O peptídeo idêntico ao C-terminal da proteína S100A9 murina (pS100A9mH92-G110) inibe a hiperalgesia inflamatória induzida pela carragenina. Em adição, este peptídeo inibe a hiperalgesia inflamatória induzida por tripsina, uma serino protease capaz de ativar receptores ativados por protease do tipo 2 (PAR2). O objetivo inicial deste trabalho foi caracterizar a relação estrutura/ efeito do pS100A9m, a fim de determinar a menor seqüência peptídica dotada de atividade antinociceptiva. Ainda, como parte dos objetivos, neste trabalho foram investigados os mecanismos envolvidos no efeito antinociceptivo do pS100A9m e da menor seqüência ativa sobre a hiperalgesia induzida pela ativação de PAR2. Diferentes seqüências peptídicas homólogas ao pS100A9m foram sintetizadas e avaliadas em ratos submetidos ao modelo de hiperalgesia mecânica induzida por carragenina. Dentre todas as seqüências peptídicas investigadas, o peptídeo denominado AcE97-G102 foi determinado como a menor seqüência ativa com efeito semelhante ao pS100A9m. Com relação aos estudos sobre a ativação de PAR2, os resultados obtidos demonstraram que o pS100A9m bem como o AcE97-G102 inibem a hiperalgesia térmica e mecânica decorrentes da ativação de PAR2 (induzida por um peptídeo agonista deste receptor ? PAR2AP). A análise por imuno-histoquímica demonstrou que a ativação de PAR2 aumenta a expressão da proteína Egr-1 em neurônios nociceptivos, sendo o pS100A9m capaz de inibir este efeito. Em adição, ambos pS100A9m e AcE97-G102 inibiram o influxo de cálcio induzido por PAR2AP ou tripsina, em neurônios sensoriais do gânglio da raiz dorsal da medula espinhal (DRG). Por outro lado, nenhum dos peptídeos apresentou efeito sobre a mobilização de cálcio em células HEK-293, que naturalmente expressam PAR2, ou em células KNRK transfectadas com este tipo de receptor, sugerindo que o efeito tanto do pS100A9m quanto do AcE97-G102, sobre a ativação de PAR2, seja específico para neurônios sensoriais. O pS100A9m e o AcE97-G102 inibiram o influxo de cálcio nos neurônios DRG estimulados com bradicinina, capsaicina ou KCl. Ainda, o pS100A9m inibiu a liberação de substância P induzida por PAR2. Os resultados obtidos com o tratamento de neurônios DRG com tapsigaragina ou com ionóforo de cálcio sugerem um efeito direto do pS100A9m sobre os canais de cálcio. Desta forma, foi avaliada atividade do pS100A9m e do AcE97-G102 sobre culturas de células HEK-tsA transfectadas com canais de cálcio dependente de voltagem do tipo N ou do tipo L. Os resultados obtidos demonstraram que ambos peptídeos inibirem o influxo de cálcio em células transfectadas com receptores do tipo N. Em conjunto, os dados aqui obtidos demonstram que o efeito do C-terminal da proteína S100A9 murina sobre a nocicepção experimental é devido a uma inibição de canais de cálcio do tipo N, por uma ação direta em neurônios sensoriais. Ainda, a seqüência responsável por este efeito está localizada na porção E97-G102 do domínio C-terminal da proteína S100A9 murina. / Peptide identical to the C-terminus of S100A9 protein (mS100A9pH92-G110) inhibits inflammatory hyperalgesia induced by carrageenan and trypsin, a serine protease that activates protease-activated receptors 2 (PAR2). The aim of this work was to characterize the relationship between structure and function of mS100A9p in order to identify the shortest peptide sequence endowed with antinociceptive effect. Furthermore, the mechanisms involved on the antinociceptive effect of both mS100A9p and the shortest homologous sequence on PAR2-induced hyperalgesia were also evaluated. Different peptide sequences homologous to mS100A9p were synthesized and evaluated in rats submitted to the carrageenan-induced mechanical hyperalgesia model. Among all evaluated sequences, the peptide AcE97-G102 was found to be the shortest sequence that showed an antinociceptive effect similar to that induced by mS100A9p. In regard to PAR2 activation, data obtained herein demonstrated that both mS100A9p and AcE97-G102 inhibit PAR2-induced mechanical and thermal hyperalgesia, induced by the selective agonist peptide ? PAR2AP. Imunohistochemical evaluation demonstrated that PAR2 activation increased Egr-1 protein expression on sensory neurons and mS100A9p inhibited this effect. In addition, both mS100A9p and AcE97-G102 inhibited PAR2- and trypsin-induced calcium influx in dorsal root ganglia neurons (DRG). On the other hand, no effect on the calcium influx of the peptides were observed on HEK-293 cells or KNRK-PAR2 transfected cells, suggesting that the effects of mS100A9p and AcE97-G102 on PAR2 activation are specific for sensory neurons. Both mS100A9p and AcE97-G102 inhibited DRG calcium flux when cells were stimulated with bradykinin, capsaicin or KCl. Also, mS100A9p inhibited PAR2-induced substance P release in DRG. Treatment of DRG with either thapsigargin or calcium ionophore suggest a direct effect of mS100A9p on calcium channels. To evaluate this hypothesis the effects of mS100A9p and AcE97-G102 were evaluated on N-type or L-type voltage-dependent calcium channel transfected HEK-tsA cells. Both peptides inhibited calcium influx of N-type transfected cells. In conclusion, data presented herein demonstrate that the C-terminus of murine S100A9 protein inhibits experimental nociception through a block of N-type voltage-dependent calcium channels, directly on sensory neurons. Also, the domain involved in this effect is localized on the sequence E97-G102 of the C-terminus of murine S100A9 protein.

Introdução: A litotripsia extracorpórea por ondas de choque (LEOC) é o tratamento mais utilizado para cálculos renais de até 20 mm. O uso adjuvante de algumas drogas pode aumentar as taxas de sucesso do procedimento e diminuir a sua morbidade. Objetivos: Avaliar os efeitos da tansulosina e do nifedipino nas taxas de sucesso, nos episódios de dor e na velocidade de eliminação dos fragmentos após o tratamento de cálculos renais de 5 a 20 mm com uma única sessão de LEOC. Casuística e Métodos: Foram estudados prospectivamente 136 indivíduos portadores de cálculos renais entre 5 e 20 mm, submetidos à LEOC entre 2006 e 2009. Os pacientes foram divididos aleatoriamente em 3 grupos para receber diariamente tansulosina 0,4 mg, nifedipino retard 20mg ou placebo por até 30 dias da realização de LEOC. A analgesia foi feita com celecoxibe 200 mg. Os pacientes foram avaliados semanalmente por meio de radiografia de abdome. Foi definido como sucesso do tratamento a ausência de fragmentos maiores que 4 mm ao final de 30 dias. Os parâmetros avaliados foram: taxa de sucesso do tratamento, ocorrência de rua de cálculos, necessidade de analgésicos, intensidade de dor após a LEOC, tempo de eliminação de fragmentos, efeitos adversos da medicação e visitas ao Pronto Socorro. Resultados: Cento e onze pacientes completaram o estudo. Não houve diferenças demográficas entre os pacientes e nem em relação ao tamanho dos cálculos entre os grupos. As taxas de sucesso foram de 60,5% (23 de 38) no Grupo Tansulosina, 48,6% (17 de 35) no Grupo Nifedipino e 36,8% (14 de 38) no Grupo Placebo. (p=0,118) Entre os pacientes com cálculos de 10 a 20 mm, a taxa de sucesso foi significativamente maior nos Grupos Tansulosina (61,9%) e Nifedipino (60,0%) do que no Grupo Placebo (26,1%) (p=0,024), porém não foi significativa entre os cálculos de 5 a 9 mm (p=0,128). O Número Necessário para Tratar (NNT) da Tansulosina foi de 2,9 e o do Nifedipino foi de 3, considerando-se o uso para cálculos de 10 a 20 mm. Os pacientes que usaram nifedipino tiveram mais efeitos adversos do que os do Grupo Placebo (28,5 % x 2,6% respectivamente, p = 0,009), porém sem levar à interrupção do uso da drogas. Não houve diferença significativa entre os grupos Tansulosina x Nifedipino e Tansulosina x Placebo em relação aos efeitos adversos (p= 0,15 e p = 0,054, respectivamente). Não houve diferença entre os grupos com relação à intensidade da dor observada após o tratamento (p=0,28), ao número de comprimidos de Celecoxibe (p=0,39), ao tempo de eliminação dos fragmentos (p=0,6), à ocorrência de rua de cálculos (p=0,482) e ao número de vistas ao Pronto Socorro (p=0,175). Conclusões: O uso adjuvante de tansulosina ou de nifedipino após LEOC aumenta a taxa de sucesso para cálculos renais entre 10 e 20 mm, porém sem diminuir a intensidade da dor ou a necessidade de analgésicos após o tratamento, nem o tempo de eliminação dos fragmentos / Purpose: We evaluated the effects of the adjuvant use of tamsulosin and nifedipine after extracorporeal shock wave lithotripsy (SWL) for 5-20 mm kidney stones. Materials and Methods: We conducted a randomized double-blind trial involving 136 patients with radiopaque kidney stones between 2006 and 2009. Patients were divided into three groups to receive daily treatments of 0.4 mg tamsulosin, 20 mg nifedipine retard or placebo for up to 30 days after one session of SWL. The parameters assessed were success rate, analgesic requirements, pain intensity, time to clearance, adverse effects and occurrence of Steinstrasse. Results: The success rate was 60.5% (23 of 38) in the Tamsulosin group, 48.6% (17 of 35) in the Nifedipine group and 36.8% (14 of 38) in the Placebo group (p=0.118). For stones ranging from 10 to 20 mm, the success rates were significantly higher in the Tamsulosin (61.9%) and Nifedipine groups (60.0%) when compared with the Placebo group (26.1%) (p=0.024), but not for the 5-9 mm stones (p=0.128). The Number Needed to Treat was 2.9 for tamsulosin and 3 for nifedipine. Adverse events were more frequent in the Nifedipine than the Placebo Group (28.5% vs. 2.6%, respectively, p=0.009). There was no difference among groups with regard to stone and demographic characteristics, pain intensity, time to clearance and Steinstrasse. Conclusions: Adjuvant use of tamsulosin or nifedipine after SWL significantly increased the success rates for 10 to 20 mm renal stones and could be recommended. Both drugs had similar beneficial effects and adverse events

Os anti-hipertensivos bloqueadores de canais de cálcio, por interferirem no transporte de cálcio através das membranas celulares, podem afetar muitos processos metabólicos, incluindo o metabolismo ósseo. O objetivo deste estudo foi avaliar, de forma radiográfica, histológica e bioquímica, os efeitos do bloqueador de canais de cálcio amlodipina no processo de reparo de um defeito ósseo, simulando fratura, no ramo mandibular de ratos. Foram utilizados 50 ratos machos Wistar, que foram submetidos ao mesmo procedimento cirúrgico unilateral simulando fratura mandibular, e distribuídos em dois grupos de 25 animais: grupo experimental, que receberam amlodipina, via oral, na dosagem de 0,04 mg / rato / dia, iniciando 12 dias antes do procedimento e continuando até o sacrifício; grupo controle, que permaneceu não tratado. Os animais foram sacrificados nos períodos de 1, 7, 14, 30 e 90 dias pós-operatórios. Foram realizados testes bioquímicos de fosfatase alcalina e cálcio séricos. Exame radiográfico foi obtido para mensuração da área radiolúcida do defeito ósseo. O estudo histológico compreendeu a análise descritiva do processo de reparo ósseo e a avaliação histomorfométrica da quantidade de osso neoformado. Os valores numéricos foram submetidos a análises estatísticas. A análise radiográfica demonstrou maior área radiolúcida no interior do defeito ósseo para o grupo experimental, nos períodos de 14 (p=0,016), 30 (p=0,009) e 90 (p=0,028) dias. Na análise histológica não se observaram atrasos no processo de reparo ósseo para ambos os grupos. Porém, na análise histomorfométrica, o grupo da amlodipina apresentou redução significante do volume de osso neoformado nos períodos de 7 e 14 dias (p=0,049), não havendo diferenças significativas no período de 30 dias. Houve redução significante nos níveis de fosfatase alcalina para o grupo da amlodipina nos períodos iniciais (p=0,049). Não houve alterações para os níveis de cálcio sérico. Concluiu-se que o uso crônico da amlodipina prejudicou a neoformação óssea no processo de reparo do defeito cirúrgico no ramo mandibular de ratos, porém não impediu a consolidação da fratura. / Antihypertensive, calcium channel blockers, which interfere on calcium transport across the cell membrane, may affect many metabolic processes, including bone metabolism. The aim of this study was to evaluate by radiographic, histologic and biochemical analyses the effects of calcium channel blocker amlodipine on bone healing of a defect simulating a fracture in mandibular ramus of rats. Fifty male Wistar rats were used, and submitted to the same unilateral surgical procedure simulating a mandibular fracture, distributed into two groups of 25 animals: experimental group, which received oral doses of 0.04 mg / rat / day starting 12 days before of procedure and continuing until sacrifice; control group, which remained untreated. Animals were sacrificed at 1, 7, 14, 30 and 90 days postoperatively. Blood biochemical tests of alkaline phosphatase and serum calcium were made. Radiographic examination was obtained in order to mensurate the radiolucent area of bone defect. Histological study comprised descriptive analysis of bone healing and histomorphometric analysis of the amount of newly formed bone. Numerical values were submitted to statistical analyses. Radiographic analysis showed larger radiolucent area into bone defect to the experimental group at the periods of 14 (p=0.016), 30 (p=0.009) and 90 (p=0.028) days. In the histological analysis there was no delay in the bone repair stages in both groups. However, in the histomorphometric analysis, the experimental group presented significative lowering of newly formed bone volume at 7 and 14 days periods (p=0.049), with no significant differences at 30 days period. There was significative decrease of alkaline phosphatase levels in experimental group in the initial periods (p=0.049). There was no change in the serum calcium levels. It was concluded that chronic use of amlodipine compromised bone neoformation in the repairing process of surgical defect in the mandibular ramus of rats, but no precluded occurrence of fracture consolidation.

Submitted by (lucia.rodrigues@ufrpe.br) on 2016-05-31T15:10:49Z No. of bitstreams: 1 Bruno Mendes Tenorio.pdf: 4101398 bytes, checksum: d81bf09fb306302eb9abbcd6d926a6a7 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-05-31T15:10:49Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Bruno Mendes Tenorio.pdf: 4101398 bytes, checksum: d81bf09fb306302eb9abbcd6d926a6a7 (MD5) Previous issue date: 2011-12-12 / In recent decades, humans have been exposed to various exogenous physical agents, such as high temperatures emitted by industrial devices and electromagnetic fields emitted by the electricity distribution networks and electronic devices. Researches demonstrated that these agents can cause reproductive disorders. The chapter 1 of this study aimed to investigate the possible effects of low frequency EMF exposure of 60 Hz and 1 mT from day 13 of gestation up to puberty at 21 postnatal days. The results showed that exposure to EMF reduced parameters related to the lumen, epithelium and seminiferous tubules. It was also observed an increase in the volume of blood vessels and connective tissue cells in animals exposed to EMF. The plasma testosterone did not change due to EMF exposure. The exposure to EMF of 60 Hz and 1 mT from gestation to puberty can induce a delay in testicular development. In chapter 2, the aim was to evaluate the effects of exposure to low frequency EMF (60 Hz and 1 mT) from the 13th day of gestation up to 90 postnatal days (adult). The plasma testosterone concentration was not changed by EMF exposure. However, the histopathological and histomorphometrical analysis showed testicular degeneration in a subset of animals exposed to EMF. The degenerative process severity varied among affected animals, indicating an individual sensitivity to EMF. The electron microscopy analysis also showed testicular degeneration, the main change was high electrodense mitochondria with loss of normal organization and cristae. The exposure to EMF of 60 Hz and 1 mT seems to alter spermatogenesis and reduce the fertility. Chapter 3 aimed to analyze the effects of heat shock (43 °C / 15 min.) and Hsp90 inhibition on CaV3 T-type calcium channels and calciumactivated potassium channels (BKCa) in Leydig cells. The results showed that exposure to heat shock induced a reduction in BKCa channels steady-state current (49.8%), maximum conductance (68.9%) and activation time constant (31.9%). Heat shock slowed the BKCa channels activation and reduced its voltage dependence. Hsp90 inhibition did not change BKCa channels. The CaV3 channels current was not affected by heat shock or Hsp90 inhibition. The heat shock can inhibit BKCa channels, the Hsp90 does not seem to be involved in this process. / Nas últimas décadas, os seres humanos vêm sendo expostos a vários agentes físicos exógenos, como temperaturas elevadas induzidas por equipamentos industriais e a exposição aos campos eletromagnéticos (CEM) emitidos por aparelhos eletrônicos. Pesquisas vêm demonstrando que estes agentes podem gerar distúrbios reprodutivos. O objetivo do capítulo 1 do presente trabalho foi investigar o possível efeito da exposição ao CEM de baixa frequência de 60 Hz e 1 mT desde o 13º dia de gestação até a puberdade aos 21 dias pós-natal. Os resultados demonstraram que a exposição ao CEM reduziu os parâmetros relacionados ao lúmen, epitélio e túbulos seminíferos. Também foi observado o aumento no volume dos vasos sanguíneos e das células do tecido conjuntivo nos animais expostos ao CEM. A testosterona plasmática não se alterou devido à exposição ao CEM. A exposição ao CEM de 60 Hz e 1 mT desde a gestação até a puberdade pode induzir o retardo no desenvolvimento testicular. No capítulo 2, o objetivo foi avaliar o efeito da exposição ao CEM de baixa frequência (60 Hz e 1 mT) desde o 13º dia de gestação até os 90 dias pós-natal (adulto). A concentração da testosterona plasmática não foi alterada devido à exposição ao CEM. Entretanto, as análises histopatológicas e histomorfométricas demonstraram degeneração testicular em um sub-grupo dos animais expostos ao CEM. A gravidade do processo degenerativo variou entre os indivíduos afetados, indicando uma sensibilidade individual ao CEM. A análise de microscopia eletrônica também demonstrou degeneração testicular, sendo a principal alteração observada a presença de mitocôndrias eletrodensas e com perda da sua organização e cristas. A exposição ao CEM de 60 Hz e 1 mT parece alterar a espermatogênese e reduzir a fertilidade. No capítulo 3, o presente trabalho objetivou analisar os efeitos do choque térmico (43ºC / 15 min.) e da inibição da Hsp90 nos canais de cálcio CaV3 tipo-T e potássio ativado por cálcio (BKCa) em células de Leydig. Os resultados obtidos revelaram que nos canais BKCa o choque térmico reduziu a corrente do estado estacionário em 49,8%, a condutância máxima em 68,9% e a constante de tempo de ativação em 31,9%. O choque térmico tornou mais lenta a ativação dos canais BKCa e reduziu sua dependência de voltagem. A inibição da Hsp90 não alterou os canais BKCa. A corrente dos canais CaV3 tipo-T não foi afetada pelo estresse térmico ou pela inibição da Hsp90. A exposição das células de Leydig à temperatura elevada pode inibir os canais BKCa, a Hsp90 parece não estar envolvida neste processo.

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Lippia alba (Mill.) N.E. Brown (VERBENACEAE), popularly know as Erva Cidreira Brasileira, has been one of the most commonly herbs used in the Brazilian folk medicine to blood pressure control. This study aimed to investigate the cardiovascular effects of the essential oil of Lippia alba (EOLA) in rats. For the hemodynamic measurement, normotensive male Wistar rats had their abdominal aorta and lower vena cava cannulated. Initially, five chemotypes (geranial, limonene, linalool, mircene, and carvone) were tested in normotensive conscious rats. They were intravenously and in bolus administrated at the doses of 5, 10, 20, 40 and 60 mg/kg. The EOLAG showed the best results on blood pressure, being chosen for the following experiments. The administration of EOLAG (5, 10, 20, and 40 mg/kg, i.v.) induced transient hypotension and bradycardia. These responses were attenuated by atropine (2 mg/kg, i.v.), hexamethonium (20 mg/kg, i.v.) and NG-nitro-Larginine methyl ester hydrochloride (L-NAME - 20 mg/kg, i.v.), but not by indomethacin (5 mg/kg, i.v.). For in vitro approach, the rats were euthanized and the superior mesenteric artery was removed and cut in rings (1-2 mm), which were placed in organ baths containing Tyrode`s solution at 37o C and gassed with carbogen. In intact rings of rat mesenteric artery pre-contracted with phenilephrine (1 μM), EOLAG (1 - 1000 mg/mL) induced relaxation (pD2 = 1.89 ± 0.21; Emax = 110.8 ± 10.8 %) which was not modified after the removal of the endothelium (pD2 = 2.37 ± 0.16; Emax = 134.8 ± 16.5 %), after incubation with TEA (pD2 = 2.23 ± 0.04; Emax = 117.2 ± 4.96 %) or KCl (80 mM) (pD2 = 1.96 ± 0.06; Emax = 112.6 ± 6.70 %). In addition, the EOLAG was able to inhibit the contraction caused by CaCl2 and produced additional effect (34.82 %; n = 5) on maximal relaxation of nifedipine (10 μM). In conclusions, the results demonstrate that the EOLAG induces hypotensive effect, that seems to be caused by muscarinic activation and NO release, and bradycardia, that seems to be due to an activation of ganglion nicotinic and cardiac muscarinic receptors. Furthermore, EOLAG produces vasorelaxation primarily caused by blocking Ca2+ influx through voltage-operated Ca2+ channels. / A Lippia alba (Mill.) N.E. Brown (VERBENACEAE), conhecida popularmente como Erva Cidreira Brasileira, é uma das plantas mais utilizadas na medicina popular brasileira, inclusive para o tratamento da hipertensão arterial. Este estudo buscou investigar os efeitos cardiovasculares do óleo essencial de Lippia alba (OELA) em ratos. Para registro dos parâmetros hemodinâmicos, ratos machos Wistar saudáveis foram canulados na aorta abdominal e na veia cava inferior. Inicialmente foram testados 5 quimiotipos deste óleo (geranial, limoneno, linalol, mirceno e carvona), administrados por via intravenosa e in bolus, nas doses de 5, 10, 20, 40 e 60 mg/kg. Após análise destes resultados, observou-se que o quimiotipo geranial (OELAG) foi o que apresentou o melhor efeito sobre a pressão arterial, tornando-se o quimiotipo de escolha. Em animais saudáveis e não-anestesiados, o OELAG (5, 10, 20 e 40 mg/kg, i.v.) induziu hipotensão e bradicardia transientes. Estes efeitos foram atenuados em animais pré-tratados com atropina (2 mg/kg, i.v.), hexametônio (20 mg/kg, i.v.) ou LNAME (20 mg/kg, i.v.), mas não com indometacina (5 mg/kg, i.v.). Para os experimentos in vitro, os ratos foram eutanasiados e a artéria mesentérica superior foi removida e seccionada em anéis (1-2 mm), os quais foram montados em cubas para órgão isolado contendo solução de Tyrode a 37o C e gaseificada com carbogênio. Em anéis intactos de artéria mesentérica superior de ratos, pré-contraídos com fenilefrina (10 μM), o OELAG (1 - 1000 mg/mL) induziu relaxamento (pD2 = 1,89 ± 0,21; Emax = 110,8 ± 10,8 %) cujo efeito não foi alterado após remoção do endotélio (pD2 = 2,37 ± 0,16; Emax = 134,8 ± 16,5 %), após a incubação com tetraetilamônio (TEA) (pD2 = 2,23 ± 0,04; Emax = 117,2 ± 4,96 %) ou KCl (80 mM) (pD2 = 1,96 ± 0,06; Emax = 112,6 ± 6,70 %). Além disso, o OELAG foi capaz de inibir as contrações induzidas por CaCl2 e produzir um efeito adicional (34,82 %; n = 5) sobre o relaxamento máximo causado pela nifedipina (10 μM) em anéis sem endotélio. Diante destes resultados, pode-se concluir que o OELAG produz efeito hipotensor, que parece ser causado por ativação de receptores muscarínicos e liberação de NO, e bradicardia, que parece ser causado pela ativação de receptores muscarínicos cardíacos e Efeitos cardiovasculares do óleo essencial de Lippia alba em ratos MAYNARD, L.G (2011) 9 nicotínicos ganglionares. Além disso, o OELAG induz vasorelaxamento que parece ser causado inicialmente por um bloqueio do influxo de Ca2+ através dos canais de Ca2+ operados por voltagem.

Orientador: Everardo Magalhães Carneiro / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-17T13:23:02Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Trevisan_Amon_M.pdf: 3520740 bytes, checksum: 90ddd0dc662586a0279a2c1e1f000b3b (MD5) Previous issue date: 2010 / Resumo: Os canais de cálcio voltagem-dependentes (CaV) são proteínas de membrana plasmática que conduzem cálcio, e são ativados pela despolarização da mesma promovendo influxo do íon, que serve como um segundo mensageiro intracelular, transformando sinais elétricos em químicos. Esse processo controla diversos eventos intracelulares, como exocitose, endocitose, contração muscular, transmissão sináptica e metabolismo. Em células beta (B), a secreção de insulina estimulada por glicose e/ou leucina ocorre por diversos sinais que levam à despolarização da membrana e influxo de cálcio, que age no processo de acoplamento estímulo/secreção dos grânulos contendo insulina. É possível a existência de efeitos sinérgicos entre o metabolismo da leucina e glicose, permitindo um controle fino da expressão gênica, produção e secreção de insulina em células B. Recentemente demonstramos que animais que sofreram um processo de restrição protéica modificam o mecanismo de secreção de insulina alterando a resposta secretória para diferentes secretagogos (glicose, aminoácidos, etc.). Nesse trabalho, buscamos elucidar o envolvimento dos íons cálcio nos processos de secreção de insulina, bem como avaliar a expressão gênica e protéica das subunidades alfa1 e beta2 do canal nos diferentes grupos estudados. Observamos uma redução na expressão gênica das duas subunidades do CaV em ilhotas de animais desnutridos e uma tendência de recuperação na expressão protéica da subunidade ?1 em animais desnutridos suplementados com leucina. As áreas abaixo das curvas (AUC) de cálcio das ilhotas não apresentaram diferença entre os grupos quando estimulados com alta (16,7 mM) glicose e 40 mM de K+, porém, há um aumento na área abaixo da curva quando estimuladas com tolbutamida no grupo desnutrido suplementado com leucina (LPL). As secreções de insulina frente a inibidores de canal de cálcio apresentaram resultados similares frente a alta glicose e tolbutamida, porém apresentando valores absolutos menores. Ilhotas provenientes de animais LPL apresentaram recuperação da taxa de liberação de insulina quando estimuladas com ácido ketoisocapróico, atingindo valores similares aos controles. Essa recuperação não foi observada quando estimulamos as ilhotas com cloreto de potássio. Observamos também uma redução na área das ilhotas de animais desnutridos, com recuperação a valores equivalentes aos controles quando há suplementação com leucina. Nossos dados sugerem que o manejo dos íons cálcio possa não estar diretamente envolvido na melhora da secreção de insulina por ilhotas de animais desnutridos suplementados com leucina, mesmo havendo uma melhora na expressão protéica da subunidade alpha1 do Cav em ilhotas de animais LPL, através de uma possível modulação pós-transcricional. / Abstract: Voltage-dependent calcium channels (CaV) are plasma membrane proteins that lead calcium, and are activated by depolarization of the same by promoting the influx of this ion, which serves as an intracellular second messenger, turning electrical signals into chemical. This process controls several intracellular events such as exocytosis, endocytosis, muscle contraction, synaptic transmission and metabolism. In beta cells (B), insulin secretion stimulated by glucose and/or leucine occurs by several signs that lead to membrane depolarization and calcium influx, which acts on the coupling process stimulus/secretion of granules containing insulin. It is possible that there are synergistic effects between the metabolism of glucose and leucine, allowing fine control of gene expression, production and insulin secretion in B cells. We have shown that animals which have undergone a process of protein restriction alter the mechanism of insulin secretion by altering the secretory response to different secretagogues (glucose, amino acids, etc.). In this paper we elucidate the involvement of calcium ions in the process of insulin secretion, as well assess the gene and protein expression of alpha1 and beta2 subunits of the channel in different groups. Observed a decrease in gene expression of two subunits of CaV in islets of malnourished animals and a recovery trend in protein expression of ?1 subunit in malnourished animals supplemented with leucine. The areas under the curve (AUC) for calcium of islets did not differ between groups when stimulated with high (16.7 mM) glucose and 40 mM K +, however, there is an increase in area under the curve when stimulated with tolbutamide in undernourished group supplemented with leucine (LPL). The secretions of insulin compared to calcium channel inhibitors showed similar results compared to high glucose and tolbutadima, although a smaller absolute values. Islets from LPL animals showed recovery of the rate of insulin release when stimulated with ketoisocaproic acid (KIC), reaching values similar to controls. This recovery was not observed when we stimulate the islets with potassium chloride. We also observed a reduction in the area of the islets of malnourished animals, with recovery to similar values for controls when supplementation with leucine. Our data suggest that the management of calcium ions can not be directly involved the improvement of insulin secretion by islets of malnourished animals supplemented with leucine, even with an improvement in protein expression of the alpha1 subunit of the Cav in islets of animals LPL, through a possible post-transcriptional modulation. / Mestrado / Fisiologia / Mestre em Biologia Funcional e Molecular

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / The farnesol (C15H26O) is a sesquiterpene alcohol found in herbs and essential oils. Research show some beneficial properties of farnesol as: antioxidant, anti-inflammatory and chemopreventive properties. However, the farnesol futher inhibition of activity of L-type calcium channels in smooth muscle. This study sought to analyze the involvement of calcium channels L-type in the cardiodepressant farnesol response in the rat heart. To this, contractile studies were conducted on left atria drawn to rest tension 5mN (0,5gf) and subjected to field stimulation with above-threshold current pulses of the 1 Hz, kept in isolated organ vessel, submerged in Krebs-Henseleit solution (8 mL) and aerated with carbogênica mixture (95% O2 and 5% CO2). The atrial contraction force was capture by an isometric transducer. Electrocardiographic recordings were performe on isolated heart, aortic perfusion under a constant flow (10 ml / min) Langendorff type system. The hearts were keep spontaneously beating, to determine the heart rate, and in heart stimulated were determined PR interval (PRI), QT (QTi) and complex QRS. Left ventricular pressure was determined in the heart stimulated electrically by means of a balloon inflated with water at a pressure of 15 cmHg. In rat left atrium, the farnesol response to the contraction strength showed a negative inotropic effect, reducing the contraction force at 41.63% at the maximum concentration used, with an EC50 of 2.84 ± 0.19 mM. To evaluate the effect of farnesol of the positive inotropic response of CaCl2 and (±)-Bay K8644 was observed that the farnesol shifted to the right CaCl2 concentration-response curve and decreased maximum efficiency (100% to 23%) and abolished curve of (±)-Bay K8644. TEA was use to evaluate the role of K+ channels in the negative inotropic response and the maximum effect by farnesol (41.63 to 63.02%) was increased. In isolated heart, there was an increase of PRI, QTi and QRS complex, and reduced left ventricular pressure (37, 38%) and heart rate (25.22%). Thus, farnesol exerts inotropic and negative chronotropic responses in the heart by reducing current to the L-type Ca2+. / O farnesol (C15H26O) é um álcool sesquiterpênico encontrado em óleos essenciais e ervas aromáticas. Pesquisas evidenciam algumas propriedades benéficas do farnesol como: propriedades antioxidantes, anti-inflamatórias e quimiopreventivas. Entretanto, o farnesol promoveu inibição dos canais de cálcio tipo-L em músculo liso. Neste trabalho procurou-se analisar os efeitos do farnesol sobre os mecanismos contráteis e eletrofisiológicos sobre o coração de rato. Para esse fim, os estudos contráteis foram realizados em átrios esquerdo estirados a para uma tensão de repouso de 5mN (0,5gf) e submetidos a estimulação de campo com pulsos de corrente supralimiares de 1 Hz, mantido em cuba para órgão isolado, submerso em solução de Krebs-Henseleit (8 mL) e aerado com mistura carbogênica (95 % O2 e 5 % CO2). A força de contração atrial foi captada por um transdutor isométrico. Os registros eletrocardiográficos foram obtidos em coração isolado, sob perfusão aórtica de fluxo constante (10 mL/min), em sistema de Langendorff. Os corações foram mantidos com batimento espontâneo, para determinar a frequência cardíaca, e em corações estimulados foram determinados os intervalos PR (PRi), QT (QTi) e complexo QRS. A pressão ventricular esquerda foi determinada, em coração estimulado eletricamente, por meio de um balonete insuflado com água até uma pressão de 15 cmHg. Em átrio esquerdo de rato, a resposta do farnesol sobre a força de contração apresentou efeito inotrópico negativo, diminuindo a força de contração em 41,63% na concentração máxima usada, apresentando uma CE50 de 2,843 ± 0,19 mM. Ao avaliar o efeito do farnesol sobre a resposta inotrópica positiva do CaCl2 e (±)-BAY K8644 foi observado que o farnesol deslocou para direita a curva concentração-resposta do CaCl2 e diminuiu a eficácia máxima (100% para 23%) e aboliu a curva do (±)-BAY K8644. Para avaliar a participação dos canais para potássio na resposta inotrópica negativa foi utilizado TEA tendo aumento da eficácia máxima do farnesol de 41,63 para 63,02%. Em coração isolado, foi observado aumento do PRi, QTi e complexo QRS, e redução da pressão ventricular esquerda (37,38%) e frequência cardíaca (25,22%). Assim sendo, o farnesol exerce respostas inotrópicas e cronotrópicas negativas no coração, por redução das correntes para Ca2+ tipo-L.

Os anti-hipertensivos bloqueadores de canais de cálcio, por interferirem no transporte de cálcio através das membranas celulares, podem afetar muitos processos metabólicos, incluindo o metabolismo ósseo. O objetivo deste estudo foi avaliar, de forma radiográfica, histológica e bioquímica, os efeitos do bloqueador de canais de cálcio amlodipina no processo de reparo de um defeito ósseo, simulando fratura, no ramo mandibular de ratos. Foram utilizados 50 ratos machos Wistar, que foram submetidos ao mesmo procedimento cirúrgico unilateral simulando fratura mandibular, e distribuídos em dois grupos de 25 animais: grupo experimental, que receberam amlodipina, via oral, na dosagem de 0,04 mg / rato / dia, iniciando 12 dias antes do procedimento e continuando até o sacrifício; grupo controle, que permaneceu não tratado. Os animais foram sacrificados nos períodos de 1, 7, 14, 30 e 90 dias pós-operatórios. Foram realizados testes bioquímicos de fosfatase alcalina e cálcio séricos. Exame radiográfico foi obtido para mensuração da área radiolúcida do defeito ósseo. O estudo histológico compreendeu a análise descritiva do processo de reparo ósseo e a avaliação histomorfométrica da quantidade de osso neoformado. Os valores numéricos foram submetidos a análises estatísticas. A análise radiográfica demonstrou maior área radiolúcida no interior do defeito ósseo para o grupo experimental, nos períodos de 14 (p=0,016), 30 (p=0,009) e 90 (p=0,028) dias. Na análise histológica não se observaram atrasos no processo de reparo ósseo para ambos os grupos. Porém, na análise histomorfométrica, o grupo da amlodipina apresentou redução significante do volume de osso neoformado nos períodos de 7 e 14 dias (p=0,049), não havendo diferenças significativas no período de 30 dias. Houve redução significante nos níveis de fosfatase alcalina para o grupo da amlodipina nos períodos iniciais (p=0,049). Não houve alterações para os níveis de cálcio sérico. Concluiu-se que o uso crônico da amlodipina prejudicou a neoformação óssea no processo de reparo do defeito cirúrgico no ramo mandibular de ratos, porém não impediu a consolidação da fratura. / Antihypertensive, calcium channel blockers, which interfere on calcium transport across the cell membrane, may affect many metabolic processes, including bone metabolism. The aim of this study was to evaluate by radiographic, histologic and biochemical analyses the effects of calcium channel blocker amlodipine on bone healing of a defect simulating a fracture in mandibular ramus of rats. Fifty male Wistar rats were used, and submitted to the same unilateral surgical procedure simulating a mandibular fracture, distributed into two groups of 25 animals: experimental group, which received oral doses of 0.04 mg / rat / day starting 12 days before of procedure and continuing until sacrifice; control group, which remained untreated. Animals were sacrificed at 1, 7, 14, 30 and 90 days postoperatively. Blood biochemical tests of alkaline phosphatase and serum calcium were made. Radiographic examination was obtained in order to mensurate the radiolucent area of bone defect. Histological study comprised descriptive analysis of bone healing and histomorphometric analysis of the amount of newly formed bone. Numerical values were submitted to statistical analyses. Radiographic analysis showed larger radiolucent area into bone defect to the experimental group at the periods of 14 (p=0.016), 30 (p=0.009) and 90 (p=0.028) days. In the histological analysis there was no delay in the bone repair stages in both groups. However, in the histomorphometric analysis, the experimental group presented significative lowering of newly formed bone volume at 7 and 14 days periods (p=0.049), with no significant differences at 30 days period. There was significative decrease of alkaline phosphatase levels in experimental group in the initial periods (p=0.049). There was no change in the serum calcium levels. It was concluded that chronic use of amlodipine compromised bone neoformation in the repairing process of surgical defect in the mandibular ramus of rats, but no precluded occurrence of fracture consolidation.

Fundação de Amparo a Pesquisa no Estado do Rio Grande do Sul / Opioids are the most common drugs prescribed worldwide for alleviating moderate to severe pain. However, the use of opioids is associated with the development of tolerance to the analgesic effect and potential adverse effects, such as paradoxical hyperalgesia, withdrawal syndrome and constipation. An important target for morphine-induced analgesia is the blockade of voltage-gated calcium channels (VGCCs). However, the participation of VGCCs in the tolerance and adverse effects caused by morphine is poorly understood. Thus, the present study was conducted in order to evaluate the possible actions of Phα1β, a peptide inhibitor of VGCCs purified from the venom of the Phoneutria nigriventer spider on the antinociceptive and adverse effects produced by single or repeated administration of morphine. It was evaluated the effect of intrathecal injection Phα1β (0.01-30 pmol/site) on mechanical and heat hyperalgesia, tolerance, withdrawal syndrome and constipation induced throught single (10 mg/kg) or repeated (increasing doses, 3 times a day, for 3 consecutive days) subcutaneous treatment of morphine in C57BL/6 mice. We observed that a single administration of morphine was able to reduce heat but not mechanical nociception as well as decrease gastrointestinal transit. The antinociception, but not the constipation, caused by a single injection of morphine was slightly increased by an intrathecal injection of Phα1β. Repeated treatment with morphine caused not only tolerance to its antinociceptive effect but also induced paradoxical heat and mechanical hyperalgesia, withdrawal syndrome and constipation. Phα1β was able to reverse the tolerance, withdrawal syndrome, mechanical and heat hyperalgesia and constipation induced by repeated morphine treatment. Finally, the effects produced by the native form of Phα1β were fully mimicked by a recombinant version of this peptide in naïve mice. Our results suggest that Phα1β is effective in potentiating the analgesia as well as in reducing tolerance and the adverse effects induced by morphine, indicating its potential use as an adjuvant drug in combination with opioids. / Os opióides são os medicamentos mais comuns prescritos em todo o mundo para aliviar as dores moderadas a intensas. No entanto, a utilização de opióides está associada com o desenvolvimento de tolerância ao efeito analgésico e de efeitos adversos, tais como hiperalgesia paradoxal, síndrome de abstinência e constipação. Um alvo importante para a analgesia induzida pela morfina é o bloqueio dos canais de cálcio regulados por voltagem (CCRV). Porém pouco se sabe sobre o papel desses canais na tolerância e nos efeitos adversos produzidos pela morfina. Assim, o presente estudo foi realizado com o intuito de avaliar as possíveis ações da Phα1β, um inibidor peptídico dos CCRVs purificado do veneno da aranha Phoneutria nigriventer, sobre os efeitos antinociceptivos e adversos produzidos pela administração única ou repetida de morfina. Foi avaliado o efeito da administração intratecal da Phα1β (0.01-30 pmol/site) sobre a hiperalgesia térmica e mecânica, tolerância, síndrome de abstinência e constipação induzidos pelo tratamento único (10 mg/kg) ou repetido (doses crescentes, 3 vezes ao dia, durante três dias) de morfina por via subcutânea em camundongos C57BL/6. Observamos que uma única administração de morfina foi capaz de reduzir a nocicepção térmica mas não a mecânica em camundongos, bem como reduzir o trânsito gastrointestinal. A antinocicepção, mas não a constipação, causada por uma única dose de morfina foi levemente aumentada pela administração intratecal da Phα1β. O tratamento repetido com morfina não causou somente tolerância analgésica como também induziu hiperalgesia, síndrome de abstinência e constipação. A Phα1β foi capaz de reverter a tolerância, a síndrome de abstinência, a hiperalgesia mecânica e térmica e a constipação induzidas pelo tratamento repetido de morfina. Finalmente, os efeitos produzidos pela forma nativa Phα1β foram totalmente mimetizados por uma versão recombinante do presente peptídeo. Em conclusão, nossos resultados sugerem que a Phα1β é efetiva em potencializar a analgesia, bem como, reduzir a tolerância e os efeitos adversos induzidos pela morfina. Desta maneira, a Phα1β apresenta um uso potencial como uma droga adjuvante na terapia opióide.

Receptores purinérgicos e canais de cálcio voltagem-dependentes estão envolvidos em diversos processos biológicos como na gastrulação, durante o desenvolvimento embrionário, e na diferenciação neural. Quando ativados, canais de cálcio voltagem-dependentes e receptores purinérgicos do tipo P2, ativados por nucleotídeos, desencadeiam transientes de cálcio intracelulares controlando diversos processos biológicos. Neste trabalho, nós estudamos a participação de canais de cálcio voltagem-dependentes e receptores do tipo P2 na geração de transientes de cálcio espontâneos e sua regulação na expressão de fatores de transcrição relacionados com a neurogênese utilizando como modelo células tronco (CTE) induzidas à diferenciação em células tronco neurais (NSC) com ácido retinóico. Descrevemos que CTE indiferenciadas podem ter a proliferação acelerada pela ativação de receptores P2X7, enquanto que a expressão e a atividade desse receptor precisam ser inibidas para o progresso da diferenciação em neuroblasto. Além disso, ao longo da diferenciação neural, por análise em tempo real dos níveis de cálcio intracelular livre identificamos 3 padrões de oscilações espontâneas de cálcio (onda, pico e unique), e mostramos que ondas e picos tiveram a frequência e amplitude aumentadas conforme o andamento da diferenciação. Células tratadas com o inibidor do receptor de inositol 1,4,5-trifosfato (IP3R), Xestospongin C, apresentaram picos mas não ondas, indicando que ondas dependem exclusivamente de cálcio oriundo do retículo endoplasmático pela ativação de IP3R. NSC de telencéfalo de embrião de camundongos transgênicos ou pré-diferenciadas de CTE tratadas com Bz-ATP, o agonista do receptor P2X7, e com 2SUTP, agonista de P2Y2 e P2Y4, aumentaram a frequência e a amplitude das oscilações espontâneas de cálcio do tipo pico. Dados, obtidos por microscopia de luminescência, da expressão em tempo real de gene repórter luciferase fusionado à Mash1 e Ngn2 revelou que a ativação dos receptores P2Y2/P2Y4 aumentou a expressão estável de Mash1 enquanto que ativação do receptor P2X7 levou ao aumento de Ngn2. Além disso, células na presença do quelante de cálcio extracelular (EGTA) ou do depletor dos estoques intracelulares de cálcio do retículo endoplasmático (thapsigargin) apresentaram redução na expressão de Mash1 e Ngn2, indicando que ambos são regulados pela sinalização de cálcio. A investigação dos canais de cálcio voltagem-dependentes demonstrou que o influxo de cálcio gerado por despolarização da membrana de NSC diferenciadas de CTE é decorrente da ativação de canais de cálcio voltagem-dependentes do tipo L. Além disso, esse influxo pode controlar o destino celular por estabilizar expressão de Mash1 e induzir a diferenciação neuronal por fosforilação e translocação do fator de transcrição CREB. Esses dados sugerem que os receptores P2X7, P2Y2, P2Y4 e canais de cálcio voltagem-dependentes do tipo L podem modular as oscilações espontâneas de cálcio durante a diferenciação neural e consequentemente alteram o padrão de expressão de Mash1 e Ngn2 favorecendo a decisão do destino celular neuronal. / Purinergic receptors and voltage gated Ca2+ channels have been attributed with developmental functions including gastrulation and neural differentiation. Upon activation, nucleotide-activated P2 purinergic receptor and voltage-gated Ca2+ channel subtypes trigger intracellular calcium transients controlling cellular processes. Here, we studied the participation of voltage-gated calcium channels and P2 receptor activity in spontaneous calcium transients and consequent regulation expression of transcription factors related to retinoic acid-induced neurogenesis of mouse neural stem and embryonic stem cells (ESC). In embryonic pluripotent stem cells, proliferation is accelerated by P2X7 receptor activation, while receptor expression / activity needs to be down-regulated for the progress of neuroblast differentiation. Moreover, along neural differentiation time lapse imaging with means of a cytosolic calcium-sensitive fluorescent probe provided different patterns of spontaneous calcium transients (waves and spikes) showing that both, frequency and amplitude increased along differentiation. Cells treated with the inositol 1,4,5-trisphosphate receptor (IP3R) inhibitor Xestospongin C showed spikes but not waves, indicating that waves exclusively depended on calcium release from endoplasmic reticulum by IP3R activation. Cells treated with the P2X7 receptor subtype agonist Bz-ATP and the P2Y2 and P2Y4 receptor 2-S-UTP increased frequency and amplitudes of calcium transients, mainly spikes, in embryonic telencephalon neural stem cells (NSC) and NSC pre-differentiated from ESC. Data obtained by luminescence time lapse imaging of stable transfected cells with Mash1 or Ngn2 promoter-protein fusion to luciferase reporter construct revealed increased Mash1 expression due to activation of P2Y2/P2Y4 receptor subtypes, while increased expression of Ngn2 was observed following P2X7 receptor activation. In addition, cells imaged in presence of the extracellular calcium chelator EGTA or following endoplasmic reticulum calcium store depletion by thapsigargin showed a decrease in Mash1 and Ngn2 expression, indicating that both are regulated by calcium signaling. Investigation of the roles of voltage gated Ca2+ channels in neural differentiation showed that Ca2+ influx in NSC pre-differentiated from ESC is due to membrane depolarization and L-type voltage gated Ca2+ channel activation, thereby controlling cell fate decision, by stabilizing the expression of MASH1 and inducing differentiation, by phosphorylation of the transcription factor CREB. Altogether these data suggest that P2X7, P2Y2, P2Y4 receptors and L-type voltage gated Ca2+ channels can modulate spontaneous calcium oscillations during neural differentiation and consequently change the Mash1 and Ngn2 expression patterns, thus favoring the cell fate decision to the neuronal phenotype.