Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2017-02-15T15:39:28Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1246444 bytes, checksum: 4901c76fe1d76e482dba8c70875663f3 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-02-15T15:39:28Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1246444 bytes, checksum: 4901c76fe1d76e482dba8c70875663f3 (MD5) Previous issue date: 2016-03-31 / O Brasil é o maior produtor mundial de frutos cítricos e maior exportador de suco de laranja. A maior produção está em São Paulo, seguida por Bahia, Paraná e Minas Gerais. Entre as pragas que atacam as plantas cítricas, a que vem se destacando pela rápida disseminação, difícil controle e por ser altamente destrutiva é o Huanglongbing. Tem como agente etiológico a bactéria Candidatus liberibacter sp. e é transmitida através do inseto vetor Diaphorina citri Kuwayama (Hemiptera: Liviidae). No Brasil, é regulamentada como praga quarentenária presente, e a Instrução Normativa No 53, publicada pelo Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento em 16 de outubro de 2008, aprova os critérios e procedimentos para que os órgãos estaduais de defesa sanitária vegetal realizem os levantamentos de ocorrência do HLB e adotem medidas de prevenção e erradicação. Este trabalho buscou avaliar a evolução do HLB no estado de Minas Gerais, no período do segundo semestre de 2010 ao primeiro semestre de 2015, assim como as ações no levantamento e controle da praga. Para isso, foram analisados os dados dos Relatórios de Vistoria de Plantas Cítricas entregues pelos produtores ao Instituto Mineiro de Agropecuária (IMA) e dos relatórios de levantamento fitossanitário realizado nos pomares comerciais pelos fiscais do IMA, com os objetivos de detectar plantas cítricas com sintomas de HLB e coletar amostras dessas plantas para análise laboratorial e confirmação oficial da presença da praga. Houve aumento no número de plantas cítricas com sintomas de HLB erradicadas, sendo o município de Três Pontas e a coordenadoria de Varginha os que mais eliminaram plantas nesse período. Propriedades com área menor do que 15 hectares apresentaram taxas de erradicação maiores do que propriedades com área maior do que 100 hectares. Os resultados dos relatórios de levantamento fitossanitário indicaram que desde 2013 não são confirmados novos focos da praga em municípios produtores de citros em Minas Gerais, que se restringem a 20 municipalidades. As ações para levantamento e controle da praga requerem disponibilidade de recursos humanos e financeiros, e os esforços para que ela não se dissemine devem ser mantidos e intensificados. / Brazil is currently in the first position worldwide in citros production and orange juice exportation. The main producing states are São Paulo, Paraná, Bahia and Minas Gerais. From all the diseases that attack citrus plants, the one that has been highlighted by the rapid spread, difficult to control and to be highly destructive is the HLB (ex-greening). It is caused by the bacterium Candidatus liberibacter sp. and transmitted by Diaphorina citri Kuwayama (Hemiptera: Liviidae). In Brazil is regulated as present quarantine pest and the Normative Instruction No. 53 issued by the Ministry of Agriculture, Livestock and Supply on October 16, 2008 approves the criteria and procedures for state agencies of plant health protection conduct the surveys on occurrence of HLB and adopt prevention and eradication measures. This study aimed to evaluate the evolution of HLB in the state of Minas Gerais in the second half of 2010 to the first half of 2015, and the evaluation of actions in the survey and control of the disease. To do this, data from Citrus Plant Inspection Reports delivered by producers to the Instituto Mineiro de Agropecuária (IMA) and phytosanitary survey reports conducted in commercial orchards by IMA’s supervisors in order to detect citrus plants with symptoms of HLB were analyzed and to collect samples of these plants for laboratory analysis and official confirmation of the presence of the disease. It was noted that the second half of 2010 to the first half of 2015 there was an increase in the number of citrus plants with symptoms of HLB eradicated, and the city of Três Pontas and the coordinating office of Varginha eliminated more plants in this period. Properties with an area less than 15 hectares showed higher eradication rates than properties with an area greater than 100 hectares. The results of phytosanitary survey reports showed that since 2013 is not confirmed new outbreaks of the disease in citrus producing municipalities in Minas Gerais, which is restricted in 20 municipalities. The actions for the survey and control of the disease require the availability of human and financial resources and efforts so that it can not be established must be maintained and intensified.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:26:08Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009-07-23Bitstream added on 2014-06-13T20:54:11Z : No. of bitstreams: 1 jacob_tr_me_jabo.pdf: 729486 bytes, checksum: 4304febd044d7016287bf88e804083f7 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / A citricultura é uma atividade agro-industrial de suma importância para o Estado de São Paulo e para o Brasil. Com uma área plantada em torno de aproximadamente 1 milhão de hectares o país mantém a posição de maior produtor mundial de citros. Desse total, 77% encontram-se localizados na região Sudeste. O sistema citrícola representa 4,47% das exportações de produtos do agronegócio nacional, sendo que o suco de laranja concentrado representa 72% do valor dessas exportações. Entretanto, todo este potencial econômico vem sendo prejudicado por várias doenças dentre elas uma denominada Cancro Cítrico, a qual é causada por um fitopatógeno bacteriano denominado Xanthomonas citri subsp. citri (Xcc). Com o objetivo de analisar os feitos da interação entre essa bactéria e seu hospedeiro natural, utilizou-se a técnica de Análise da Transcrição Reversa em Tempo Real (qRT-PCR) para quantificar a expressão dos genes que compõem o SSTT, SSTQ, algumas ORFs hipotéticas e as quatro cópias do gene pthA. Para tanto, realizou-se um estudo prévio com 10 genes candidatos visando identificar os mais adequados para serem usados como genes de referência no processo de normalização de dados em experimentos dessa natureza. O experimento contou com quatro replicatas biológicas e duas replicatas técnicas. Com base nos resultados, verificou-se que os genes rpoB e rpoC parecem ser os mais indicados para a normalização de dados em experimentos de expressão gênica por qRT-PCR que envolvam analises intergrupos. A maioria dos genes que compõem o SSTT se mostraram induzidos quando a bactéria esteve em contato com seu hospedeiro, com destaque para os genes hrpXct e hrpB4, o que sugere que este sistema tenha um importante papel na patogenicidade dessa bactéria. Por outro lado, os resultados e o estudo da expressão gênica evidenciaram que... / The citrus is an agro-industrial activity of great importance for the State of São Paulo and Brazil. With a planted area around 1 million hectares the country maintains its position of world's leading producer of citrus. Of these, 77% are located in the Southeast. The citrus system represents 4.47% of national agribusiness exportation, being the orange juice concentrate responsible for 72% of the value of these exports. However, all this economic potential is being hampered by diseases among them one called citrus canker, which is caused by a phytopathogenic bacterium known as Xanthomonas citri subsp. citri (Xcc). With the aim of analyzing the achievements of the interaction between this bacterium and its natural host, we used the technique of Real- Time Reverse Transcription Analysis (qRT-PCR) to quantify the expression of genes that comprise the SSTT, SSTQ, some hypothetical ORFs and the four copies of the gene pthA. Thus, a preliminary study with 10 candidate genes were conducted to identify the most suitable ones for use as reference in the process of data standardization in such experiments. The experiment had four biological replicates and two technical replicates. Based on the results, it was found that the rpoB and rpoC genes seem to be the most suitable for the standardization of data in experiments of gene expression by qRT-PCR analysis involving intergroup. Most of the genes that comprise the SSTT was induced when the bacterium was in contact with its host, with emphasis on the genes... (Complete abstract, click electronic access below)

Made available in DSpace on 2016-06-02T20:21:34Z (GMT). No. of bitstreams: 1 6066.pdf: 3990215 bytes, checksum: 05550a0cc5074637afaa52685749e202 (MD5) Previous issue date: 2014-02-25 / Financiadora de Estudos e Projetos / Brazil is a major exporter of oranges in the world, with the state of São Paulo, the largest citrus producer in the country. In the last years plants of the genus citrus have been strongly affected by various diseases and among them, the disease Huanglongbing (HLB) have occupied prominent role and importance due to the devastating damage caused to citrus production worldwide. Caused by Candidatus Liberibacter spp., a bacterium that colonizes and blocks the conductive vessels of elaborated sap (phloem) and transmitted by the vector, hemiptera, the psyllid Diaphorina citri. In this context, it is necessary to search for strategies to control the disease in citrus orchards. In order to identify a cysteine peptidase D. citri, in this work, the identification, recombinant expression and characterization of a cysteine peptidase D. citri, the type (cathepsin B) called DiaciCATHB was performed. The identification of an ORF for cysteine peptidase was performed using the database of the transcriptome of D. citri. Recombinant expression was performed in Pichia pastoris yeast cells. For activation of the recombinant enzyme important factors were observed, acidic conditions and incubation in suitable temperature and time. Kinetic characterization of the enzyme was verified by hydrolysis of the synthetic substrate Z-Phe-Arg-MCA, resulting in a (km) of 15.7 mM. Inhibition of the enzymatic activity tests were conducted using the recombinant inhibitor of cysteine peptidases CaneCPI-4, resulting in the inhibition constant (Ki) of 0.05 nM. The analysis of gene expression DiaciCATHB demonstrated that gene expression occurs in all stages of insect development, there is however a significant difference in expression level. According to the developmental stages of the insect D. citri, the expression level gradually increases DiaciCATHB, being higher in nymph and adult stages. The present results do not prove that the location and function performed by the enzyme DiaciCATHB, but regardless, the cysteine peptidase in this study has the potential to become an important target for use in future studies on insect control. / O Brasil é um dos maiores exportadores de laranjas do mundo, sendo o estado de São Paulo o maior produtor de citros no país. Nos últimos anos as plantas do gênero citrus têm sido fortemente afetadas por diversas patologias e dentre estas, a doença Huanglongbing (HLB) têm ocupado papel de destaque e importância devido aos danos devastadores causados a citricultura mundial. Causada pela Candidatus Liberibacter spp., uma bactéria que coloniza e obstrui os vasos condutores da seiva elaborada (floema) e transmitida pelo vetor, hemíptero, o psilídeo Diaphorina citri. Neste contexto, se faz necessário à busca por estratégias de controle para a doença nos pomares de citros. Com a finalidade de identificar uma cisteíno peptidase de D. citri, no presente trabalho, foi realizada a identificação, expressão recombinante e caracterização de uma cisteíno peptidase de D. citri, do tipo (catepsina B) denominada DiaciCATHB. A identificação de uma ORF para cisteíno peptidase de foi realizada através do banco de dados do transcriptoma de D. citri. A expressão recombinante foi realizada em células da levedura Pichia pastoris. Para a ativação da enzima recombinante fatores importantes foram observados, como condições ácidas e incubação em temperatura e tempo adequados. A caracterização cinética da enzima foi verificada pela hidrólise do substrato sintético Z-Phe-Arg-MCA, resultando em um (Km) de 15,7 μM. Testes de inibição da atividade enzimática foram realizados utilizando a o inibidor de cisteíno peptidases recombinante CaneCPI-4, resultando na constante de inibição (Ki) de 0,05 nM. A análise de expressão do gene DiaciCATHB demonstrou que a expressão do gene ocorre em todas as fases de desenvolvimento do inseto, havendo no entanto, uma diferença significativa no nível de expressão. De acordo com as fases de desenvolvimento do inseto D. citri, o nível de expressão de DiaciCATHB aumenta gradualmente, sendo maior nas fases de ninfa e adulto. Os resultados obtidos nesse trabalho não comprovam qual a localização e função exercida pela enzima DiaciCATHB, porém, independente disso, a cisteíno peptidase em estudo apresenta potencial para tornar-se um importante alvo para a utilização em futuros estudos no controle do inseto.

Resumo: O cancro cítrico é uma das mais graves doenças da cultura dos citros e seu agente causal (Xanthomonas citri subsp. citri) encontra-se distribuído em dezenas de países localizados na Oceania, Ásia e América. Poucas informações estão disponíveis na literatura científica concernente à caracterização e clonagem de genes de resistência ao cancro cítrico. Sessenta um genótipos, desde altamente suscetíveis até os de plantas não hospedeiras, foram utilizados no presente estudo na tentativa de identificar possíveis R-genes envolvidos na resistência a essa doença. Quatro oligonucleotídeos, desenhados com base em R-genes de Arabdopsis thaliana e Malus floribunda, foram empregados na amplificação de amostras de DNA, clonagem e sequenciamento. Algumas sequências foram amplificadas unicamente em fenótipos altamente resistentes ou de plantas não hospedeiras, ou apresentaram homologia com sequências de genes envolvidas na resistência de plantas a estresses bióticos e abióticos. Algumas sequências traduzidas, encontradas em Citrus mitis, Citrus reticulata e Poncirus trifoliata, apresentaram mesmos aminoácidos presentes em domínios conservados de R-genes do tipo NBS-LRR. / Abstract: Citrus canker is one of the most important citrus diseases worldwide. Its pathogen is the bacterium Xanthomonas citri subsp. citri that is presented in Ocean, Asia and America continents. Almost no information is available in the scientific literature about the genetic resistant against citrus canker. In the present work we developed and used primers in the tentative identification of genes involved in the resistance of citrus and other rutaceous genotypes against this disease. Sixty one genotypes, presenting complete resistant or extremely susceptible phenotypes, were tested with four primers developed based on R-genes from Arabdopsis thaliana and Malus floribunda. Some cloned sequences were identified only in resistant or non-host phenotypes or were similar with translated sequences homologues from genes involved in responses against biotic and abiotic stresses. Other traduced sequences, identified in Citrus mitis, Citrus reticulata and Poncirus trifoliata species, presented some predicted aminoacids from conserved domains of R-genes type NBS-LRR. / Orientadora: Maria Inês Tiraboschi Ferro / Coorientador: José Belasque Junior / Banca: Jackson Antonio Marcondes de Souza / Banca: Henrique Ferreira / Mestre

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:27:22Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2010-07-07Bitstream added on 2014-06-13T19:35:21Z : No. of bitstreams: 1 braga_gl_me_jabo.pdf: 800422 bytes, checksum: 8c818bf680f780fe0fe026c87dafb42e (MD5) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / O cancro cítrico é uma das mais graves doenças da cultura dos citros e seu agente causal (Xanthomonas citri subsp. citri) encontra-se distribuído em dezenas de países localizados na Oceania, Ásia e América. Poucas informações estão disponíveis na literatura científica concernente à caracterização e clonagem de genes de resistência ao cancro cítrico. Sessenta um genótipos, desde altamente suscetíveis até os de plantas não hospedeiras, foram utilizados no presente estudo na tentativa de identificar possíveis R-genes envolvidos na resistência a essa doença. Quatro oligonucleotídeos, desenhados com base em R-genes de Arabdopsis thaliana e Malus floribunda, foram empregados na amplificação de amostras de DNA, clonagem e sequenciamento. Algumas sequências foram amplificadas unicamente em fenótipos altamente resistentes ou de plantas não hospedeiras, ou apresentaram homologia com sequências de genes envolvidas na resistência de plantas a estresses bióticos e abióticos. Algumas sequências traduzidas, encontradas em Citrus mitis, Citrus reticulata e Poncirus trifoliata, apresentaram mesmos aminoácidos presentes em domínios conservados de R-genes do tipo NBS-LRR. / Citrus canker is one of the most important citrus diseases worldwide. Its pathogen is the bacterium Xanthomonas citri subsp. citri that is presented in Ocean, Asia and America continents. Almost no information is available in the scientific literature about the genetic resistant against citrus canker. In the present work we developed and used primers in the tentative identification of genes involved in the resistance of citrus and other rutaceous genotypes against this disease. Sixty one genotypes, presenting complete resistant or extremely susceptible phenotypes, were tested with four primers developed based on R-genes from Arabdopsis thaliana and Malus floribunda. Some cloned sequences were identified only in resistant or non-host phenotypes or were similar with translated sequences homologues from genes involved in responses against biotic and abiotic stresses. Other traduced sequences, identified in Citrus mitis, Citrus reticulata and Poncirus trifoliata species, presented some predicted aminoacids from conserved domains of R-genes type NBS-LRR.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:28:31Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2007-06-19Bitstream added on 2014-06-13T20:37:29Z : No. of bitstreams: 1 lopes_mv_me_jabo_prot.pdf: 799999 bytes, checksum: a3da99204a58afdd2f525f466e3bf214 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Funep/Oxiquimica / O objetivo do presente trabalho foi analisar as condições climáticas do Estado de São Paulo e desenvolver mapas de zonas de risco de epidemias de cancro cítrico, podridão floral e pinta preta do citros. Foram utilizados dados meteorológicos referentes aos anos de 2002, 2003, 2004 e 2005, os quais foram utilizados os modelos de previsão. Para o cancro cítrico desenvolvido por Campbell e Madden (1990) e Hau e Kranz (1990); podridão floral dos citros desenvolvido por Timmer e Zitko (1993) e Timmer e Brown (2000); pinta preta desenvolvido por Hau e Kranz (1990) e Bergamin Filho (1995. Após a contabilização dos índices, foram calculadas as porcentagens de dias favoráveis à ocorrência das doenças durante o ano e em períodos pré-definidos. A partir destas informações, foram gerados os mapas temáticos do Estado de São Paulo, com a distribuição espacial da porcentagem de dias favoráveis à ocorrência das doenças. A região Noroeste do Estado foi a que apresentou a maior porcentagem de dias favoráveis à ocorrência de cancro cítrico. As regiões Sul e Leste foram as que apresentaram maior favorabilidade de ocorrência da podridão floral do s citros. Para a pinta preta a região Sul com pontos no centro do Estado foi a que apresentou maior porcentagem de dias favoráveis a ocorrência da doença. / The objective of the present work was to analyze the climatic conditions of the State of São Paulo and to develop maps of zones of risk of epidemics of citrus canker, postbloom fruit drop of citrus and citrus black spot. They had been used given meteorological referring to the years of 2002, 2003, 2004 and 2005, which had been used the forecast models. For the citrus canker developed by Campbell and Madden (1990) and Hau and Kranz (1990); postbloom fruit drop of citrus developed by Timmer and Zitko (1993) and Timmer and Brown (2000); it citrus black spot developed for Hau and Kranz (1990) and Bergamin Filho (1995). The frequency of the data was hourly and when some station presented imperfection in the series of data, these had been surpassed of the station next. After the accounting of the indices, had been calculated the percentages of days favorable to the occurrence of the diseases in the year and in the periods. From these information, the thematic maps of the State of São Paulo had been generated, with the space distribution of the percentage of days favorable to the occurrence of the diseases. The region the Northwest of the State was the one that presented the biggest percentage of days favorable to the occurrence of citrus canker. The regions South and East had been the ones that had presented greater favorable of occurrence of the postbloom fruit drop of citrus. For the citrus black spot the South region with points in the center of the State was the one that presented greater percentage of favorable days the occurrence of the diseases.

Made available in DSpace on 2016-08-17T18:39:43Z (GMT). No. of bitstreams: 1 4434.pdf: 2956570 bytes, checksum: f54aa91fcb424a121affb3c9674f546e (MD5) Previous issue date: 2012-08-17 / Universidade Federal de Minas Gerais / The aim of this work was to perform differential proteomic analysis of the periplasmic protein profiles of the genome strains A, B and C of Xanthomonas spp, which differ in pathogenicity and host range of citrus. The strain Xanthomonas citri subsp. citri (Xac) is the most virulent and infects all types of citrus, while the strain B (Xanthomonas fuscans subsp. aurantifolii, Xau-B) is less virulent and the strain C (Xanthomonas fuscans subsp. aurantifolii, Xau-C) has a unique citrus-host. The comparative proteomic analysis of Xau-B and Xau-C in relation to Xac can reveal genes and proteins involved in pathogenicity and host range of citrus, respectively. The strains A (Xanthomonas citri subsp. citri, Xac) and C (Xanthomonas fuscans subsp. aurantifolii, Xau-C) were grown in XAM-1, which is known to be a pathogenicity-inducing medium for Xac, and in a non-inducing pathogenicity (Nutrient Broth, NB). Proteins from both types (grown in triplicate using both media), were separated by bidimensional electrophoresis (2DPAGE) and the gels were stained using Coomassie Brilliant Blue R-250 and documented. A comparative analysis of the protein profiles of Xac and Xau-B, and Xac and Xau-C, grown in the same culture medium, was performed using ImageMaster Platinum software (GE Healthcare). Statistical analysis (ANOVA) revealed a large number of periplasmic proteins that presented type-specific or differential expression between the two bacteria. For the comparison between Xac and Xau-B we used the twodimensional Xau-B gels of periplasmic proteins obtained by Carnielli (2011). The differential spots between Xac and Xau-C, Xac and Xau-B that showed a significant differential expression (p <0.05) were isolated from gels and identified by ESI-QUADTOF mass spectrometry (LNBio, Campinas-SP), employing Xac, Xau-B and Xau-C databases. Several differentially expressed proteins between strains were identified for the different conditions studied, showing that some of them were strain-specific (approximately 10) while others were expressed in all strains, differing only in intensity. Those proteins potentially related to pathogenicity and citrus host were quantified using the software Scaffold v. 3.0, for the mass spectrometry data.The results showed that Xac, Xau-B, and Xau-C had remarkable differences between the periplasm protein profiles for both conditions, even under conditions of no induction of pathogenicity. The proteomics approach showed that even though the strains showed a different pattern of protein expression, the sequences of genes related to the differential proteins are present in all strains. Based on the proteomic analysis, proteins that showed remarkable differential expression between the genome strainswere selected, and its expression was evaluated by Western blot in periplasmic fraction of the bacteria. The data obtained in the the comparative proteomic analysis for the superoxide dismutase corroborated most quantitative results generated by the software Scaffold. This work showed that the proteomic analysis, combined with quantitative analysis tools, is an important tool that comes to complement genomic investigations designed to differentiate the species of Xanthomonas spp. / O presente trabalho teve por objetivo a análise proteômica comparativa da fração periplasmática das estirpes-genoma A, B e C de Xanthomonas spp, as quais diferem em patogenicidade e gama de citros hospedeiros. A estirpe A (Xanthomonas citri subsp. citri, Xac) é a mais virulenta e infecta todos os tipos de citros, enquanto que a estirpe B (Xanthomonas fuscans subsp. aurantifolii, Xau-B) é menos virulenta e a estirpe C (Xanthomonas fuscans subsp. aurantifolii, Xau-C) possui um único hospedeiro cítrico. Estas estirpes foram cultivadas em meio XAM-1, conhecido como sendo um meio indutor de patogenicidade para Xac, e em meio não indutor de patogenicidade (Caldo Nutriente, CN). Após a extração de proteínas da fração periplasmática em triplicata, as mesmas foram separadas por eletroforese bidimensional (2D-PAGE) e os géis foram corados com Coomassie Brilliant Blue R-250 e documentados. A análise proteômica comparativa de Xau-B e Xau-C relativamente à Xac pode nos levar a genes e proteínas envolvidas com patogenicidade e espectro de hospedeiro cítrico, respectivamente. Assim, Xac e Xau-C foram cultivadas em triplicata em meio XAM-1, conhecido como sendo um meio indutor de patogenicidade para Xac, e em meio não indutor de patogenicidade (Caldo Nutriente, CN), sendo as células coletadas ao final da fase exponencial de crescimento, segundo curvas previamente realizadas. Após a extração de proteínas periplasmáticas, as mesmas foram separadas por eletroforese bidimensional (2D-PAGE) e os géis foram corados com Coomassie Brilliant Blue R-250 e documentados. Uma análise estatística das diferenças observadas nas intensidades dos spots nos géis 2D foi realizada entre Xau-C e Xac e entre Xau-B e Xac (nos mesmos meios de cultura) utilizando o software Image Master 2D-Platinum (GE Healthcare). Para esta última comparação foram utilizados os géis bidimensionais de proteínas periplasmáticas de Xau-B obtidos por Carnielli (2011). As proteínas diferenciais entre Xac e Xau-C e entre Xac e Xau-B que apresentaram uma expressão diferencial significativa (p<0,05) foram isoladas a partir dos géis e identificadas por espectrometria de massas (LNBio, Campinas-SP) após pesquisa em banco de proteínas anotadas a partir do genoma de cada uma das linhagens. Inúmeras proteínas diferencialmente expressas entre as linhagens foram identificadas para as diferentes condições estudadas, demonstrando que algumas foram estirpe-específicas (10 aproximadamente) enquanto outras foram expressas em todas as linhagens, diferindo na sua intensidade. Aquelas proteínas que indicaram alguma potencialidade em relação à patogenicidade e hospedeiro cítrico foram quantificadas com o uso do software Scaffold v. 3,0, a partir de dados provenientes da espectrometria de massas. Os resultados obtidos demonstram que Xac, Xau-B e Xau-C apresentam perfis proteicos marcadamente diferentes na fração de periplasma, mesmo em condições de não indução da patogenicidade. A abordagem proteômica evidenciou que embora as estirpes apresentem um padrão de expressão protéica muito distinto na fração rica em proteínas periplasmáticas, as sequências dos genes relacionados às proteínas diferenciais (superóxido dismutase e fosfoglicomutase) estão presentes em todas as estirpes. Com base na análise proteômica, foram selecionadas proteínas que apresentaram expressão diferencial acentuada entre as linhagens-genomas, nas condições estudadas, sendo sua expressão avaliada por Western blot contra extrato protéico periplasmático das três linhagens- genomas, após cultivo das mesmas em meio CN e XAM-1 Os dados obtidos para a superoxido dismutase corroboraram a maioria dos resultados quantitativos gerados pelo software Scaffold. Este trabalho evidenciou que a análise proteômica, aliada às ferramentas de análises quantitativas, é um recurso que vem complementar as investigações genômicas destinadas a diferenciar as diferentes espécies de Xanthomonas spp. Sob os aspectos biotecnológicos a busca e identificação de proteínas biomarcadoras, em especial aquelas relacionadas com patogenicidade e especificidade à hospedeiro, são importantes alvos para produção de drogas no combate ao cancro cítrico.

Submitted by Luriany Pompeo Ferraz (luriany@hotmail.com) on 2018-05-10T13:54:38Z No. of bitstreams: 1 Tese Luriany Pompeo Ferraz.pdf: 2121530 bytes, checksum: dbc5ecaf4e4d278a002ba09e3ed9af57 (MD5) / Approved for entry into archive by Alexandra Maria Donadon Lusser Segali null (alexmar@fcav.unesp.br) on 2018-05-10T18:09:10Z (GMT) No. of bitstreams: 1 ferraz_lp_dr_jabo.pdf: 2121530 bytes, checksum: dbc5ecaf4e4d278a002ba09e3ed9af57 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-05-10T18:09:10Z (GMT). No. of bitstreams: 1 ferraz_lp_dr_jabo.pdf: 2121530 bytes, checksum: dbc5ecaf4e4d278a002ba09e3ed9af57 (MD5) Previous issue date: 2018-04-10 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / O fenômeno killler é característico de leveduras que produzem e excretam proteínas ou glicoproteínas que são inibidoras de células microbianas sensíveis. A estabilidade e atividade das toxinas killer são altamente sensíveis a fatores como pH, temperatura de incubação das leveduras, composição e propriedades físico-químicas do meio e concentração de células sensíveis. Sporobolomyces koalae é uma nova espécie de levedura com potencial para produção de toxina killer. No intuito de se conhecer mais sobre as funções desse microrganismo no ecossistema, esse trabalho teve por objetivos: (i) detectar a atividade killer do precipitado proteico de S. koalae, (ii) caracterizar bioquimicamente e funcionalmente o precipitado proteico S. koalae, (iii) purificar parcialmente a toxina killer produzida por S. koalae e, finalmente, (iv) verificar sua ação antagônica sobre Geotrichum citri-aurantii e Penicillium digitatum, patógenos que ocorrem na póscolheita de citros. Pelos resultados obtidos neste trabalho, foi possível detectar a presença de atividade killer no precipitado proteico da levedura S. koalae contra células sensíveis da levedura Saccharomyces cerevisiae NCYC 1006. O precipitado proteico da levedura apresenta várias proteínas com diferentes tamanhos moleculares e, parte dessas proteínas é positiva para atividade de β1,3-glucanase, quitinase e protease, podendo ser uma dessas enzimas ou, o sinergismo entre elas, o responsável pelo fator killer da levedura. A funcionalidade de suas proteínas para atividade killer aumenta em pH 4.9 e em uma faixa de temperatura de 22 °C a 27 °C e, o melhor agente precipitante das proteínas da levedura foi o etanol 80%. A purificação parcial das proteínas, que constituem o precipitado proteico de S. koalae, mostrou a existência de aproximadamente quatro bandas proteicas em uma das frações de purificação, Fração 1, com tamanhos aproximados que variaram de 8 a 65 kDa. A atividade killer, presente no precipitado proteico da levedura S. koalae, não apresenta ação antagônica sobre Geotrichum citri-aurantii e Penicillium digitatum. / The killer phenomenon is characterized by yeasts that produce and excrete proteins or glycoproteins that are inhibitors of sensitive microbial cells. The stability and activity of killer toxins are highly sensitive to the factors such as pH, the temperature of incubation of yeasts, composition and physical-chemical properties of the medium and concentration of sensitive cells. Sporobolomyces koalae is a new species of yeast with potential for killer toxin production. In order to know more about the functions of this microorganism in the ecosystem, this work had as objectives: (i) to detect the killer activity of the S. koalae protein precipitate, (ii) to characterize biochemically and functionally the S. koalae protein precipitate, (iii) to partially purify the killer toxin produced by S. koalae, and, finally, (iv) to verify its antagonistic action on Geotrichum citri-aurantii and Penicillium digitatum, pathogens that occur in the postharvest of citrus. By the results obtained in this work, it was possible to detect the presence of killer activity in the protein precipitate of S. koalae against sensitive cells of Saccharomyces cerevisiae NCYC 1006. The protein precipitate from yeast has several proteins with different molecular sizes and some of these proteins are positive for β1,3-glucanase, chitinase and protease activity. It may be one of these enzymes or synergism between them, the responsible for the killer factor. The functionality of their proteins for killer activity increases at pH 4.9 and a temperature range of 22 oC to 27 oC and the best precipitant of protein from yeast was ethanol (80%). Partial purification of the proteins showed the existence of approximately 4 protein bands in one of the purification fractions, Fraction 1, with approximate sizes ranging from 8 to 65 kDa. The killer activity, present in the protein precipitate of yeast S. koalae, did not present antagonistic action on G. citri-aurantii and P. digitatum. / FAPESP: 14/25067-3

Orientador: Maria Célia Bertolini / Banca: Julio Cezar Franco de Oliveira / Banca: Eliana Gertrudes de Macedo Lemos / Banca: Shaker Chuck Farah / Banca: Celso Eduardo Benedetti / Resumo: O presente trabalho teve como principal objetivo realizar estudos funcionais na bactéria Xac, estudando o possível envolvimento dos genes copA, copB e cutC no mecanismo de resistência a cobre nesta bactéria. Estes estudos funcionais envolveram: análise da expressão dos genes durante o crescimento na presença de cobre por Northern e Western blots e por eletroforese bi-dimensional, produção e purificação das proteínas recombinantes e produção de anticorpos, inativação de um dos genes (copA) para avaliar a participação da proteína CopA no mecanismo de resistência a cobre e análise da interação das proteínas de resistência a cobre com outras proteínas de Xac através do ensaio de duplo híbrido de leveduras. Os resultados obtidos mostraram que a linhagem mutante infecta a planta, mas os sintomas são mais retardados na presença do metal, quando comparada à linhagem selvagem. O crescimento das células mutantes na ausência e presença de cobre in planta indicou maior sensibilidade ao cobre pelas células mutantes. Na tentativa de verificar se as proteínas CopA, CopB e CutC interagem com outras proteínas de Xac, um ensaio de duplo híbrido de leveduras foi realizado. Através deste ensaio, algumas proteínas foram identificadas, as quais necessitam de estudos de caracterização adicionais. / Abstract: Xanthomonas axonopodis pv. citri (Xac) is the causal agent of the citrus canker, a serious disease that affects the most commercial citrus cultivars causing serious economic impacts. Symptoms include canker lesions, leading to abscission of fruit and leaves and general tree decline. By sequencing the genome of this bacterium (ONSA Network, FAPESP, Brazil), a better knowledge of this microorganism and its molecular interactions with the host might be elucidated. For this, we analyzed the gene expression during growth in the presence of copper by Northern and Western blots, 2D-electrophoresis, production and purification of the CopA, CopB, and CutC recombinant proteins, inactivation of the copA gene to evaluate the participation of CopA protein in the copper resistance mechanism, and protein-protein interactions assays by the yeast two-hybrid assay. Results showed that the mutant strain infects the plant, but the lesions formation was retarded in the presence of copper. The mutant strain showed more sensitivity to copper than the wild type strain during growth in planta. In order to verify whether the CopA, CopB, and CutC proteins interact with other proteins of Xac, a yeast two-hybrid assay was performed. By this assay, some proteins were identified, which need further characterizations. / Doutor

Orientador: Antonio Carlos Maringoni / Banca: Renate Krause Sakate / Banca: Julio Rodrigues Neto / Resumo: O presente trabalho teve por objetivo avaliar a produção e a sensibilidade de 48 isolados de Xanthomonas axonopodis pv. citri e de 14 isolados de Xanthomonas spp. à bacteriocinas. Estudos foram realizados para verificar o efeito da temperatura, tempo de incubação e do tipo do meio de cultura sobre a produção de bacteriocina por isolados de X. axonopodis pv. citri. Todos isolados de X. axonopodis pv. citri não foram sensíveis às bacteriocinas produzidas por eles, não sendo essas afetadas pelo meio BDA, nutriente ágar + NaCl e YPDA, nos diferentes tempos e temperaturas de incubação. Porém, isolados de X. axonopodis pv. passiflorae foram sensíveis às bacteriocinas produzidas por 25 isolados de avaliados e o isolado de X. campestri pv. campestris e o de X. axonopodis pv. manihotis apresentaram sensibilidade variável. Dos 25 isolados de X. axonopodis pv. citri apenas cinco não foram inibidos pelas bacteriocinas produzidas por dois isolados de X. axonopodis pv. passiflorae. As bacteriocinas produzidas pelos isolados de X. axonopodis pv. citri (FDC-806) e de X. axonopodis pv. passiflorae (Mar 2850-A) foram termolábeis e resistentes à lisozima e sensíveis a DNAse. A bacteriocina produzida pelo isolado de X. axonopodis pv. passiflorae foi resistente à ação de proteinase K, tripsina e RNAse enquanto que a produzida pelo isolado de X. axonopodis pv. citri foi sensível a essas enzimas. / Abstract: The objective of this work was to evaluate the production and sensitivity of 48 Xanthomonas axonopodis pv. citri strains and 14 Xanthomonas spp. strains to bacteriocins. A number of studies were carried out to verify the effect of temperature, incubation time, and type of culture medium on bacteriocine yield by X. axonopodis pv. citri strains. None of the X. axonopodis pv. citri strains were sensitive to the bacteriocins produced by themselves, and were not affected by the PDA, nutrient agar + NaCl, and YPDA media, at the different incubation times and temperatures studied. However, X. axonopodis pv. passiflorae and strains were sensitive to the bacteriocins produced by the 25 Xac strains evaluated, while a X. campestri pv. campestris and X. axonopodis pv. manihotis strains showed variable sensitivity. Of the 25 X. axonopodis pv. citri strains, only five were not inhibited by the bacteriocins produced by the two X. axonopodis pv. passiflorae strains. The bacteriocins produced by X. axonopodis pv. citri (FDC-806) and X. axonopodis pv. passiflorae (Mar 2850-A) were thermolabile and resistant to lysozyme and sensitive to DNAse. The bacteriocin produced by the X. axonopodis pv. passiflorae was resistant to the action of proteinase K, trypsin and RNAse, while the bacteriocin produced by the X. axonopodis pv. citri isolate was sensitive to those enzymes. / Mestre