Optimal response to drought is critical for plant survival and will affect biodiversity and crop performance during climate change. Mitotically heritable epigenetic and dynamic chromatin state changes have been implicated in the plant response to the drought stress hormone abscisic acid (ABA). The Arabidopsis SWI/SNF chromatin-remodeling ATPase BRAHMA (BRM) modulates response to ABA by preventing premature activation of stress response pathways during germination. Here, we show that the core ABA signalosome formed by ABA receptors, PP2Cs and SnRK2s physically interact with BRM to regulate BRM activity and post-translationally modify BRM by phosphorylation/dephosphorylation. Genetic evidence suggests that BRM acts downstream of SnRK2.2/2.3 kinases and biochemical studies identified evolutionary conserved SnRK2 phosphorylation sites in the C-terminal region of BRM. Our data suggest that SnRK2-dependent phosphorylation of BRM leads to its inhibition, and PP2CA-mediated dephosphorylation of BRM restores the ability of BRM to repress ABA response. ABA plays a key role to regulate germination and post-germination growth and the AP2-type ABI4 and bZIP-type ABI5 transcription factors (TFs) are required for ABA-mediated inhibition of post-germination growth when the embryo encounters water stress. The growth arrest induced by ABI4 and ABI5 involves ABA signaling and in the case of ABI5, it has been demonstrated that ABA inhibits the activity of BRM to induce ABI5 transcription. Loss of BRM activity leads to destabilization of a nucleosome involved in repression of ABI5 transcription. Therefore reduction of BRM activity in the brm-3 allele leads to enhanced expression of ABI5 in 2-d-old seedlings and enhanced sensitivity to ABA. Novel genetic evidence obtained in this work indicates that ABI4 is one of the redundant TFs regulated by BRM that mediate ABA response during germination and early seedling growth. Thus, the association of BRM with the ABI4 locus together with the observed derepression of ABI4 expression in brm-3 suggests that BRM directly regulates ABI4 expression. Finally, this work provides a direct link between the ABA signalosome and the chromatin-remodeling ATPase BRM, which enables ABA-dependent modulation of BRM activity as a possible mechanism to enhance plant drought tolerance. Additionally, we identified and characterized the promoter of PP2CA as a stress-inducible promoter and we have used it to drive the expression of ABA receptors from Arabidopsis and Solanum lycopersicum. This technology appears to be promising for the expression of ABA receptors in an inducible manner and to generate drought tolerant plants. / La respuesta óptima a la sequía es crítica para la supervivencia de las plantas y afectará a la biodiversidad y al rendimiento de los cultivos durante el cambio climático. Las modificaciones epigenéticas y los cambios dinámicos del estado de la cromatina han sido implicados en la respuesta de la planta al ácido abscísico (ABA), la conocida como la hormona del estrés hídrico. La ATPasa remodeladora de cromatina de tipo SWI/SNF de Arabidopsis, BRAHMA (BRM), modula la respuesta al ABA mediante la prevención de la activación prematura de las vías de respuesta al estrés durante la germinación. Aquí, mostramos que el núcleo del señalosoma de ABA formado por los receptores de ABA, las PP2Cs y las SnRK2s interaccionan físicamente con BRM para regular su actividad y modificarla post-traduccionalmente por mecanismos de fosforilación/desfosforilación. La evidencia genética sugiere que BRM actúa aguas abajo de las quinasas SnRK2.2/2.3 y los estudios bioquímicos identificaron la presencia en la región C-terminal de BRM de sitios de fosforilación de las SnRK2 que estaban conservados evolutivamente. Nuestros datos sugieren que la fosforilación de BRM que depende de las SnRK2 conduce a su inhibición, y que la desfosforilación de BRM mediada por PP2CA restaura la capacidad de BRM para reprimir la respuesta a ABA. El ABA juega un papel clave en la regulación de la germinación y el crecimiento post germinativo y los factores de transcripción de tipo AP2 como ABI4 y de tipo bZIP como ABI5, son necesarios para la inhibición del crecimiento post germinativo mediado por ABA cuando los embriones encuentran estrés hídrico. La detención del crecimiento inducida por ABI4 y ABI5 implica la señalización de ABA y en el caso de ABI5, se ha demostrado que el ABA inhibe la actividad de BRM para inducir la transcripción de ABI5. La pérdida de actividad de BRM conduce a la desestabilización de un nucleosoma implicado en la represión de la transcripción de ABI5. Por lo tanto, la reducción de la actividad de BRM en el alelo brm-3 conduce a una mayor expresión de ABI5 en plántulas de 2 días y una mayor sensibilidad a ABA. La nueva evidencia genética obtenida en este trabajo indica que ABI4 es uno de los factores de transcripción redundantes regulados por BRM que median la respuesta a ABA durante los estadios de germinación y crecimiento temprano de las plántulas. La asociación de BRM con el locus ABI4, junto con la desrepresión de la expresión de ABI4 observada en el mutante brm-3 sugiere que BRM regula directamente la expresión de ABI4. Por último, este trabajo proporciona una relación directa entre el señalosoma de ABA y la ATPasa remodeladora de cromatina BRM, que permite la modulación de la actividad de BRM de modo dependiente de ABA como un posible mecanismo para mejorar la tolerancia a sequía de las plantas. Además, hemos identificado y caracterizado el promotor de PP2CA como un promotor inducible por estrés y lo hemos utilizado para dirigir la expresión de los receptores de ABA de Arabidopsis y Solanum lycopersicum. Esta tecnología parece ser prometedora para la expresión de receptores de ABA de modo inducible y para generar plantas tolerantes a la sequía. / La resposta òptima a la sequera és crítica per a la supervivència de les plantes i afectarà la biodiversitat i al rendiment dels cultius durant el canvi climàtic. Les modificacions epigenètiques i els canvis dinàmics de l'estat de la cromatina han estat implicats en la resposta de la planta a l'àcid abscísic (ABA), la coneguda com hormona de l'estrès hídric. La ATPasa remodeladora de cromatina de tipus SWI/SNF d'Arabidopsis, BRAHMA (BRM), modula la resposta al ABA mitjançant la prevenció de l'activació prematura de les vies de resposta a l'estrès durant la germinació. Ací, mostrem que el nucli del senyalosoma d'ABA format pels receptors d'ABA, les PP2Cs i les SnRK2s interaccionen físicament amb BRM per regular la seva activitat i modificar-la post-traduccionalment per mecanismes de fosforilació/desfosforilació. L'evidència genètica suggereix que BRM actua aigües avall de les quinases SnRK2.2/2.3 i els estudis bioquímics van identificar la presència, a la regió C-terminal de BRM, de llocs de fosforilació de les SnRK2 que estaven conservats evolutivament. Les nostres dades suggereixen que la fosforilació de BRM que depèn de les SnRK2, condueix a la inhibició de BRM, i que la defosforilació de BRM mediada per PP2CA restaura la capacitat de BRM per reprimir la resposta a ABA. El ABA juga un paper clau en la regulació de la germinació i el creixement post-germinació i els factors de transcripció de tipus AP2 com ABI4 i de tipus bZIP com ABI5, són necessaris per a la inhibició del creixement post-germinació mediat per ABA quan els embrions pateixen estrès hídric. La detenció del creixement induïda per ABI4 i ABI5 implica la senyalització d'ABA i en el cas d'ABI5, s'ha demostrat que l'ABA inhibeix l'activitat de BRM per induir la transcripció d'ABI5. La pèrdua d'activitat de BRM condueix a la desestabilització d'un nucleosoma implicat en la repressió de la transcripció d'ABI5. Per tant, la reducció de l'activitat de BRM a l'al·lel brm-3 condueix a una major expressió d'ABI5 en plàntules de 2 dies i una major sensibilitat a l'ABA. La nova evidència genètica obtinguda en aquest treball indica que ABI4 és un dels factors de transcripció redundants que són regulats per BRM que medien la resposta a l'ABA durant els estadis de germinació i creixement primerenc de les plàntules. Per tant, l'associació de BRM amb el locus ABI4, juntament amb la desrepressió de l'expressió de ABI4 observada al mutant brm-3 suggereix que BRM regula directament l'expressió d'ABI4. Finalment, aquest treball proporciona una relació directa entre el senyalosoma d'ABA i l'ATPasa remodeladora de cromatina BRM, que permet la modulació de l'activitat de BRM de manera dependent d'ABA com un possible mecanisme per millorar la tolerància a sequera de les plantes. A més, hem identificat i caracteritzat el promotor de PP2CA com un promotor induïble per estrès i l'hem utilitzat per dirigir l'expressió dels receptors d'ABA d'Arabidopsis i Solanum lycopersicum. Aquesta tecnologia sembla ser prometedora per a l'expressió de receptors d'ABA de manera induïble i per generar plantes tolerants a la sequera. / Peirats Llobet, M. (2017). Fundamental and applied research in ABA signaling: Regulation by ABA of the chromatin remodeling ATPase BRAHMA and biotechnological use of the PP2CA promoter [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/82694 / TESIS / Premios Extraordinarios de tesis doctorales

[ES] La Biología Sintética de Plantas tiene como objetivo rediseñar las plantas para que adquieran características y funcionalidades novedosas a través de circuitos reguladores ortogonales. Para lograr este objetivo, se deben desarrollar nuevas herramientas moleculares con la capacidad de interactuar con factores endógenos de manera potente y específica. CRISPR/Cas9 surgió como una herramienta prometedora que combina la capacidad personalizable de unión al DNA, a través de la versión catalíticamente inactivada de la proteína Cas9 (dCas9), con la posibilidad de anclar dominios autónomos de activación transcripcional (TADs) a su estructura para lograr una regulación específica de la expresión génica. Los activadores transcripcionales programables (PTAs) pueden actuar como procesadores específicos, ortogonales y versátiles para el desarrollo de nuevos circuitos genéticos en las plantas. En busca de dCas9-PTA optimizados, se llevó a cabo una evaluación combinatoria de diferentes arquitecturas dCas9 con un catálogo de varios TAD. La mejor herramienta resultante de esta comparación, denominada dCasEV2.1, se basa en la estrategia scRNA y la combinación de los dominios de activación EDLL y VPR con un bucle multiplexable gRNA2.1, que es una versión mutada del gRNA2.0 descrito previamente. En este trabajo, el activador programable dCasEV2.1 demostró ser una herramienta potente y específica, logrando tasas de activación más altas que otras estrategias dCas9 disponibles en plantas. Se observaron tasas de activación sin precedentes dirigidas a genes endógenos en N. benthamiana, acompañadas de una estricta especificidad en todo el genoma, lo que hace que esta herramienta sea adecuada para la regulación estricta de redes reguladoras complejas. Como prueba de concepto, se diseñaron cuatro programas de activación para distintas ramas de la ruta de los flavonoides, buscando obtener enriquecimientos metabólicos específicos en hojas de N. benthamiana. El análisis metabólico de las hojas metabólicamente reprogramadas mediante dCasEV2.1 reveló un enriquecimiento selectivo de los metabolitos diana y sus derivados glicosilados, que se correlacionaron con el programa de activación empleado. Estos resultados demuestran que dCasEV2.1 es una herramienta eficaz para la ingeniería metabólica y un componente clave en los circuitos genéticos destinados a reprogramar los flujos metabólicos. Finalmente, basándonos en dCasEV2.1, desarrollamos un sistema optimizado de regulación de genes inducidos por virus (VIGR) que utiliza un vector Potato Virus X (PVX) para el suministro de los programas de activación CRISPR codificados con gRNA. Este enfoque permite controlar el transcriptoma de la planta a través de una aplicación sistémica basada en aerosol de componentes CRISPR a plantas adultas. El nuevo sistema PVX-VIGR produjo una fuerte activación transcripcional en varios genes diana endógenos, incluidos tres factores de transcripción MYB-like seleccionados. Las activaciones específicas de MYB condujeron a perfiles metabólicos distintivos, demostrando que las aplicaciones potenciales de la herramienta dCasEV2.1 en plantas incluyen la obtención de perfiles metabólicos personalizados utilizando un suministro basado en aerosol de instrucciones de reprogramación transcripcional codificadas por gRNA. En resumen, esta tesis proporciona herramientas novedosas para la activación transcripcional fuerte, ortogonal y programable en plantas, con una caja de herramientas ampliada para el suministro de los programas de activación. / [CA] La Biologia Sintètica de Plantes té com objectiu redissenyar les plantes per que obtinguen característiques i funcionalitats innovadores mitjançant circuits reguladors ortogonals. Per arribar a aquest objectiu, s'han de desenvolupar noves ferramentes moleculars amb la capacitat d'interactuar amb factor endògens d'una manera potent i específica. CRISPR/Cas9 va sorgir com una ferramenta prometedora que combina la capacitat personalitzable d'unió al DNA, mitjançant la versió catalíticament inactivada de la proteïna Cas9 (dCas9), amb la possibilitat de fixar dominis autònoms de activació transcripcional (TADs) a la seua estructura per aconseguir una regulació específica de la expressió gènica. Els activadors transcripcionals programables (PTAs) poden actuar com a processadors específics, ortogonals i versàtils per al desenvolupament de nous circuits genètics a les plantes. Buscant dCas9-PTA optimitzats, es va realitzar una avaluació combinatòria de distintes arquitectures dCas9 amb un catàleg de diversos TAD. La millor ferramenta segons aquesta comparació, anomenada dCasEV2.1, es basa en la estratègia scRNA i la combinació del dominis d'activació EDLL i VPR amb un bucle multiplexable gRNA2.1, que es una versió mutada del gRNA2.0 descrit prèviament. En aquest treball, el activador programable dCasEV2.1 es va mostrar com una ferramenta potent i específica, aconseguint nivells d'activació majors que altes estratègies dCas9 disponibles en plantes. Es van observar taxes d'activació sense precedents dirigides a gens endògens en N. benthamiana, junt a una estricta especificitat en tot el genoma, indicant que aquesta ferramenta és adequada per a la regulació estricta de xarxes reguladores complexes. Como proba de concepte, se van dissenyar quatre programes d'activació per a diferent branques de la ruta dels flavonoides, cercant obtenir enriquiments metabòlics específics en fulles de N. benthamiana. L'anàlisi metabòlic de les fulles metabòlicament reprogramades mitjançant dCasEV2.1 va revelar un enriquiment selectiu del metabòlits diana i els seus derivats glicosilats que es correlacionen amb el programa d'activació emprat. Aquests resultats demostren que dCasEV2.1 és una ferramenta eficaç per a l'enginyeria metabòlica i un component clau als circuits genètics destinats a reprogramar els fluxos metabòlics. Finalment, en base a dCasEV2.1, desenvoluparem un sistema optimitzat de regulació de gens induïts per virus (VIGR) que utilitza un vector Potato Virus X (PVX) per al subministrament dels programes d'activació CRISPR codificats amb gRNA. Aquesta aproximació permet controlar el transcriptoma de la planta mitjançant l'aplicació sistèmica basada en aerosol de components CRISPR a plantes adultes. El nou sistema PVX-VIGR va produir una gran activació transcripcional en diversos gens diana endògens, inclosos tres factors de transcripció MYB-like seleccionats prèviament. Les activacions específiques de MYB conduïren a perfils metabòlics distintius, demostrant que les aplicacions potencials de la ferramenta dCasEV2.1 en plantes inclouen la obtenció de perfils metabòlics personalitzats emprant un subministrament basat en aerosol de instruccions de reprogramació transcripcional codificades per gRNA. En resum, aquesta tesis proporciona noves ferramentes per a l'activació transcripcional forta, ortogonal i programable en plantes, amb una caixa de ferramentes eixamplada per al subministraments dels programes d'activació. / [EN] Plant Synthetic Biology aims to redesign plants to acquire novel traits and functionalities through orthogonal regulatory circuits. To achieve this goal, new molecular tools with the capacity of interacting with endogenous factors in a potent and specific manner must be developed. CRISPR/Cas9 emerged as promising tools which combine a customizable DNA-binding activity through the catalytically inactivated version of Cas9 protein (dCas9) with the possibility to anchor autonomous transcriptional activation domains (TADs) to its structure to achieve a specific regulation of the gene expression. The Programmable Transcriptional Activators (PTAs) could act as specific, orthogonal and versatile processor components in the development of new genetic circuits in plants. In search for optimized dCas9-PTAs, a combinatorial evaluation of different dCas9 architectures with a catalogue of various TADs was performed. The best resulting tool of this comparison, named dCasEV2.1, is based on the scRNA strategy and the combination of EDLL and VPR activation domains with a multiplexable gRNA2.1 loop, which is a mutated version of the previously described gRNA2.0. In this work, the dCasEV2.1 programable activator was proved to be a strong and specific tool, achieving higher activation rates than other available dCas9 strategies in plants. Unprecedented activation rates were observed targeting endogenous genes in N. benthamiana, accompanied by strict genome-wide specificity that makes this tool suitable to perform a tight regulation of complex regulatory networks. As a proof of concept, a design of four activation programs to activate different branches of the flavonoid pathway and obtain specific metabolic enrichments in N. benthamiana leaves was performed. The metabolic analysis on the dCasEV2.1 metabolically reprogrammed leaves revealed a selective enrichment of the targeted metabolites and their glycosylated derivatives that correlated with the activation program employed. These results demonstrate that dCasEV2.1 is a powerful tool for metabolic engineering and a key component in genetic circuits aimed at reprogramming metabolic fluxes. Finally, based on dCasEV2.1, we developed an optimized Viral Induced Gene Regulation (VIGR) system that makes use of a Potato Virus X (PVX) vector for the delivery of the gRNA-encoded CRISPR activation programs. This approach offers a way to control the plant transcriptome through a spray-based systemic delivery of CRISPR components to adult plants. The new PVX-VIGR system led to strong transcriptional activation in several endogenous target genes, including three selected MYB-like transcription factors. Specific MYB activations lead to distinctive metabolic profiles, showing that the potential applications of the dCasEV2.1 tool in plants include the obtention of custom metabolic profiles using a spray-based delivery of gRNA-encoded transcriptional reprogramming instructions. In sum, this thesis provides novel tools for strong, orthogonal and programmable transcriptional activation in plants, with an expanded toolbox for the delivery of the activation programs. / Selma García, S. (2022). Development of CRISPR-based programmable transcriptional regulators and their applications in plants [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/185046 / TESIS

Submitted by Ingritt Moreira (ingritt@gmail.com) on 2019-01-21T20:58:31Z No. of bitstreams: 2 Tese INGRITT CAROLINE MOREIRA.pdf: 2137024 bytes, checksum: 63efdff4c7afd9eeb4db6d7a1a0af110 (MD5) Carta Comprovante Versão Final Tese Ingritt.jpg: 150492 bytes, checksum: 9562c1ad3497c4bc78d70963e45afa55 (MD5) / Approved for entry into archive by Eunice Nunes (eunicenunes6@gmail.com) on 2019-01-22T14:04:13Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Tese INGRITT CAROLINE MOREIRA.pdf: 2137024 bytes, checksum: 63efdff4c7afd9eeb4db6d7a1a0af110 (MD5) Carta Comprovante Versão Final Tese Ingritt.jpg: 150492 bytes, checksum: 9562c1ad3497c4bc78d70963e45afa55 (MD5) / Approved for entry into archive by Eunice Nunes (eunicenunes6@gmail.com) on 2019-01-22T14:17:14Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Tese INGRITT CAROLINE MOREIRA.pdf: 2137024 bytes, checksum: 63efdff4c7afd9eeb4db6d7a1a0af110 (MD5) Carta Comprovante Versão Final Tese Ingritt.jpg: 150492 bytes, checksum: 9562c1ad3497c4bc78d70963e45afa55 (MD5) / Made available in DSpace on 2019-01-22T14:17:28Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Tese INGRITT CAROLINE MOREIRA.pdf: 2137024 bytes, checksum: 63efdff4c7afd9eeb4db6d7a1a0af110 (MD5) Carta Comprovante Versão Final Tese Ingritt.jpg: 150492 bytes, checksum: 9562c1ad3497c4bc78d70963e45afa55 (MD5) Previous issue date: 2018-08-24 / Outra / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / This research focuses on the oxylipins with eighteen carbons, compound derived of polyunsaturated fatty acids, produced by twenty-two species of freshwater algae, one cyanobacteria and three species of plants, with emphasis on green microalgae from the Chlorophyta and Charophyta phylum, and also species of the Selenastraceae family (Chlorophyta, Chlorophyceae, Sphaeropleales). The aim was detected, identified and quantified oxylipins derived from linoleic and linolenic acids produced by microorganisms using High-Performance Liquid Chromatography coupled tandem Mass Spectrometry technique. It was used microalgae from the Culture Collection of Freshwater Microalgae (CCMA-UFSCar), species already classified by classic and / or molecular taxonomy, as well as the species of plants for comparative purposes. For the experiments, the material came from the end of stationary phase. Once the compounds were identified by these techniques, it was tested the possibility of using profiles as diacritical characteristics in a chemotaxonomic approach for formation of hierarchical clusters. The pharmacological potential of these compounds was discussed since they present antibiotic and anti-inflammatory activities. Other possible commercial applications were approached since microalgae revealed their potential value as natural sources of hydroxy fatty acids. No oxylipin was exclusively observed to determinated organism that could represents as species indicator. This condition limits the use of oxylipins derived from C18 PUFAs in the taxonomy of the Selenastraceae family, but even so, these compounds provide complementary information for organisms that may be useful in their identification. There was universality regarding the presence of oxylipins analysed in all the taxonomic groups studied. The strains belonging to Chlorophyta division showed the highest total concentrations of oxylipins. Charophyta algae have a concentration of oxylipins dozens of times lower than Chlorophyta, and similar to concentrations found in plants, which may be related to the evolutionary proximity among plants and Charophyta. / Esta pesquisa tem como foco oxilipinas com dezoito carbonos, substâncias derivadas de ácidos graxos poli-insaturados, produzidas por vinte e duas cepas de algas de água doce, uma cianobactéria e três espécies de plantas, com ênfase em microalgas verdes das divisões Chlorophyta e Charophyta, e também em espécies da família Selenastraceae (Chlorophyta, Chlorophyceae, Sphaeropleales). O objetivo principal foi detectar, identificar e quantificar as oxilipinas derivadas de ácidos linoléico e linolênico produzidas por esses organismos utilizando-se de técnicas de cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas. Utilizou-se cepas de microalgas da coleção de culturas do Laboratório de Ficologia da UFSCar, espécies já classificadas através da taxonomia clássica e/ou molecular, como também espécies de plantas para fins comparativos. Para os experimentos, a biomassa algal foi proveniente do final da fase estacionária. Uma vez identificados estes compostos pelas técnicas acima, testou-se a possibilidade de se utilizar estes perfis como características diacríticas em uma abordagem quimiotaxonômica para a formação de clusters hierárquicos. Também foi discutido o potencial farmacológico destes compostos por apresentarem atividades antibióticas e anti-inflamatórias. Outras possíveis aplicações comerciais também foram abordadas uma vez que as microalgas revelaram seu potencial valor como reservas naturais de hidroxi-ácidos. Não foi observada qualquer oxilipina exclusiva para determinado organismo que pudesse servir como um indicador de espécie. Esta condição limita a utilização de oxilipinas derivadas de PUFAs C18 na taxonomia da família Selenastraceae. Porém, mesmo assim, a quantidade e proporções das oxilipinas nos diversos perfis permitem que estes compostos forneçam informações complementares sobre os organismos que podem ser uteis na sua identificação. Houve universalidade quanto à presença das oxilipinas analisadas em todos os grupos taxonômicos estudados. As cepas pertencentes à divisão Chlorophyta apresentaram as maiores concentrações totais de oxilipinas. As algas Charophyta apresentaram concentrações de oxilipinas dezenas de vezes menor que Chlorophyta e semelhantes às concentrações encontradas em plantas, fato que pode estar relacionado à proximidade evolutiva entre plantas e Charophyta. / CNPQ: 141267/2014-3 / FAPESP: 2011/50054-4

Submitted by Cássio da Cruz Nogueira (cassionogueirakk@gmail.com) on 2017-10-18T14:56:14Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Dissertacao_CaracterizacaoEpidemiologicaGenotipica.pdf: 2006227 bytes, checksum: 29730c9982b04cd3d56cbf0c52947d27 (MD5) / Approved for entry into archive by Irvana Coutinho (irvana@ufpa.br) on 2017-11-08T14:22:55Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Dissertacao_CaracterizacaoEpidemiologicaGenotipica.pdf: 2006227 bytes, checksum: 29730c9982b04cd3d56cbf0c52947d27 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-11-08T14:22:56Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Dissertacao_CaracterizacaoEpidemiologicaGenotipica.pdf: 2006227 bytes, checksum: 29730c9982b04cd3d56cbf0c52947d27 (MD5) Previous issue date: 2012 / CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / A criptococose é uma infecção fúngica causada por uma levedura encapsulada do gênero Cryptococcus que afeta tanto humanos quanto animais, sendo considerada como uma infecção oportunista normalmente associada à imunodepressão. Trata-se de uma das infecções fúngicas humanas de significativa morbidade e mortalidade tanto em indivíduos imunocomprometidos quanto em imunocompetentes, e manifesta-se principalmente sob a forma de meningoencefalite. O objetivo deste trabalho foi realizar a caracterização epidemiológica, genotípica e fenotípica da criptococose em uma unidade de referência no estado do Pará. A população alvo foi composta pelos pacientes atendidos no Hospital Universitário João de Barros Barreto/UFPA, de janeiro de 2010 a dezembro de 2011 com diagnóstico de criptococose confirmado laboratorialmente. Os dados pessoais, clínicos e laboratoriais foram coletados a partir da revisão dos prontuários do arquivo médico do HUJBB e os isolados foram identificados e caracterizados morfológica e bioquimicamente. O tipo sexuado e o genótipo foram identificados através de PCR utilizando iniciadores específicos. No período de janeiro de 2010 a dezembro de 2011 foram identificados 59 casos de criptococose. A maioria dos pacientes eram homens (36/59, 61%), com idade entre 5 a 70 anos, média de 30,8 anos. A faixa etária que predominou foi de 34 a 43 anos (39% dos casos). Os principais sinais e sintomas apresentados por eles foram cefaleia (85,5%), vômito (80%) e febre (76,4%). Todas as crianças (6/6) eram HIV negativas, tendo como agente causador o C. gattii (31,6%); já em adultos 71,1% das infecções eram causadas por C. neoformans, sendo a maioria HIV positivo. Os casos de óbito e de recidivas foram mais elevados entre os pacientes infectados por C. neoformans e a presença de sequelas foi mais frequente entre os pacientes infectados por C. gattii. Todos os isolados eram MAT α e houve a predominância de dois tipos moleculares: VNI (64,4%) e VGII (35,6%). Este estudo reforça que o estado do Pará é endêmico para a infecção por Cryptococcus spp., cuja forma de apresentação clinica principal, a meningoencefalite determina elevadas taxas de morbi-mortalidade. / Cryptococcosis is a fungal infection caused by an encapsulated yeast Cryptococcus genus that affects both humans and animals, and is considered as an opportunistic infection commonly associated with immunosuppression. This is one of human fungal infections cause significant morbidity and mortality in both immunocompetent and in immunocompromised individuals and appears mainly in the form of meningoencephalitis. The aim of this study was to characterize epidemiological, genotypic and phenotypic cryptococcosis in a reference unit in the state of Pará. The target population was composed of patients treated at the University Hospital João de Barros Barreto/UFPA, January 2010 to December 2011 with laboratory confirmed diagnosis of cryptococcosis. Personal, clinical and laboratory data were collected from a review of medical records file HUJBB and the isolates were identified and characterized morphologically and biochemically. The type sexed and genotype were identified by PCR using specific primers. From January 2010 to December 2011 were identified 59 cases of cryptococcosis. Most patients were men (36/59, 61%), aged 5-70 years, mean 30.8 years. The predominant age group was 34-43 years (39% of cases). The main signs and symptoms presented by them were headache (85.5%), vomiting (80%) and fever (76.4%). All children (6/6) were HIV negative, and as the causative agent C. gattii (31.6%), while in adults 71.1% of infections were caused by C. neoformans, most HIV positive. The cases of death and recurrence were higher among patients infected with C. neoformans and the presence of sequelae was more frequent among patients infected with C. gattii. All isolates were MAT α and there was a predominance of two molecular types: VNI (64.4%) and VGII (35.6%). This study reinforces that the state of Pará is endemic to infection by Cryptococcus spp., Whose main clinical presentation, meningoencephalitis determines high rates of morbidity and mortality.

Submitted by Gabriele Gabriel (gabriele.mgabriel@yahoo.com.br) on 2018-01-05T14:37:40Z No. of bitstreams: 1 Tese_Gabriele-Gabriel_VERSAO-FINAL.pdf: 3365844 bytes, checksum: c94734430443f3bf6c8ad3ad9fd11a8d (MD5) / Rejected by Ronildo Prado (bco.producao.intelectual@gmail.com), reason: Oi Gabriele, Faltou enviar a Carta comprovante assinada pelo orientador. Solicite o modelo em sua Secretaria de Pós-graduação, preencha e colete a assinatura com o orientador e acesse novamente o sistema para fazer o Upload. Fico no aguardo para finalizarmos o processo. Abraços Ronildo on 2018-01-18T16:17:33Z (GMT) / Submitted by Gabriele Gabriel (gabriele.mgabriel@yahoo.com.br) on 2018-01-19T17:45:54Z No. of bitstreams: 2 GABRIEL_Gabriele_2017.pdf: 4796378 bytes, checksum: b47c6fae3bd085c69ed8a81c74a9be4d (MD5) GABRIEL_Gabriele_carta.pdf: 557241 bytes, checksum: fbed02fe69c0cab6190201e18b304f40 (MD5) / Approved for entry into archive by Ronildo Prado (bco.producao.intelectual@gmail.com) on 2018-01-22T18:44:07Z (GMT) No. of bitstreams: 2 GABRIEL_Gabriele_2017.pdf: 4796378 bytes, checksum: b47c6fae3bd085c69ed8a81c74a9be4d (MD5) GABRIEL_Gabriele_carta.pdf: 557241 bytes, checksum: fbed02fe69c0cab6190201e18b304f40 (MD5) / Approved for entry into archive by Ronildo Prado (bco.producao.intelectual@gmail.com) on 2018-01-22T18:44:18Z (GMT) No. of bitstreams: 2 GABRIEL_Gabriele_2017.pdf: 4796378 bytes, checksum: b47c6fae3bd085c69ed8a81c74a9be4d (MD5) GABRIEL_Gabriele_carta.pdf: 557241 bytes, checksum: fbed02fe69c0cab6190201e18b304f40 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-01-22T18:51:21Z (GMT). No. of bitstreams: 2 GABRIEL_Gabriele_2017.pdf: 4796378 bytes, checksum: b47c6fae3bd085c69ed8a81c74a9be4d (MD5) GABRIEL_Gabriele_carta.pdf: 557241 bytes, checksum: fbed02fe69c0cab6190201e18b304f40 (MD5) Previous issue date: 2017-12-01 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Bioluminescence, the emission of visible light by living organisms is widely used in biosensors. Firefly luciferases and genes are among the most used reporter gene in bioluminescent biosensors. Firefly luciferases are pH-sensitive, exhibiting a red shifted bioluminescence spectra on the presence of metals, high temperatures and acidic pH, being this last property considered unusual for the most analytical applications. Nowadays most luminescent biosensors to metals and pH are fluorescent, and few of them are ratiometric based on spectral changes. Bioluminescent biosensors despite been less common, have same advantages as low background and does not need UV light irradiation, bring no photodamage to the cell. The aim of this project was: (I) study the applicability of the use of Macrolampis sp2 firefly luciferase and other pH-sensitive luciferases as spectral intracellular ratiometric pH biosensor; (II) apply these pH ratiometric biosensors in mammalian cells to investigate its physiology in real time and (III) developing, by engineering the pH sensor region of Macrolampis sp2 firefly luciferase, a ratiometric biosensor specific to metals. We obtained a relation between the pH and the ratio of the bioluminescence at green and red region of the spectra, allowing estimate ratiometrically the intracellular pH of bacteria and mammalian cells. Besides that, we confirmed its use to cellular image of pH and observed that occurs an alkalinization of the cytosol and nucleus during cell division and apoptosis. We demonstrate the applicability of firefly luciferases, in special the luciferase of Macrolampis sp2, as a ratiometric biosensor to metals and intracellular pH. The existence of a linear relationship between the concentrations of metals like cadmium, mercury and zinc, and the ratio of the bioluminescence at green and red region of the spectra, allowed also estimate ratiometrically, for the first time, concentrations of metals less than 100 µM, enabling the use of firefly luciferases as bioavailability indicator to toxic and potential toxic metals. / Bioluminescência, a emissão de luz fria e visível por organismos vivos é amplamente utilizada em biossensores. Luciferases de vagalumes e seus genes estão entre os genes repórteres mais utilizados em biossensores bioluminescentes. Luciferases de vagalumes são sensíveis ao pH, apresentando um deslocamento do espectro de bioluminescência para o vermelho na presença de metais, em temperaturas elevadas e pH ácido, sendo esta última propriedade considerada sem utilidade para a maioria das aplicações analíticas. Atualmente a maioria dos biossensores luminescentes para metais e pH são fluorescentes, poucos deles são raciométricos baseados nas mudanças espectrais. Biossensores bioluminescentes apesar de serem menos comuns, possuem algumas vantagens como baixo background e não necessitam de irradiação com luz UV, não causando fotodanos às células. Os objetivos desse projeto foram: (I) investigar a aplicabilidade de uso da luciferase do vagalume Macrolampis sp2 e outras luciferases pH-sensitivas como biossensor espectral raciométrico intracelular de pH; (II) aplicar esses biossensores raciométricos de pH em células de mamíferos para investigar sua fisiologia em tempo real e (III) desenvolver, por engenharia da região sensora de pH da luciferase de Macrolampis sp2, um biossensor raciométrico específico para metais. Obtivemos uma relação entre o pH e a razão da bioluminescência nas regiões do verde e do vermelho do espectro, permitindo estimar raciometricamente o pH intracelular de bactérias e células de mamíferos. Além disso, confirmamos seu uso para imagem celular de pH, e observamos que ocorre uma alcalinização do citosol e núcleo durante os processos de divisão celular e apoptose. Demonstramos a aplicabilidade das luciferases de vagalumes, em especial a luciferase de Macrolampis sp2, como biossensor raciométrico para metais e pH intracelular. A existência de uma relação linear entre a concentração de metais como cádmio, mercúrio e zinco, e a razão da bioluminescência nas regiões do verde e do vermelho do espectro, permitiu também estimar raciometricamente pela primeira vez concentrações de metais menores que 100 µM, possibilitando o uso de luciferase de vagalumes como indicador de biodisponibilidade de metais tóxicos e potencialmente tóxicos. / FAPESP: 2014/04477-9 / FAPESP: 2015/22603-4 / FAPESP: 2016/15946-5

CoordenaÃÃo de AperfeÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / Os estresses salino e osmÃtico sÃo responsÃveis por perdas significativas na produÃÃo agrÃcola, particularmente nas regiÃes semiÃridas. Nessas condiÃÃes, a raiz à o ÃrgÃo da planta que sofre os primeiros efeitos e à responsÃvel pela percepÃÃo e sinalizaÃÃo bioquÃmica dos estresses. Em folhas, as peroxidases do ascorbato do citosol sÃo as principais isoformas envolvidas com a proteÃÃo antioxidativa contra o excesso de H2O2 e sÃo tambÃm relacionadas na sinalizaÃÃo em condiÃÃes de estresses. Entretanto, esses mecanismos de aÃÃo em raÃzes sÃo pouco conhecidos. O objetivo deste estudo foi testar a hipÃtese de que as APXs citosÃlicas sÃo essenciais para a proteÃÃo antioxidativa de raÃzes de arroz expostas Ãs condiÃÃes de estresse salino e osmÃtico. Para isso, plantas transgÃnicas silenciadas nas duas isoformas de APXs citosÃlicas (APX1/2) e plantas nÃo transformadas (45 dias de idade) foram expostas a duas condiÃÃes de estresse: (1) NaCl e manitol em concentraÃÃes iso-osmÃticas (-0,62 MPa) durante oito dias e (2) manitol 268 mM (-0,62 MPa) por dois dias. Em plantas silenciadas, a quantidade de transcritos (RNAs) de OsAPX1 e OsAPX2 foi reduzida em 90% enquanto que a abundÃncia das duas proteÃnas mensurada por western blotting nÃo foi detectÃvel. A atividade total de APX foi diminuÃda em 66% em comparaÃÃo com as NTs na condiÃÃo controle, evidenciando que o silenciamento foi efetivo nas raÃzes. Como consequÃncia da deficiÃncia das APX1/2, o nÃvel de H2O2 foi aumentado em 51% comparado com as NTs. Ambos os estresses afetaram de modo similar o crescimento da raiz e parte aÃrea das APX1/2, em comparaÃÃo com as plantas nÃo transformadas (NT). Os valores de danos de membrana nas raÃzes foram aumentados na mesma intensidade nos dois genÃtipos e nos dois tipos de estresses, indicando que as APX1/2 apresentaram mesma sensibilidade aos estresses estudados. Nas plantas NT, as quantidades de transcritos de OsAPX1 e OsAPX2 foram aumentadas discretamente por NaCl e manitol enquanto que a atividade de APX foi aumentada somente pelo NaCl. As plantas APX1/2 mostraram a mesma tendÃncia das NTs quanto a expressÃo e atividade de APX. O aumento na quantidade relativa dos transcritos das outras isoformas de APX, principalmente de OsAPX3, OsAPX5 e OsAPX8, em ambos os genÃtipos sob estresse salino, foi correlacionado com o aumento da atividade da APX. AlÃm disso, outras peroxidases (GPX e GPOD) apresentaram a mesma tendÃncia de aumento de atividade apenas sob estresse salino. Diferentemente, manitol induziu um aumento proeminente na atividade de catalase nas plantas NT enquanto que nas APX1/2 essa enzima jà apresentava atividade aumentada antes do estresse e permaneceu no mesmo nÃvel. As concentraÃÃes de H2O2 foram aumentadas intensamente por manitol e reduzidas na presenÃa de NaCl. O nÃvel de TBARS (indicador de peroxidaÃÃo lipÃdica) foi mantido inalterado na presenÃa dos dois estresses e nos dois tipos de plantas. Os resultados deste estudo, quando analisados em conjunto, mostram que raÃzes de arroz expostas aos estresses salino e osmÃtico exibiram respostas complexas em termos de metabolismo redox. Aparentemente, as duas APXs citosÃlicas nÃo sÃo essenciais para a proteÃÃo antioxidativa, uma vez que as plantas mutantes apresentaram uma performance fisiolÃgica semelhante as plantas NT. As respostas aos dois fatores de estresse, NaCl e manitol, foram contrastantes nos dois genÃtipos, sugerindo que diferentes mecanismos de proteÃÃo antioxidante foram acionados para cada tipo de estresse. / Os estresses salino e osmÃtico sÃo responsÃveis por perdas significativas na produÃÃo agrÃcola, particularmente nas regiÃes semiÃridas. Nessas condiÃÃes, a raiz à o ÃrgÃo da planta que sofre os primeiros efeitos e à responsÃvel pela percepÃÃo e sinalizaÃÃo bioquÃmica dos estresses. Em folhas, as peroxidases do ascorbato do citosol sÃo as principais isoformas envolvidas com a proteÃÃo antioxidativa contra o excesso de H2O2 e sÃo tambÃm relacionadas na sinalizaÃÃo em condiÃÃes de estresses. Entretanto, esses mecanismos de aÃÃo em raÃzes sÃo pouco conhecidos. O objetivo deste estudo foi testar a hipÃtese de que as APXs citosÃlicas sÃo essenciais para a proteÃÃo antioxidativa de raÃzes de arroz expostas Ãs condiÃÃes de estresse salino e osmÃtico. Para isso, plantas transgÃnicas silenciadas nas duas isoformas de APXs citosÃlicas (APX1/2) e plantas nÃo transformadas (45 dias de idade) foram expostas a duas condiÃÃes de estresse: (1) NaCl e manitol em concentraÃÃes iso-osmÃticas (-0,62 MPa) durante oito dias e (2) manitol 268 mM (-0,62 MPa) por dois dias. Em plantas silenciadas, a quantidade de transcritos (RNAs) de OsAPX1 e OsAPX2 foi reduzida em 90% enquanto que a abundÃncia das duas proteÃnas mensurada por western blotting nÃo foi detectÃvel. A atividade total de APX foi diminuÃda em 66% em comparaÃÃo com as NTs na condiÃÃo controle, evidenciando que o silenciamento foi efetivo nas raÃzes. Como consequÃncia da deficiÃncia das APX1/2, o nÃvel de H2O2 foi aumentado em 51% comparado com as NTs. Ambos os estresses afetaram de modo similar o crescimento da raiz e parte aÃrea das APX1/2, em comparaÃÃo com as plantas nÃo transformadas (NT). Os valores de danos de membrana nas raÃzes foram aumentados na mesma intensidade nos dois genÃtipos e nos dois tipos de estresses, indicando que as APX1/2 apresentaram mesma sensibilidade aos estresses estudados. Nas plantas NT, as quantidades de transcritos de OsAPX1 e OsAPX2 foram aumentadas discretamente por NaCl e manitol enquanto que a atividade de APX foi aumentada somente pelo NaCl. As plantas APX1/2 mostraram a mesma tendÃncia das NTs quanto a expressÃo e atividade de APX. O aumento na quantidade relativa dos transcritos das outras isoformas de APX, principalmente de OsAPX3, OsAPX5 e OsAPX8, em ambos os genÃtipos sob estresse salino, foi correlacionado com o aumento da atividade da APX. AlÃm disso, outras peroxidases (GPX e GPOD) apresentaram a mesma tendÃncia de aumento de atividade apenas sob estresse salino. Diferentemente, manitol induziu um aumento proeminente na atividade de catalase nas plantas NT enquanto que nas APX1/2 essa enzima jà apresentava atividade aumentada antes do estresse e permaneceu no mesmo nÃvel. As concentraÃÃes de H2O2 foram aumentadas intensamente por manitol e reduzidas na presenÃa de NaCl. O nÃvel de TBARS (indicador de peroxidaÃÃo lipÃdica) foi mantido inalterado na presenÃa dos dois estresses e nos dois tipos de plantas. Os resultados deste estudo, quando analisados em conjunto, mostram que raÃzes de arroz expostas aos estresses salino e osmÃtico exibiram respostas complexas em termos de metabolismo redox. Aparentemente, as duas APXs citosÃlicas nÃo sÃo essenciais para a proteÃÃo antioxidativa, uma vez que as plantas mutantes apresentaram uma performance fisiolÃgica semelhante as plantas NT. As respostas aos dois fatores de estresse, NaCl e manitol, foram contrastantes nos dois genÃtipos, sugerindo que diferentes mecanismos de proteÃÃo antioxidante foram acionados para cada tipo de estresse. / Salt and osmotic stresses are responsible for significant losses in agriculture, particularly in semiarid regions. In such conditions, roots are the first plant organ in contact with the stress and are responsible for perception and signaling. In leaves, cytosolic ascorbate peroxidases (APX) are the main isoforms involved with antioxidative defence against H2O2 excess and signaling under stressful conditions. Nevertheless, such metabolic mechanisms in roots are still unknown. The aim of this study was to test the hypothesis that cytosolic APX isoforms are essential to antioxidant protection in rice roots exposed to salt and osmotic stresses. To test this hypothesis, rice mutants double silenced for cytosolic APXs (APX1/2) and non-transformed plants, both with 45 day-old, were submitted to two stressful treatments: (1) NaCl and mannitol in iso-osmotic concentrations (-0.62MPa) for eight days and (2) mannitol 268 mM (-0.62MPa) for two days. In mutant plants, OsAPX1 and OsAPX2 transcript amounts (RNAs) were reduced by 90% whereas both protein abundance measured by Western blotting were not detectable. Under control conditions, total APX activity was reduced by 66% in comparison with NT plants, showing that the silencing was effective in roots. In APX1/2 roots, H2O2 level was increased by 51% as a consequence of APX1/2 silencing. Both stresses affected similarly root and shoot growing compared with NT. Membrane damage was increased at the same level in both genotypes and in both stresses, showing that APX1/2 were as sensible as NT plants. In NT roots, OsAPX1 and OsAPX2 transcript amounts was slightly increased by NaCl and mannitol whereas only NaCl increased APX activity. Under salt stress, both genotypes increased other APX isoforms, especially OsAPX3, OsAPX5 and OsAPX8. These increases were correlated with the increased APX activity. In addition, other peroxidases (GPX and GPOD) displayed the same trend as APX, increasing their activity in response to NaCl. On the other hand, mannitol induced a prominent increase in catalase activity in NT plants, while in APX1/2 plants CAT activity did not changed. The H2O2 content was increased in both genotypes exposed to mannitol treatments, and was reduced for NaCl. TBARS level was not altered in the presence of both stresses for both genotypes. This study shows that rice plants exposed to salt or osmotic stresses display complex responses regarding to redox metabolism. Apparently, both cytosolic APXs are not essential to antioxidative protection, since mutant plants presented similar physiological performance to NT plants. The responses to both stresses, NaCl and mannitol, were contrasting for both genotypes, suggesting that different mechanisms of antioxidative protection were triggered for each different stress condition. / Salt and osmotic stresses are responsible for significant losses in agriculture, particularly in semiarid regions. In such conditions, roots are the first plant organ in contact with the stress and are responsible for perception and signaling. In leaves, cytosolic ascorbate peroxidases (APX) are the main isoforms involved with antioxidative defence against H2O2 excess and signaling under stressful conditions. Nevertheless, such metabolic mechanisms in roots are still unknown. The aim of this study was to test the hypothesis that cytosolic APX isoforms are essential to antioxidant protection in rice roots exposed to salt and osmotic stresses. To test this hypothesis, rice mutants double silenced for cytosolic APXs (APX1/2) and non-transformed plants, both with 45 day-old, were submitted to two stressful treatments: (1) NaCl and mannitol in iso-osmotic concentrations (-0.62MPa) for eight days and (2) mannitol 268 mM (-0.62MPa) for two days. In mutant plants, OsAPX1 and OsAPX2 transcript amounts (RNAs) were reduced by 90% whereas both protein abundance measured by Western blotting were not detectable. Under control conditions, total APX activity was reduced by 66% in comparison with NT plants, showing that the silencing was effective in roots. In APX1/2 roots, H2O2 level was increased by 51% as a consequence of APX1/2 silencing. Both stresses affected similarly root and shoot growing compared with NT. Membrane damage was increased at the same level in both genotypes and in both stresses, showing that APX1/2 were as sensible as NT plants. In NT roots, OsAPX1 and OsAPX2 transcript amounts was slightly increased by NaCl and mannitol whereas only NaCl increased APX activity. Under salt stress, both genotypes increased other APX isoforms, especially OsAPX3, OsAPX5 and OsAPX8. These increases were correlated with the increased APX activity. In addition, other peroxidases (GPX and GPOD) displayed the same trend as APX, increasing their activity in response to NaCl. On the other hand, mannitol induced a prominent increase in catalase activity in NT plants, while in APX1/2 plants CAT activity did not changed. The H2O2 content was increased in both genotypes exposed to mannitol treatments, and was reduced for NaCl. TBARS level was not altered in the presence of both stresses for both genotypes. This study shows that rice plants exposed to salt or osmotic stresses display complex responses regarding to redox metabolism. Apparently, both cytosolic APXs are not essential to antioxidative protection, since mutant plants presented similar physiological performance to NT plants. The responses to both stresses, NaCl and mannitol, were contrasting for both genotypes, suggesting that different mechanisms of antioxidative protection were triggered for each different stress condition.

Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de Minas Gerais / A Esporotricose é uma infecção subaguda ou crônica causada pelo fungo Sporothrix schenckii. A transmissão zoonótica pode ocorrer depois de arranhões ou mordidas de animais, principalmente gatos, roedores e tatus. Até o momento, nenhuma vacina esta em uso para esporotricose ou para qualquer infecção fúngica de importância médica, indicando a necessidade de ampliar a investigação neste campo e explorar novas alternativas. O objetivo deste estudo foi avaliar os efeitos da radiação gama em leveduras de S. schenckii, visando a sua atenuação, para aplicação posterior de leveduras radioatenuadas no desenvolvimento de uma vacina destinada a imunização de gatos e cães. As leveduras S. schenckii foram cultivadas em meio sólido BHI (Infuso Cérebro e Coração) suplementados com tiamina e na temperatura de 36oC. As culturas foram irradiadas com doses variando de 1,0 a 9,0 kGy. Após cada dose foram avaliados a capacidade reprodutiva, a viabilidade, e o metabolismo de síntese de proteínas. A avaliação da virulência foi realizada pela inoculação das leveduras irradiadas em camundongos Balb/c imunossuprimidos e posterior recuperação de unidades formadoras de colônias (UFCs). A integridade do DNA, a ocorrência de apoptose e de alterações ultraestruturais também foram analisada nas leveduras radioatenuadas. Os resultados mostraram uma redução de 6 ciclos log10 no número de UFCs recuperadas na dose de 6,0 kGy e a partir de 8,0 kGy não foram recuperadas UFCs. A análise de viabilidade indicou que as leveduras permaneceram viáveis até a dose de 9,0 kGy, a maior dose testada. As leveduras irradiadas mantiveram a capacidade de síntese de proteínas, porém esta foi reduzida significarivamente na dose de 9,0 kGy, quando avaliada 24 horas após a irradiação. Os ensaios de virulência utilizando leveduras irradiadas com as doses de 7,0 e 9,0 kGy mostraram que não houve recuperação de UFCs dos órgãos dos camundongos imunossuprimidos, indicando que as células estavam atenuadas. O ensaio de integridade do DNA mostrou que com 7,0 kGy o DNA das leveduras estava fragmentado. Nesta mesma dose foi verificada uma diferença discreta, mas significativa, na ocorrência de apoptose entre as células irradiadas e controles 24 horas após a irradiação. Através da microscopia eletrônica de transmissão foram verificadas alterações ultra-estruturais nas leveduras irradiadas com 7,0 kGy. Duas horas após a irradiação as principais alterações verificadas foram a vacuolização e a perda de homogeneidade do citoplasma. Após 24 horas, além destas alterações o citoplasma se mostrou retraído e freqüentemente se descolando da parede celular. Nossos resultados indicaram que para as leveduras do S. schenckii, foi possível encontrar uma dose absorvida em que o agente tem comprometida sua capacidade reprodutiva e perde a virulência, mantendo a sua viabilidade, uma condição desejável para o desenvolvimento de uma vacina radioatenuada. / Sporotrichosis is a subacute or chronic infection caused by the fungus Sporothrix schenckii. Zoonotic transmission can occur after scratches or bites of animals, mainly cats, rodents, and armadillos. Up to the moment, no approved vaccine was reported for S. schenckii or to any important pathogenic fungi infection in humans, indicating the need to expand the research in this field and to explore new alternatives. The aim of this study was to evaluate the effects of gamma radiation on the viability, metabolic activity and reproductive ability of S. schenckii yeast cells for further studies on the development of a vaccine for immunization of cats and dogs. The culture of S. schenckii, in solid medium, was irradiated at doses ranging from 1.0 to 9.0 kGy. After each dose the reproductive capacity, viability and protein synthesis were estimated. The results showed that a reduction of 6 log10 cycles in the number of colonies was achieved at 6.0 kGy and after 8.0 kGy no colonies could be recovered. The viability analysis indicated that yeast cells remained viable up to 9.0 kGy. The results of protein synthesis analysis showed that the yeast cells, irradiated up to 9.0 kGy, were able to synthesize proteins. But this ability was significantly reduced with 9.0 kGy, 24 h after irradiation. The virulence assays using yeast irradiated with doses of 7.0 and 9.0 kGy showed no CFUs recovery from tissues of immunosuppressed mice, indicating that the cells were attenuated. The DNA integrity test showed that the DNA of 7.0 kGy irradiated yeast cells was fragmented. At the same dose was verified a discrete but significant increase in the apoptose occurrence in relation to controls 24 hours after the irradiation. By transmission electron microscopy were observed ultrastructural changes in yeast irradiated with 7.0 kGy. Two hours after irradiation the major changes were the vacuolization and the loss of homogeneity of the cytoplasm. After 24 hours, apart from these changes, the cytoplasm was often retracted and sometimes taking off from the cell wall. Our results indicated that for the yeast cells of S. schenckii, it was possible to find an absorbed dose in which the fungus loses the virulence, while maintaining the viability, a desirable condition for the development of a radioattenuated yeast vaccine.

Submitted by Marcos Anselmo (marcos.anselmo@unipampa.edu.br) on 2017-06-12T18:00:24Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) CARLOS BORGES FILHO.pdf: 1634053 bytes, checksum: f644f69e5e2309834c31b95712982bd3 (MD5) / Approved for entry into archive by Marcos Anselmo (marcos.anselmo@unipampa.edu.br) on 2017-06-12T18:00:55Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) CARLOS BORGES FILHO.pdf: 1634053 bytes, checksum: f644f69e5e2309834c31b95712982bd3 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-06-12T18:00:55Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) CARLOS BORGES FILHO.pdf: 1634053 bytes, checksum: f644f69e5e2309834c31b95712982bd3 (MD5) Previous issue date: 2016-12-30 / A depressao e uma doenca altamente incapacitante e que tem acometido um percentual crescente da populacao mundial. Ainda que varios antidepressivos estejam comercialmente disponiveis ha decadas, os efeitos colaterais destas drogas, aliados ao fato de que nem todos os pacientes respondem satisfatoriamente ao tratamento, levam a uma busca continua por novas alternativas para o tratamento ou complementacao do tratamento da depressao. Assim, expande-se cada vez mais o numero de estudos que avaliam compostos candidatos a antidepressivos. Neste contexto e que o efeito tipo-antidepressivo da crisina, um flavonoide natural abundante no maracuja do mato (Passiflora coerulea), em camundongos submetidos ao estresse cronico imprevisivel (UCS) foi demonstrado anteriormente por nosso grupo. No entanto, os fatores neuroquimicos associados a este efeito carecem de maiores investigacoes. Deste modo, o objetivo deste estudo foi avaliar os fatores neuroquimicos associados ao efeito tipo-antidepressivo do flavonoide crisina em dois modelos animais de depressao, o modelo do UCS e o modelo da bulbectomia olfatoria (OB), ambos em camundongos. No modelo do UCS foram avaliados o cortex pre-frontal (PFC) e o hipocampo (HP), enquanto no modelo da OB foi avaliado o HP. O UCS e a OB induziram um comportamento tipo-depressivo, caracterizado pela diminuicao no tempo de lambida no teste de borrifagem de sacarose e pelo aumento no tempo de imobilidade no teste de suspensao de cauda ou no teste de nado forcado. Ainda, a OB ocasionou alteracoes no teste de campo aberto, decorrentes da hiperatividade caracteristicamente induzida por este modelo. O tratamento oral com crisina (5 ou 20 mg/kg, durante 28 dias no modelo do UCS, e por 14 dias no modelo da OB), de forma semelhante a fluoxetina (10 mg/kg, controle positivo), culminou na prevencao destas alteracoes, confirmando a acao tipo-antidepressiva da crisina nos parametros comportamentais avaliados. O UCS ocasionou o aumento nos niveis plasmaticos do hormonio liberador de corticotrofina, do hormonio adrenocorticotrofico, e a atividade das caspases 3 e 9 nas estruturas cerebrais avaliadas, enquanto a OB ocasionou a reducao dos niveis hipocampais do fator neurotrofico derivado do encefalo. O UCS e a OB resultaram no aumento dos niveis de citocinas proinflamatorias nas estruturas cerebrais avaliadas, como fator de necrose tumoral-α, interferon- γ, interleucina-1β, interleucina-6, alem do aumento dos niveis de quinurenina. O UCS e a OB tambem induziram a diminuicao dos niveis de 5-hidroxitriptamina (5-HT) e o aumento da 11 atividade da enzima indoleamina-2,3-dioxigenase. O tratamento com crisina, de forma semelhante a fluoxetina, promoveu a atenuacao de todas estas alteracoes ocasionadas pelo UCS ou pela OB. Em suma, os resultados deste estudo vem a corroborar com a hipotese de que o flavonoide crisina e um alvo potencial no estudo de novas alternativas para o tratamento ou para a complementacao do tratamento da depressao. Adicionalmente, este trabalho indica a associacao das citocinas pro-inflamatorias, da via da quinurenina, do metabolismo da 5-HT, das neurotrofinas e da atividade das caspases na acao tipo-antidepressiva exercida pela crisina em camundongos expostos ao UCS ou a OB. Finalmente, o presente trabalho expoe o maracuja do mato como um importante alvo para o estudo dos produtos naturais no combate a depressao, mostrando a fundamentalidade da investigacao da funcionalidade e constituicao bioativa desta e outras plantas do bioma pampa. / Depression is a highly incapacitating disease that has affected a crescent percentage of the world population. Although various antidepressants have been commercially available for decades, the side effects of these drugs, together with the fact that not all patients respond satisfactorily to treatment, lead to continuous search for new alternatives for the treatment or supplementary treatment of depression. Thus, the number of studies evaluating compounds candidate to antidepressants expands increasingly. In this context, the antidepressant-like effect of chrysin, a natural flavonoid abundant in passion fruit bush (Passiflora coerulea), in mice subjected to unpredictable chronic stress (UCS) has been previously demonstrated by our group. However, neurochemical factors associated with this effect require further investigations. Thus, the objective of this study was to evaluate the neurochemical factors associated with the antidepressant-like effect of chrysin in two animal models of depression, the model of UCS and the model of olfactory bulbectomy (OB), both in mice. In the UCS model the prefrontal cortex (PFC) and the hippocampus (HP) were evaluated, in the OB model the HP was evaluated. The UCS and OB induced a depressive-like behavior, characterized by the decrease in the total time of grooming in the splash test and by increase on immobility time in the tail suspension test or forced swimming test. Still, OB induced changes in open field test, resulting from the hyperactivity characteristically induced by this model. The oral treatment with chrysin (5 or 20 mg/kg for 28 days in the UCS model and for 14 days in OB model), similarly to fluoxetine (10 mg/kg, positive control) resulted in the prevention of these changes, confirming the antidepressant-like action of chrysin in the behavioral parameters evaluated. The UCS led to an increase in plasma levels of corticotropin-releasing hormone, adrenocorticotropic hormone and activity of caspases 3 and 9 in the brain structures evaluated, while the OB caused a reduction of hippocampal levels of brain-derived neurotrophic factor. The UCS and OB resulted in increase of proinflammatory cytokines levels in the brain structures evaluated, such as tumor necrosis factor-α, interferon- γ, interleukin-1β, interleukin-6, and increase kynurenine levels. UCS and OB also induced the decrease in 5-hydroxytryptamine (5-HT) levels and the increase of the activity of indoleamine-2,3-dioxygenase enzyme. Treatment with chrysin, similarly to fluoxetine, 13 promoted the attenuation of all these changes caused by UCS or OB. In summary, results of this study come to corroborate the hyphotesis that the flavonoid chrysin is a potential target in the study of new alternatives for the treatment or complement treatment of depression. Additionally, this study indicates the association of pro-inflammatory cytokines, of kynurenine pathway, of 5-HT metabolism, of neurotrophins and of caspases activities in the antidepressant-like action exerted by chrysin in mice exposed to UCS or OB. Finally, this paper exposes the passion bush as an important target for the study of natural products to combat depression, showing the importance of research of functionality and bioactive constitution of this and other plants of the pampa biome.

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No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) ANDRÉIA CAROLINE FERNANDES SALGUEIRO.pdf: 5179931 bytes, checksum: b1e888ee98755fdef5badebb2b78a8a0 (MD5) Previous issue date: 2017-02-27 / Muitas plantas são utilizadas na medicina tradicional para o tratamento do Diabetes mellitus (DM) e suas complicações. A hiperglicemia crônica no DM está intimamente associada ao aumento do estresse oxidativo. Assim, esta pesquisa teve como objetivos: i) investigar quais plantas são utilizadas na medicina tradicional por pessoas com DM na cidade de Uruguaiana/RS; ii) avaliar o potencial antidiabético, antioxidante e toxicológico de duas destas plantas in silico, in vitro e in vivo. Para isso, foi realizada uma entrevista com 105 pessoas com DM em Uruguaiana/RS, no intuito de investigar os hábitos de consumo de plantas medicinais (Manuscrito 1). Dos entrevistados, 67,6% afirmaram usar plantas medicinais. As quatro plantas mais utilizadas foram a pata-de-vaca (Bauhinia), jambolão (Syzygium jambolanum; Syzygium cumini), camomila (Matricaria recutita) e macela (Achyrocline satureioides). A infusão foi a forma de preparo mais utilizada e a frequência de consumo, em mais de 80% dos casos, foi diária. Predições in silico dos constituintes majoritários das plantas mais utilizadas mostraram a existência de provável atividade (Pa) antidiabética para alguns dos compostos analisados (Manuscrito 1). Na sequência, o potencial antidiabético, antioxidante e tóxico da Bauhinia forficata Link subsp. pruinosa (BF) foi testado in silico, in vitro e in vivo, neste último caso utilizando camundongos com hiperglicemia crônica (Manuscrito 2). Os resultados mostram que os fitoconstituintes previamente identificados na infusão de BF (quercetin 3-o-(2-rhamnosyl)rutinoside; kampferol 3-o-(2-rhamnosyl)rutinoside; quercetin-3-O-rutinoside; e kaempferol-3-O-rutinoside) apresentam alta predição in silico como antioxidantes e baixa predição como antidiabéticos e como agentes tóxicos (mutagenicidade, cardiotoxicidade e hepatotoxicidade). A predição antioxidante foi confirmada in vitro e ex vivo, sendo a BF capaz de reduzir a peroxidação lipídica e controlar os níveis de espécies reativas à diclorofluoresceína (DCF-RS) em eritrócitos de camundongos com hiperglicemia crônica. Da mesma forma, a baixa predição antidiabética foi ratificada, visto que tanto a hiperglicemia, quanto os demais sintomas clássicos do DM (poliúria, polidpsia, polifagia e perda de peso) não foram controlados pelo tratamento com a BF (Manuscrito 2). Além disso, a ação da BF sobre os danos hepáticos induzidos pela hiperglicemia foi avaliada em camundongos com DM (Artigo 1). Os resultados mostraram que os animais com DM apresentavam altos níveis de NQO-1 no pâncreas, e de DCF-RS e lipoperoxidação no fígado, assim como diminuição da atividade da catalase hepática. O tratamento com a BF foi capaz de normalizar estes parâmetros, porém não teve efeitos sobre a hiperglicemia, a hepatomegalia, as proteínas carboniladas, os tiois não-proteicos e a atividade da - aminolevulinato desidratase (Artigo 1). Adicionalmente, o potencial antidiabético, antioxidante e tóxico da Achyrocline satureioides (AS) foi testado (Artigo 2). A toxicidade foi predita in silico e avaliada in vitro no ensaio de cometa com linfócitos humanos isolados, e no ensaio de determinação da dose letal mediana (DL50) em naúplios de Artêmia salina. Os resultados mostraram que os componentes majoritários identificados na infusão de AS (quercetina, isoquercitrina e ácido cafeíco) apresentam alta predição como antioxidantes e baixa predição de toxicidade, exceto para a quercetina. A ação antioxidante foi confirmada tanto para o extrato aquoso bruto (infusão), quanto para os constituintes isolados. A DL50 determinada classifica a planta como não tóxica. No ensaio de cometa não foi identificado potencial genotóxico para a infusão de AS (Artigo 2). Os dados apresentados confirmam o elevado uso de plantas por pessoas com DM na medicina tradicional. Da mesma forma, as análises realizadas apontam o estresse oxidativo como sendo um dos mecanismos envolvidos nos danos teciduais decorrentes do DM. As análises mostram ainda que os efeitos protetores resultantes do tratamento com a BF podem ser atribuídos à sua capacidade antioxidante, demonstrada in vitro e ex vivo, visto que não foi identificado potencial antidiabético in silico e in vivo. Nesta mesma linha, o alto potencial antioxidante e baixa predição toxicológica apontam a AS como uma alternativa para o tratamento dos danos causados pelo estresse oxidativo. Em suma, os resultados aqui apresentados permitem concluir que a planta BF, utilizada na medicina tradicional para tratar DM e suas complicações, não apresenta efeito antidiabético direto na forma como foi aqui testada. No entanto, sua importante atividade antioxidante faz, tanto da BF quanto da AS, potenciais agentes para o tratamento complementar do DM, especialmente considerando as complicações diabéticas decorrentes do incremento do estresse oxidativo. Neste contexto, abrem-se perspectivas para investigações futuras do uso dessas plantas como terapia complementar ao tratamento clínico tradicional. / Medicinal plants are extensively used in traditional medicine to treat Diabetes mellitus (DM) and its complications. Chronic hyperglycemia in DM is pointed as responsible for oxidative stress development. The aims of this study were: i) to evaluate which plants are used in traditional medicine by people with DM in Uruguaiana/RS; ii) to evaluate the antidiabetic, antioxidant and toxicological potential for two of these plants in silico, in vitro e in vivo. For this, a research with 105 DM patients from Uruguaiana/RS was conducted to investigate their medicinal plants consumption habits (Manuscript 1). From the interviewed people, 67.6% say they do use medicinal plants. The four more used plants were “cow paw” (Bauhinia), jambolan (Syzygium jambolanum; Syzygium cumini), chamomile (Matricaria recutita), and macela (Achyrocline satureioides). The most used form of consumption was the infusion; in more than 80% of the cases, the consumption frequency was daily. Predictions in silico for the major phytoconstituents of the most used plants showed that some compounds presented probable antidiabetic activity (Manuscript 1). In sequence, the antidiabetic, antioxidant and toxicological potential of Bauhinia forficata Link subsp. pruinosa (BF) was tested in silico, in vitro and in vivo, in the last case using mice with chronic hyperglycemia (Manuscript 2). Results show that the phytoconstituents previously identified in the BF infusion (quercetin3-o-(2-rhammosyl)rutinoside; kampferol 3-o-(2-rhammnosyl)rutinoside; quercentin-3-O-rutinoside; and kaempferol-3-o-rutinoside) show high prediction in silico as antioxidants and low prediction as antidiabetic agents and toxic agents (mutagenicity, cardiotoxicity and hepatotoxicity). The antioxidant prediction was confirmed in vivo and ex vivo. BF was able to reduce lipid peroxidation and to control the reactive dichlorofluroscein species (DCF-RS) levels in erythrocytes from hyperglycemic mice. In the same way, the low antidiabetic prediction was ratified, since both hyperglycemia and other classic DM symptoms (polyuria, polydipsia, polyphagia, and weight loss) were not controlled by BF treatment (Manuscript 2). Besides, the BF action in the hepatic damages induced by hyperglycemia was evaluated in mice with DM (Article 1). Diabetic mice showed high levels of NQO-1 in pancreas, and of DCF-RS and lipid peroxidation in the liver, as well as decrease in the activity of hepatic catalase. BF treatment was able of normalizing these parameters. However, it did not have any effects over hyperglycemia, hepatomegaly, carbonylated proteins, non-protein thiols, and the - aminolevulinate dehydratase activity (Article 1). Additionally, the antidiabetic, antioxidant, and toxicological potential of Achyrocline satureioides (AS) was tested (Article 2). The toxicity was predicted in silico and, after, evaluated in vitro with the comet assay using human lymphocytes. The median lethal dose (LD50) was evaluated in nauplii of Artemia salina. Results showed that the AS major compounds (quercetin, isoquercitrin, and caffeic acid) presents high prediction as antioxidants and low toxicity prediction, except for quercetin. The antioxidant activity was confirmed both in crude aqueous extract (infusion) and in isolated compounds. The determined LD50 classifies the plant as non-toxic. The comet assay showed no genotoxic potential for AS infusion (Article 2). Our data confirm the extensive use of plants by people with DM. In the same way, our analysis point oxidative stress as one of the mechanisms involved in tissue damages resulting of DM. The analysis also showed that the protective effects resulting of the BF treatment could be assigned to its antioxidant capacity, demonstrated in vitro and ex vivo, since no antidiabetic potential was identified in silico and in vivo. In the same line, the high antioxidant potential and the low toxicological prediction, point AS as a possible alternative treatment to the damage caused by oxidative stress. In summary, the results here presented allow us to conclude that BF plant, used in traditional medicine to treat DM and its complications, does not show direct antidiabetic effects. However, the antioxidant potential observed in both, BF and AS, make them possible complementary treatments to DM, especially considering the diabetic complications resulting of the oxidative stress increase. In this context, perspectives to future investigations on the use of these plants as complementary therapy to the traditional clinic treatment are open.

Made available in DSpace on 2015-03-04T18:50:32Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Diogo_Marinho.pdf: 3506314 bytes, checksum: 33551832c16356372e97856d79324b25 (MD5) Previous issue date: 2011-03-24 / Coordenacao de Aperfeicoamento de Pessoal de Nivel Superior / Os métodos computacionais de docking receptor-ligante são importantes ferramentas utilizadas em estudos na quimica medicinal, auxiliando o processo de descoberta de novos fármacos para alvos moleculares envolvidos em doenças sem tratamento, ou que necessitam de novos tratamentos quimioterápicos. Estes métodos são parte importante dentro da abordagem conhecida como desenho racional de fármacos baseado em estruturas. Esta dissertação apresenta o desenvolvimento da nova versão do programa Dockthor, para docking molecular de ligante flexível, tendo como inovações: (i) uma nova e completa implementação computacional com o aperfeiçoamento do algoritmo genético não-geracional de múltiplas soluções; (ii) a implementação do campo de força molecular MMFF94; (iii) a criação de ferramentas auxiliares para parametrização automática de ligantes, cofatores e receptores protéicos; (iv) introdução da opção de triagem virtual. A nova versão do programa foi validada utilizando dois conjuntos teste. O primeiro envolvendo cinco ligantes altamente flexíveis do receptor HIV-I protease. O segundo, envolvendo 35 complexos receptor-ligante com uma grande diversidade strutural e química nos ligantes, associados a receptores representativos de 18 famílias de proteínas. A validação do programa foi feita através de experimentos de redocking sem utilizar nenhuma etapa de pré-otimizacão do ligante dentro do sítio receptor. Os resultados obtidos são considerados muito bons nos seguintes aspectos: (i) foi obtida uma taxa de sucesso de cerca de 80% (90%) no redocking de ligantes da HIV-1 protease considerando as solucoes de menor energia (menorRMSD); (ii) foi obtida uma taxa de sucesso de cerca de 94% (99%) no redocking do conjunto mais amplo de ligantes considerando as solucoes de menor energia (menor RMSD); (iii) com exceção de dois casos, todas as soluções de menor energia encontradas apresentavam um RMSD < 2.5 _A com relação a estrutura experimental. Os excelentes resultados obtidos nos experimentos de redocking mostram que o programa está apto para estudos de interações receptor-ligante envolvendo moléculas de interesse na química medicinal. As facilidades introduzidas no programa Dockthor permitirão a sua disponibilização e uso pela comunidade acadêmica e grupos de pesquisa atuantes na área de desenho racional de fármacos.