Made available in DSpace on 2014-08-20T13:32:57Z (GMT). No. of bitstreams: 1 dissertacao_andre_grassmann.pdf: 1497268 bytes, checksum: 73f55a329ef2c9be70227b63b45785a2 (MD5) Previous issue date: 2011-02-28 / Leptospirosis is an infectious disease that affects humans, wild and domestic animals worldwide. Pathogenic spirochetes from the Leptospira genus are the causative agents of this zoonosis. The several Leptospira species have noted antigenic diversity, even within the same species. This is the main reason current bacterin vaccines have limitations, such as adverse effects and short term immunity, restricting their use in human populations. The need for effective leptospirosis vaccines promoted studies on characterization of new vaccine candidates. The 32 kDa outer membrane lipoprotein, LipL32, is the most abundant protein in the whole leptospira proteome, it is conserved in all pathogenic serovars and absent in saprophytes. This protein is immunogenic and able to bind to mammalian extracellular matrix. However, LipL32 subunit vaccines did not protect animals against challenge. In an attempt to solve this, we use LipL32 fused and coadministered with B subunit of the Escherichia coli heat-labile enterotoxin (LTB) to enhance the immune response. LTB is a non-toxic molecule with immunoestimulatory and immunomodulatory properties. The recombinant proteins rLTB, rLipL32 and rLTB::LipL32 were expressed in E. coli, purified and characterized. Female hamsters were distributed in groups as follows: rLTB; rLTB+rLipL32; rLTB::LipL32, homologous bacterin; PBS. The serum from each animal was collected for humoral immune response determination by ELISA. The animals were challenged with 5×LD50 dose of Leptospira interrogans strain Fiocruz L1-130. Both treatments induced high titers of anti-rLipL32 antibodies. The rLTB+rLipL32 and rLTB::LipL32 treatments afforded significant protective response upon challenge, when compared to control groups (p<0.05). No prior study with leptospirosis had used LTB as the adjuvant, or fused antigens in an attempt to control this disease. Furthermore, this is the first report of a protective subunit vaccine using rLipL32 as the antigen, and an important contribution towards the development of improved leptospirosis vaccines. / A leptospirose é uma doença infecciosa que afeta humanos e animais silvestres e domésticos em todo mundo. As espiroquetas patogênicas do gênero Leptospira são os agentes causadores desta zoonose. As diversas espécies de leptospiras possuem notada diversidade antigênica, inclusive em uma mesma espécie. Esta característica resulta em limitação das atuais vacinas bacterinas que não induzem proteção cruzada entre os diferentes sorovares. Além disso, estas vacinas geram efeitos adversos e imunidade de curta duração, restringindo seu uso em populações humanas. A necessidade de novas vacinas eficazes contra a leptospirose estimulou estudos para caracterizar novos antígenos vacinais. A lipoproteína de membrana externa de 32 kDa, LipL32 é a proteína mais abundante no proteoma total da leptospira, conservada entre todos os sorovares patogênicos e ausente nas leptospiras saprófitas. Esta proteína é imunogênica e possui habilidade de ligar-se à matriz extracelular de mamíferos. Porém, animais inoculados com vacinas de subunidade utilizando LipL32 não sobrevivem ao desafio. Em função disso, utilizamos LipL32 fusionada e co-administrada com a subunidade B da enterotoxina termolábil de Escherichia coli (LTB) para melhorar a resposta imune. LTB é uma molécula atóxica com reconhecida atividade imunoestimuladora e imunomoduladora. As proteínas recombinantes rLTB, rLipL32 e rLTB::LipL32 foram produzidas em E. coli, purificadas e caracterizadas. Hamsters fêmeas foram distribuídas em grupos e inoculadas com duas doses, da seguinte forma: rLTB; rLTB+rLipL32; rLTB::LipL32, bacterina homóloga e PBS. Soro foi coletado individualmente para determinação da resposta imune humoral por ELISA. Os animais foram desafiados com uma dose de 5×DL50 de Leptospira interrogans cepa Fiocruz L1-130. Os tratamentos induziram altos títulos de anticorpos anti-rLipL32. Os tratamentos rLTB+rLipL32 e rLTB::LipL32 induziram resposta protetora significativa frente ao desafio quando comparados com os grupos controle (p<0,05). Nenhum estudo anterior usou LTB como adjuvante para uma vacina contra leptospirose, tampouco antígenos fusionados com o intuito de controlar esta doença. Além disso, este é o primeiro relato de indução de imunidade protetora utilizando rLipL32 como vacina de subunidade, uma importante contribuição para o desenvolvimento de vacinas mais eficazes contra leptospirose.

Studies on vertical stratification of small mammals in the Cerrado biome are scarce and, therefore, this study has the aim to check the community composition of small mammals in relation to the vertical stratum utilization in gallery forest and cerradão of south-western Brazil. The captures were carried out during the months of August/September, November/December 2006 and February/March, May/June 2007. The traps were set in three transaction lines with 10 capture stations each one. Each station had a trap on the ground, other in the understory (2.0 to 3.0 m in height) and another in the canopy (8 to 10 m) in each environment, totalling 60 stations.. With an effort of 3600 traps-night 11 species of small mammals were captured, which were distributed differentially regarding the environments and the utilization of the vertical strata. Species presented habitat high segregation on physiognomies, only Rhipidomys macrurus presented in two environments. As for use of vertical strato for the Correspondence analysis Caluromys philander was the only notable in the canopy, Cryptonanus agricolai, Marmosa murina and, Oecomys bicolor were in the understory, and Gracilinanus agilis and Nectomys rattus were only sampled on the ground. In relation the faunistic and environments parameters formed two groups, where C agricolai and G. Agilis were associated to cerradão, dry season and number of tree and C. philander, M. Murina, N. rattus and O. bicolor were associated to gallery forest, stratification, number of branch and lianas. The Cerrado biome presents distinct fauna of small mammals associated with the two main forest physiognomies in it: gallery forest and cerradão. The utilization of traps in different strata increased the species richness, showing that they are distributed in different vertical strata of the forest, utilizing the complexity of the environment which enables them to coexist. / Estudos sobre estratificação vertical por pequenos mamíferos no Cerrado são escassos. Este estudo objetivou verificar a composição da comunidade de pequenos mamíferos em relação à utilização do estrato vertical em áreas de floresta de galeria e cerradão no sudoeste do Brasil. As capturas foram realizadas durante os meses de agosto/setembro, novembro/dezembro de 2006 e fevereiro/março, maio/junho de 2007. As armadilhas foram dispostas em três transecções com 10 estações de captura cada, sendo que cada estação compreendeu uma armadilhas no solo, uma no subbosque (2,0 a 3,0 m de altura) e uma no dossel (8 a 10 m) em cada ambiente, totalizando 60 estações de capturas. Com um esforço de 3600 armadilhas-noite foram capturadas 11 espécies de pequenos mamíferos, que estiveram distribuídas diferencialmente em relação aos ambientes e à utilização do estrato vertical. As espécies apresentaram forte segregação de hábitat, onde apenas Rhipidomys macrurus esteve presente nos dois ambientes. Quanto ao uso do estrato vertical, pela análise de Correspondência, Caluromys philander foi a única espécie que se destacou no dossel, Cryptonanus agricolai, Marmosa murina, e Oecomys bicolor, e se destacaram no sub-bosque, e Gracilinanus agilis e Nectomys rattus se destacaram ao nível do solo. Em ralação aos parâmetros faunísticos e ambientais formaram-se dois grupos , onde C. agricolai e G. agilis estiveram associados ao cerradão, estação seca e número de árvores e C. philander, M. murina, N. rattus e O. bicolor estiveram associados a floresta de galeria, estratificação, número de ramos e número de lianas. O bioma Cerrado apresenta distintas faunas de pequenos mamíferos associadas às duas formações florestais: floresta de galeria e o cerradão. A utilização de armadilhas em diferentes estratos aumenta a riqueza de pequenos mamíferos, mostrando que as espécies estão distribuídas em diferentes camadas verticais da floresta, utilizando a complexidade do ambiente o que possibilita a coexistência de um número maior de espécies.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The synthesis of compounds that use a nucleoside as the base structure, has an intense field application. Among these compounds, the most known nowadays is azydothymidine or zidovudine, a drug which was first synthesized to work against tumor processes. However, it was discovered that it could take action to viral combat and now it is the drug of choice in the treatment of acquired immunodeficiency syndrome (AIDS). On the other hand, organochalcogens compounds have been calling the attention of the scientific community, mainly because of their potential in biological molecules containing these atoms. Considering this last factor and aiming to explore the structural basis of nucleosides and biological influences that changes in the 5' position of the deoxyribose ring of AZT would promote, it was planned through an efficient and accessible synthetic route to produce a new series of nucleosides, the 5'-arylseleno azidothymidine, which had the insertion of the selenium atom connected to different aril groups. Moreover, the series of selenium derivatives were evaluated for their toxicological potential for oxidative stress (TBARS and thiol peroxidase), where the compounds 5´-p-methylseleno azidothymidine 3b and 5´-p-chloroseleno azidothymidine (3h) had the results of this series, with potential as antioxidant agent. After this, the compounds 3b and 3h were tested against culture cell lines of bladder cancer (5637). The tests aimed to assess the cytotoxicity, cell morphology, apoptosis analysis and gene expression. The results showed that the compounds 3b and 3h present apoptotic profile, additionally they seem to modulate the expression of anti-apoptotic gene. The results obtained indicate that the compounds 3b and 3h in addition of presenting an antioxidant potential, have a pro-apoptotic profile, even more effective than AZT itself. Considering all the results presented, it was concluded that this new nucleoside serie has great antitumor potential and can be used as a chemopreventive, combined to the antioxidant potential. / A síntese de compostos que usam como base a estrutura de nucleosídeos é um campo que possui uma intensa aplicação biológica. Dentre estes compostos, o mais conhecido é a azidotimidina ou zidovudina (AZT), um fármaco que teve sua síntese inicial voltada para o combate de processos tumorais. No entanto, descobriu-se que este poderia agir no combate viral e hoje é o fármaco de primeira escolha no tratamento da síndrome da imunodeficiência adquirida. Adicionalmente, compostos organocalcogênio, principalmente compostos de selênio, despertam a atenção da comunidade científica principalmente devido as suas potencialidades biológicas. Dessa forma, a fim de explorar a base estrutural dos nucleosídeos e as influências biológicas que modificações na posição 5´ do anel da desoxirribose do AZT promoveriam, planejou-se através de uma eficiente rota sintética, a síntese de uma nova série de nucleosídeos, os 5´-arilseleno azidotimidina, que apresentaram a inserção do átomo de selênio ligados a diferentes grupamentos arílicos. Com o objetivo de realizarmos uma seleção dos melhores compostos da série de selenonuclesídeos, avaliamos o parâmetro toxicológico para o estresse oxidativo (TBARS e tiol peroxidase) destes compostos. Onde, os compostos 5´-p-metilseleno azidotimidina (3b) e 5´-p-cloroseleno azidotimidina (3h) apresentaram os resultados mais promissores, apresentando inclusive perfil como agente antioxidante. Dessa forma, após realizarmos a triagem, os compostos 3b e 3h tiveram suas atividades testadas frente à cultura celular de linhagem de câncer de bexiga (5637). Os testes buscaram avaliar os parâmetros de citotoxicidade, morfologia celular, análise apoptótica e a expressão gênica. Os resultados obtidos mostraram que os compostos 3b e 3h apresentaram perfil apoptótico, além de serem capazes de modular a expressão do gene anti-apoptótico. Por fim, os resultados obtidos, apontam que os compostos 3b e 3h além de apresentarem um perfil antioxidante, possuem ação pró-apoptótica mais eficientes do que o próprio AZT. Dessa forma, considerando todos os resultados obtidos, foi possível concluir que essa nova série de nucleosídeos apresenta potencial antitumoral, podendo ser usado quimiopreventivamente, aliado ao perfil antioxidante.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Epilepsy is among the most common neurological disorders around the world. Even with the advances in the pathophysiological studies and treatment of this condition, about 30% of the patients do not present satisfactory response to pharmacological treatment available today. In this sense, the searches for new therapies that can help the treatment of this condition are essential. The present thesis aimed to investigate the effect and the mechanisms involved in creatine supplementation and exercise training on a seizure model induced by PTZ. The results presented here showed that exercise training, acute and chronic creatine supplementation as well as the combination between exercise training and chronic creatine supplementation, protected against PTZ-induced seizures. Also, exercise training increased the SOD activity and the thiol groups content per se. Additionally, the chronic creatine supplementation also increased the thiol group content and the acute creatine administration increased the mitochondrial membrane potential () per se. Moreover, also the chronic supplementation and the physical activity program, as well as their combination controlled the increase in the lipoperoxidation and protein carbonylation, the decrease in thiol group content and in the activity of SOD, CAT and Na+,K+-ATPase, induced by the injection of PTZ. In the same way, the acute creatine treatment prevented against the decrease in the Na+,K+-ATPase and xanthine oxidase activity, the decrease in the ATP and ADP content, the increase in the AMP, adenosine, inosine, uric acid content, carbonylated protein and lipoperoxidation, after seizures induced by PTZ. The results indicate that the increase in antioxidant defenses and the maintenance in the energetic storages promoted by exercise training and acute and chronic creatine supplementation can be the putative mechanisms involved in protection against seizures and neurochemical changes induced by PTZ injection. Taking into account the high energetic requirement in disorders with epileptic phenotype, and the known oxidative component involved also in epileptogenesis and in spread of seizures, the exercise training and the creatine supplementation can be considered adjunct therapies in potential to treatment of conditions that present epileptic phenotype. / A epilepsia está entre as desordens neurológicas graves mais comuns no mundo. Apesar dos avanços no estudo patofisiológico e no tratamento dessa condição, cerca de 30% dos pacientes não respondem satisfatoriamente ao tratamento farmacológico disponível atualmente. Nesse sentido, a busca por novas terapias que possam auxiliar no tratamento desta condição é essencial. A presente tese buscou investigar o efeito e os mecanismos envolvidos na suplementação com creatina e no exercício físico, sobre um modelo de convulsões induzidas por pentilenotetrazol (PTZ). Os resultados aqui apresentados demonstraram que o exercício físico, a suplementação aguda e crônica com creatina assim como a combinação entre o exercício físico e a suplementação crônica com creatina protegeram das convulsões induzidas por PTZ. Verificou-se também que o exercício físico aumentou a atividade da enzima superóxido dismutase (SOD) e o conteúdo de grupamentos tióis per se. Além disso, a suplementação crônica com creatina também aumentou o conteúdo de grupamentos tióis e a administração aguda com creatina aumentou o potencial de membrana mitocondrial () per se. Somando-se a isso, tanto a suplementação crônica com creatina, quanto o programa de atividade física, ou sua combinação, controlaram o aumento na lipoperoxidação e na carbonilação de proteínas, a redução no conteúdo de grupamentos tióis não-protéicos e da atividade das enzimas SOD, Catalase (CAT) e Na+,K+-ATPase, induzidas pela injeção de PTZ. Semelhantemente, o tratamento agudo com creatina preveniu contra a redução da atividade da enzima Na+,K+-ATPase e xantina oxidase, redução no potencial de membrana mitocondrial e nos conteúdos de ATP e ADP, aumento nos conteúdos de AMP, Adenosina, Inosina, Ácido Úrico, proteína carbonilada e lipoperoxidação, após convulsões induzidas por PTZ. Esses resultados indicam que o aumento nas defesas antioxidantes e a manutenção nos estoques energéticos exercidos pela atividade física e pela suplementação aguda e crônica com creatina podem ser os possíveis mecanismos envolvidos na proteção contra as convulsões e as alterações neuroquímicas induzidas pela injeção de PTZ. Levando em conta a alta demanda energética presente em desordens com fenótipo epiléptico, além do conhecido componente oxidativo envolvido tanto na epileptogênese quanto na propagação de crises, a atividade física e a suplementação com creatina podem ser consideradas potenciais terapias auxiliares para o tratamento de condições que apresentem fenótipo epiléptico.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Type 1 diabetes (T1D) is a disease characterized by the individual's inability to produce the hormone insulin due to destruction of pancreatic β-cells by the immune cells of the organism itself. So far, there is no 100% effective therapy for treating the symptoms of T1D. Current treatments involve constant monitoring of blood glucose levels and regular insulin injections. Inflammatory processes are associated with the development and progression of T1D, and so new therapies involving drugs with anti-inflammatory properties have been the subject of increasing interest in the scientific community. Polyphenols are a class of heterocyclic compounds that include anthocyanins and rosmarinic acid, both known for their antioxidant and anti-inflammatory properties. We studied the effects of two polyphenol rich extracts (cooked potato and rosemary) and a concentrate of anthocyanins in a model of type 1 streptozotocin-induced diabetic rats. The extracts were administered by gavage for 30 days. After this period, the rats were euthanized and we assessed acetylcholinesterase (AChE) activity in lymphocytes and serum butyrylcholinesterase (BuChE) activity, because of the importance of these enzymes as biomarkers of inflammation. The activities of both enzymes were shown to be increased in diabetic rats compared to controls. The cooked potato peel extract and concentrated anthocyanins did not altered AChE activity in lymphocytes, probably due to low bioavailability, while rosemary extract was a potent inhibitor and reverted the activity to normal levels. None of the treatments had any effect on serum BuChE activity. These results support the involvement of inflammatory processes on TD1 pathology and present the rosemary extracts as a promising alternative for future phytochemical therapies for the treatment of inflammatory-related diseases, such as type 1 diabetes. / O diabetes tipo 1 (DT1) é uma doença caracterizada pela incapacidade do indivíduo de produzir o hormônio insulina devido à destruição das células-β pancreáticas pelas células imune do próprio organismo. Ainda não existe uma terapia 100 % eficaz para tratar os sintomas do DT1. Os tratamentos atuais envolvem monitoramento constante dos níveis de glicose do sangue e injeções periódicas de insulina. Os processos inflamatórios estão associados com o desenvolvimento e a progressão do DT1 e, por isso, novas terapias envolvendo fármacos com propriedades anti-inflamatórias têm sido alvo crescente de interesse no meio científico. Os polifenois são uma classe de compostos heterocíclicos dos quais fazem parte as antocianinas e o ácido rosmarínico, conhecidos por suas propriedades antioxidantes e anti-inflamatórias. Neste trabalho, estudamos os efeitos de dois extratos ricos em polifenois batata cozida e alecrim - e de um concentrado de antocianinas em um modelo de ratos com diabetes tipo 1 induzido por estreptozotocina. Os extratos foram administrados por gavagem durante 30 dias. Após, os ratos foram eutanasiados e verificou-se os efeitos do tratamento sobre a atividade da acetilcolinesterase (AChE) de linfócitos e da butirilcolinesterase (BuChE) de soro, devido à importância dessas enzimas como biomarcadores de inflamação. As atividades de ambas as enzimas mostraram-se aumentadas nos ratos diabéticos em relação aos controles. O extrato de casca de batata cozida e as antocianinas concentradas não alteraram significativamente a atividade da AChE em linfócitos, provavelmente devido à sua baixa biodisponibilidade, enquanto o extrato de alecrim foi um potente inibidor dessa enzima. Nenhum dos tratamentos surtiu efeito sobre a atividade da BuChE de soro. Estes resultados reforçam a hipótese inflamatória na patologia do DT1 e apresentam o extrato de alecrim como uma possível terapia secundária para o tratamento de doenças associadas à inflamação, como o diabetes tipo 1.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Reserpine treatment is a putative animal model of orofacial dyskinesia, tremor, and Parkinsonism. Here, we examined the effects of resveratrol, a polyphenol with neuroprotective properties primarily contained in red grapes and red wine, in an animal model of vacuous chewing movements (VCM) induced by treatment with reserpine in mice. Mice were treated with reserpine (1 mg/kg, subcutaneously administered on days 1 and 3) and/or resveratrol (5 mg/kg, intraperitonealy administered 3 consecutive days). VCM, locomotor, and exploratory performance were evaluated. It was also analysed nonproteic thiol groups and Vitamin C levels in cortex and region containing both substantia nigra and striatum as antioxidant defense parameters. Reserpine treatment produced an increase in VCM intensity, which was significantly reduced by resveratrol co-treatment. Reserpine also decreased locomotor and exploratory activity in the open field test. However, resveratrol co-treatment was not able to protect against these effects. We did not find any statistical differences among the groups when antioxidant defense parameters were evaluated. The data suggest that resveratrol could be a promising pharmacological tool for treating VCM in rodents. However, further investigations are needed to understand the exact mechanisms involved in the neuroprotective effects of resveratrol. / A administração de reserpina consiste num modelo animal de discinesia orofacial, tremor e parkinsonismo. Neste trabalho, investigamos o efeito do resveratrol, um polifenol com propriedades neuroprotetoras encontrado principalmente em frutas vermelhas e no vinho tinto, em um modelo animal de movimentos de mascar no vazio induzidos (MMVs) por tratamento com reserpina em camundongos. Os camundongos foram tratados com reserpina (1 mg/kg, administrado subcutaneamente nos dias 1 e 3) e/ou resveratrol (5 mg/kg, administrado intraperitonealmente durante 3 dias consecutivos). Foram avaliados os MMVs, atividade locomotora e exploratória. Também analisamos os níveis de tióis nãoprotéicos e de ácido ascórbico em córtex e região contendo ambos, substância negra e estriado, como parâmetros de defesa antioxidante. O tratamento com reserpina produziu um aumento na intensidade dos MMVs, os quais foram significativamente reduzidos pelo cotratamento com resveratrol. A reserpina também diminuiu a atividade locomotora e exploratória no teste de campo aberto. Contudo, o co-tratamento com resveratrol não foi capaz de modificar estes efeitos. Não foram encontradas diferenças estatisticamente significativas entre os grupos quando os parâmetros de defesa antioxidantes foram avaliados. Os dados obtidos sugerem que o resveratrol poderia ser um agente promissor no tratamento de MMVs em camundongos. Contudo, investigações adicionais são necessárias para entender os exatos mecanismos envolvidos nos efeitos neuroprotetores do resveratrol.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The antioxidant action of organic selenium compounds, as well as ebselen and diphenyl diselenide (DPDS), is closely connected to its ability of generating the selenol group. (In) this study it was evaluated the in vitro antioxidant effect of new mono and diselenide compounds, where it was compared whether the formation of p-methyl-selenol from compounds 1-phenyl-3-(p-tolylselanyl)propan-2-amine (C1) and 1,2-dip-tolyldiselenide (C4) and o-methoxy-selenol from compounds 1-(2-methoxyphenylselanyl)-3-phenylpropan-2-amine (C2) and 1,2-bis(2-methoxyphenyl) diselenide (C3) may be involved with their antioxidant effects. The mono and diselenide compounds were tested in their Fe(II) and sodium nitroprusside (SNP)-induced lipid peroxidation in rat brain and liver homogenates and also in their antioxidant ability in phosphomolybdenum test-reductionand and DPPH radical. Besides, the effects of the compounds in the antioxidant enzymes thioredoxin reductase (TrxR) and glutathione peroxidase (GPx) were quantified. The new compounds oxidant effects were investigated through the thiol oxidase assay and the cellular viability of isolated leukocytes. The results demonstrated that the compounds obtained a significant reduce on the lipid peroxidation induced by different pro-oxidants, as well as an antioxidant effect similarly when compared to ascorbic acid equivalents. In the same manner, the compounds did not present thiol oxidase activity. Furthermore, they did not preset any decrease on the cellular viability of leucocytes. The compounds C1 and C2 did not show mimetic activity of GPx enzyme or had a substrate effect on TrxR enzyme, probably due the amino group presence on their chemical structures which must have inhibited the selenol formation. However, DPDS analog-compounds presented a mimetic activity of GPx, as well as they showed an increase in the TrxR activity, presumably due the formation of the selenol groups (p-methyl-selenol and o-methoxy-selenol). / A ação antioxidante dos compostos orgânicos de selênio, como o ebselen e o disseleneto de difenila (DPDS), está intimamente envolvida com a capacidade de formação do grupamento selenol. Neste estudo foi avaliado o perfil antioxidante in vitro de novos compostos mono e disseleneto, onde foi comparado se a formação do p-metil-selenol pelos compostos 1-fenil-3-(p-tolilselenil)propano-2-amina (C1) e o 1,2-dip-tolildisseleneto (C4), assim como a formação do grupamento o-metoxi-selenol pelos compostos 1-(2-metoxifenilselenil)-3-fenilpropano-2-amina (C2) e 1,2-bis(2-metoxifenil)disseleneto (C3) pode estar associados com os efeitos antioxidantes apresentados. Os novos compostos mono e disseleneto foram avaliados quanto a capacidade de redução dos níveis de peroxidação lipídica induzida por Fe(II) e nitroprussiato de sódio em homogenatos de cérebro e fígado de ratos, assim como também foi avaliada a capacidade antioxidante através do ensaio da redução do fosfomolibdênio e do radical DPPH. Além disso, foram quantificados os efeitos dos compostos quanto à atividade das enzimas antioxidantes, tioredoxina redutase (TrxR) e glutationa peroxidase (GPx). O efeito oxidante, dos novos compostos, foi investigado através do ensaio da tiol oxidase e da viabilidade celular de leucócitos isolados. Decorrente dos resultados obtidos foi possível evidenciar que ambos os compostos apresentaram uma redução significativa da peroxidação lipídica quando induzidas por diferentes pro oxidantes assim como, uma capacidade antioxidante total semelhante a equivalentes de acido ascórbico. Da mesma forma, os compostos não apresentaram efeito tiol oxidase, assim como não apresentaram uma diminuição da viabilidade celular de leucócitos. Os compostos C1 e C2 não apresentaram atividade mimética a enzima GPx assim como, também não serviram de substrato para a enzima TrxR, provavelmente devido a presença do grupamento amino nas estruturas químicas destas moléculas o que incapacitou a formação dos respectivos grupamentos selenois. No entanto, os compostos análogos ao DPDS apresentaram atividades miméticas a GPx, assim como também apresentaram uma aumento na atividade da TrxR provavelmente devido a formação dos selenois (p-metil-selenol e o-metoxi-selenol).

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The enzyme acetylcholinesterase (EC 3.1.1.7, AChE) is responsible to terminate acetylcholine activity in the terminal nervous junctions with its effector organs or post-synaptic sites. The activity of this enzyme could be inhibited by organophosphorus (OP) compounds, and this inactivation leads to an accumulation of acetylcholine in the cholinergic receptors, leading to a cholinergic crisis that may result in death. In this way, the OP compound methamidophos has been related to its broad use in various agriculture cultures in Brazil, with high intoxication rate. Actually, the only compounds able to revert the AChE inhibition by OP, are the oxime, such compounds may reactive the enzyme activity due its high nuclephilic power, attacking the phosphoryl group of the inhibited enzyme and displacing it. However, such compounds show toxic effects, and its use is limited by the high specificity, with each oxime acting only in the reactivation of AChE induced by specific OP coumponds. These limitations raise the need of development of new compounds with AChE reactivator potency, with minor side effects. In this way, have been utilized a series of computational tools (in silico models), with the aim of understand the interaction occurring at a molecular level and, so, rationalize the new compounds development. Thus, the aim of this thesis is to evaluate the activity of three new compounds in reactivate the AChE inhibited by methamidophos, in comparison with two others oximes used in clinical (obidoxime and pralidoxime), both in in silico and in vitro models. Our work demonstrate that the newly synthesized compounds are able to reactivate human erythrocyte AChE, however less efficiently than pralidoxime and obidoxime, and reactivate human plasma butyrylcholinesterase (BChE), where the classical oximes failed. We also show that pralidoxime, which obtained the best reactivation constant among all tested compounds, attack the phosphorus-oxygen moiety (formed between the methamidophos and the AChE catalytic triad residue Ser203) via a region known as oxyanion-hole , composed by the residues Gly120, Gly121 and Ala204. Such found may help in the development of new compounds with better reactivatory activity on AChE inhibited by OP compounds. Furthermore, we show for the first time the individual contribution of each amino acid of AChE, in a radii of 14 Å from the ligand, to the oxime bonding to its active site, using quantum chemistry methods. Here, we demonstrate the important of a quaternary nitrogen to the stabilization of the oximes into the active site; as well as, we obtained evidences that the active form of oximes should be the unprotonated one, instead the protonated, which has been target of debate in the scientific society. Particularly important, we show the critical contribution of amino acids that lies distant from the ligand to the adopted conformation and stabilization of the compounds into the active site of AChE, which has been neglected until far. Finally, our study also evaluates the toxic effects of the compound isatin-3-N4-benzilthiosemicarbazone (IBTC) in mice, which presented low toxicity, with median lethal dose superior at 500 mg/kg. Concluding, this study contributes significantly to the development of new drugs able to restore the AChE activity with minor toxic effects. / A enzima acetilcolinesterase (EC 3.1.1.7, AChE) é responsável por terminar a ação da acetilcolina nas junções das terminações nervosas com seus órgãos efetores ou sítios pós-sinaptícos. A atividade desta enzima pode ser inibida por compostos organofosforados (OP), e sua inativação resulta em um acúmulo de acetilcolina nos receptores colinérgicos, levando a crise colinérgica que pode levar a morte. No Brasil, se destaca o uso do composto OP metamidofós, que é largamente utilizado no controle de pragas em culturas agrícolas e tem sido relacionado com altas taxas de intoxicação. Atualmente, os únicos compostos capazes de reverter a inibição da AChE por OP são as oximas, tais compostos podem reativar a enzima devido a seu alto poder nucleofílico, podendo atacar e retirar o grupamento fosforil da enzima inibida. Porém, tais compostos apresentam efeitos tóxicos, e tem seu uso limitado pela alta especificidade, com cada oxima atuando na AChE inibida por apenas alguns compostos OP. Tais limitações criam a necessidade do desenvolvimento de novos fármacos com potencial reativador da AChE com menores efeitos colaterais. Neste sentido, se tem utilizado uma série de ferramentas computacionais (modelos in silico), com o objetivo de entender as interações que ocorrem em nível molecular e, desta forma, racionalizar o desenvolvimento de novos compostos. Sendo assim, o objetivo desta tese consiste em avaliar a atividade de três novos compostos, em comparação com duas oximas já utilizadas na clínica (obidoxima e pralidoxima), sobre a atividade da AChE inibida por metamidofós, tanto em modelos in silico como in vitro. Como resultados, observamos que os três novos compostos foram capazes de reativar a AChE de eritrócitos humanos inibida por metamidofós, contudo com menor eficiência que as oximas já utilizadas na clínica. Porém, todos os novos compostos foram capazes de reativar a enzima butirilcolinesterase (BChE), uma enzima acessória à AChE no sistema colinérgico, inibida por metamidofós, enquanto nenhumas das oximas clássicas tiveram qualquer atividade reativadora nesta enzima. Nosso trabalho também demonstrou que a pralidoxima, que obteve a melhor constante de reativação entre todos os compostos testados, ataca a ligação fosforo-oxigênio (formada entre o metamidofós e o resíduo Ser203, da tríade catalítica da AChE) via uma região conhecida como oxyanion-hole , que compreende os resíduos Gly120, Gly121 e Ala204. Tal achado pode ajudar no desenvolvimento de novos compostos com melhor atividade reativatória na AChE inibida por OPs. Além disso, mostramos aqui pela primeira vez, a contribuição de cada resíduo de aminoácido da AChE, num raio de 14 Å do ligante, para a ligação das oximas no seu sítio ativo, usando métodos de química quântica. Tais achados mostraram a importância da presença de um nitrogênio quaternário para a estabilização das oximas no sítio ativo; assim como colheu evidências que a forma ativa das oximas seria a sua forma desprotonada, ao invés da forma protonada, o que tem sido alvo de algum debate no meio cientifico. Particularmente importante, foi demonstrado a contribuição fundamental de aminoácidos que se encontram distantes do ligante, para a estabilização e conformação adotada pelos compostos, e que até o momento tem sido negligenciados em estudos in silico. Por fim, nosso estudo também avaliou os efeitos tóxicos do composto isatina-3-N4-benziltiosemicarbazona (IBTC) em camundongos, o qual apresentando baixa toxicidade, com valores de dose letal mediana (LD50) superiores a 500 mg/kg. Desta forma, este estudo contribui para a desenvolvimento de novos fármacos capazes de reativar a AChE e que apresentem menos efeitos tóxicos.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Obesity is a systemic low grade inflammation, that is associated to the increased production of proinflammatory molecules by adipose tissue. Besides, the adiposity elevated induces cellular apoptosis and release of a large amounts of free fatty acids from disrupted adipocyte. These molecules tend to accumulate in the liver and other body tissues like skeletal muscles causing a phenomenon known as lipotoxicity. Evidence suggests that in addition to fatty acids there are other molecules that could have a severe effect lipotoxicity. This is the case of the inflammatory cytokine interleukin 1 beta (IL-1β). The IL-1β is a major inflammatory cytokines in immunity system. Studies suggest that its continued production may act by reducing the glucose influx, and induces the free radicals production contributing to the maintenance of a state of oxidative stress. For this reason, some authors have suggested that IL-1β would be a molecule glicolipotóxic. In humans the expression of IL-1B is under strong genetic control. The single nucleotide polymorphism (SNP) of C to T at nucleotide position +3953 of the IL-1B gene appears to be functional because it has been associated with increased production of IL-1β in vivo. Therefore, the aim of this study was to analyze the association between the polymorphism +3953 IL-1B gene with obesity, the influence on glycemic control, lipid and oxidized LDL molecule (oxLDL). For this, two studies were performed. The first was a case-control study with 880 Caucasian individuals, classified to obesity (non-obese = 283, overweight = 334, obese = 263), age between 18-92 years, and genotyped to IL-1B +3953 polymorphism. It was measured the bioanthropometric variables (DBP, SBP, IBM, height, weight, waist circumference) and serum parameters of blood glucose, lipid profile. In the second study, we included 225 subjects genotyped previously and measured the oxLDL serum levels, besides bioanthropometric and lipid profile measures. In both studies the volunteers did not smoke and had no cardiovascular disease or chronic degenerative diseases that could affect results. The IL-1B polymorphism genotypes were determined by PCR-RFLP and biochemical parameters by spectrophotometry. The first study results showed that the C allele (CC and CT) had a higher frequency in the group of obese and overweight when compared to the non obese group. The odds ratio showed 1.340 (95% CI: 1.119-1.605) times more chance of the obese group being CC carriers compared to non-obese group independent of gender and age. The second study showed that TT genotype carriers presented lower levels of oxLDL than patients with other genotypes. However no significant influence was observed of this polymorphism in blood glucose levels. Multivariate analysis showed that this result is independent of sex, age, obesity and hypertension. Thus, these results support the hypothesis that IL-1β is a molecule indeed obesogenic and lipotoxicity as previously suggested from animal models studies. Key-word: obesity. Interleukin-1beta. Oxidized-LDL / A obesidade é um inflamação sistêmica de baixo grau associado a elevada liberação de moléculas pró-inflamatórias pelo tecido adiposo. O aumento da adiposidade resulta em necrose tecidual e liberação de ácidos graxos, a partir dos adipócitos, que tendem a se acumular em outros tecidos corporais causando um fenômeno conhecido como lipotoxicidade. A IL-1β é uma das principais citocinas pró-inflamatórias do sistema imune, e a sua produção continuada pode agir diminuindo o influxo da glicose para dentro da célula, e induzir a produção de radicais livres contribuindo para a manutenção de um estado de estresse oxidativo. Por este motivo, alguns autores sugeriram que a IL- 1β seria uma molécula glicolipotóxica. Nos seres humanos a IL-1β possui um polimorfismo +3953 do gene da IL-1B parece ser funcional pois tem sido associado a variações na produção da IL-1β in vivo. Portanto, o objetivo deste estudo foi o de analisar a associação entre o polimorfismo +3953 do gene da IL-1B com a obesidade, a influencia nos níveis glicêmicos, lipídicos e da molécula de LDL- oxidado (LDL-ox). Para isso, foram realizados dois estudos. O primeiro foi um estudo caso-controle com 880 indivíduos Caucasianos classificados para obesidade (não obesos= 283, sobrepeso=334, obesos= 263), com idade entre 18 e 92 anos, genotipados para IL-1B +3953 determinados por PCR-RFLP. As variáveis PAD, PAS, circunferência abdominal, IMC, altura, peso, bem como o perfil glicêmico e lipídico foram medidos. No segundo estudo foram selecionados 225 indivíduos, previamente genotipados para IL-1B +3953, e medido os níveis séricos de LDL-ox, além das medidas bioantropométricas e perfil glicêmico e lipídico. Em ambos os estudos os voluntários não fumavam e não apresentavam doenças cardiovasculares ou crônico-degenerativas que pudessem interferir nos resultados. Os resultados, do primeiro estudo, mostraram que o alelo C (CT CC) apresentou uma frequência maior no grupo dos obesos e sobrepeso quando comparado ao grupo dos não obesos. A chance dos indivíduos obesos de serem portadores do genótipo CC foi de 1,34 (IC 95%, 1,119- 1,605). Estes resultados foram independente do gênero e idade. O segundo estudo mostrou que indivíduos com o genótipo CC e CT apresentaram níveis mais elevados de LDL-ox do que os portadores do genótipo TT. A análise multivariada mostrou que este resultado é independente do gênero, idade e obesidade. Entretanto, em ambos os estudos, não foi observada influência deste polimorfismo nos níveis glicêmicos. Assim, podemos concluir que a IL-1β é uma molécula, com efeito obesogênico e lipotóxico, corroborando estudos prévios em modelos animais.

The meningitis is a serious inflammatory illness of meninges, the membranes that recover and protect encephalo and the spinal cord. The main causing agents of the meningitis are the viruses and the bacteria. Some works affirm that the adenosine, the final product of ATP hydrolysis (when degraded by ectonucleotidases), have an important protective role in brain disorders. Breakdown of extracellular ATP to adenosine is catalyzes by ecto-nucleotidases family, the NTPDase hydrolyze extracellular nucleotide tri and diphosphates (ATP and ADP) to nucleotide monophosphate (AMP) and the 5'-nucleotidase catalyzes the hydrolysis of AMP to adenosine. In this work we verified adenine nucleotides hydrolysis in the CSF of aseptic and bacterial meningitis patients, in order to compare with adenine nucleotides hydrolysis in controls patient (absence of neural inflammatory process). Were used patients with age between 18 and 59 years of both the sex in a sampling of 15 patient controls, 15 patients with aseptic meningitis and 15 patients with bacterial meningitis. For the criteria of inclusion and exclusion had been analyzed parameters like, aspect of the CSF, total counting of leukocytes, distinguishing counting of leukocytes, values of protein, glucose and lactate. We got as resulted a significant reduction of hydrolysis of the ATP in the patients with aseptic and bacterial meningitis when compared with patient controls. In contrast we got a significant increase of hydrolysis of the ADP and the AMP in the two groups of meningitis when compared with the controls. The increase in ADP and AMP hydrolysis maybe means the attempt of increase the adenosine production, that have a recognized neuroprotective actions in brain insults. / A meningite é uma grave doença inflamatória das meninges, as membranas que recobrem e protegem o encéfalo e a medula espinhal. Os principais agentes causadores da meningite são os vírus e as bactérias. Vários trabalhos afirmam que a adenosina, produto final da degradação do ATP (quando degradado pelas ectonucleotidases), possui um importante papel protetor nas desordens cerebrais. A degradação do ATP até adenosina é catalisada pela família das ecto-nucleotidases, a NTPDase hidrolisa nucleotídeos extracelulares tri e di-fosfatados (ATP e ADP) até nucleotídeos mono-fosfatados (AMP), e a 5'-nucleotidase catalisa a hidrolise do AMP até adenosina. Neste trabalho verificou-se a hidrólise dos nucleotídeos de adenina no líquor de pacientes com meningite asséptica e bacteriana, a fim de comparar a hidrólise destes nucleotídeos com pacientes controles (ausência de processo inflamatório neural). Foram utilizados pacientes com idade entre 18 e 59 anos de ambos os sexos em uma amostragem de 15 pacientes controles, 15 pacientes com meningite asséptica e 15 paciente com meningite bacteriana. Para os critérios de inclusão e exclusão foram analisados parâmetros tais como: aspecto do líquor, contagem total de leucócitos, contagem diferencial de leucócitos, valores de proteína, glicose e lactato. Obtivemos como resultado uma diminuição significativa da hidrólise do ATP nos pacientes com meningite asséptica e bacteriana quando comparados com pacientes controles. Ao contrário obtivemos um aumento significativo da hidrólise do ADP e do AMP nos dois grupos de meningites quando comparados com os controles. A hidrólise aumentada do ADP e do AMP refere-se talvez a tentativa de aumentar a produção de adenosina, que por sua vez possui um conhecido papel neuroprotetor frente a insultos cerebrais.