Capítulo 1 O diclofenaco de sodio é um antiinflamatório não-esteroidal que, além de atividade antiinflamatória, apresenta também propriedades analgésica e antipirética. Seus efeitos farmacológicos estão relacionados à inibição da síntese de prostaglandinas. Vários métodos utilizando técnicas cromatográficas tem sido propostos para a determinação de diclofenaco em plasma, incluindo a cromatografia gás-líquido com detecção por captura de elétrons ou por ionização de chama, a cromatografia gás-líquido-espectrometria de massa e a cromatografia líquida de alta eficiência com detecção eletroquímica ou no ultravioleta. Descreve-se aqui um método rápido, sensível e específico para a determinação de diclofenaco em plasma usando apenas 200 &#181;l de amostra e envolvendo extração simples e cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) com detecção no ultravioleta. Extraiu-se o diclofenaco adicionando-se 200 &#181;l de plasma a tubos contendo 500 ng de padrão interno (ácido 2-(p-ciclo-hexen- 1\'-il-fenil)propiônico e 100 &#181;l de ácido ortofosfórico 2,5 N. A seguir adicionaram-se 4 ml de diclorometano e extraiu-se a mistura em agitador de tubos durante 60 segundos. Após centrifugação a 3000 rpm por 20 minutos a fase aquosa foi desprezada e a fase orgânica foi filtrada em membrana Millipore&#174; FHLP 01300 de 0,4 &#181;m e evaporada em corrente de nitrogênio a 37°C. O resÍduo foi dissolvido em 100 a 1000 &#181;l de fase móvel para injeção em CLAE. Empregou-se para a separação coluna Novapak&#174; C18, 150 x 3,9 mm, 4 &#181;m e fase móvel constituída por mistura de tampão acetato 0,75 M, pH 5,O e acetonitrila (55:45, v/v). A detecção foi feita em &#955; = 282 nm. O diclofenaco e seu padrão interno foram eluidos respectivamente a 3,3 e 6,5 minutos em fluxo de 0,9 ml/min. Os limites de confiança do método foram: 10-10000 ng/ml. linearidade; 1 ng/ml, sensibilidade; 95 %, recuperação relativa e 3,5 e 5,7 %, precisão intra e interdias, respectivamente. Este micrométodo mostrou-se suficientemente sensível, preciso e exato para estudos de disposição cinética e bioequivalêneia de fomulações contendo diclofenaco. Capítulo 2 Estudou-se a biodisponibilidade do diclofenaco nos produtos Voltaren&#174; 50 (A), Voltaren Retard&#174; 100 (B) e Artren&#174; 100 (C) após administração de dose única peroral de um comprimido a oito voluntários de ambos os sexos, adultos e sadios. As formulações foram administradas seguindo protocolo de estudo estabelecido por sorteio. Os voluntários em jejum receberam os medicamentos em dose única pela manhã e as amostras de sangue foram colhidas 1, 2, 3, 4, 6, 8, 10, 12 e 24 horas após a administração. A concentração plasmática de diclofenaco foi determinada por técnica em cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) de fase reversa com detecção no ultravioleta em &#955; = 282 nm após extração com solvente orgânico em meio ácido. Com base nas curvas \"concentração plasmática (C) vs tempo\" e \"logC vs tempo\" foram detenninados os parâmetros da fase absortiva para os três produtos, em X-&#177; EPM: Cmax= 741 &#177; 137 ng/ml e tmax = 2,6 &#177; 0,4 h para o produto A, Cmax = 1399 &#177; 326 ng/ml e tmax = 2,4 &#177; 0,2 h para o produto B, Cmax = 192 &#177; 70 ng/ml e tmax = 2,3 &#177; 0,2 h para o produto C. Os valores de AUCT, calculados pelo método dos trapezóides e extrapolação a infinito, foram, em X- &#177; EPM: 1603 &#177; 253 ng.h/ml para o produto A, 3177 &#177; 606 ng.h/ml para o produto B, 2237 &#177; 529 ng.h/ml para o produto C. A extensão da biodisponibilidade (EBA) do diclofenaco nos produtos Voltaren&#174; 50 (A) e Artren&#174; 100 (C) foi calculada usando-se como referência o produto Voltaren Retard&#174; 100 (B). Foram obtidos os seguintes valores, em X- &#177; EPM (mediana): 138 &#177; 35 (123) % para o produto A, 102 &#177; 35 (68) % para o produto C. A partir dos resultados obtidos sugere-se que o produto B, citado como de liberação prolongada e usado como referência neste trabalho, apresentou características de rápida liberação, semelhantes às do produto A, sugerindo possível falha de impermeabilização no revestimento dos núcleos contendo diclofenaco de sódio durante o processamento industrial do lote do qual provieram os comprimidos aqui avaliados. Capítulo 3 O diclofenaco é um antiinflamatório não-esteroidal indicado para o tratamento de pacientes portadores de inflamações dolorosas de origem reumática ou não. É biotransformado por reações de oxidação seguidas de conjugação glicurônica. Uma pequena porcentagem do fármaco original sofre glicuronização direta. Vários métodos têm sido propostos para a determinação de diclofenaco e seus produtos de biotransformação em fluidos biológicos, incluindo cromatografia a gás com detecção por captura de elétrons e cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) com detecção eletroquímica ou no ultravioleta. Entretanto, nenhum dos métodos utilizando CLAE mostrou-se suficientemente seletivo para o uso em estudos de disposição cinética. Descreve-se aqui um método sensível e específico para a determinação de diclofenaco e seus produtos de biotransformação hidroxilados em urina por CLAE com detecção no ultravioleta precedida de hidrólise enzimática nas amostras e extração com solvente orgânico em meio ácido. Adicionaram-se 500 &#181;l de urina a tubos contendo 10 mg de mistura de &#946;-glicuronidase e aril-sulfatase e 500 &#181;l de tampão acetato 0,75 M. A mistura foi incubada a 37°C por uma hora e, em seguida, transferiram-se 800 &#181;l do hidrolisado para tubos contendo 3,3 &#181; de padrão interno para diclofenaco (ácido 2-(p-ciclo-hexen-1\'-fenil)propiônico) e 1,0 &#181; de padrão interno para produtos de biotransformação (fenacetina). Procedeu-se à extração com 2 ml de mistura de diclorometano e álcool isopropílico (9:1, v/v) e agitação seguida por centrifugação a 3000 rpm durante 30 minutos. Desprezou-se a fase aquosa e filtrou-se a fase orgânica em sistema Millipore&#174; com membrana FHLP 01300 0,4 &#181;m. O extrato orgânico foi evaporado em corrente de nitrogênio a 37°C e o resíduo, dissolvido em volumes de 500-2000 &#181;l de fase móvel e injetado em CLAE. Usaram-se dois sistemas cromatográficos independentes e consecutivos para a separação do diclofenaco e seus metabólitos hidroxilados. Inicialmente utilizou-se coluna de fase reversa ODS-Shimadzu, 150 x 6,0 mm, 5 &#181;m e fase móvel constituída por tampão acetato 0,01 M, pH 5,0, metanol e acetonitrila (50:40:5) a um fluxo de 1,0 ml/min para eluição do padrão interno (fenacetina) a 10 minutos, 4\',5-di-hidroxidiclofenaco a 12 minutos, 3\'-hidroxidiclofenaco a 34 minutos, 4\'-hidroxidiclofenaco a 40 minutos e 5-hidroxidiclofenaco a 44 minutos. Em seguida utilizou-se a coluna Novapak&#174; C18, 150 x 3,9 mm, 4 &#181;m e fase móvel constituída por tampão acetato 0,75 M, pH 5,0 e acetonitrila (55:45, v/v) e um fluxo de 0,9 ml/min para eluição do diclofenaco a 3,3 minutos e padrão interno (ácido 2-(p-ciclo-hexen-l\'-il-fenil)propiônico, a 6,5 minutos. Os limites de confiança do método foram: 0,4-10,0 &#181;g/ml, linearidade; 0,1 &#181;/ml, sensibilidade, 75 %, recuperação relativa média da extração e precisão intra e interdias variando de 1,3 a 2,2 % e de 3,3 a 5,7 %, respectivamente. O método mostrou-se suficientemente sensível, preciso, exato e específico para o uso em estudos de excreção urinária de diclofenaco e seus produtos de biotransformação hidroxilados. Capítulo 4 Avaliou-se a existência ou não de interação farmacocinética entre a ranitidina e o diclofenaco em voluntários sadios após administração de dose peroral de Voltaren&#174; 50. Selecionaram-se 15 e avaliaram-se oito voluntários adultos, de ambos os sexos, sadios, em estudo constituído por duas fases. Dos oito voluntários, um foi excluído do estudo. Na Fase I o diclofenaco foi administrado isoladamente aos voluntários em jejum pela manhã. Na Fase II, os voluntários foram submetidos a um tratamento de sete dias com ranitidina, depois do qual receberam nova dose de diclofenaco. A administração de ranitidina continuou por mais três dias. Foram colhidas amostras de sangue e urina no intervalo de 0-72 horas após a administração de diclofenaco nas duas fases do estudo. Determinou-se a concentração plasmática e urinária de diclofenaco e a concentração urinária de seus produtos de biotransformação hidroxilados por técnica de cromatografia líquida de alta eficiência, em dois perfis independentes e consecutivos para diclofenaco e produtos de biotransformação, precedida por extração com solvente orgânico em meio ácido e, no caso das amostras de urina, precedida também por hidrólise enzimática. Os valores de \"clearance\" de formação (Clf) dos produtos de biotransformação hidroxilados foram, em X &#177; EPM (mediana): 15,9 &#177; 2,9 (15,2) ml/min para o 4\',5-hidroxidiclofenaco, 3,3 &#177; 0,9 (2,6) ml/min para o 3\'-hidroxidiclofenaco, 22,1 &#177; 5,9 (23,5) ml/min para o 4\'-hidroxidiclofenaco e 8,74 &#177; 1,43 (7,4) ml/min para o 5-hidroxidiclofenaco quando se administrou diclofenaco isoladamente. Não houve alteração significativa destes valores pela associação com a ranitidina. Da mesma forma, o \"clearance\" renal (Clr) do diclofenaco, de 7,1 &#177; 2,8 (5,1) ml/min após administração de diclofenaco isolado, não sofreu alteração significativa pela associação com a ranitidina. A associação com a ranitidina provocou um aumento significativo de cerca de 43 % na meia-vida de eliminação do diclofenaco em plasma, que passou de 1,01 &#177; 0,13 h (X &#177; EPM) na Fase I (fármaco isolado) para 1,44 &#177; 0,34 h na Fase II (fármaco associado), além de causar redução da excreção urinária do produto de biotransformação 4\'-hidroxidiclofenaco, que teve sua fração eliminada total (FelT) reduzida de 5,85 &#177; 1,12 (5,06) % (X &#177; EPM (med)) na Fase I para 4,39 &#177; 0,75 (3,73) % na Fase II. Com base nestes resultados sugere-se que a ranitidina reduza a biotransformação do diclofenaco pela diminuição da excreção renal de seu principal produto de biotransformação hidroxilado (4\'-hidroxidiclofenaco) com conseqüente aumento da meia-vida de eliminação plasmática do diclofenaco. Apesar da interação farmacocinética aqui registrada, a associação diclofenaco-ranitidina é vantajosa para pacientes com história de úlcera péptica, suscetíveis a ulceração recorrente. / Capítulo 1 Diclofenac sodium is a non-steroid anti-inflammatory agent which shows a high degree of anti-inflammatory, analgesic and antipyretic activity . It inhibits prostaglandin biosynthesis in vitro and in vivo, and this inhibitory effect at least partly explains the mechanism of action of the drug. Several methods have been described for the determination of diclofenac in human plasma or serum, including gas chromatography with electron-capture or flame ionization detection, gas-chromatography-mass spectrometry, and high-performance liquid chromatography with UV-detection. We describe a rapid, sensitive and specific procedure for the determination of diclofenac in plasma, using only 200 &#181;l of biological sample, involving single extraction and high-performance liquid chromatography (HPLC) with UV-detection. An extraction with dichlormethane was performed by adding 200 &#181;l of plasma to a test tube containing 500 ng internal standard (2-(p-ciclohexen-1\'-fenil)propionic acid) and 100 &#181;l 2,5 N phosphoric acid. HPLC grade dichlormethane (4 ml) was added and the mixture was agitated with a vortex mixer and eentrifuged at 3000 rpm for 20 minutes. The aqueous phase was discarded and the organic phase filtered through a 0,4 &#181;m FHLP 01300 Millipore&#174; filter and evaporated in a stream of nitrogen at 37°C. The residue was dissolved in 100-1000 &#181;l mobile phase and injected into the liquid chromatograph. Analytical separation was performed in an isocratic system on a reverse-phase column (Novapk&#174; C18, 150 x 3,9 mm, 4 &#181;m). The mobile phase was 0,75 M acetate buffer, pH 5,0 and acetonitrile (55:45, v/v). Peaks were monitored at 955; = 282 nm. Diclofenac and its internal standard were eluted at 3,3 and 6,5 minutes, respeCtively, at a flow rate of 0,9 ml/min. Confidence limits for diclofenac measurements in plasma were: 10-10000 ng/ml, linearity; 1 ng/ml, sensitivity; 95 %, relative recovery, and intra and interassay precision of 3,5 and 5,7%, respectively. This micromethod proved to be sufficiently sensible, precise and accurate for kinetic disposition or bioequivalence studies. Capítulo 2 Bioavailability of diclofenac in two test formulations was compared to a reference after single oral dose to healthy adult volunteers of both sex. Formulations were administered after a fasting night following a randomized study protocol. Blood samples were collected at 1, 2, 3, 4, 6, 8, 10, 12 and 24 hours after dose administration. Diclofenac plasma levels were measured by HPLC technique using a reversed phase system after single extraction with organic solvent in acidic medium.. Peaks were monitored at UV-282 nm. Based on \"plasma concentration vs time\" curves, parameters were determined,expressed as X-&#177; SEM: Cmax = 741 &#177; 137 ng/ml and tmaxm = 2,6 &#177; 0,4 h, product A, Cmax = 1399 &#177; 326 ng/ml and tmax = 2,4 &#177; 0,2 h, product B and Cmax = 192 &#177; 70 ng/ml and tmax = 2,3 &#177; 0,2 h, product C AUCT values, determined by trapezoidal rule and integration to infinity, were, expressed as X- &#177; SEM: 1603 &#177; 253 ng.h/ml, product A, 3177 &#177; 606 ng.h/ml, product B and 2237 &#177; 529 ng.h/ml, product C. Bioavailability (EBA) of diclofenac in test products (A, B) was calculated against reference (B). EBA, expressed as X- &#177; SEM (median), were: 138 &#177;35(123) %, product A and 102 &#177;35 (68) %, product C. Based on this data formulation A and B are bioequivalents while C and B are not bioequivalents. There is a strong evidence that product B, slow-release formulations, as described by the manufacturer, presented fast-release properties. Capítulo 3 Diclofenac is a non-steroidal anti-inflammatory drug (NSAID) advocated for use in painful and inflammatory rheumatic diseases and certain non-rheumatic conditions. Diclofenac is extensively metabolized mainly by oxidative pathways followed by glucuronide conjugation. A small percentage of the original drug is glucuronidated directly. Many methods have been described for the determination of diclofenac and its metabolites in biological fluids, including gas-chromatography with electron-capture detection and high-performance liquid chromatography (HPLC) with UV or electrochemical detection. However, none of the HPLC methods was sufficiently specific for use in kinetic disposition studies. We describe a sensitive and specific procedure for the determination of diclofenac and its hydroxy metabolites in urine, involving single extraction after enzymic hydrolysis of the glucuronic conjugates and HPLC with UV detection. The enzymic hydrolysis was performed by adding 500 &#181;l of urine to test tubes containing 10 mg of a mixture of &#946;-glucuronidase and aril-sulphatase and 500 &#181;l of acetate buffer 0,75 M, pH 5,0. This mixture was incubated at 37°C for one hour. Then, 800 &#181;l of the mixture were transferred to test tubes containing 3,3 &#181;g internal standard for diclofenac (2-(p-ciclohexen-l\'-il-phenyl)propionic acid) and 1 &#181;g internal standard for metabolites (phenacetine). Dichlormethane and isopropyl alcohol (9:1, v/v) (2 ml) was added and the mixture was agitated with a vortex mixer and centrifuged at 3000 rpm for 30 minutes. The aqueous phase was discarded and the organic phase filtered through a 0,4 &#181;m FHLP 01300 Millipore&#174; filter and evaporated in a stream of nitrogen at 37°C. The residue was dissolved in 500-2000 &#181;l mobile phase and injected in the liquid chromatograph. Analytical separation was performed in two independent consecutives isocratic systems on reverse-phase column. In the first HPLC profile an ODS-Shimadzu column, 150 x 6,0 mm, 5 &#181;m and a mobile phase constituted of acetate buffer 0,01 M, pH 5,0, methanol and acetonitrile (50:40:5, v/v) at a flow rate of 1,0 <l/min were used for the elution of internal standard (phenacetine) at 10 minutes, 4\',5-dihydroxydiclofenac at 12 minutes, 3\'-hydroxydiclofenac at 34 minutes, 4\'-hydroxydiclofenac at 40 minutes and 5-hydroxydiclofenac at 44 minutes. In the secondonea Novapak&#174; C18 column, 150x 3,9 mm, 4 &#181;m and a mobile phase constituted of acetate buffer 0,75 M, pH 5,0 and acetonitrile (55:45, v/v) at a flow rate of 0,9 ml/min were used for the elution of diclofenac at 3,3 minutes and internal standard (2-(p-cyclohexen-1\'-phenyl)propionic acid) at 6,5 minutes. Confidence limits for diclofenac an its hydroxy metabolites were: 0,4-10,0 &#181;g/ml, linearity; 0.1 &#181;g/ml, sensitivity, 75 %, mean extraction recovery, and intra and interassay precision ranging from 1,3 to 2,2 % and 3,3 to 5,7 %, respectively. This method proved to be sufficiently sensitive, precise, accurate and specific for urinary excretin studies involving diclofenac and its hydroxy metabolites. Capítulo 4 The pharmacokinetic interaction between diclofenac and ranitidine was evaluated in 8 healthy volunteers after peroral single administration of Voltaren&#174; 50 in a two-phase study protocol. On phase I, diclofenac was administered alone, while on Phase II the volunteers were submitted to a chronic treatment with ranitidine for seven days; then a dose of diclofenac was administered and ranitidine continued for three days afterwards. Blood and urine samples were collected at time intervals 0-72 hours after diclofenac administration. Diclofenac and its hydroxylated metabolites in biological fluids were determined by two independent profiles using HPLC technique after a single extraction with organic solvent in acidic medium. Enzymic hydrolysis was necessary for the cleavage of conjugates in urine. Diclofenac elimination half-life was increased by 43 % ranging from 1,01&#177; 0,13 h to 1,44 &#177; 0,34 h (X &#177; SEM) when ranitidine was coadministered. Significant decrease on FelT of 4\'-OH-D ranging from 5,85 &#177; 1,12 (5,06) % to 4,89 &#177; 0,75 (3,73) % (X &#177; SEM (med)) was obtained by ranitidine association. Clf of metabolites expressed as X &#177; SEM (med) were, in ml/min: 15,9 &#177; 2,9 (15,2) for 4\',5-0H-D, 3,3 &#177; 0,9 (2,6) for 3\'-OH-D, 22,1 &#177; 5,9 (23,5) for 4\'-OH-D and 8,7&#177; 1,4 (7,4) for 5-0H-D after peroral single dose of diclofenac alone. These data showed no significant difference when ranitidine was administered. Diclofenac renal clearance (Clr), expressed as X &#177; SEM (med), was 7,1 &#177; 2,8 (5,1) ml/min after diclofenac and 5,4 &#177; 1,9 (3,5) ml/min, ranitidine. Based on these data, ranitidine decreases the biotransformation of diclofenac by inhibition of hydroxylation affecting urinary excretion of its main hydroxy metabolite, 4\'-hydroxydiclofenac. In spite of this pharmacokinetic interaction, without clinical relevance, patients with a history of peptic ulcer and more susceptible to recurrent ulceration, could benefit from the association diclofenac-ranitidine.

Orientador: Eduardo Alves de Almeida / Coorientador: Daniel Schlenk / Banca: Claudia Bueno dos Reis Martinez / Banca: Gisela de Aragão Umbuzeiro / Banca: Larissa Paola Rodrigues Venancio / Banca: Igor Dias de Medeiros / Resumo: O Brasil é o principal produtor de cana-de-açúcar do mundo e, para que esta demanda seja suprida, muitos compostos químicos são aplicados nas culturas, visando controlar o surgimento e proliferação de pragas. Assim, faz-se o uso dos praguicidas, dentre eles, o diuron (N-(3,4-diclorofenil)-N,N-dimetiluréia), que é aplicado em plantações ao redor do mundo. O diuron pode ser biodegradado em outros três principais compostos o 3,4-dicloroanilina (DCA), 3,4-diclorofenilureia (DCPMU) e 2,4-diclorofenil-N-metilureia (DCPMU). Normalmente, o diuron é aplicado nas plantações juntamente com os alquilfenóis etoxilatos (APE), como o nonilfenol etoxilato (NPE) e o octilfenol etoxilato (OPE), compostos que facilitam a dispersão do diuron. Alguns estudos têm demonstrado que tanto o diuron quanto os alquilfenóis podem causar alterações enzimáticas e/ou estrogênicas em diversos organismos. Dentre as enzimas que podem ser alteradas, estão as enzimas de biotransformação, tanto de fase I (7-etoxirresorufina-O-deetilase - EROD, 7-pentóxiresorufinaO-desalquilase - PROD, 7-benzilóxiresorufina-O-desalquilase - BROD e a P450 aromatase), quanto as de fase II (glutationa-S-transferase - GST) e as proteínas de fase III (resistência a multixenobioticos - MXR). Outros parâmetros que podem sofrer alterações são os antioxidantes (superóxido dismutase - SOD, catalase - CAT, glutationa peroxidase - GPx, glutationa redutase - GR, glutationa-6-fosfato desidrogenase - G6PDH, aldeído desidrogenase - ALDH e... / Abstract: Brazil is the main sugar cane producer in the world, and to support these productions many chemical compounds have being apply in agriculture, aiming to control the appearance and proliferation of pests. Therefore, the use of pesticide, as diuron, (N- (3,4-dichlorophenyl) -N,N-dimethylurea), in some crops in the world is common. Diuron can be biodegraded in three others compounds, 3,4-dichloroaniline (DCA), 3,4-dichlorophenylurea (DCPU) and 2,4-dichlorophenyl-N-methylurea (DCPMU). Normally, diuron have being applied associated with alkylphenols ethoxylates (APE), like nonilphenol (NP) and octylphenol (OP), which increase the solubility and dispersion of the herbicide. Some studies have shown that diuron and alkylphenols can cause enzymatic and/or estrogenic changes, in various organisms. Therefore, biotransformation enzymes, phase I (7-ethoxirresorufin-O-deethylase - EROD, 7- pentaxirisorufin-O-dealkylase - PROD, 7-benzyloxysorufin-O-desalkylase - BROD and P450 aromatase), phase II (glutathione-S-transferase-GST) and phase III proteins (multixenobiotic resistance - MXR), and antioxidant parameters (superoxide dismutase - SOD, catalase - CAT, glutathione peroxidase - GPx, glutathione reductase - GR, glutathione-6-phosphate dehydrogenase - G6PDH, aldehyde dehydrogenase - ALDH and lipid peroxidation), which are responsible for the control between production and degradation of reactive oxygen species (ROS). The endocrine parameters that can be altered and used as biomarkers are ... / Doutor

Biotransformações são reações de compostos orgânicos realizadas por microrganismos, plantas ou enzimas isoladas. A transformação de um composto em particular pode ser realizada em grupos funcionais com ou sem degradação de seu esqueleto. Neste trabalho foram utilizados fungos endofíticos e de solo na biotransformação da lactona sesquiterpênica enidrina e do diterpeno afidicolina. A enidrina possui atividade antidiabética e anti-inflamatória. A afidicolina possui pronunciada atividade antitumoral, antiviral e leishmanicida. Foram realizados experimentos de biotransformação da enidrina e da afidicolina com os fungos endofíticos Penicillium crustosum VR4, Papulospora immersa SS13, Fusarium oxysorium SS50 e com o fungo de solo Rhizopus stolonifer. A biotransformação da enidrina com fungo endofítico Papulospora immersa SS13 levou à obtenção de um derivado di-hidroxilado, produzido pela abertura do epóxido presente no éster da cadeia lateral desta lactona sesquiterpênica. Este produto só havia sido previamente obtido na literatura por semi-síntese a partir da enidrina. Os experimentos de biotransformação da afidicolina não levaram ao isolamento e identificação de produtos. Reações semi-sintéticas com a afidicolina foram mais eficientes para a obtenção de derivados deste diterpeno. Foram obtidos cinco derivados semi-sintéticos da afidicolina: dois derivados mono-éteres de silício, um di-éter de silício, um derivado tetra-acetilado e um tri-acetilado. Ainda, na purificação dos produtos reacionais isolou-se o produto natural 3-desoxiafidicolina. Todos os derivados afidicolanos foram submetidos ao ensaio frente a Leishmania major. A afidicolina, a 3-desoxiafidicolina e a afidicolina tri-acetilada exibiram as atividades leishmanicidas mais significativas. Foram calculadas as lipofilicidades dos derivados afidicolanos. A maior atividade observada para o derivado tri-acetilado da afidicolina pode estar relacionada com sua maior capacidade de cruzar as membranas celulares. Este trabalho levou ao isolamento de um produto de biotransformação da enidrina e à identificação de novos derivados afidicolanos naturais e semi-sintéticos com atividade leishmanicida. / Biotransformations are reactions of organic compounds made by intact microbial cells, plant cells or enzymes isolated. The transformation of a particular compound can be carried out at functional groups, with or without degradation of the carbonic skeleton. In this work endophytic and soil fungal strains were applied for the biotransformation of the bioactive terpenes enhydrin (sesquiterpene lactone) and aphidicolin (diterpene). Enhydrin shows anti-diabetic and anti-inflammatory activity. Aphidicolin has been reported as an antiviral, antitumoral and leishmanicidal hit. The endophytes Penicillium crustosum VR4, Papulospora immersa SS13, Fusarium oxysporium SS50 and the soil fungus Rhizopus stolonifer have been screened for the biotransformation of enhydrin and aphidicolin. The biotransformation of enhydrin, catalyzed by the endophytic P. immersa SS13, led to the isolation of a dihydroxy-derivative, a product of the sesquiterpene lactone side chain epoxide opening. This product had only been obtained previously by chemical means. The biotransformation experiments using aphidicolin as substrate were not successful in the production of derivatives. The derivatives of aphidicolin were more efficiently prepared through semi-synthetic approaches. Five aphidicolin semi-synthetic derivatives were obtained: two silicon mono-silyl ether derivatives, one silicon bis-silyl ether derivative, one tetra-acetylated derivative and one triacetylated derivative. During the purification of synthetic mixtures, the natural product 3-deoxyaphidicolin was also isolated. All the aphidicolane derivatives have been assayed against Leishmania major. Aphidicolin, 3-deoxyaphidicolin and triacetylated aphidicolin showed the higher leishmanicidal activities. The lipophilicities of aphidicolane derivatives were calculated. The higher activity presented by the triacetylated aphidicolin may be due to its higher ability to cross the cell membranes. This work led to the isolation of one biotransformation product of enhydrin and to the identification of new natural and semi-synthetic leishmanicidal aphidicolanes.

Oleorresinas de espécies de Copaifera sp são amplamente utilizadas na medicina popular brasileira e estudos químicos e biológicos demonstram que diterpenos e sesquiterpenos estão entre os principais compostos bioativos das oleorresinas. Um importante fator para a avaliação da segurança e eficácia de fármacos é o conhecimento sobre o seu metabolismo, o qual pode ser adquirido por meio de estudos de biotransformação utilizando fungos filamentosos e bactérias do trato gastrointestinal. Os fungos filamentosos são organismos eucariotos e o aparato enzimático se assemelha com o dos mamíferos podendo contribuir para a elucidação de rotas metabólicas fornecendo informações sobre a formação de produtos farmacologicamente ativos, inativos ou tóxicos para o organismo. Esses estudos podem ainda contribuir para a obtenção de substâncias inéditas com potencial atividade biológica. O uso de bactérias da microbiota intestinal em estudos de metabolismo também é importante, pois os medicamentos e alimentos, quando ingeridos, podem ser metabolizados por essas bactérias que colonizam o trato gastrointestinal. O objetivo deste estudo foi avaliar o potencial de fungos filamentosos e de bactérias do trato gastrointestinal para biotransformar o ácido 3?-acetoxi-copálico e ?-cariofileno, presentes em oleorresinas de Copaifera, bem como isolar os produtos de biotransformação para avaliação da citotoxidade. Os experimentos de biotransformação foram realizados com 10 linhagens de fungos filamentosos e com 8 linhagens de bactérias do trato gastrointestinal. Os extratos obtidos em acetato de etila das culturas das biotransformações do diterpeno foram analisados por CLAE/DAD/CAD e CLAE-EM e os extratos obtidos em n-hexano e em acetato de etila das culturas das biotransformações do sesquiterpeno, bem como a fração volátil captada das culturas por microextração em fase sólida (SPME) no modo headspace, foram analisados por CG-EM. Todos os micro-organismos testados foram capazes de biotransformar o ácido 3?-acetoxi-copálico e 9 produtos de biotransformação foram isolados, suas estruturas químicas foram identificadas, sendo seis inéditos e todos os produtos foram avaliados quanto a atividade citotóxica frente às linhagens celulares de glândulas mamárias normais (MCF-10A) e de adenocarcinoma mamário (MCF-7). Todos os metabólitos do ácido 3?-acetoxi-copálico apresentaram menor citotoxidade frente as linhagens avaliadas do que o próprio ácido 3?-acetóxi-copálico. Os fungos A. niger, A. brasiliensis e as três linhagens de Cunninghamella foram capazes de biotransformar o ?-cariofileno. Entretanto, como não foram obtidos bons rendimentos nesses processos, não foi possível isolar os produtos de biotransformação. Com os dados obtidos foi possível apenas elaborar uma proposta para a estrutura química de um dos produtos oriundos da biotransformação do ?-cariofileno realizada com C. echinulata ATCC 9245. / Oleoresins from Copaifera sp species are widely used in Brazilian folk medicine and chemical and biological studies showed that diterpenes and sesquiterpenes are among the main bioactive compounds of oleoresins. An important factor for assessing the safety and efficacy of drugs is the knowledge about their metabolism, which can be acquired through biotransformation studies using filamentous fungi and human gut bacteria. Filamentous fungi are eukaryotic organisms and the enzymatic apparatus is similar to those of mammals and may contribute to the elucidation of metabolic pathways providing information on the production of pharmacologically active, inactive or toxic compounds to the organism. These studies may also contribute to provide new compounds with potential biological activity. The use of human gut bacteria in metabolism studies is also important because drugs and foods, when ingested, can be metabolized by bacteria that colonize the gastrointestinal tract. The aim of this study was to evaluate the potential of filamentous fungi and human gut bacteria to biotransform 3?-acetoxy-copalic acid and ?-caryophyllene found in oleoresins from Copaifera as well as to isolate the biotransformation products for evaluation of their cytotoxicity. Biotransformation experiments were carried out with 10 filamentous fungi strains and 8 human gut bacteria strains. The ethyl acetate extracts obtained from the biotransformation processes of diterpene were analyzed by HPLC/DAD/CAD and HPLC-MS and n-hexane and ethyl acetate extracts obtained from the biotransformation processes of sesquiterpene, as well as the volatile fraction collected by solid phase microextraction headspace, were analyzed by GC-MS. All tested microorganisms were able to biotransform the 3?-acetoxy-copalic acid and 9 biotransformation products were isolated, their chemical structures were identified, from which six are new and all the products were evaluated for cytotoxic activity against normal mammary gland (MCF-10A) and breast adenocarcinoma (MCF-7) cell lines. All metabolites of 3?-acetoxy-copalic acid showed lower cytotoxicity against the evaluated cell lines than the 3?-acetoxy-copalic acid. The fungi A. niger, A. brasiliensis and the three Cunninghamella strains were able to biotransform ?-caryophyllene. However, as good yields were not achieved in these processes, it was not possible to isolate the biotransformation products. The obtained data became possible to just make a proposal for the chemical structure of a product from the ?-caryophyllene biotransformation process performed by C. echinulata ATCC 9245.

Neste trabalho foram investigados sistemas modelos do citocromo P450 para o estudo do metabolismo da monensina A empregando três estratégias de abordagem: a) utilização de metaloporfirinas e complexos salen como catalisadores para a oxidação da monensina A por diferentes oxidantes e meios reacionais; b) utilização de fungos de diferentes cepas para estudos de biotransformação deste antibiótico e c) emprego de microssomas de fígado de ratos e humanos para o estudo do metabolismo in vitro da monensina A. Os produtos obtidos nestes três sistemas foram comparados com os metabólitos formados em estudos in vivo relatados na literatura. Os resultados obtidos com os sistemas envolvendo os catalisadores mostraram que a formação dos produtos é dependente da escolha do meio reacional e do oxidante empregado. Os estudos de biotransformação da monensina A empregando microssomas de fígado e os fungos Aspergillus awamori, Beauveria bassianna, Cunninghamella echinulata, Cunninghamella elegans, Fusarium oxysporum, M61, Mucor rouxii e Penicillium brevicompactum mostraram que estes sistemas são viáveis nos processos de biotransformação deste fármaco nas condições empregadas. Os produtos obtidos nas reações e/ou meios de cultura com os diferentes sistemas foram identificados por espectrometria de massas sequencial e também por comparação com padrões obtidos anteriormente. Foram obtidos três principais metabólitos: (i) 3-O-desmetil-monensina A, (ii) 12-hidroxi-monensina A e (iii) 12-hidroxi-3-O-desmetil-monensina A, os quais coincidem com os principais metabólitos obtidos em estudos in vivo. Assim, os resultados mostraram que os modelos estudados podem ser usados para predizer o metabolismo da monensina A. Os metabólitos 3-O-desmetil-monensina A e 12-hidroxi-monensina A puderam ser produzidos e isolados dos sistemas catalíticos envolvendo a metaloporfirina e o catalisador de Jacobsen. Os ensaios biológicos de atividade tóxica em mitocôndrias, bem como a atividade antimicrobiana da monensina A e de seus metabólitos 3-O-desmetil-monensina A e 12-hidroxi-monensina A mostraram que estes metabólitos possuem menor ou nenhuma atividade nos parâmetros biológicos testados quando comparados à monensina A. Assim, pode-se inferir que o metabolismo da monensina A corresponde a uma via de detoxicação clássica, através da qual as moléculas produzidas são mais polares, dificultando o transporte de complexos catiônicos através das membranas, diminuindo suas propriedades biológicas e facilitando a sua eliminação. / This study used model systems to investigate monensin A metabolism. More specifically, this work employed three strategies: (i) use of biomimetic systems, involving metalloporphyrins and salen complexes, to catalyze monensin A oxidation by different oxidants in distinct reaction media; (ii) application of different fungal strains to conduct biotransformation studies of this antibiotic; and (iii) use of rat and human liver microsomes as a cytochrome P450 model to monitor the in vitro metabolism of monensin A and compare the products with the metabolites generated in in vivo studies reported in the literature. Studies involving chemical catalysts showed that product formation depended on the choice of reaction medium and oxidant. Monensin A biotransformation studies employing fungi revealed that Aspergillus awamori, Beauveria bassianna, Cunninghamella echinulata, Cunninghamella elegans, Fusarium oxysporum, Marine M61, Mucor rouxii, and Penicillium brevicompactum successfully biotransformed the drug under the employed conditions. Liver microsomes also effectively transformed the target compound. Spectrometric analysis of the evaluated models attested to the formation of three main metabolites: (i) 3-O-demethyl monensin A, (ii) 12-hydroxy monensin A, and (iii) 12-hydroxy-3-O-demethyl-monensin A as the main monensin A derivatives. The products were identified by tandem mass spectrometry as well as by comparison with standards obtained in other studies. Taken together, the results demonstrated that the models studied herein could help to predict monensin A metabolismthey produced the main metabolites obtained in in vivo studies. Toxicity tests performed on mitochondria and antimicrobial assays revealed that the metabolites 3-O-demethyl-monensin A and 12-hydroxy-monensin A isolated from the reactions that employed chemical catalysts were less active or inactive as compared with monensin A. Therefore, it was possible to infer that monensin A metabolism is a classical detoxification pathway that generates polar molecules. The transport of such cationic molecules through the membrane is more difficult, decreasing their biological properties and facilitating their elimination.

Em face das recentes exigências das agências regulatórias quanto à aprovação de novos fármacos, os estudos de biotransformação têm-se tornado uma etapa indispensável para a identificação e otimização de compostos bioativos. O objetivo desses estudos é identificar, já nas fases iniciais da descoberta de fármacos, candidatos que apresentam propriedades indesejáveis como a (i) presença de metabólitos ativos ou tóxicos; (ii) inibição de enzimas metabolizadoras; (iii) depuração metabólica inadequada, entre outras. Neste estudo, foi realizada a caracterização metabólica e a identificação de possíveis inibidores das enzimas do citocromo P450 de oito promissores candidatos a fármacos, identificados através de ensaios virtuais como inibidores da TcGAPDH, Cruzaina e TcDHODH, todas do Trypanosoma cruzi, agente causador da doença de Chagas. Esses compostos foram testados contra as três principais isoformas do citrocromo P450: CYP 3A4, CYP 2D6 e CYP2C9. Os valores de IC50 de 1,4 &micro;M e 1,3 &micro;M contra a CYP2C9 foram encontrados para os compostos Nequimed53 e Nequimed125, enquanto o Nequimed42 inibiu a CYP 3A4 com um valor de IC50 de 7,12 &micro;M. Posteriormente foi conduzida a caracterização metabólica dos compostos Nequimed53 e 125 com foco na identificação dos principais metabólitos, sítios de metabolismo e vias de biotransformação através da técnica de LC-ESI-QqTOF-MS. Para ambos os compostos, a biotransformação por microssomas extraídos de fígado de ratos deu-se preferencialmente por uma única via dependente de NADPH. No caso do Nequimed54, o metabólito formado apresentou uma variação da razão m/z de +16, indicando a ocorrência da hidroxilação do composto parental, enquanto que para o composto Nequimed125, o metabólito formado apresentou uma variação da razão m/z de -28, condizente com a perda de um fragmento etila do composto parental. / In the light of recent demands from regulatory agencies for the acceptance of new drugs, the biotransformation studies have become an essential step for the identification and optimization of bioactive compounds. The objective of these studies is to identify compounds that have undesirable properties such as (i) the presence of toxic or active metabolites, (ii) inhibition of metabolizing enzymes, (iii) excessive metabolic clearance, inter alia. In this study we characterized the metabolism and cytochrome P450 inhibition of eight compounds identified by virtual screening as inhibitors of TcGAPDH, Cruzain and TcDHODH which are of interest as targets for intervention in treatment of Chagas Disease. These compounds were tested against cytochrome P450 isoforms 3A4, 2D6 and 2C9. IC50 values of 1.4 &micro;M and 1.3 &micro;M against CYP 2C9 were observed for Nequimed53 and Nequimed125.while Nequimed42 inhibited CYP 3A4 with an IC50 of 7.1 &micro;M. Subsequently, we characterized the in vitro metabolism of Nequimed53 and 125 with a focus on metabolite identification and biotransformation pathways using the LC-ESI-MS-QqTOF technique. For each, the biotransformation by rat liver microsomes occurred by a single NADPH-dependent pathway. For Nequimed54, the observed metabolite [M+16]+ indicated hydroxylation of parent compound. The metabolite [M-28]+ observed for Nequimed125 indicated desethylation of the parent compound.

A hidroquinona (HQ) é um composto fenólico obtido a partir da metabolização endógena do benzeno, está presente no cigarro, medicamentos, reveladores fotográficos, alimentos e plantas medicinais. Temos demonstrado que a intoxicação experimental de ratos à HQ compromete a migração de leucócitos para o pulmão na vigência de resposta inflamatória alérgica ou inespecífica. O presente trabalho visou avaliar os efeitos da HQ sobre atividades da célula endotelial e de neutrófilos envolvidas na inflamação. Culturas primárias de células endoteliais da rede microcirculatória obtidas do músculo cremaster de ratos Wistar, machos, foram tratadas com HQ (10 ou 100 µM, 2 horas) e posteriormente incubadas ou não com LPS de E. coli (LPS; 2 µg/mL). Neutrófilos obtidos da cavidade peritoneal de ratos Wistar, 4 horas após a injeção local de glicogênio de ostra (10 mL, 1%) , foram tratados com HQ (5 ou 10 µM, 1 hora) e, em seguida, foram incubados ou não com LPS (5 µg/mL). Células controles receberam volumes equivalentes dos veículos da HQ e do LPS. Os dados obtidos mostram que o tratamento com a HQ não induziu necrose ou apoptose em ambos os tipos celulares; reduziu a produção de NO pela célula endotelial e por neutrófilos, por bloqueio das atividades das óxido nítrico sintases; reduziu a expressão gênica e protéica de TNF-&#945;, IL-6 e IL-1&#946; induzida pelo LPS em neutrófilos, possivelmente decorrente de redução da translocação nuclear do NF&#954;B; por outro lado aumentou a expressão gênica e protéica basal de TNF-&#945;, IL-1&#946;, ICAM-1, PECAM-1 e VCAM-1, bem como a translocação nuclear do NF-&#954;B; reduziu a atividade fagocítica e microbicida de neutrófilos frente a Candida albicans; não afetou a expressão gênica da CYP2E1 em ambos os tipos celulares, mas aumentou a expressão gênica de MPO em neutrófilos. Em conjunto, os dados permitem concluir que a HQ atua diferentemente nos dois tipos de células estudadas, ativando e inibindo propriedades inflamatórias na célula endotelial e nos neutrófilos, respectivamente. É possível as ações sobre os neutrófilos possam contribuir, pelo menos em parte, pela redução da migração celular durante a resposta inflamatória observada após exposição in vivo à HQ. / Hydroquinone (HQ) is a fenolic compound obtained after benzene metabolism, it is a component of cigarette, medicines, photographic developer, and it is also finding in some foods and medicinal herbs. Our research group has been shown that rats in vivo exposed to HQ present impaired leukocyte migration into lung during allergic or non-specific inflammation. In the present study, we investigate the effects of HQ on functional activities of neutrophils and endothelial cells (EC) involved in inflammation. Primary cultured EC was obtained from microcirculatory network of male Wistar rats, and treated with HQ (10 or 100 µM, two hours). After the treatments, EC was incubated in presence or absence of lipopolissacharide of E. coli (LPS; 2 µg/mL). Peritoneal neutrophils obtained four hours after local injection of oyster glycogen (10 mL, 1%) were incubated with HQ (5 or 10 µM, one hour) and in sequence it was incubated in presence or absence of LPS (5 µg/mL) .Control cells were cultured with equivalent volumes of HQ and LPS vehicle. Results obtained showed that treatment with HQ did not induce apoptosis or necrosis in both types of cells; impaired NO production by endothelial cells and neutrophils dependent on blockade of Ca+2-dependent and independent NOS activity; decreased gene and protein expression of TNF-&#945;, IL-6 and IL-1&#946; in neutrophils induced by LPS, possibly due to reduced nuclear translocation of the NF-&#954;B. On the other hand, HQ treatment enhanced basal protein and gene expression of TNF-&#945;, IL-1&#946; , ICAM-1, PECAM-1 and VCAM-1 and the nuclear translocation of NF-&#954;B; impaired Candida albicans phagocytic and killing indexes; did not affect the gene expression of CYP2E1 in both types of cell, but increased the gene expression of MPO in neutrophils. Taken together, results obtained show that HQ acts differently in the two types of cells studied, activating and inhibiting inflammatory properties in endothelial cells and neutrophils, respectively. Actions on neutrophils may contribute, at least in part, on the reduced leukocyte recruitment during in vivo HQ exposure.

O câncer é a segunda maior causa de morte no Brasil, atrás apenas de doenças cardíacas. Por isto, é evidente que grandes recursos sejam direcionados para a pesquisa no descobrimento de novas opções com a finalidade de erradicar esta doença. Dentre estas opções, a quimioprevenção do câncer tem chamado a atenção já que, mesmo com os imensos avanços no conhecimento sobre os mecanismos da carcinogênese e conseqüente desenvolvimento de novas drogas, os dados estatísticos de mortalidade não se tornaram menores. Somando-se a estes fatos, deve ser considerado que no Brasil o tratamento padrão do câncer não chega a todas as pessoas por ser extremamente caro. Desta forma, a quimioprevenção do câncer com fatores presentes na dieta ou oriundos de fontes consideradas baratas como fitoterápicos, deve ser apreciada. Assim, este trabalho teve como objetivo avaliar os efeitos quimiopreventivos e antineoplásicos de uma planta brasileira, o guaraná (Paullinia cupana Mart var. sorbilis). Foram utilizados alguns experimentos em camundongos como indução genotóxica em fígado pela Dietilnitrosamina (DEN); carcinogênese pulmonar induzida pela 4-(metilnitrosamino)-1-(3-piridil)-1-butanona (NNK), uma nitrosamina presente no tabaco; tumor ascítico de Ehrlich; disseminação hematógena de melanoma B16/f10; e cultivo de células tumorais e não tumorais. Além disso, caracterizou-se o papel da Conexin43 na carcinogênese pulmonar induzida pelo NNK e os efeitos do guaraná sobre o receptor CAR e sua ação quando da administração do ligante do CAR, 1,4-bis[2-(3,5-dichloropiridiloxi)]benzeno (TCPOBOP). Pudemos observar efeitos quimiopreventivos e antineoplásicos do guaraná dependendo do modelo utilizado, demonstrando que seu modo de ação principal é a redução da proliferação celular. Além disso, observamos que os tumores de pulmão dos animais tratados com a planta apresentavam menor tamanho, menor grau maligno, menor índice de proliferação celular e menor ativação do fator de transcrição CREB. Observamos também que a Conexina43 (Cx43) tem importante papel na carcinogênese pulmonar induzida pelo NNK, atuando como supressor tumoral e em fases tardias possivelmente tendo papel inverso, ou seja, como um oncogene. Caracterizamos os efeitos do guaraná sobre a ativação do receptor CAR e demonstramos que, por si só, o guaraná induz a expressão do CAR, além de alterar a expressão de alguns de seus transcritos como a CYP2B10 e CYP3A11. Ao analisarmos os efeitos de extratos de guaraná sobre células de tumor de pulmão (E9) in vitro, verificamos o mesmo efeito antiproliferativo, diminuindo a expressão do PCNA e da Conexina43 de maneira dose-dependente, além de verificar um aumento da expressão do receptor CAR. Ao fim propomos uma hipótese de mecanismo de ação baseando-se nas alterações encontradas oriundas da administração do guaraná. Concluímos que o guaraná apresenta componentes com ação antitumoral em camundongos, tendo efeito quimiopreventivo ou antineoplásico dependendo do modelo utilizado. / Cancer is the second biggest cause of deaths in Brazil, only behind of cardiac diseases. As a result, it is evident that great resources for research will be directed towards the discovery of new options to eradicate this disease. Among these options, cancer chemoprevention has calling for attention since the huge advances in the knowledge of carcinogenesis and development of new drugs did not decrease statistical data on mortality due to cancer. In addition, it must be considered that in Brazil, cancer therapy is not available for all given that it is too expensive. Therefore, cancer chemoprevention with dietary factors or from medicinal plants has got to be treasured. Following these lines, the aim of this work was to evaluate the chemopreventive and antineoplastic effects of a Brazilian plant, Paullinia cupana Mart var. sorbilis, most known as guarana. It was used several experiments in mice and cell culture essays as: protection against DEN-induced DNA damage; NNK-induced lung carcinogenesis; Ehrlich Ascitic Tumor; metastasis of B16/f10 melanoma cells; and cell culture of a tumorigenic and a non-tumorigenic cell lines. Additionally, it was characterized the role of Connexin43 in the NNK-induced lung carcinogenesis and the effects of guarana on the CAR receptor before and after the administration of TCPOBOP. We note a chemopreventive or antineoplastic effect of guarana depending on the model employed and showed that the mode of action responsible for these effects was reduced cell proliferation. Also, the lung tumors of guarana-treated animals were smaller, less aggressive, with decreased cell proliferation and CREB activation. On the other hand, we observed that Connexin43 have an important role on NNK-induced lung carcinogenesis because it may act as a tumor suppressor and in advanced stages as an oncogene. The effects of guarana on the CAR activation were characterized and we showed that guarana induces CAR mRNA expression, altering the levels of its transcripts as CYP2B10 and CYP3A11. We also examined the effects of guarana extracts on a lung tumor cell culture (E9 cells) and demonstrated the same antiproliferative effect observed previously, by decreased PCNA and Connexin43 proteins in a dose-dependent manner along with an increase in CAR protein. At last we hypothesized a mechanism of action for guarana effects basing in our findings. We concluded that guarana presents substances that have antitumoral effects in mice, enclosing a chemopreventive or antineoplastic effect depending on the model studied.

A soja (Glycine max) contém uma variedade de compostos com comprovada atividade biológica, tais como as isoflavonas, que estão presentes em diferentes formas, glicosiladas e agliconas. Além disso, a soja contém uma grande quantidade de proteínas, que são consideradas fontes de peptídeos bioativos. As isoflavonas agliconas, daidzeína e genisteína, possuem maior atividade antioxidante que as glicosiladas, daidzina e genistina. No entanto, os grãos de soja são ricos nas formas glicosiladas das isoflavonas. Estudos mostram que a biotransformação da soja, por micro-organismos e enzimas, leva ao aumento dos teores das isoflavonas agliconas, as quais são liberadas pela ação de enzimas -glicosidases, que clivam as ligações -glicosídicas das isoflavonas glicosiladas, e também pode possibilitar a hidrólise das proteínas da soja. Além disso, pesquisadores têm demonstrado aumento na atividade antioxidante e na prevenção e/ou supressão de certos cânceres após biotransformação da soja. Neste contexto, foi realizada a biotransformação da soja pelo fungo A. awamori, e por uma mistura enzimática, proveniente do processo fermentativo deste fungo na soja. Os extratos da soja biotransformada, não biotransformada, e o extrato comercial isoflavin beta®, rico em isoflavonas, foram avaliados quanto aos perfis cromatográficos, teores de daidzeína, genisteína, proteínas, aminoácidos e/ou peptídeos, potencial antioxidante e atividade citotóxica frente a células de fibroblasto e melanoma. O modo de morte celular das células de melanoma, necrose ou apoptose, também foi avaliado. A biotransformação da soja, pelos dois processos, resultou em extratos enriquecidos com isoflavonas agliconas e aminoácidos e/ou peptídeos, e com maior atividade antioxidante que o extrato da soja não biotransformada. Os dois processos de biotransformação da soja resultaram em extratos com características químicas e biológicas diferentes. O conteúdo de daidzeína, proteínas, aminoácidos e/ou peptídeos encontrados no extrato da soja biotransformada pelo fungo foram 6%, 56% e 357%, respectivamente, superiores ao extrato da soja biotransformada pela mistura enzimática. Ao contrário do observado para o teor de genisteína que foi 48% maior no extrato da soja biotransformada pela mistura enzimática. O extrato da soja biotransformada pelo fungo apresentou maior atividade antioxidante que o extrato da soja biotransformada pela mistura enzimática, além disso, foi o único dos extratos aqui estudados que apresentou citotoxicidade seletiva para as células de melanoma, induzindo morte celular por apoptose destas células cancerosas. Sendo assim, os resultados obtidos pelo extrato da soja biotransformada pelo fungo A. awamori fornecem boas perspectivas para futura utilização deste extrato como antitumoral. / Soybean (Glycine max) contains a variety of compounds with proven biological activity, such as isoflavones, which are present in different forms, glycosides and aglycones. In addition, soybean contains a lot of proteins, which are considered sources of bioactive peptides. The aglycone isoflavones, daidzein and genistein, have higher antioxidant activity than the glucoside ones, daidzin and genistin. However, soybean grains are rich in the glycosylated forms of isoflavones. Studies have shown that the soybean biotransformation, by microorganisms and enzymes, lead to increased levels of aglycone isoflavones, which are released by the action of -glycosidase enzymes, which cleave the -glycosidic bonds of isoflavone glucosides, and can also allow the hydrolysis of soybean proteins. Additionally, researchers have shown an increase in the antioxidant activity and in the prevention and/or suppression of certain cancers after soybean biotransformation. In this context, it was performed the biotransformation of soybeans with the fungus A. awamori, and with an enzyme mixture, from the fermentation process of the fungus in soybean. The biotransformed, the non biotransformed soybean extracts and the marketed isoflavin beta® extract rich in isoflavones, were evaluated regarding their chromatographic profiles, levels of daidzein, genistein, proteins, amino acids and/or peptides, the antioxidant potential and the cytotoxic activity against melanoma cells and fibroblasts. The mode of cell death of melanoma cells, necrosis or apoptosis, was also evaluated. The biotransformation of soybean by the two processes resulted in extracts enriched with aglycone isoflavones and aminoacids and/or peptides, and with antioxidant activity higher than the non biotransformed soybean extract. The two processes of soybean biotransformation resulted in extracts with different chemical and biological characteristics. The contents of daidzein, proteins, aminoacids and/or peptides found in soybean extract biotransformed by the fungus were 6%, 56% and 357%, respectively, higher than the soybeam extract biotransformed by the enzyme mixture. Contrary to what was observed with the genistein content that was 48% higher in the soybean extract biotransformed by the enzyme mixture. The soybean extract biotransformed by the fungus had a higher antioxidant activity than the soybean extract biotransformed by the enzyme mixture, moreover, it was the unique extract among the ones studied in this work that showed selective cytotoxicity to melanoma cells, inducing cell death by apoptosis of these cancer cells. Thus, the obtained results of the soybean extract biotransformed by the fungus A. awamori provide good prospects for future use of this extract as antitumoral.

Made available in DSpace on 2016-06-02T19:29:51Z (GMT). No. of bitstreams: 1 4461.pdf: 864627 bytes, checksum: 65403dae241e7d12b25fab4c53a4ee0b (MD5) Previous issue date: 2012-03-30 / The use of biomarkers can provide a great help in the evaluation of the damages caused by pesticides in aquatic organisms. The present study aimed to verify the toxicity of clomazone and ametryn for a tropical freshwater fish Prochilodus lineatus by using different parameters in fish exposed for 96h to clomazone (1, 5 and 10 mg.L-1) and to ametryn, as the commercial product GesapaxR500 or in its pure form, in the concentrations 2.5 and 5.0 mg.L-1, or only to water (CTR). The parameters used were: hematological; metabolic (concentration of glucose); osmoionic (osmolarity and plasmatic Cl-, Na+ e K+); biochemical and genotoxic (DNA damage). Clomazone caused hematological disturbances in P. lineatus as noted in the lowervalues of hematocrit (Hct) in 10 mg.L-1; hemoglobin (Hb), mean corpuscular hemoglobin (HCM) and mean corpuscular hemoglobin concentration (CHCM) in 5 and 10 mg.L-1, which, in general, may indicate anemia. The number of erythrocytes (RBC) presented increased values in the lowerconcentration tested for clomazone, which probable is related to the stress response, with the releasing of immature erythrocytes in the blood stream. Clomazone also activated the detoxification and antioxidant pathways of the tested animals, as shown by the increased activity of the hepatic biotransformation enzyme glutathione-S-transferase (GST) and the antioxidant enzyme catalase (CAT) in 5 and 10 mg.L-1. The reduced activity of glutathione peroxidase (GPx) observed in 5 and 10 mg.L-1 indicated efficient performance of CAT removing the H2O2, or even a competition with GST for the substratereduced glutathione (GSH). The activity of brain acetylcholinesterase (AChE) in P. lineatus was inhibited in the concentrations of 5 and 10 mg.L-1 of clomazone, showing that this herbicide has an anticholinesterasic effect on the studied fish species. Fish exposed to ametrynshowed hematological disturbances such as lower values of Hct in 2.5 and 5.0 mg.L-1 and of RBC in the concentration of 5.0 mg.L-1. The reduction of plasmatic K+ in the concentration of 2.5 mg.L-1, and the hematological alterations mentioned above, may indicate a rupture of the erythrocytes. Fish exposed both to pure ametrynand the formulated product, showed higher values of glucose as a stress response, in both concentrations tested. The two products also caused inhibition of the gill activity of Na+/K+ATPase in 5.0 mg.L-1. The concentration of 5.0 mg.L-1 caused significant decrease in the malondialdehyde (MDA) levels, leading to the conclusion that ametrynor its formulated product do not generate lipidic peroxidation. DNA damages in the erythrocytes of P. lineatus were x observed in the concentration of 5.0 mg.L-1 of ametryn and GesapaxR 500, showing the genotoxicity of ametryn, probably because it binds directly to the genetic material of the fish. The results presented here allow concluding that the pesticides ametryn and clomazone interfere in the functional parameters of P. lineatus and can compromise the health of these animals / O uso de biomarcadores é importante para avaliar os efeitos causados por agrotóxicos em organismos aquáticos como os peixes. No presente estudo foram utilizados os parâmetros hematológicos, metabólico (glicose plasmática), osmoiônicos (íons Na+, K+ e Cl-), bioquímicose genotóxico (ensaio do cometa), para avaliar a toxicidade dos herbicidas ametrina e clomazone para a espécie de peixe neotropical Prochilodus lineatus. Peixes jovens foram expostos a três concentrações de clomazone: 1, 5 e 10 mg.L-1 , além do grupo controle (CTR) por 96 h. Este herbicida provocou alterações sanguíneas em P. lineatus como diminuição do hematócrito (Hcto) em 10 mg.L-1; hemoglobina (Hb), hemoglobina corpuscular média (HCM) e concentração de hemoglobina corpuscular média (CHCM) em 5 e 10 mg.L- 1, que podem indicar anemia. O número de eritrócitos (RBC) apresentou aumento na menor concentração testada, refletindo provável resposta de estresse com liberação de eritrócitos jovens na corrente sanguínea. O clomazone também ativou as vias de desintoxicação e as vias antioxidantes dos animais testados, como foi demonstrado pelo aumento da atividade hepática da enzima de biotransformação glutationa-Stransferase (GST) e da enzima antioxidante catalase (CAT) em 5 e 10 mg.L-1. A redução da atividade da glutationa peroxidase (GPx) observada em 5 e 10 mg.L-1 indica atuação eficiente da CAT na remoção do H2O2, ou competição com a GST pelo substrato glutationa reduzida (GSH). A atividade da enzima acetilcolinesterase (AChE) cerebral de P. lineatus foi inibida nas concentrações de 5 e 10 mg.L-1 de clomazone, mostrando que este produto tem ação anticolinesterásica para a espécie em questão. O herbicida ametrina foi testado de duas formas: utilizado na sua forma pura e também como produto formulado GesapaxR500, nas concentrações de 2,5 e 5,0 mg.L-1. Os peixes expostos a estes produtos durante 96 h apresentaram alterações hematológicas como diminuição do Hcto em 2,5 e 5,0 mg.L-1 e do RBC na concentração de 5,0 mg.L-1. O aumento do K+ plasmático na concentração de 2,5 mg.L-1, juntamente com as alterações hematológicas podem ser indicativos de rompimento dos eritrócitos. Os peixes expostos tanto à ametrina pura quanto ao produto formulado, apresentaram aumento da glicemia como resposta de estresse em ambas as concentrações testadas. A ametrina pura e o GesapaxR500 causaram inibição da atividade branquial da Na+/K+ATPase em 5,0 mg.L-1. Foi verificado diminuição significativa de malondialdeído (MDA) nos peixes expostos à concentração de 5 mg.L-1 de ametrina e de GesapaxR500, indicando que estes não viii geraram peroxidação lipídica. Danos no DNA de eritrócitos de P. lineatus foram observados na concentração de 5,0 mg.L-1 de ametrina e GesapaxR500, evidenciando a genotoxicidade destes, provavelmente por ação direta sobre material genético. Os resultados obtidos permitem concluir que os herbicidas ametrina e clomazone interferem nos parâmetros funcionais de P. lineatus, podendo comprometer a saúde desses animais.