de l’infiltration des lymphocytes T; ni des monocytes/ macrophages dans la paroi artérielle, ni du profil cytokinique pro-/anti-inflammatoire dans la rate. A 15 semaines, les souris femelles ApoE-/-SSAO-/-, sm-MHC a diminué dans les AA de ces souris par rapport aux ApoE-/- ainsi qu’une réorientation du trafic des cellules immunitaires vers la paroi aortique sans modification significative de la surface des plaques a été détecté. La SSAO jouerait donc un rôle précoce dans le développement de l’athérosclérose via une modification du trafic des cellules immunitaires et du phénotype des CML dans la paroi / The semicarbazide-sensitive amine oxidase (SSAO) catalyzes the oxidative deamination of primary amines into aldehydes, hydrogen peroxide and ammonia. The SSAO was implicated in cellular differentiation, inflammation and transmigration of leukocyte through the lymphatic. The objectives of this work were to study the role of SSAO (i) in chondrocyte differentiation and in the development of osteoarthritis using rat chondrocyte primary cell culture and osteroarthritic samples from patients. (ii) in the development of atherosclerosis using ApoE-/- mice, which develop naturally atherosclerosis, invalidated for the SSAO gene. Concerning the articulation, the SSAO (expression and activity) was detected in the rat and human cartilage. In vitro, SSAO increases during chondrocyte terminal differentiation (hypertrophy) and the inhibition of its activity by LJP1586, decreases the level of differentiation. In human arthritic cartilage, SSAO was higher that in healthy cartilage, in association with an increase in hypertrophic markers. The SSAO plays a role in the terminal differentiation of chondrocytes and might be involved in the development of osteoarthritis. At the vascular level, 25 week-old female ApoE-/-SSAO-/- mice presented a 50% increase in plaque surface associated with an 80% decrease in α-actin expression in the media of aortic sinus and a decrease in sm-MCH in abdominal aortas (AA) compared to ApoE-/- mice. These results were not due neither to a modification of monocytes/ macrophages, Tcell infiltration in the plaque nor in a pro- or anti-inflammatory cytokine change in spleen. In 15 week-old ApoE-/-SSAO-/- mice, even if no modification of plaque surface was found, a decrease in sm-MHC was noticed in the AA from ApoE-/-SSAO-/- compare to ApoE-/- mice. More over, the immune cell trafficking was increased in the aortic wall of ApoE-/-SSAO-/- compared to ApoE-/- mice. Thus, SSAO is involved in the early development of atherosclerosis in changing the immune cell trafficking and the VSMC phenotype