Dans les pathologies ostéo-articulaires, les critères d'évaluation rapportés par les patients (Patient-Reported Outcomes ou PROs) sont désormais les critères de jugement incontournables, réclamés par les autorités sanitaires et les organismes de régulation. La validation de leurs propriétés psychométriques et leur adaptation transculturelle sont donc indispensables pour pouvoir les utiliser dans les essais thérapeutiques internationaux. Ce processus complexe de validation transculturelle permet d'élaborer une version du PRO dans le langage cible qui prenne en considération tous les spécificités socioculturelles et les équivalences linguistiques.Ce travail de thèse a comme problématique la validation transculturelle des PROs spécifiquement développés pour les pathologies du genou et de la hanche. Après avoir explicité les recommandations publiées dans ce domaine puis avoir réalisé une revue de la littérature de la qualité méthodologique des auto-questionnaires disponibles pour ces pathologies articulaires, nous avons entrepris les validations transculturelles du questionnaire KOOS (ou Knee injury and Osteoarthritis Outcome Score), du questionnaire HOOS (ou Hip disability and Osteoarthritis Outcome Score) et de leurs formes réduites (KOOS-PS et HOOS-PS pour Physical function Short form). Ces auto-questionnaires, développés en langue anglaise au cours de la dernière décennie, permettent d'évaluer de manière globale (symptômes, retentissement fonctionnel dans les activités quotidiennes et sportives, qualité de vie) des pathologies du genou ou de la hanche, aussi bien traumatiques que dégénératives. Après traduction et adaptation française selon les recommandations internationales, les versions françaises du KOOS, du HOOS, du KOOS-PS et du HOOS-PS ont ensuite été validées de manière prospective dans des cohortes françaises bi-centriques de patients arthrosiques suivis en milieu rhumatologique et orthopédique. Les résultats de ces travaux, publiés sous la forme de trois articles originaux, démontrent que les propriétés psychométriques des versions françaises de ces questionnaires sont satisfaisantes quelle que soit la sévérité de l'arthrose, en terme de faisabilité, de cohérence interne, de reproductibilité, de validité et de sensibilité au changement (après mise en place de prothèse totale ou viscosupplémentation par acide hyaluronique). Ces PROs capturent des concepts supplémentaires pertinents, comme le retentissement sur les activités sportives ou la qualité de vie, et permettent avec le même outil de mesure le suivi longitudinal de patients, depuis l'atteinte traumatique jusqu'à l'arthrose. Ils améliorent ainsi l'évaluation globale des pathologies du genou et de la hanche. La validation exhaustive, y compris transculturelle, permet à ce jour de considérer les questionnaires KOOS et le HOOS comme des PROS de référence. A ce titre, leur utilisation dans les essais thérapeutiques internationaux doit être encouragée.

L'arthrose est un processus menant à la dégénérescence du cartilage articulaire dont l'un des principaux composants est un protéoglycane (PG) : l'aggrécane. Il est constitué de glycosaminoglycanes (GAGs), essentiellement le sulfate de chondroitine (CS), liés de façon covalente à un squelette peptidique par l'intermédiaire d'une zone de liaison tétrasaccharidique commune aux principaux types de GAGs (CS et sulfate d'héparane (HS)). La biosynthèse des PGs met en jeu l'action séquentielle de O-glycosyltransférases qui additionnent spécifiquement chaque unité saccharidique. Lors de cette biosynthèse, encore mal connue, la zone de liaison subit des modifications (sulfatation et phosphorylation) qui peuvent être importantes pour la polymérisation des PGs en faveur des CS ou des HS.L'objectif de ce travail était de synthétiser, pour la première fois, une collection complète de trisaccharides biotinylés diversement monosulfatés ou non de la zone de liaison des PGs ainsi que des tétrasaccharides biotinylés (zone de liaison et amorces de CS) dans le but de déterminer le rôle des différentes sulfatations possibles dans la biosynthèse des PGs par les O-glycosyltransférases.

L’arthrose est une pathologie fréquente et responsable d’une morbidité majeure. En France, cette pathologie est devenue une priorité de santé publique et jusqu’à récemment il n’existait aucune donnée épidémiologique en population générale. Mon travail a permis d’apporter les premiers chiffres de prévalence en population générale et a constitué une étape préliminaire essentielle à la réalisation d’une étude de prévalence nationale et à la constitution d’une cohorte de cas prévalents d’arthrose symptomatique des membres inférieurs. Ces travaux m’ont amené à m’intéresser à l’apport diagnostique des clichés en Schuss et ainsi mettre en évidence que ces clichés seuls sont aussi contributifs que l’association clichés en extension et clichés en Schuss classiquement réalisés pour le diagnostic de gonarthrose. L'ocytocine est une hormone exprimée dans un grand nombre de cellules dont les ostéoblastes et les adipocytes. Son rôle dans l'ostéoporose a été démontré. A ce jour aucune donnée sur son éventuel rôle dans l’arthrose n’a été publiée. J’ai donc recherché un éventuel rôle direct et/ou indirect de l'ocytocine. Pour cela, nous avons utilisé un modèle cellulaire: ’’Multipotent Adipose-Derived Stem’’ (hMADS) développé dans notre laboratoire de recherche. Nous avons, dans un premier temps, montré les capacités chondrogéniques de ces cellules ainsi que leur intérêt comme potentiel outil de tests pharmacologiques dans l’arthrose. La deuxième étape a consisté à démontrer un rôle de l’ocytocine dans la chondrogenèse. Nous avons montré que l’ocytocine a une action bénéfique sur l’expression des gènes chondrocytaire. De plus, le traitement des cellules par l'ocytocine atténue l'effet négatif de l'IL-1β sur ADAMTS-4 qui est responsable de la dégradation de l'aggrécane. L’ensemble de ces résultats indique que l'ocytocine représente un modulateur positif de la formation des chondrocytes et prometteur comme traitement potentiel pour l'arthrose. / Osteoarthritis is the most frequent cause of rheumatic complaints in Rheumatology. Osteoarthritis is responsible of major morbidity. Increase of life span is accompanied by an increase of aging diseases such as osteoporosis and osteoarthritis. In France, the disease became a public health priority, and until recently, there was no osteoarthritis epidemiologic data in the general population concerning lower limbs. My clinical studies enabled me to bring the first prevalence study in the general population. It was an essential preliminary step for a national prevalence study, and the constitution of a prevalent symptomatic cases cohort of lower limbs osteoarthritis. These observations let me to analyze the diagnostic contribution of Schuss X rays and to show that Schuss X-rays alone do not provide less information’s for the diagnosis of knee osteoarthritis, than the usual association standard extension X rays -Schuss X rays. Oxytocin is a hormone expressed by a large number of cells including osteoblasts and adipocytes. Recently, its role in osteoporosis has been shown. So far, no data about its potential role in osteoarthritis are available. I thus searched for a possible direct and / or indirect role of oxytocin on chondrogenesis. For that, I used a cellular model developed in our research laboratory: the “Multipotent Adipose-Derived Stem’’ (hMADS) cells. A first step, I show that hMADS cells are endowed with a chondrogenic capacity, and they represent a powerful tool for therapeutic test in osteoarthritis. The second step was to analyze the role of oxytocin in chondrogenesis. We shown that oxytocin has a benefic effect especially on the aggrecan (increase), probably via a negative effect on ADAMTS4, and also several other major chondrogenesis genes such as COMP and Sox9. Taken together, these results indicate that oxytocin represents a positive modulator of chondrocyte formation and holds promise as a potential therapy for osteoarthritis.

L’arthrose est une maladie ostéoarticulaire fréquente et sans traitement curatif. Elle se manifeste par une dégénérescence du cartilage, associée à une altération des autres tissus de l’articulation. Dans ce contexte, les cellules souches mésenchymateuses (CSM) démontrent un effet thérapeutique. Afin d’identifier de nouveaux médiateurs de l’homéostasie articulaire, nous avons analysé le secrétome des CSM en nous focalisant sur les membres de la famille du facteur de croissance transformant β (TGFβ), une voie centrale dérégulée dans l’arthrose.Cette approche nous a permis d’identifier la protéine induite par le TGFβ (TGFβI ou βIGH3), pour laquelle nous avons évalué le rôle dans la différenciation des CSM et comparé l’expression dans les tissus articulaires de patients arthrosiques et de sujets sains.Nous montrons l’importance du TGFβI dans la régulation des processus de différenciation osseuse et chondrogénique des CSM. Nous mettons également en évidence une dérégulation au niveau transcriptionnel et protéique de ce facteur dans le cartilage, l’os sous-chondral ainsi que les CSM de patients arthrosiques. En testant son implication dans l’effet thérapeutique des CSM sur des modèles d’arthrose in vitro et in vivo, nous montrons que la diminution de son expression dans les CSM annule leur effet thérapeutique dans les modèles d’arthrose. Cet effet chondroprotecteur du TGFβI est associé à une inhibition du remodelage osseux et de la calcification des tissus mous articulaires.L’ensemble de nos résultats démontrent l’importance de la régulation de la voie TGFβ, et plus particulièrement du TGFβI, dans l’homéostasie articulaire. En parallèle, nos travaux illustrent le rôle de ce facteur dans l’effet thérapeutique des CSM, et suggèrent que l’altération de son expression dans les CSM de patients arthrosiques soit à l’origine d’une diminution de leur potentiel régénératif. / Osteoarthritis (OA) is the most common form of joint diseases without curative treatments. The disease is mainly characterized by the degradation of articular cartilage which is associated with other pathological changes in joint tissues. In this context, mesenchymal stem cells (MSC) have demonstrated a therapeutic effect. In order to identify new mediators involved in articular homeostasis, we analyzed MSC secretome, focusing on the transforming growth factor β (TGFβ) members, a central pathway dysregulated in OA.This approach allows us to identify the TGFβ induced protein (TGFβI or βIGH3). In the present study, we evaluated its role in the differentiation of MSC and compared its expression in articular tissues from OA patients and healthy donors.We highlight the importance of TGFβI in the regulation of differentiation of MSC towards bone and cartilage. We also demonstrate its dysregulation at both transcript and protein level in cartilage, bone and MSC from OA patients. We then evaluated its role in the therapeutic effect of MSC in vitro and in vivo and demonstrated that its decreased expression in MSC is associated with a loss of their therapeutic effect in OA models. The chondroprotective effect of TGFβI is associated with an inhibition of bone remodeling and calcification of soft articular tissues.Together, our results highlight the importance of the TGFβ pathway, and specially of TGFβI regulation, in joint homeostasis. Moreover, our work demonstrates its role in the therapeutic effect of MSC, suggesting that its dysregulation in OA MSC could lead to a decreased regenerative potential.

Nox4 est une source de ROS constitutive et ubiquitaire intervenant dans la signalisation intracellulaire. Une dérégulation de son activité a été associée à l'athérosclérose, la fibrose pulmonaire, le diabète et nous suspectons son rôle dans l'arthrose. L'arthrose est la résultante de phénomènes mécaniques et biologiques conduisant à la dégradation du cartilage et de l'os sous-chondral. Le chondrocyte, synthétisant et libérant des métalloprotéases matricielles (MMP), principales effectrices de la protéolyse matricielle, en est l'acteur principal. Dans la lignée de chondrocytes C-20/A4, l'IL-1β induit la synthèse de la collagénase MMP-1 de manière dépendante de l'activité de Nox4.Ces données suggèrent que Nox4 pourrait jouer un rôle dans la physiopathologie de l'arthrose. De manière à éclaircir le rôle de Nox4 dans le chondrocyte mais également pour proposer des pistes permettant de moduler cette activité, ce projet à été découpé en trois parties étroitement liées.1- Une meilleure connaissance de la topologie de Nox4 permettrait de mieux comprendre son fonctionnement pour mieux appréhender le développement d'inhibiteurs de son activité. L'étude de la topologie membranaire de Nox4 a été abordée en préparant des protéines de fusion avec l'ubiquitine marquée à la GFP. Cette méthode (ToDUFA) a permis pour la première fois de proposer expérimentalement une topologie de Nox4 avec 6 passages transmembranaires. 2- L'indentification de nouveaux partenaires modulateurs de l'activité de Nox4 pourrait être une première étape vers le traitement de l'arthrose. L'hème oxygénase (HO-1) est l'enzyme limitante dans le catabolisme de l'hème, molécule indispensable à l'activité catalytique des Nox. Les résultats montrent que HO-1 est capable de réprimer l'activité de Nox4 et suggèrent un mécanisme dépendant de la libération de monoxyde de carbone (CO) produit au cours de l'activité de HO-1. Ces résultats soulèvent également le rôle de l'hème dans le processus de maturation du complexe Nox4/p22phox. 3- Le rôle de Nox4 dans la physiopathologie de l'arthrose doit être validé sur des cultures primaires. Les résultats montrent que Nox4 est la seule Nox exprimée dans les chondrocytes primaires humains. Nox4, stabilisée par une augmentation protéique de p22phox après stimulation des chondrocytes par IL-1β, conduirait à la synthèse des MMP-1, MMP-13 et de l'ADAMTS4. Ces travaux montrent enfin que l'activité de Nox4 est impliquée dans le rétrocontrôle positif conduisant à la néosynthèse de l'IL-1β et à la persistance du catabolisme.En conclusion, les résultats suggèrent un rôle significatif de Nox4/p22phox dans la dégénérescence cartilagineuse. Nous décrivons un nouveau mécanisme de régulation de l'activité de Nox4 par HO-1 dans la lignée C-20/A4 et dans les chondrocytes primaires humains, préfigurant d'un rôle thérapeutique potentiel de HO-1. Enfin, le premier modèle topologique de Nox4 basé sur nos données expérimentales pourrait constituer une base pour le développement d'inhibiteurs ou de peptides compétiteurs. / Nox4 is a ubiquitous and constitutive source of ROS involved in intracellular signaling. However, a dysregulation of its activity has been shown to be involved in atherosclerosis, pulmonary fibrosis, diabetes, and we suspect its role in osteoarthritis (OA). OA is the consequence of mechanical and biological processes leading to the breakdown of cartilage and subchondral bone. Chondrocytes by synthesizing and releasing matrix metalloproteinases (MMP) mediates proteolysis of the extracellular matrix and is therefore the main actor of OA. In the C-20/A4 chondrocytes cell line, IL-1β leads to the synthesis of the MMP-1 collagenase in a Nox4 dependent manner suggesting that Nox4 might be a good therapeutic candidate for osteoarthristis treatment.In order to shed light on the role of Nox4 in the chondrocyte and to propose new strategies to modulate its activity, 3 mains objectives have been developed in this work.1 - A better understanding of the topology of Nox4 could allow a better comprehension of its function and the development of inhibitors: Membrane topology of Nox4 was assessed by preparing fusion proteins with ubiquitin fused with GFP's tag. This method (ToDUFA) allowed us for the first time to determine experimentally a topology organization for Nox4 with 6 transmembrane domains.2 - The identification of novel partners of modulation of Nox4 activity might be a first step toward the treatment of osteoarthritis: Heme oxygenase (HO-1) is the rate limiting enzyme in heme catabolism, an essential molecule for the catalytic activity of Nox. Our results showed that HO-1 was able to inhibit Nox4 activity and suggest a mechanism involving the release of carbon monoxide (CO) that was produced during the activity of HO-1. These findings also highlight the role of heme in the maturation process of Nox4/p22phox hetero-complex.3 - The role of Nox4 in the pathophysiology of osteoarthritis must be validated in primary cultures: Our results showed that Nox4 is the sole Nox isoform expressed in human primary chondrocytes. Nox4 activity, stabilized by the induced expression of p22phox in the IL-1β-stimulated chondrocytes, might mediate the synthesis of MMP- 1, MMP-13 and ADAMTS4. Finally, our data demonstrated that the activity of Nox4 is involved in the positive feedback leading to the neo-synthesis of IL-1β, mechanism that sustains the catabolism.In conclusion, our data suggest a significant role of Nox4/p22phox in cartilage degeneration. We describe a new mechanism by which HO-1 regulates the activity of Nox4 in C-20/A4 cell line and in primary human chondrocytes, predicting a potential therapeutic effect of HO-1. Finally, the first topological model of Nox4 based on our experimental data might provide a basis for the development of inhibitors or competitor peptides.

L’arthrose du genou est une maladie rhumatismale dégénérative touchant tous les tissus de l’articulation. Elle est classée parmi les dix affections les plus invalidantes dans le monde et l’absence de traitement curatif efficace en fait un véritable problème de santé publique. Dans le cas d’arthrose post-traumatique, les lésions méniscales sont fréquentes et entravent leurs fonctions de répartition des efforts, d’absorption des chocs et de stabilité. Les objectifs de ce travail de thèse sont (1) d’analyser les changements de propriétés mécaniques des ménisques à un stade précoce de développement de l’arthrose et de les corréler avec les modifications morphologiques, biochimiques et microstructurales, et (2) d’évaluer l’effet d’une thérapie de viscosupplémentation commerciale. Le modèle d’arthrose post-traumatique choisi dans cette étude est la rupture du ligament croisé antérieur chez le lapin. Les ménisques de lapins sains, arthrosiques non traités et arthrosiques traités ont été caractérisés six semaines après l’opération par un score macroscopique, puis par indentation – relaxation grâce au développement d’une méthode de test adaptée, ainsi que par microspectroscopie Raman, microscopie confocale biphotonique et histologie. Cette étude a révélé la formation de lésions à la surface des ménisques arthrosiques et une diminution de leurs propriétés viscoélastiques, s’expliquant par une désorganisation de leurs fibres de collagène et une diminution de leur quantité de glycosaminoglycanes. Bien que le traitement améliore significativement l’état de surface des ménisques et joue un rôle dans la régulation des glycosaminoglycanes, il a peu d’effet sur l’organisation des fibres de collagène et sur les propriétés viscoélastiques. Ce travail de thèse apporte une meilleure compréhension des modifications affectant le ménisque, dans l’optique de développer de nouveaux traitements. / Knee osteoarthritis (OA) is a rheumatic degenerative disease affecting all tissues of the joint. It is classified among the ten most disabling affections in the world and the lack of efficient curative treatment makes it a real public health issue. In case of post-traumatic OA, meniscal tears are frequent and interfere with their functions of load distribution, shock absorption and stability. The aims of this work are (1) to analyze the changes of mechanical properties of the menisci at an early stage of OA development and to correlate them with morphological, biochemical and microstructural modifications, and (2) to assess the effect of a commercial viscosupplementation therapy. For this study, an anterior cruciate ligament transection model of post-traumatic OA was used in rabbits. Menisci from healthy, non-treated OA and treated OA rabbits were characterized six weeks after surgery through macroscopic grading, indentation-relaxation with the development of an adapted test method, Raman microspectroscopy, biphotonic confocal microscopy and histology. This study revealed the formation of tears at the surface of OA menisci and a decrease in their viscoelastic properties, which was explained by a disorganization of their collagen fibers and a decrease in their glycosaminoglycan content. Although the treatment significantly improves the surface integrity of the menisci and plays a role in the glycosaminoglycan regulation, it has little effect on the organization of their collagen fibers and on their viscoelastic properties. This work brings a better understanding of the disease processes affecting the meniscus, for the purposes of developing new treatments.

La dédifférentiation du chondrocyte peut être provoquée par le stress mécanique ou cytokinique ainsi que la diffusion des facteurs de croissance dans le cartilage. C’est un élément-clé de la dégradation irréversible qui accompagne l’arthrose (ostéoarthritis, OA). Notre but est de rechercher des mécanismes moléculaires susceptibles d’être des cibles thérapeutiques originales contre cette affection. Or, il a été montré récemment que la voie des récepteurs Notch est fortement exprimée dans l’OA humaine. Objectifs: Etudier le rôle de la voie de signalisation Notch /Hes1/Hey1 dans les effets de l’Interleukine-1 β (IL-1β) et du FGF2 sur la dédifférenciation in-vitro des chondrocytes. Méthodes: Des chondrocytes de cartilage articulaire humain ou murin sont mis en culture primaire, puis traités par IL-1β ou FGF2. L’expression de Notch1-R/Hes1/Hey1 est étudiée par immunocytochimie, immunoblot et q-RT-PCR. L’implication de Hes1 dans les effets de l'IL-1β et du FGF2 a été étudiée au moyen d’un siRNA spécifique anti Hes1. Résultats: En normoxie, le marquage de Notch-R1 est localisé à la membrane et dans le cytoplasme des chondrocytes, sans effet des effecteurs. Notch1-R est en revanche nucléaire en hypoxie. L’hypothèse d’un contrôle de la localisation de Notch1-R par la pO2 est confortée par l’inhibition de l’expression de la Préséniline (γ-secrétase) en hypoxie. L’étude des effets des effecteurs sur Hes1 et Hey1 a été réalisée dans les conditions classiques de culture en normoxie. Hes1 est cytoplasmique mais passe dans le noyau sous l’effet de l’IL1β ou de FGF2, suggérant la possibilité d’effets transcriptionnels. Les ARNm de Hes1 sont augmentés d’un facteur de 2,5 avec l’IL-1β et de 7-8 avec le FGF2. Hey1 est insensible à l’IL-1β mais augmente de 4-5 fois sous FGF2. Ces effets sont transcriptionnels directement pour Hes1 (DRB-) et indirectement pour Hey1 (DRB+). Ils passent par la voie NF-κB pour les deux facteurs mais en plus par p38 MAP pour le FGF2. L’induction de Hes1 est insensible au DAPT, inhibiteur de la γ-sécrétase, donc indépendant d’une activation de novo du Notch-R1. L’utilisation d’un siRNA spécifique contre Hes1 montre que l’induction de Hey1 par FGF2 dépend de Hes1 et permet de vérifier l’influence de Hes1 dans la modulation des marqueurs phénotypiques. Hes1 est impliqué dans l’induction par IL-1β de l’expression de MMP13 et ADMTS-5. Hes1 est aussi le médiateur de l’induction par le FGF2 des messagers de la MMP13 (en partie) et de l’isomère Col2A. La protéine Col2A immature est normalement absente du cartilage de souris post-natale, où Col2B est l’isoforme essentielle du collagène de type 2. A l’inverse, le cartilage de souris vieillissante réexprime Col2A, comme cela a été montré dans le cartilage arthrosique chez l’homme. Conclusion: Hes1 est le médiateur des effets d’IL-1β et du FGF2 sur la dédifférentiation in-vitro des chondrocytes (Col2A, MMP13). La voie de Hes1 apparaît donc comme une cible valide pour de nouvelles thérapeutiques contre la dégradation chondrocytaire et donc les maladies dégénératives du cartilage. / Chondrocyte dedifferentiation is a key element of irreversible cartilage degradation induced by mechanical or cytokinic stress, or growth factors, as in degenerative osteoarthritis (OA). Our goal is to search for new therapeutical targets within this process, and Notch signaling has been reported to be strongly expressed during human OA. Objectives: To investigate the involvement of the Notch1/Hes1/Hey1 pathway as mediators of interleukin 1 β (IL-1β) and FGF2 in chondrocytes in vitro. Methods: Mouse or human articular chondrocytes were established in primary culture then challenged with IL-1β or FGF2. Notch-R1, Hes1/Hey1 and chondrogenic target genes expression was monitored by immunocytochemistry, q-rt-PCR, and immunoblotting. Hes1 involvement in IL-1β/FGF2 induced gene expression was investigated with a specific siRNA against Hes1. Results: In normoxia, Notch1-R labeling remained nuclear and stable in intensity in chondrocytes, irrespective of treatment. This suggested steady-state activation of this pathway. In contrast, Notch1-R labeling was located almost exclusively at the membrane or cytoplasm of chondrocytes in hypoxia, irrespective of treatment. Notch-R1 activation may thus be, at least in part, regulated by pO2 as supported by the inhibition of γ-secretase (Presenilin1) expression in hypoxia versus normoxia. In normoxia, addition of IL1β or FGF2 to the cells induced Hes1 translocation to the nucleus, suggesting the possibility of transcriptional effects. This was associated with a transient increase of Hes1 mRNA cyclic expression with mechanistic differences between the two effectors. Hes1 mRNA was increased 2.5-fold by IL-1β and 7-8-fold by FGF2. IL-1β elicited a loss of cyclicity in Hes1 expression while FGF2 conserved the cycles, akin to the effect of serum. These effects were transcriptional and occurred through NF-κB for both effectors but only through the p38 pathway for FGF2. Hey1 expression was not modified by IL-1β, while a 4-5 fold transient increase was observed with FGF2, always posterior to the Hes1 peak. Hey induction by FGF2 was transcriptional and depended on Hes1 expression (DRB). Hes1/ Hey inductions by IL-1β or FGF2 were insensitive to DAPT, a γ-secretase inhibitor, confirming the independence from novel activation of Notch-R. Hes1 expression was silenced by a specific siRNA, showing that the FGF2-induced Hey1 expression is under Hes1 control and ascertaining the role of Hes1 in chondrocyte phenotype modulations. Hes1 mediated IL-1β induction of MMP-13 and ADAMTS-5. Hes1 also mediated FGF2 up-regulation of MMP13 (partly) and Col2A isomer expression. Col2A is normally absent in post-natal mice cartilage, Col2B being the essential isoform of Type 2 collagen. Conversely, aging mice cartilage re-expresses Col2A abundantly as shown for human OA cartilage. Conclusion: Hes1 mediates IL-1β and FGF2 modulations of dedifferentiating chondrocyte phenotype (MMP13, Col2A). Thus the Hes1 pathway appears a valid target for therapeutical research on chondrocytes dedifferentiation, hence degradative cartilage diseases.

Le cartilage articulaire est un tissu conjonctif spécialisé recouvrant les surfaces osseuses et assurant, avec d’autres tissus comme la membrane synoviale, le bon fonctionnement des articulations. Le cartilage est composé d'un type cellulaire, le chondrocyte, qui assure la synthèse et la dégradation d’une matrice extracellulaire essentielle à ses propriétés mécaniques. Les articulations, en conditions physiologique et pathologique, sont soumises à deux stress principaux agissant sur l’homéostasie du cartilage : le stress mécanique et le stress inflammatoire. Le premier objectif de ma thèse était d’étudier l’effet d’un stress mécanique de type étirement sur le profil d’expression des gènes dans des chondrocytes articulaires de lapin en culture primaire en utilisant une approche à grande échelle (micro‐arrays). Nous avons identifié 36 et 57 transcrits répertoriés dans le génome de lapin et dont les taux d’expression sont respectivement augmentés et diminués par un étirement équibiaxial cyclique (5%, 1Hz, 20h). Certains gènes sont connus pour leur implication dans l’inflammation, la mort cellulaire et la dégradation matricielle. Parmi eux, celui de la relaxine (RLN) était le gène le plus induit par l’étirement. La relaxine, hormone peptidique de la superfamille de l’insuline/relaxine, est connue pour son implication dans la reproduction et la grossesse. En revanche son rôle dans le cartilage articulaire restait à étudier. Le deuxième objectif de ma thèse était, par conséquent, de caractériser la fonction de la RLN dans le cartilage. Mes résultats de RT‐PCR quantitative montrent pour la première fois que la quantité des transcrits de la RLN est augmentée par le stress mécanique et le stress inflammatoire (traitement par l’interleukine‐1) dans des chondrocytes articulaires de lapin. De plus, la quantité des transcrits de la RLN est diminuée au cours de la dédifférenciation des chondrocytes. Dans un modèle de gonarthrose induite chez la souris par déstabilisation du ménisque médial, j’ai montré par immunofluorescence que la RLN est principalement présente au niveau des couches superficielles du cartilage de genou et que son expression diminue dans le cartilage arthrosique par rapport au cartilage normal. De plus, le traitement par de la RLN de chondrocytes de lapin augmente l’activité de la métalloprotéinase MMP‐9 impliquées dans la dégradation du cartilage. En conclusion, cette étude montre que la RLN est sensible aux stress mécanique et inflammatoire et la dédifférenciation des chondrocytes. Elle suggère que cette hormone pourrait moduler l’homéostasie du cartilage. La RLN est donc une cible potentielle d’intérêt dans les pathologies ostéoarticulaires. / The articular cartilage is a specialized conjunctive tissue covering bone surfaces. It ensures, together with other tissues like the synovial membrane, the right functioning of the articulations. The cartilage is formed of one cellular type, the chondrocyte, which is responsible for the synthesis and degradation of the extracellular matrix required for its mechanical properties. The joints, under physiological and pathological conditions, are subjected to two main types of stress that affect cartilage homeostasis: mechanical stress and inflammatory stress. The first objective of my PhD thesisis is to study the effect of stretching, one type of mechanical stress, on the gene expression profile in rabbit articular chondrocytes in culture using a large scale approach (micro‐arrays). 36 and 57 transcripts of the rabbit genome which are up‐regulated and down‐regulated by equibiaxial cyclic tensile stretching (5%, 1Hz, 20h) respectively were identified. Some of these genes are known for their implication in inflammation, cell death and matrix degradation. Among them, the relaxin (RLN) gene is the most induced by stretching. RLN is a peptide hormone that belongs to the insulin/relaxin superfamily. It is known for its implication in reproduction and pregnancy. However, the role of RLN in cartilage is still to be studied. The second objective of my PhD thesis is, consequently, to characterize the function of RLN in cartilage. My qRT‐PCR results show, for the first time, that the RLN transcript levels increase upon mechanical and inflammatory (interleukin ‐1treatment) stress in rabbit articular chondrocytes. Moreover, RLN transcript levels decrease during cell dedifferentiation. In a model of gonarthrosis induced in mice by destabilization of the medial meniscus, I showed by immunofluorescence that RLN is mainly present in the superficial layers of the knee cartilage and that its expression decreases in osteoarthritic cartilage as compared to normal cartilage. Furthermore, treatment of rabbit chondrocytes with RLN increases the activity of the metalloproteinase MMP‐9 involved in cartilage degradation. In conclusion, this study shows that RLN is sensitive to mechanical and inflammatory stress and to chondrocyte dedifferentiation. It also suggests that this hormone could modulate cartilage homeostasis. Therefore, RLN is a potential target in osteoarticular pathologies.

L’arthrose affecte une dizaine de millions de français. La présence de microcristaux calciques notamment ceux de pyrophosphates de calcium (CPP) dihydratés (Ca2P2O72H2O ; mono- et/ou triclinique : respectivement m- et/ou t-CPPD) au sein de l’articulation est l’un des facteurs aggravant identifié de cette maladie. Cependant, les conditions et mécanismes de formation de ces cristaux ainsi que l’ordre d’apparition de ces deux phases de CPPD restent méconnus ou n’ont pas encore été entièrement décrits et les traitements existants sont seulement symptomatiques. Dans ce mémoire nous nous sommes intéressés à l’étude de l’effet d’additifs ioniques sur la formation et les cinétiques de croissance cristalline de cristaux de CPP qui constitue une étape clé pour la mise au point à moyen ou long terme d’une stratégie thérapeutique visant à empêcher la formation, transformer ou dissoudre ces cristaux. La synthèse in vitro par précipitation des phases pures de CPP hydratés d’intérêt biologique (m-CPPD, t-CPPD et CPP monoclinique tétrahydraté ) a été réalisée afin d’identifier les paramètres opératoires conduisant à leur apparition et d’analyser l’effet d’additifs ioniques (Mg2+, Cu2+, Zn2+, Fe3+ ou S2O32-) lors de leur précipitation en conditions maîtrisées. La méthode de synthèse établie par Gras et al. a été transposée en réacteur agité. Il s’agit d’une précipitation avec ajout simultané de deux solutions mères respectivement de nitrate de calcium et de pyrophosphate de potassium dans une solution tampon d’acétate d’ammonium. Les composés obtenus ont été caractérisés par diffraction des rayons X, résonance magnétique nucléaire du solide, spectroscopies FTIR et RAMAN, microscopie électronique à balayage (MEB) et spectrométrie à plasma à couplage inductif. Grâce à une analyse semi-quantitative par diffraction des RX, nous avons montré que la présence d’additifs ioniques (Mg2+, Zn2+, Fe3+ ou Cu2+) lors de la précipitation change significativement les proportions des phases de CPP du produit final. Ainsi nous montrons que les ions Mg2+, Cu2+ ou Zn2+ orientent la formation de cristaux de m-CPPD lors de la précipitation en conditions maîtrisées de t-CPPD, et selon les conditions l’ion Fe3+ peut totalement inhiber la cristallisation de t-CPPD. Des analyses fines par RMN du solide 31P ont permis de déterminer les modes d’action de ces additifs. Les ions Cu2+ et Mg2+ ont notamment agi par substitution au Ca2+ dans la maille de CPP. Nous avons aussi mis en œuvre la méthode de croissance cristalline à composition constante pour étudier la germination et la croissance cristalline à température, pH, sursaturation et force ionique constants de t-CPPD sur une semence de t-CPPD en présence ou non d’additif ionique. La semence est introduite dans une solution sursaturée métastable de CPP à pH 6,2 incluant l’additif ionique et placée dans un réacteur agité et thermostaté à 37°C. La sursaturation du milieu est calculée à l’aide du logiciel Phreeqc et les temps de germination et vitesses initiales de croissance cristalline ont été déterminés. Les cristaux ont été analysés par spectroscopie FTIR et MEB. Nous avons mis en évidence l’influence d’additifs ioniques (Mg2+, Zn2+ ou Cu2+) sur les paramètres cinétiques de germination et croissance cristalline de t-CPPD. Ainsi les ions Cu2+ et Mg2+ ont respectivement inhibé partiellement et totalement la croissance cristalline de t-CPPD. Les résultats obtenus dans cette étude pourraient aider à expliquer la formation in vivo de cristaux de m-CPPD au sein des articulations de patients arthritiques alors que cette phase pure est difficile à obtenir in vitro par précipitation sans ions autres que Ca2+ et P2O74-. Ces résultats cinétiques pourront donner une indication sur l’évolution du ratio des deux phases (m-CPPD et tCPPD) formées in vivo dans les articulations arthrosiques et des pistes de traitement pour éviter la formation de ces cristaux inflammatoires ou orienter la formation de phases non inflammatoires. / Osteoarthritis (OA) affects about ten million people in France. The presence of microcrystals including those of calcium pyrophosphate (CPP) dihydrates (Ca2P2O7•2H2O; mono- and/or triclinic: m-CPPD and/or t-CPPD respectively) in the joints has been identified as an aggravating factor of OA. However the conditions of formation of both CPPD phases and their order of appearance remain unknown or have not been totally described and the existing treatments are only symptomatic. In the present work we were interested in the effect of ionic additives on the formation and the kinetics of the crystallization of CPP which is a key step in the medium to long term development of a therapeutic strategy to prevent the formation of these crystals, their transformation or their dissolution. At first the in vitro synthesis by precipitation of hydrated CPP pure phases of biological interest (mCPPD, t-CPPD and monoclinic CPP tetrahydrated ) have been realized to identify the operating parameters (concentration, pH, temperature) leading to their formation and to analyze the effect of ionic additives (Mg2+, Cu2+, Zn2+, Fe3+ or S2O32-) on their precipitation under controlled conditions. To achieve this objective, the synthesis method developed by Gras et al. was transposed in stirred reactor. It consists in a precipitation by simultaneous addition of two reagent solutions of calcium nitrate and potassium pyrophosphate in an ammonium acetate buffer solution. Powders synthesized were analyzed by X-ray diffraction, solid state nuclear magnetic resonance, FTIR and RAMAN spectroscopies, scanning electron microscopy and inductively coupled plasma atomic emission spectroscopy. Thanks to a semiquantitative analysis by X-ray diffraction, we showed that the presence of ionic additives (Mg2+, Zn2+, Fe3+ or Cu2+) during the precipitation significantly modified the proportions of CPP phases constituting the final product. We showed that Mg2+, Cu2+ or Zn2+ promote the formation of m-CPPD crystals during the precipitation under controlled conditions for t-CPPD phase synthesis and depending on the conditions Fe3+ ion can completely inhibit t-CPPD phase crystallization. 31P solid state NMR fine analyzes have allowed determining the mode of action of these ionic additives. Thus, Cu2+ or Mg2+ ions have substituted for Ca2+ in the CPP lattice. Additionally, we have implemented the method of constant composition crystal growth to study the nucleation and crystal growth at constant temperature, pH, supersaturation and ionic strength of tCPPD on seeds of t-CPPD crystals in the presence or not of ionic additive. The seed was introduced into a supersaturated metastable solution of calcium pyrophosphate at pH 6.2 including the ionic additive and placed in a stirred reactor maintained at 37°C. Supersaturation of the medium was calculated using Phreeqc software and nucleation time and the initial rate of crystal growth were determined. The resulting crystals were analyzed by FTIR spectroscopy and scanning electron microscopy. We were able to highlight the influence of ionic additives (Mg2+, Zn2+ or Cu2+) on the kinetic parameters of nucleation and crystal growth of t-CPPD. Thereby, Cu2+ and Mg2+ ions have respectively inhibited partially and totally the growth of the tCPPD crystals. These results may help to explain why m-CPPD phase is identified in vivo in the joint of arthritic patients while this pure phase is difficult to obtain by in vitro precipitation (very narrow temperature-pH domain in a medium free of any ionic additives). These results could also provide indications on the order of appearance and potential evolutions of m-CPPD and tCPPD phases formed in vivo in osteoarthritic joints and provide some clues to avoid the formation of CPPD crystals with inflammatory potential or orient the formation of noninflammatory CPP phases

L’arthrose, maladie articulaire la plus fréquente, se décline en plusieurs phénotypes selon les facteurs de risque : vieillissement, traumatisme et obésité. Dans l’arthrose liée à l’obésité il existe une origine mécanique mais aussi systémique faisant intervenir les adipokines. De plus, chez les sujets obèses, la présence d’un syndrome métabolique, et singulièrement un diabète de type 2 augmente fortement le risque d’arthrose. L’objectif de ce travail a été d’étudier les rôles d’une adipokine, la visfatine/Nampt (nicotinamide phosphoribosyltransférase), et de l’hyperglucidie dans l’arthrose. Ainsi, la visfatine est produite et libérée sous forme dimérique par l’ensemble des tissus articulaires, et son activité enzymatique Nampt est présente dans le tissu synovial. Elle induit un profil pro-inflammatoire des chondrocytes et des ostéoblastes murins caractérisé par la production de cytokines (IL-6, IL -8, MCP-1) qui implique en partie l’activité Nampt, démontré par utilisation de l’inhibiteur pharmacologique APO866. Sur chondrocytes murins, l’hyperglucidie potentialise l’effet de l’IL-1β sur l’activation pro-inflammatoire (IL-6, PGE2), sans stress osmotique. Cette potentialisation pro-inflammatoire passe par l’activation de la voie alternative des polyols, ainsi que par un stress oxydant, démontré par utilisation de l’inhibiteur de l’aldose réductase (epalrestat) et de deux antioxydants (Mitotempo et L-NAME). Chez l’Homme, le cartilage issu de patients arthrosiques diabétiques est plus sensible à l’IL-1β (libération d’IL-6 et de PGE2) et exprime plus l’AGE carboxyméthyllysine, que celui issu de patients non diabétiques de même âge et poids. / Osteoarthritis,the most frequent joint disease, can be declined in different phenotypes, depending on its risk factors: aging, trauma and obesity. In obesity-linked osteoarthritis, there is a mechanical stress but also a systemic stress involving adipokines. Moreover, in obese patients, a metabolic syndrome, and particularly a type 2 diabetes, increases the risk of developing osteoarthritis. The aims of the thesis were to study the roles of the adipokine visfatin/Nampt (nicotinamide phosphoribosyltransferase) et high glucose in osteoarthritis. Then, we demonstrate that visfatin is produced and released in an enzymatic dimeric form by all the articular tissues and that its enzymatic activity Nampt is present in synovium. Visfatin/Nampt induces a pro-inflammatory phenotype of murine chondrocytes and osteoblasts characterized by the production of cytokines (IL-6, IL-8, MCP-1), involving in part the enzymatic activity Nampt, demonstrated by using the pharmacological inhibitor APO866. On murine chondrocytes, high glucose potentiates the effect of IL-1β on pro-inflammatory activation (IL-6, PGE2), without inducing an osmotic stress. This potentiation involves the alternative polyol pathway and oxidative stress, demonstrated by using an inhibitor of aldose reductase (epalrestat) and two antioxidants (Mitotempo and L-NAME). In human, the cartilage from osteoarthritic diabetic patients is more sensitive to IL-1β (release of IL-6 and PGE2) and expresses more the AGE carboxymethyllysine than the one from non diabetic patients, of same age and weight.