Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The exposure to the cigarette smoke xenobiotics is related with a compromised immune system and the development of many diseases such as Chronic Obstructive Pulmonary Disease (COPD) and lung cancer. The NTPDase and acetylcholinesterase (AChE) are important enzymes involved in the regulation of immune system and alterations in their activities have been showed in many diseases including the related with cigarette smoke-exposure. The curcumin (Cur), polyphenol isolated from the rhizomes of Curcuma longa and widely employed in the culinary and oriental traditional medicine, has many biological activities such as antioxidant, anticarcinogenic and antiinflammatory. Considering the relevance of lymphocytes in the establishment and progression of immune responses, the purpose of this study was to evaluate the effect of curcumin in the NTPDase and AChE activities in peripheral lymphocytes (PL) and lung lymphocytes (LL) from rats exposed to cigarette smoke. The establishment of a protocol to lung lymphocytes separation using the lung tissue was performed with the objective of optimize the cellular viability and the purity of separation, using as references the protocols for separation of human peripheral and lung lymphocytes. The experimental procedure to evaluate the effect of curcumin on the NTPDase and AChE in lymphocytes from rats exposed to the cigarette smoke was divided in two sets of experiments. In the first set, the animals were randomly divided into four groups: Vehicle; Cur 12.5 mg/kg; Cur 25 mg/kg; Cur 50 mg/kg. In the second experimental set, the animals were divided into 5 groups: Vehicle; smoke exposed; smoke and Cur 12.5 mg/kg; smoke and Cur 25 mg/kg; smoke and Cur 50 mg/kg. Curcumin was diluted with corn oil, administered by oral gavage, not exceeding 1 ml/kg body weight. The treatment with curcumin and cigarette smoke was carried out once a day, 5 days each week, during 30 days. It was administered the curcumin or corn oil, and approximately 10 minutes later, the smoking groups were exposed to the sidestream smoke of four commercial cigarettes (nicotine 0.9 mg, tar 10 mg each) inside a whole-body smoke exposure chamber. Control animals were placed in an equal chamber for the same amount of time. After thirty days, the animals were euthanized, the lung was removed and the peripheral blood collected for separation of lymphocytes. With the standardization of the protocol to the separation of lung lymphocytes it was achieved a percentage of lymphocytes higher than 82% and it was observed a strong correlation between the enzyme activity using ATP and ADP as substrates, which indicates that the results can be expressed in milligram of protein, millions of cells and millions of viable cells. The results from the experiments with the cigarette smoke exposure demonstrated that the treatment with curcumin prevented the alterations observed in the cigarette smoke-exposed animals such as the decrease of ATP and ADP hydrolysis in PL and LL, and the increase of AChE activity in PL. We suggest that the treatment with curcumin was protective, since the high concentrations of ATP are positively related with inflammation and tissue damage, and the emphysematous damages observed in cigarette smoke-exposed was not observed in the groups treated with curcumin. / A exposição aos xenobióticos da fumaça do cigarro está relacionada com o comprometimento do sistema imune e o desenvolvimento de diversas doenças como a Doença Pulmonar Obstrutiva Crônica (DPOC) e câncer de pulmão. A NTPDase e a acetilcolinesterase (AChE) são importantes enzimas envolvidas na regulação do sistema imune e alterações nas suas atividades tem sido descritas em várias doenças incluindo as relacionadas à exposição à fumaça do cigarro. A curcumina (Cur), polifenol obtido a partir de rizomas de Curcuma longa e amplamente utilizado na culinária e na medicina tradicional oriental, possui muitas atividades biológicas como antioxidante, anticarcinogênica e antiinflamatória. Tendo em vista a relevância dos linfócitos no estabelecimento e progressão de respostas imunes, o objetivo deste estudo foi avaliar o efeito da curcumina na atividade das enzimas NTPDase e AChE em linfócitos periféricos (PL) e linfócitos pulmonares (LL) de ratos expostos à fumaça do cigarro. A padronização da separação dos linfócitos a partir de tecido pulmonar foi realizada com o objetivo de otimizar a viabilidade celular e a pureza da separação, utilizando-se como base os protocolos de separação de linfócitos periféricos e pulmonares de seres humanos. Os procedimentos experimentais para a avaliação do efeito da curcumina sob a atividade das enzimas NTPDase e AChE em linfócitos de ratos expostos à fumaça do cigarro foram divididos em duas etapas. Primeiramente, os animais foram divididos aleatoriamente em quatro grupos: veículo; Cur 12.5 mg/kg, Cur 25 mg/kg; Cur 50 mg/kg. Na segunda etapa experimental os animais foram divididos aleatoriamente em cinco grupos: veículo; cigarro; cigarro e Cur 12.5 mg/kg; cigarro e Cur 25 mg/kg; cigarro e Cur 50 mg/kg. A curcumina foi diluída em óleo de milho, administrada por gavagem oral, não excedendo 1 ml/kg de massa corpórea. O tratamento com a curcumina e com a fumaça do cigarro foi realizada uma vez por dia, cinco dias por semana, durante trinta dias. A curcumina foi administrada e, após aproximadamente dez minutos, os grupos fumantes eram expostos à fumaça de quatro cigarros comerciais (0,9 mg nicotina, 10 mg alcatrão cada) dentro de uma câmara de exposição. Os animais não expostos à fumaça do cigarro foram colocados em uma câmara equivalente, pelo mesmo período. Após trinta dias, os animais foram eutanasiados, os pulmões removidos e o sangue periférico coletado para a separação dos linfócitos. Com a padronização da técnica para a separação de linfócitos pulmonares foi obtido um percentual de linfócitos superior a 82% e ainda observou-se uma forte correlação entre a atividade da enzima usando ATP e ADP como substrato o que indica que os resultados podem ser expressos tanto em miligramas de proteína, quanto em milhões de células quanto em milhões de células viáveis. Os resultados dos experimentos com a fumaça do cigarro demonstraram que o tratamento com a curcumina preveniu as alterações observadas nos animais expostos à fumaça do cigarro como a diminuição na hidrólise de ATP e ADP em PL e LL, e o aumento da atividade da AChE em PL. Analisando os resultados obtidos, sugere-se que o tratamento com a curcumina foi protetor, uma vez que as altas concentrações de ATP estão positivamente relacionadas com inflamação e dano tecidual, e as lesões enfisematosas observadas no grupo exposto à fumaça do cigarro não foram observadas com os tratamentos com a curcumina.

Biological aging is gradual and progressive decline of physical functions that begin in adulthood and ends with death in almost all animals species. One of the most common features of aging is the reduced ability to learn and remember new information. Age-related changes in the neural basis of memory processes are closely linked to oxidative stress. Here, the effects of caffeine caffeine and SCH58261, an A2A receptor antagonist, in the memory impairment and oxidative stress influenced by age in rats were investigated. Young and old rats were treated daily for 10 days with caffeine (30 mg/kg, p.o.) or SCH58261 (0,5 mg/kg, p.o.). The test used to evaluate the memory of animals was the novel object recognition task (article 1). After behavioral tasks, ascorbic acid and oxygen and nitrogen reactive species levels as well as Na+K+ ATPase activity were determined in rat brain. The results showed that memory deficit influenced by age was reversed by treatment with caffeine or SCH58261 besides improving short-term memory. Young animals also showed improved memory for short and long term when treated with caffeine and SCH58261.Furthermore, increased oxygen and nitrogen reactive species levels in brain of old rats were normalized by both caffeine and SCH58261. However, ascorbic acid levels decreased in brain of old rats were not changed by CAF or SCH58261. The inhibition Na+K+ ATPase activity in brain of old rats was also normalized by caffeine and SCH58261. Since caffeine ameliorates memory of aged rats and taking into account that organoselenium compounds have antioxidant and neuroprotective properties, it was also investigated whether diphenyl diselenide (PhSe)2 compound could improve memory impairment in middle-aged rats in a model of supplementation with caffeine. Middle-aged rats were treated for 30 days with both (PhSe)2 (10 p.p.m. in feed) and caffeiene (15 mg/kg, o.p.) or only (PhSe)2 or caffeine. Memory of animals was evaluated in the novel object recognition task (manuscript 1). The results showed an improvement in the short-term memory in animals treated only with (PhSe)2. The long-term memory was improved only in animals treated with both (PhSe)2 and caffeine. Moreover, treatments affected locomotor and exploratory activity. Thus, this study suggests that both antagonists of adenosinergic receptor, and (PhSe)2 were effective in ameliorating memory impairment influenced by aging. / O envelhecimento biológico é o declínio gradual e progressivo das funções físicas que começam com o nascimento e terminam com a morte em todas as espécies animais. Uma das características mais comuns do envelhecimento é a redução da capacidade de aprender e lembrar novas informações. Mudanças relacionadas à idade nos fundamentos neurais dos processos de memória estão intimamente ligadas ao estresse oxidativo. Neste estudo, os efeitos da cafeína e do SCH58261, antagonistas de receptores de adenosina, no prejuízo da memória e estresse oxidativo influenciado pela idade em ratos foram investigados. Ratos jovens (3 meses) e velhos (23 meses) foram tratados diariamente por 10 dias com cafeína (30 mg/kg p.o.) ou SCH58261 (0,5 mg/kg, p.o.). O teste utilizado para avaliar a memória dos animais foi o teste do reconhecimento do objeto novo (artigo 1). Após o teste comportamental, os níveis de acido ascórbico e espécies reativas de oxigênio e nitrogênio, bem como a atividade da Na+K+ ATPase foram determinados em amostras de cérebro dos animais. Os resultados mostraram que o déficit de memória induzido pela idade foi revertido pelo tratamento com cafeína ou SCH58261 na memória de longo prazo além de melhorar a memória de curto prazo. Os animais jovens também apresentaram melhora da memória de curto e longo prazo quando tratados com cafeína e SCH58261. Além disso, os níveis aumentados de espécies reativas de oxigênio e nitrogênio no cérebro dos ratos velhos foram revertidos por ambas cafeína e SCH58261. Entretanto os níveis de acido ascórbico, diminuídos no cérebro de ratos velhos, não foram mudados pela cafeína ou SCH58261. A atividade da Na+K+ ATPase inibida no cérebro dos animais velhos também foi normalizada pela cafeína e SCH58261. Uma vez que a cafeína melhorou a memória de ratos velhos e levando-se em consideração que muitos compostos orgânicos de selênio apresentam propriedades antioxidantes e neuroprotetoras, também foi investigado se o composto disseleneto de difenila (PhSe)2 seria capaz de melhorar o prejuízo da memória em ratos de meia idade (18 meses) em um modelo de suplementação juntamente com a cafeína. Ratos de meia idade foram tratados pelo período de 30 dias com ambos (PhSe)2 (10 p.p.m. na ração) e cafeína (15 mg/kg, o.p.) ou somente com (PhSe)2 ou cafeína. A memória dos animais foi avaliada no teste do reconhecimento do objeto novo (manuscrito 1). Os resultados demonstraram uma melhora na memória de curta duração nos animais tratados somente com (PhSe)2. Entretanto a memória de longa duração foi melhorada apenas nos animais tratados com ambos (PhSe)2 e cafeína. Além disso, os tratamentos melhoraram a atividade locomotora e exploratória. Assim, estes dois estudos sugerem que tanto os antagonistas de receptores adenosinérgicos, quanto o (PhSe)2 são capazes de melhorar o prejuízo da memória influenciado pelo envelhecimento.

O curto tempo de armazenamento dos hemocomponentes é um dos fatores que dificulta e limita a quantidade de sangue que pode ser efetivamente armazenada, o que é uma desvantagem na medicina veterinária, pois o acesso a doadores é restrito e a demanda é contínua e cada vez maior na prática de clínicas e hospitais veterinários. Durante o armazenamento do sangue em baixas temperaturas, seja sob a forma de sangue total ou concentrado de eritrócitos, há uma queda intensa de metabólitos importantes para a viabilidade e funcionalidade dos eritrócitos. O desenvolvimento de meios e soluções de preservação sanguínea possibilitou o armazenamento dos eritrócitos e, consequentemente, facilitou o trabalho dos bancos de sangue. Portanto, a busca por melhores formas e soluções para preservação capazes de evitar ou diminuir estes efeitos prejudiciais durante o seu armazenamento é contínua, para que ao final se obtenha uma melhor qualidade do sangue transfundido. O presente trabalho avaliou o concentrado de eritrócitos felino armazenado na solução de CPDA-1 e CPD/SAGM durante 35 dias. Os dados laboratoriais foram comparados entre grupos e ao longo do tempo. Neste experimento foram utilizadas 10 bolsas de concentrado de eritrócitos felino divididos em dois grupos de cinco para avaliação de cada um dos aditivos. Os parâmetros laboratoriais K+, Na+, Cl-, lactato, HCO3-, amônia, glicose e pH foram avaliados nos dias 1, 7, 14, 21, 28 e 35 após a coleta. Vários parâmetros (K+, lactato, HCO3, glicose e cloreto) demonstraram que a solução CPD/SAGM manteve o metabolismo energético do eritrócito mais estável. Com este trabalho, foi possível entender melhor as alterações metabólicas sofridas pelos eritrócitos felinos durante o armazenamento. Concluímos que, apesar da solução CPD/SAGM se mostrar mais eficaz in vitro, são necessários mais estudos com relação aos hemocomponentes em gatos e à sua viabilidade pós-transfusional. / The short shelf life of blood products is one factor that complicates and limits the amount of blood that can be effectively stored, and it is a disadvantage in veterinary practice, because the access to donors is restricted and the demand is continuous and increasing at veterinary clinics and hospitals. During blood storage at low temperatures, either as whole blood or as packed red cells, there is a significant decrease of metabolites that are important for the viability and functionality of erythrocytes. The development of blood preservation solutions has enabled the storage of red blood cells and improved the service at the blood banks. Therefore, the search for better ways and blood preservation solutions to avoid or reduce these harmful effects during the storage conditions is continuous, in order to obtain the best blood product to be transfused. This study evaluated 10 bags of feline erythrocyte concentrate divided into two groups, stored in CPDA-1 and CPD/SAGM solutions during 35 days. The laboratory data were compared between groups and over time. K+, Na+, Cl-, lactate, HCO3-, ammonia, glucose and pH were assessed on days 1, 7, 14, 21, 28, and 35 after collection. On various parameters (K+, Cl-, HCO3-, glucose and lactate) solution of CPD/SAGM kept the energy metabolism of red blood cells more stable. With these results we can better understand the biochemical changes of feline erythrocytes during storage. We conclude that, although the CPD/SAGM solution shown to be more effective, more studies are needed to improve knowledge of feline blood components and post-transfusion viability.

[EN] The plasma membrane H+-ATPase (Pma1) is essential for yeast growth and is activated by glucose metabolism by an unknown mechanism involving double phosphorylation of a regulatory site at the C-terminus (Ser911 Thr912). In this thesis we have investigated in Saccharomyces cerevisiae the role of two protein phosphatases, type 1 Glc7 and type 2A Sit4, and of an essential atypical protein kinase, TORC1, in the activation of Pma1 by glucose. The regulatory site of activated Pma1 can be dephosphorylated "in vitro" by recombinant Glc7 and Sit4, but inhibition "in vivo" of these phosphatases does not activate Pma1. Inhibition of Glc7 by regulated expression of a dominant-negative truncated form (the null mutant is not viable) had no effect on Pma1 activity while deletion of SIT4 gene decreased both Pma1 activity and double phosphorylation of the regulatory site. Inhibition of TORC1 protein kinase by treatment of yeast cells with the drug rapamycin or by exposure to non-permissive temperature of a temperature-sensitive mutant (tor1¿ tor2ts) inhibited Pma1 and decreased double phosphorylation of the regulatory site. We conclude that Sit4 and TORC1 are required for full activation of Pma1 by glucose while Glc7 either does not participate or is redundant with other phosphatases. / [ES] La H+-ATPasa de la membrana plasmática (Pma1) es esencial para el crecimiento de la levadura y se activa por metabolismo de glucosa por un mecanismo desconocido que lleva consigo la doble fosforilación de un sitio regulador en el extremo C-terminal (Ser911 Thr912). En la presente tesis hemos investigado en Saccharomyces cerevisiae la participación de dos proteína fosfatasas, Glc7 de tipo 1 y Sit4 de tipo 2A, y de una proteína kinasa atípica esencial, TORC1, en la activación de Pma1 por glucosa. El sitio regulador de Pma1 en su estado activo puede defosforilarse "in vitro" por Glc7 y Sit4 recombinantes pero la inhibición "in vivo" de estas fosfatasas no activa Pma1. La inhibición de Glc7 mediante la expresión regulada de una forma truncada que actúa como dominante-negativa (el mutante nulo no es viable) no tiene efecto en la actividad de Pma1 mientras que la deleción del gen SIT4 disminuye tanto la actividad de Pma1 como la doble fosforilación del sitio regulador. Inhibición de la proteína kinasa TORC1 mediante tratamiento de las células de levadura con el fármaco rapamicina o exponiéndolas a temperatura no permisiva en el caso de un mutante termosensible (tor1¿ tor2ts) resulta en inhibición de Pma1 y disminución de la doble fosforilación del sitio regulador. Estos resultados indican que Sit4 y TORC1 son necesarias para la máxima activación de Pma1 por glucosa mientras que Glc7 podría no participar o hacerlo de forma redundante con otras fosfatasas. / [CAT] L'H+-ATPasa de la membrana plasmàtica (Pma1) és essencial per al creixement dels llevats i s'activa gràcies al metabolisme de glucosa per un mecanisme desconegut que porta associat la doble fosforilació d'una regió reguladora a l'extrem C-terminal (Ser911 Thr912). En aquesta tesi hem investigat en Saccharomyces cerevisiae la participació de dos proteïnes fosfatases, Glc7 de tipus 1 i Sit4 de tipus 2A, i d'una proteïna quinasa essencial atípica, TORC1, en l'activació de Pma1 per glucosa. La regió reguladora de Pma1, en seu estat activat, pot desfosforar-se "in vitro" per Glc7 i Sit4 recombinants, però la inhibició "in vivo" d'aquestes fosfatases no activa Pma1. La inhibició de Glc7 mitjançant l'expressió regulada d'una forma truncada que actua com a dominant-negativa (el mutant nul no és viable) no té cap efecte en l'activitat de Pma1 mentre que la deleció del gen SIT4 disminueix tant l'activitat de Pma1 com la doble fosforilació de la regió reguladora. La inhibició de la proteïna quinasa TORC mitjançant un tractament de cèl·lules de llevat amb el fàrmac rapamicina o la seua exposició a temperatures no permissives en el cas d'un mutant termosensible (tor1¿ tor2ts) resulta en la inhibició de Pma1 i la disminució de la doble fosforilació de la regió reguladora. Aquests resultats indiquen que Sit4 i TORC1 són necessàries per a l'activació màxima de Pma1 per glucosa, mentre que Glc7 podria no participar o fer-ho d'una forma redundant amb altres fosfatases. / Mahmoud Ali Ibrahim Hamouda, S. (2015). Protein kinases and phosphatases regulating the yeast proton pump [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/54131 / TESIS

[EN] Any living cell needs to maintain adequate levels of nutrients and ions to ensure the continuity of its functions. The first step in the maintenance of both ion and nutrient homeostasis is their uptake from the extrenal environment, where plasma membrane transporter proteins play an important role. The regulation of both the activity and abundance of permeases in the plasma membrane is a pivotal aspect of the cellular response to different environmental conditions. Therefore, deciphering the pathways that regulate the function or the presence of these transport proteins is important for a better understanding of cell physiology and stress responses. Transcriptional regulation is a contributor to the control of the abundance of plasma membrane transporters, and more specifically in the yeast model Saccharomyces cerevisiae a strong transcriptional regulation of the hexose transporters has been demonstrated. However, there are other important levels for the control and maintenance of glucose homeostasis, such as post-translational regulation of glucose transporters, which are still being defined. Ubiquitination, as a signal for endocytosis of membrane proteins, mediated by the E3 ubiquitin ligase Rsp5 has been demonstrated for many transporters, including the HXT family. In recent years, several studies have shown the involvement of the ART protein family (Arrestin-Releated Trafficking proteins) in this process, acting as adapters for Rsp5 and providing specificity to the ubiquitination of permeases in response to changes in environmental conditions. In turn, the members of this family of adapter proteins are targets of post-translational modifications, such as phosphorylation or ubiquitination, affecting their activity and adding an additional level in the regulation of transporter interactions. Previous studies have demonstrated the existence of a genetic interaction between the high affinity glucose transporter Hxt6 and the Rsp5 adapter protein, Rod1 (Art4). In turn, the Snf1 kinase was shown to be involved in the phosphorylation of this adapter protein, suggesting a possible role in the regulation of its activity. With this background, and taking into consideration the interaction of 14-3-3 proteins with other adapter proteins, in this study the biochemical characterization of the Art4-Snf1-14-3-3 signaling pathway involved in the regulation of the endocytosis of the glucose transporter Hxt6 and the effect of Snf1 and 14-3-3 proteins (Bmh2) on intracellular traffic of the Hxt6-Art4 complex will be investigated. Similarly, the effect of Art4, and its paralogue Rog3 (Art7), on Hxt6 levels and the phenotypes of other glucose transporter mutants, such as hxt1 and hxt3 will be analyzed to determine whetherthese transporters display a common regulatory mechanism also involving Art4 and Art7. In short, this thesis aims to provide new data on the post-translational regulation of the HXT transporters through the Rsp5 adapter family of ART proteins, with emphasis on biochemical aspects, such as phosphorylation, and molecular and cellular aspects, such as intracellular trafficking and permease stability / [ES] Cualquier célula viva necesita mantener niveles adecuados de iones y nutrientes para asegurar la continuidad de sus funciones. El primer paso en la conservación de la homeostasis de iones como el potasio o nutrientes como la glucosa, es la toma de los mismos desde el medio externo, teniendo los transportadores de membrana un papel básico en este proceso. La regulación de estos transportadores tiene una función fundamental en la respuesta de las células a diferentes condiciones ambientales, siendo esenciales tanto la modulación de su actividad como la abundancia de permeasas en la membrana plasmática. Por esto, el estudio de las rutas que regulan la función o la presencia de dichos transportadores en la membrana plasmática es importante para un mejor conocimiento de la fisiología celular y la respuesta de las células al estrés. La regulación transcripcional supone un nivel importante en el control de la abundancia de transportadores en la membrana plasmática, y más concretamente en la levadura modelo Saccharomyces cerevisiae se ha demostrado que los transportadores de hexosas poseen una fuerte regulación a nivel transcripcional. Sin embargo, existen otros niveles importantes para el control y el mantenimiento de la homeóstasis de hexosas, como la regulación postraduccional, y que en el caso de los transportadores de glucosa es menos conocida. La ubiquitinación como señal para la endocitosis de proteínas de membrana a través de la E3 ubiquitín ligasa Rsp5 ha sido demostrada para gran número de transportadores, incluidos los de la familia HXT. En los últimos años, varios estudios han demostrado la implicación de la familia de proteínas ART (Arrestin Releated Trafficking proteins) en este proceso, actuando como adaptadores de Rsp5 y aportando especificidad a la ubiquitinación de transportadores en respuesta a cambios en las condiciones del medio. A su vez, esta familia de proteínas adaptadoras es diana de modificaciones postraduccionales, como la ubiquitinación o la fosforilación, que repercuten en su actividad y suman un nivel adicional en la regulación de los transportadores con los que interaccionan. Estudios anteriores demostraron la existencia de una interacción genética entre el transportador de glucosa de alta afinidad Hxt6 y la proteína adaptadora de Rsp5, Rod1 (Art4). A su vez, la quinasa Snf1 fue implicada en la fosforilación de esta proteína adaptadora, sugiriendo una posible función en la regulación de su actividad. Con estos precedentes, y teniendo en consideración la interacción de las proteínas 14-3-3 con otras proteínas adaptadoras, en el presente estudio se llevará a cabo la caracterización bioquímica de la ruta de señalización Art4-Snf1-14-3-3 implicada en la regulación por endocitosis del transportador de glucosa Hxt6 y se estudiará el efecto de Snf1 y las proteínas 14-3-3 (Bmh2) sobre el tráfico intracelular del complejo Hxt6-Art4. Del mismo modo, se analizará el efecto de Art4, y de su parálogo Rog3 (Art7), sobre los niveles de Hxt6 y se caracterizarán los fenotipos de mutantes para otros transportadores de glucosa, como Hxt1 y Hxt3, por la posibilidad de que presenten un mecanismo regulador común que implique también a Art4 y Art7. En definitiva, la presente tesis doctoral pretende aportar nuevos datos acerca de la regulación postraduccional de transportadores de la familia HXT a través de las proteínas ART, adaptadoras de Rsp5, haciendo hincapié en aspectos bioquímicos como la fosforilación y la ubiquitinación, y en aspectos moleculares y celulares, como el tráfico intracelular o la estabilidad de permeasas. / [CAT] Qualsevol cèl-lula viva necessita mantindre nivells adequats d'ions i nutrients per tal d'assegurar la continuïtat de les seues funcions. El primer pas en la conservació de l'homeòstasi d'ions com el potassi o nutrients com la glucosa, és la pressa dels mateixos des del medi extern, tot i tenint els transportadors de membrana un paper bàsic en este procés. De manera directa, la regulació d'aquests transportadors té una funció fonamental en la resposta de les cèl-lules a diferents condicions ambientals, tot i sent processos essencials tant la modulació de la seua activitat com l'abundància de permeases a la membrana plasmàtica. Per això, entendre les rutes que regulen la funció o la presència dels transportadors a la membrana és important per a un millor coneixement de la fisiologia cel-lular i la resposta a l'estrés. La regulació transcripcional suposa un nivell important en el control de l'abundància de transportadors a la membrana plasmàtica, i més concretament en el rent model Saccharomyces cerevisiae s'ha demostrat que les permeases d'hexoses tenen una forta regulació a nivell transcripcional. A banda d'aquest tipus de regulació, existeixen altres nivells importants per al control i el manteniment de l'homeòstasi de la glucosa, com la regulació postraduccional, i , que en el cas dels transportadors de glucosa, és menys coneguda. L'ubiquitinació com a senyal per a l'endocitosi de proteïnes de membrana a través de l'E3 ubiquitina ligasa Rsp5, ha sigut demostrada per a un gran nombre de transportadors, inclosos els de la família HXT. En els últims anys, diversos estudis han posat de manifest la implicació de la família de proteïnes ART (Arrestin Releated Trafficking proteins) en este procés, tot i actuant com adaptadores de Rsp5 i aportant especificitat a l'ubiquitinació de transportadors en resposta a canvis en les condicions del medi. Al mateix temps, aquesta família de proteïnes és diana de modificacions postraduccionals, com l'ubiquitinació o la fosforilació, que tenen un efecte en la seua activitat i sumen un nivell addicional a la regulació dels transportadors amb els quals interaccionen. Estudis anteriors demostraren l'existència d'una interacció genètica entre el transportador de glucosa d'alta afinitat Hxt6 i la proteïna adaptadora de Rsp5, Rod1 (Art4). De la mateixa manera, la quinasa Snf1 va ser involucrada en la fosforilació d'aquesta proteïna adaptadora, tot i suggerint una possible funció en la regulació de la seua activitat. Amb estos precedents, i tenint en compte la interacció de les proteïnes 14-3-3 amb altres proteïnes adaptadores, en el present estudi es durà a terme la caracterització bioquímica de la ruta de senyalització Art4-Snf1-14-3-3 implicada en la regulació per endocitosi del transportador de glucosa Hxt6, i s'estudiarà l'efecte de Snf1 i les proteïnes 14-3-3 (Bmh2) sobre el tràfic intracel-lular del complex Hxt6-Art4. Per altra banda, s'analitzarà l'efecte de Art4, i del seu paràleg Rog3 (Art7), sobre els nivells de Hxt6 i es caracteritzaran els fenotips de mutants per a altres transportadors de glucosa, tals com Hxt1 i Hxt3, per la possibilitat que presenten un mecanisme regulador comú que també implique a Art4 i Art7. En definitiva, la present tesi doctoral pretén aportar noves dades al voltant de la regulació postraduccional dels transportadors de la família HXT a través de les proteïnes ART, adaptadores de Rsp5, tot i aprofundint en aspectes bioquímics com la fosforilació i l'ubiquitinació, i en aspectes moleculars i cel-lulars, com el tràfic intracel-lular o l'estabilitat de permeases / Llopis Torregrosa, V. (2016). Mecanismos de regulación de transportadores de iones y nutrientes a través de proteínas de tráfico relacionadas con las arrestinas [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/60149 / TESIS

[EN] Eukaryotic cells adapt to environmental changes ("stress") through signal transduction pathways which coordinate complex adaptive responses. Mitochondria are able to respond to different external stimuli in a dynamic manner. In previous studies, mitochondria were shown to play an important role in adaptation to hyperosmotic stress and defects in many mitochondrial functions cause sensitivity to this stress. In the present work, we investigate novel mechanisms of mitochondrial adaptation in response to stress. First of all, the role of the mitochondrial pyruvate carrier complex (MPC) in this adaptation was analyzed. This carrier is composed by three proteins in yeast: Mpc1, Mpc2 and Mpc3. MPC3 is upregulated upon salt stress and during a diauxic shift, which leads to an increase in Mpc3 protein abundance. HOG pathway, implicated in osmostress response, is needed for the efficient induction of MPC3 transcription. Our analysis suggests that amino acid biosynthesis, respiration rate and oxidative stress tolerance are regulated by changes in the Mpc protein composition of the mitochondria. In this way, Mpc2 is most abundant under fermentative non stress conditions and important for amino acid biosynthesis, while Mpc3 is the most abundant family member upon salt stress or when high respiration rates are required. In addition, Mpc3 stimulates respiration and enhances tolerance to oxidative stress. Therefore, our results identify that the regulated mitochondrial pyruvate uptake via different Mpc proteins might be an important determinant of respiration rate and stress resistance. Secondly, since pyruvate flux to mitochondria is modified according to environmental conditions, here we study also possible changes in electron transport chain complex subunits. We found that a switch to partially or completely respiratory energy sources causes selective degradation of respiratory complex I and III subunits. Moreover, this degradation was also observed when there was a specific organelle damage caused by valinomycin, to maintain cell homeostasis. Interestingly, the loss of Atg32 function only partially affected the respiratory complex specific degradation, while the Atg11 protein was absolutely required in this process. Fission and fusion machinery proteins (Fzo1 and Fis1) and some mitochondrial proteases (Yme1, Pim1 and Afg3) also have a role in the valinomycin-mediated mitophagy. This process might start by Atg11 accumulation in foci close to the mitochondria shortly after valinomycin treatment. In this work, we describe for the first time a specific mechanism of mitophagy mediated by damage in yeast, which opposes to the concept of a generalized degradation of the organelle. / [ES] Las células eucariotas responden a cambios en su entorno ("estrés") a través de rutas de transmisión de señales que coordinan respuestas adaptativas muy complejas. Las mitocondrias son orgánulos muy dinámicos capaces de responder a diversos estímulos externos. En estudios anteriores, se demostró que la mitocondria tiene un papel en la adaptación a estrés hiperosmótico, ya que los mutantes con defectos en diversos componentes mitocondriales muestran mayor sensibilidad a este estrés. En este trabajo, se ha investigado nuevos mecanismos de adaptación de la actividad mitocondrial en respuesta a estrés. Por una parte, se ha estudiado el papel del complejo transportador de piruvato mitocondrial (MPC) en esta adaptación. Este transportador está conformado por tres proteínas en levadura: Mpc1, Mpc2 y Mpc3. El gen MPC3 sufre una fuerte inducción transcripcional en condiciones de estrés osmótico y cambio diáuxico, que se traduce en un aumento de la cantidad de proteína Mpc3. Esta regulación se vio que dependía de la ruta HOG, implicada en la respuesta a estrés osmótico, y no ocurría en Mpc1 y Mpc2. Se comprobó, además, que los cambios en la composición de MPC en la mitocondria regulaban la biosíntesis de aminoácidos, la capacidad respiratoria y la tolerancia a estrés oxidativo de la célula. De esta forma, Mpc2 es la proteína más abundante en condiciones fermentativas sin estrés y es necesaria para la biosíntesis de aminoácidos; mientras que Mpc3 es el miembro más abundante ante estrés salino o cuando se requiere una elevada tasa respiratoria. Además, Mpc3 estimula la respiración y aumenta la tolerancia a estrés oxidativo. Por tanto, nuestros resultados identifican que la entrada de piruvato en la mitocondria y su posterior uso están regulados por la composición específica de las subunidades del transportador y determina la tasa respiratoria y la resistencia a estrés. Por otra parte, dado que el flujo de piruvato a la mitocondria se modificaba en función de las condiciones ambientales, se quiso estudiar qué ocurría en los complejos de la cadena de transporte de electrones en estas condiciones. Se observó que los complejos I y III se degradaban ante elevadas tasas respiratorias, al parecer como un mecanismo de reciclaje. Además, ante un daño mitocondrial específico utilizando valinomicina, también existía una degradación específica de los complejos respiratorios I y III, para mantener la homeostasis celular. Este proceso es dependiente de Atg11, e independiente de Atg32. También parecen implicadas proteínas de la maquinaria de dinámica mitocondrial (Fzo1 y Fis1) y algunas proteasas mitocondriales (Yme1, Pim1 y Afg3). El inicio de este proceso parece producirse ante la aparición de foci de Atg11 cercanos a la mitocondria. Se describe por primera vez en levadura un mecanismo específico de mitofagia inducida por daño, que contrasta con el concepto de degradación generalizada del orgánulo. / [CAT] Les cèl·lules eucariotes responen a canvis al seu entorn ("estrès") a través de rutes de transmissió de senyals que coordinen respostes adaptatives molt complexes. Les mitocòndries són orgànuls molt dinàmics capaços de respondre a diversos estímuls externs. A estudis previs, es va demostrar que la mitocòndria té un paper en l'adaptació a estrès hiperosmòtic, ja què els mutants amb defectes en diversos components mitocondrials mostren major sensibilitat a aquest estrès. A aquest treball, s'ha analitzat nous mecanismes d'adaptació de l'activitat mitocondrial en resposta a estrès. Per una banda, s'ha estudiat el paper del complex transportador de piruvat mitocondrial (MPC) a aquesta adaptació. Aquest transportador està conformat per tres proteïnes en llevat: Mpc1, Mpc2 i Mpc3. El gen MPC3 pateix una forta inducció transcripcional en condicions d'estrès osmòtic i canvi diàuxic, que es tradueix en un augment de la quantitat de proteïna Mpc3. Aquesta regulació depèn de la ruta HOG, implicada en la resposta a estrès osmòtic, i no tenia lloc en Mpc1 i Mpc2. A més, es va comprovar que els canvis en la composició de MPC a la mitocòndria regulaven la biosíntesi de aminoàcids, la capacitat respiratòria i la tolerància a estrès oxidatiu de la cèl·lula. D'aquesta manera, Mpc2 és la proteïna més abundant en condicions fermentatives en absència d'estrès, mentre que Mpc3 és el membre més abundant davant d'estrès salí o quan és necessària una elevada taxa respiratòria. A més, Mpc3 estimula la respiració i augmenta la resistència a estrès oxidatiu. Per tant, els nostres resultats identifiquen que l'entrada de piruvat a la mitocòndria i el seu posterior ús estan regulats per la composició específica de les subunitats del transportador i determina la taxa respiratòria i la resistència a estrès. Per altra banda, com el flux de piruvat a la mitocòndria es modifica en funció de les condicions ambientals, es va voler estudiar què succeïa als complexes de la cadena de transport electrònic a aquestes condicions. Es va observar que els complexes I i III es degradaven davant d'elevades taxes respiratòries, com a mecanisme de reciclatge. A més, davant d'un dany mitocondrial específic utilitzant valinomicina, també existia una degradació específica dels complexes respiratoris I i III, per a mantenir l'homeòstasi cel·lular. Aquest procés és depenent d'Atg11, però independent d'Atg32. També semblen implicades proteïnes de la maquinària de dinàmica mitocondrial (Fzo1 i Fis1) i algunes proteases mitocondrials (Yme1, Afg3 i Pim1). L'inici d'aquest procés sembla produir-se per l'aparició de foci d'Atg11 propers a la mitocòndria. Per primera volta, es descriu en llevat un mecanisme específic de mitofagia induïda per dany, que contrasta amb el concepte de degradació generalitzada de l'orgànul. / Timón Gómez, A. (2016). MECANISMOS DE ADAPTACIÓN DE LA ACTIVIDAD MITOCONDRIAL EN RESPUESTA A ESTRÉS [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/64873 / TESIS

El exceso de sales en el medio causa grandes inconvenientes tanto a nivel agrícola debido a las pérdidas que se producen en la calidad y la cantidad de las cosechas, como a nivel médico, siendo responsable de un gran número de enfermedades. El estrés osmótico desencadena mecanismos adaptativos complejos que estudiamos en la presente tesis utilizando como organismo modelo la levadura Saccharomyces cerevisiae por tratarse de células eucariotas unicelulares metodológicamente accesibles y por la conservación evolutiva de los mecanismos moleculares de la adaptación al estrés entre organismos eucariotas. El principal objetivo de la presente tesis consistió en identificar nuevos procesos moleculares que tienen lugar en las células de levadura cuando éstas sufren un estrés hiperosmótico. Hasta el momento se sabía que la respuesta a estrés osmótico involucraba un gran número de procesos biológicos que tienen lugar a varios niveles como son la regulación de los transportadores de iones, la síntesis de osmolitos para mantener estable la estructura celular, la regulación del ciclo celular y de la traducción y la activación masiva de la expresión génica. Durante la presente tesis hemos identificado a la mitocondria como orgánulo cuya funcionalidad es crucial para la adaptación de las células de levadura al estrés hiperosmótico. Mediante análisis northern mostramos que las células responden al estrés osmótico activando la mitocondria al nivel de expresión génica. Mediante ensayos de actividad enzimática, mostramos que la mitocondria de las células sometidas a estrés es más activa que en condiciones óptimas de crecimiento y mediante ensayos proteómicos, observamos diferencias notables entre los proteomas mitocondriales de aquéllas células que crecen en condiciones hiperosmóticas. Además, hemos demostrado que una de las mayores funciones de la mitocondria en condiciones de estrés osmótico es el control de la generación de estrés oxidativo. / Martínez Pastor, MM. (2011). Análisis de la función y la regulación de la mitocondria de la levadura Saccharomyces cerevisiae en respuesta a estrés osmótico [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/10600 / Palancia

La presente tesis doctoral se enmarca dentro del tema de la homeostasis de cationes en células vegetales. El conocimiento de los transportadores involucrados en la homeostasis de cationes y sus mecanismos de regulación, puede tener aplicaciones biotecnológicas para el desarrollo de plantas tolerantes a estreses abióticos como la salinidad o el pH ácido. El objetivo general del presente trabajo es determinar y estudiar los mecanismos implicados en la homeostasis de pH en Arabidopsis thaliana. La metodología empleada ha consistido, por un lado, en la realización de micromatrices para estudiar la respuesta transcripcional al estrés por ácido acético. Por otro lado, se ha llevado a cabo un rastreo genético para encontrar genes determinantes de la tolerancia a este estrés. Los resultados del análisis transcripcional han servido para identificar posibles genes cuya expresión es relevante para la homeostasis de pH. De hecho, estos resultados han servido de base para otra tesis doctoral realizada en el departamento. Los resultados del rastreo genético han permitido aislar y caracterizar un mutante dominante negativo (wat1-1D: "weak acid tolerant") que expresa una versión truncada de la adaptina ß3 de A. thaliana y que posee una alteración en la homeostasis de pH y de otros cationes monovalentes, como el sodio o el potasio. / Niñoles Rodenes, R. (2011). Biología molecular de la regulación de la homeostasis de pH en Arabidopsis thaliana [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/11301 / Palancia

La sequía y la salinidad representan estreses ambientales que afectan de forma crítica el crecimiento de las plantas y limitan enormemente su potencial agrícola. La fitohormona ácido abcísico (ABA) juega un papel fundamental en la coordinación de la respuesta y adaptación de las plantas a este tipo de estreses, así como en la regulación del crecimiento y desarrollo vegetal. Elementos intermediarios de la ruta de señalización ya habían sido caracterizados, pero aún se desconocía el mecanismo de percepción y transducción de señal de la hormona. Este trabajo de tesis ha contribuido a la caracterización de una nueva familia de receptores intracelulares de la hormona ABA, formada por 14 miembros y denominada PYR/PYL (de pyrabactin resistance / PYR1-like) /RCAR (de Regulatory Component of Abscisic acid Receptor), y a su caracterización estructural y bioquímica. Estas proteínas son capaces de unir de forma específica la hormona ABA. La unión de la hormona induce en estos receptores un cambio conformacional, que les permite regular la actividad de los reguladores negativos de la ruta: fosfatasas del grupo A como ABI1, ABI2 o HAB1 ( Leung et al., 1994; Meyer et al.,1994; Saez et al., 2004). Para la caracterización de estos receptores se han llevado a cabo abordajes genéticos, bioquímicos, de calorimetría y estudios estructurales. / Santiago Cuéllar, J. (2011). Structural insights into ABA perception and signalling: structure of ABA receptor PYR1 [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/13260 / Palancia

La regulación del transporte iónico es importante en mamíferos ya que disfunciones en él producen enfermedades cardiovasculares, neurodegenerativas, etc. En este contexto, se ha descrito que mutaciones en el gen que codifica para la proteína quinasa activada por AMP (AMPK) están asociadas con enfermedades cardiovasculares y neurodegenerativas; como el síndrome de Wolf Parkinson White que provoca arritmias, y la epilepsia mioclónica progresiva de tipo Lafora. La disfunción de transportadores de iones esta implicada en la fisiopatología de estas enfermedades. En la presente Tesis, se profundiza en el modelo constituido por AMPK que regula un canal de sodio (ENaC) a través de la fosforilación de la E3 ubicuitina ligasa Nedd4-2, un regulador directo del canal. Para ello se ha caracterizado la interacción entre AMPK y Nedd4-2 y se ha estudiado como ésta puede afectar a la interacción entre Nedd4-2 y ENaC. El modelo conocido indica que AMPK activada fosforila a Nedd4-2, lo que favorece su interacción con ENaC y por tanto su ubicuitinación, disminuyendo su presencia en la membrana. Durante este trabajo se ha podido comprobar que la interacción física entre AMPK y Nedd4-2 es transitoria o indirecta. Sin embargo, se ha descrito que ambas se regulan de manera recíproca, ya que Nedd4-2 ubicuitina a AMPK y AMPK fosforila a Nedd4-2 en al menos tres residuos. Se ha comprobado que uno de estos sitios de fosforilación tiene un papel relevante en la interacción in vitro de Nedd4-2 con ENaC cuando AMPK está presente y activa. Aunque serán necesarios más abordajes experimentales para definir la relevancia fisiológica de estas modificaciones post-traduccionales, este estudio añade un componente novedoso y profundiza a nivel molecular en la regulación de la E3 ubicuitina ligasa Nedd4-2 por la proteína quinasa AMPK. / Hueso Lorente, G. (2012). Mecanismos de regulación de transportadores de membrana. Interacción entre AMPK y Nedd4.2 [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/14577 / Palancia