Orientador: Mara Corrêa Lelles Nogueira / Banca: Maria Teresa Destro / Banca: Alessandra Vidotto / Resumo: Nos últimos anos, a emergência de Salmonella Senftenberg no ambiente de granjas de frango tornou-se causa de preocupação, pois este sorotipo, além de ser um potencial agente de paratifo aviário em condições de estresse, tem sido associado a diversos casos de infecções humanas. Acredita-se que sua ampla disseminação seja resultado da capacidade de formar biofilmes, resistir à desidratação, acidez, temperaturas elevadas e radiação, além de permanecer por longos períodos no ceco das aves, na ração e no ambiente. Devido a estas peculiaridades, o controle de Salmonella Senftenberg é um desafio para a avicultura e exige a adoção de medidas de controle baseadas no conhecimento das rotas de disseminação e na biologia do micro-organismo. Neste estudo, a disseminação de Salmonella Senftenberg em granjas de frango, localizadas na região noroeste do estado de São Paulo, foi avaliada usando a tipagem molecular pela técnica de Pulsed Field Gel Electrophoresis (PFGE). Os dados epidemiológicos foram utilizados como ferramenta auxiliar para a comparação dos perfis de PFGE das cepas. As Salmonella Senftenberg isoladas de ingredientes de ração, ambiente de fábrica de ração, aves, ambiente dos aviários e de animais provenientes dos arredores de granjas avícolas, apresentaram diferentes identidades genéticas, indicando a transmissão de genótipos distintos entre as várias localidades / Abstract: In the last years, Salmonella Senftenberg has become an emerging pathogen affecting broiler farm's environment and figuring many concerns. In addition to be considered as potential agent of avian paratyphoid under stress conditions, this serotype has been associated to vast cases of human infections. It is supposed its wide dissemination is due to the capacity to produce biofilm, resist to dehydration, lower pH, high temperatures and radiation, and remain for long periods in the bird ceca, feed and environment. Because of these peculiarities, Salmonella Senftenberg control shows as a challenge for the poultry industry and requires the adoption of many procedures based on understanding its dissemination routes and biological cycle. In this study, Salmonella Senftenberg spread in broiler farms located in the northwestern part of São Paulo State was assessed using molecular typing by PFGE. The epidemiology data was used as an extra tool for strain comparison. Salmonella Senftenberg isolated from feed ingredients, feed mill environment, birds, poultry houses and wildlife surround poultry facilities, showed different genetic identities, indicating transmission of different genotypes between various locations / Mestre

Plasma rico em plaquetas (PRP) é um subproduto sanguíneo obtido por meio de centrifugações e subsequente separação dos elementos sanguíneos. As plaquetas são responsáveis pela produção e liberação de fatores que favorecem o reparo de diferentes tecidos. Este estudo teve como objetivo comparar e avaliar a viabilidade do PRP após congelamento e criopreservação. Foram utilizados 12 coelhos da raça Nova Zelândia adultos saudáveis para coleta de 12 mL de sangue de cada animal por meio de punção cardíaca. Para protocolo de congelamento foi usada centrífuga Centribio 14 cm de diâmetro, e para o protocolo de preservação em nitrogênio foi usada centrífuga fria a 4ºC 18 cm de diâmetro Centurion Scientific K3 Series. Foram feitas, para ambos os protocolos, duas centrifugações, a 2000 rpm por 20 minutos cada. O PRP obtido foi submetido a dois protocolos de preservação, sendo um o congelamento em freezer a -20°C (protocolo F) e outro a redução gradativa de temperatura à criopreservação a -196°C (protocolo N), usando DMSO a 6% como crioprotetor e analisados nos momentos zero (0) e decorridos 15, 30, 45 e 60 dias de preservadas. Foram realizadas contagens em câmara de Neubauer, análises através dos testes do 3-(4,5-dimetiltiazol-2yl)-2,5-difenil brometo de tetrazolina (MTT) para viabilidade celular, eletroforese SDS-PAGE para identificação proteica e cultura para fungos e mesófilas. Verificou-se que o PRP preservado sob protocolo N apresentou maior número de plaquetas preservadas quando comparado ao protocolo F (p<0,05). Ao teste de MTT o protocolo N exibiu maior variação metabólica, porém, maior viabilidade das plaquetas, confirmado pela eletroforese, onde observou-se prevalência de proteínas nas amostras criopreservadas. Ao teste microbiológico, todas as amostras se mostraram livres de contaminantes de origem bacteriana e fúngica. O método de preservação em nitrogênio líquido foi mais eficaz do que em freezer, mantendo as plaquetas metabolicamente mais ativas, as proteínas de ação reparadora tecidual e a esterilidade. / Platelet rich plasma (PRP) is a blood by-product obtained from centrifugations and subsequent separation of blood elements. Platelets are responsible for the production and release of factors that favor the repair of different tissues. This study aimed to compare and evaluate the viability of PRP after freezing and cryopreservation. Twelve healthy adult New Zealand rabbits were used to collect 12 mL of blood from each animal through cardiac puncture. Centribio centrifuge with 14 cm in diameter was used for the freezing protocol, and Centurion Scientific K3 Series cold centrifuge at 4 ° C 18 cm in diameter was used for the nitrogen preservation protocol. For both protocols, two centrifugations were done at 2000 rpm for 20 minutes each. The obtained PRP was submitted to two preservation protocols, one being the freezing at -20 ° C (protocol F) and the other the gradual reduction of temperature to cryopreservation at -196 ° C (protocol N). In both protocols were used 6% DMSO as cryoprotectant and analysis made at zero (0) times and after 15, 30, 45 and 60 days after preserved. Neubauer chamber counts were performed, tests of 3- (4,5-dimethylthiazol-2yl)-2,5-diphenyl tetrazoline bromide (MTT) for cell viability, SDS-PAGE electrophoresis for protein identification and culture for fungi and mesophiles. It was verified that PRP preserved under N protocol had a higher number of platelets preserved when compared to protocol F (p <0.05). In the MTT test, the N protocol showed greater metabolic variation, but a higher platelet viability, confirmed by electrophoresis, where protein prevalence was observed in the cryopreserved samples. At the microbiological test, all the samples were free of contaminants of bacterial and fungal origin. The preservation method in liquid nitrogen was more effective than in freezer, keeping platelets more active metabolically, tissues repairing proteins presents and sterility. / Dissertação (Mestrado)

O doripenem é um antibiótico carbapenêmico de amplo espectro e aprovado pelo Food and Drug administration (FDA) em 2007. Devido a sua recente comercialização, não está presente em códigos oficiais. Desta forma, esta dissertação teve como objetivo validar um método analítico para quantificação do Doripenem utilizando a eletroforese capilar (EC) como ferramenta analítica alternativa à Cromatografia Liquida de Alta Eficiência (CLAE), além de desenvolver métodos físico-químicos para caracterizar a matéria prima e estudar a cinética de degradação do fármaco frente à temperatura e radiação por luz UVC. Diante dos resultados obtidos, verificou-se que métodos de caracterização como a cromatografia em camada delgada, espectrofotometria de infravermelho e ultravioleta e espectroscopia de Ressonância Magnética Nuclear demonstraram ser satisfatórios para caracterização do fármaco, já os métodos como DSC e faixa de fusão não foram adequados. Para fins de comparação com a EC, realizou -se a covalidação do método de CLAE reportado na literatura, tendo sido obtido um fator de correlação de 0,9950, teor médio de I 00,09 % e recuperação de I OI , 19 %. Para o desenvolvimento do método por EC foi utilizado capilar de sílica fundida de 40 em efetivo com 50 11m de diâmetro interno, eletrólito tampão barato de sódio I 00 mM em pH 8,0, tensão aplicada de 15 kV a 25 ºC, comprimento de onda de 298 nm e, procainamida como padrão interno. O comprimento de onda 214 nm foi monitorado a presença de produtos de degradação. O método demonstrou ser específico, linear entre 25-250 11g/ml (r=0,9995) , preciso (I OI ,33 %), exato (I OI ,86 %) e robusto. Conforme os resultados obtidos, os métodos por CLAE e EC demonstraram ser intercambiáveis, contudo, a EC apresenta vantagens como menor tempo de análise e pequena quantidade de resíduo gerado. Para o estudo da cinética de degradação por EC e ensaio microbiológico (EM) , as condições verificadas foram temperatura (45 ºC, por 24 horas) e luz UVC (por 12 horas). O teor final de doripenem obtido pela EC foi de 70,74 e 64,18 % para temperatura e UVC, respectivamente. Já a potência verificada pelo ensaio microbiológico foi de 42,77 e 21 ,95 % para temperatura e UVC, respectivamente. / Doripenem is a carbapenemic antibiotic with a broad spectrum of action launched in 2005. Due to its recent commercialization, doripenem is not in official codes. So this dissertation aims to validate an analytical method to doripenem quantification using capillary electrophoresis (CE) as an alternative method to High Performance Liquid Chromatography (HPLC), besides to develop physic-chemical methods to characterize the material and to study the degradation kinetics of doripenem in UVC light and temperature (45 ºC). The characterization methods as thin layer chromatography, infrared and ultraviolet spectroscopy and spectroscopy Nuclear Magnetic Resonance proved to be satisfactory. Melting point range and DSC were not adequate to identify doripenem. To compare HPLC and EC, HPLC method was covalidate according literature. The method demonstrated a correlation factor 0.9950, average content 100.09 % and recovery 101.19 %. For the development of CE method was employed 40 em fused silica capillary in 50 11m inner, electrolyte 100 mM buffer sodium borate at pH 8.0, applied voltage 15 kV at 25 ºC, wavelength 298 nm, and procainamide as internai standard. The method demonstrated to be linear between 25-250 IJQ/ml (r=0.9995), precise (1 01.33 %), accurate (1 01.86 %) and robust. Based on these results, the HPLC and CE methods are interchangeable. However, EC presents advantages such as reduced analysis time and small residue generated. To kinetic degradation study by CE and microbiological assay (MS) conditions as temperature (45 ºC for 24 hours) and UVC light (12 hours) were tested. The final residual content for doripenem by EC was 70.74 % and 64.18 to UVC and temperature, respectively. The antimicrobial power checked by MS was 42.77 and 21 .95% for temperature and UVC, respectively.

CoordenaÃÃo de AperfeÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / O estudo foi conduzido com o objetivo de avaliar os efeitos de diferentes nÃveis de suplementaÃÃo concentrada sobre o peso corporal, parÃmetros seminais, medidas de biometria testicular, perfil proteico do plasma seminal e perfil proteico do mÃsculo Longissimus dorsi de carneiros da raÃa Morada Nova. Foram utilizados 22 carneiros com sete meses de idade. Os tratamentos consistiam em diferentes nÃveis de concentrado (0%, 0,6%, 1,2% e 1,8% do peso corporal do animal com base na matÃria seca). Os animais foram mantidos em sistema de pastejo rotacionado em pasto de capim Aruana (Panicum maximum). As amostras de sÃmen foram coletadas por eletroejaculaÃÃo ao final do experimento, quando os animais obtiveram 10 meses de idade. ApÃs o abate, os testÃculos e o mÃsculo Longissimus dorsi foram coletados. Os testÃculos foram mensurados e as proteÃnas seminais e musculares foram analisadas por meio de eletroforese bidimensional em gel de poliacrilamida. Os mapas proteicos foram analisados por meio do aplicativo PDQuest, version 8.0; Bio Rad, USA. Houve diferenÃa significativa no peso corporal e na expressÃo dos spots proteicos do mÃsculo Longissimus dorsi (P < 0,05), porÃm nÃo houve diferenÃa significativa para os parÃmetros seminais, biometria testicular e para a expressÃo de proteÃnas do plasma seminal. Os spots diferencialmente expressos (P < 0,05) foram digeridos com tripsina e submetidos à identificaÃÃo por espectrometria de massa (ESI-Q-TOF). Conclui-se, portanto, que os nÃveis de concentrado fornecido aos animais alteram o peso corporal e a expressÃo de proteÃnas do mÃsculo Longissimus dorsi, porÃm nÃo influenciam as medidas de biometria testicular, os parÃmetros seminais e a expressÃo de proteÃnas do plasma seminal. / The study was conducted in order to evaluate the effects of different levels of concentrated supplementation on body weight, seminal parameters, testicular biometry measurements, protein profile of seminal plasma and protein profile of the Longissimus dorsi muscle of the breed of sheep Morada Nova. 22 seven months old sheep were used. The treatments consisted in different levels of concentrated (0%, 0.6%, 1.2% and 1.8% of the animalsâ body weight based on dry matter). The animals were kept under a rotational grazing system, on Aruana grass (Panicum maximum). The semen samples were collected through electroejaculation at the end of the experiment, when the animals reached the age of 10 months. After slaughtering, the testicles and the muscle Longissimus dorsi were collected. The testicles were measured and the seminal and muscle proteins were analyzed through two-dimensional electrophoresis in polyacrylamide gel. The proteic maps were analyzed using the PDQuest application, version 8.0; Bio Rad, USA. There were significant differences over body weight and over the expression of the proteic spots of the muscle (P <0.05), but there was no significant difference for the seminal parameters, testicular biometry and the expression of seminal plasma proteins. The spots differentially expressed (P <0.05) were digested with trypsin and subjected to identification through mass spectrometry (ESI-Q-TOF). It is concluded, therefore, that the levels of concentrated provided to the animals change the body weight and influence the expression of the Longissimus dorsi muscle proteins, but do not modify the testicular biometry, the seminal parameters and the expression of seminal plasma proteins.

Orientador: Walkiria Hanada Viotto / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-08-10T12:05:36Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Kikuchi_Mariana_M.pdf: 738866 bytes, checksum: 1d9fee5c55f1a964b93d69d44841373b (MD5) Previous issue date: 2008 / Resumo: O conhecimento do efeito do tratamento térmico do leite e retentado sobre as características do queijo Minas Frescal com reduzido teor de gordura pode auxiliar no desenvolvimento de tecnologias que melhorem a qualidade sensorial e aumentem o rendimento desse tipo de queijo. Assim, o objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito de diferentes níveis de tratamento térmico, realizados antes e depois do processo de ultrafiltração, na composição, rendimento, tempo de coagulação, capacidade de retenção de água, proteólise, microestrutura e aceitação sensorial de queijo Minas Frescal com reduzido teor de gordura. Os tratamentos térmicos foram: a) tratamento térmico do leite (72°C/15 s ou 80°C/4s) e b) tratamento térmico do retentado (68°C/2 minutos ou 63°C/2 minutos). Leite cru integral foi padronizado a 2,0% de gordura, pasteurizado em trocador de calor de placas a 72oC/ 15 s, ou a 80°C/4 s e ultrafiltrado até atingir fator de concentração 3,5. O retentado foi então divido em duas partes, respectivamente tratadas a 68°C/2 minutos e 63°C/2 minutos. Para fabricação do queijo, o retentado foi adicionado de sal, ácido lático e coalho e coagulado diretamente na embalagem. Leite, retentado e permeado foram pesados e suas composições determinadas. O rendimento de fabricação também foi calculado. Os queijos foram analisados com relação à sua composição, tempo de coagulação, capacidade de retenção de água, reologia, textura, proteólise, microestrutura e aceitação sensorial. Os tratamentos térmicos mais intensos do leite e do retentado resultaram em maior tempo de coagulação e maior capacidade de retenção de água. O tratamento térmico mais intenso aplicado ao retentado resultou em queijos com maior teor de caseína. Os queijos obtidos a partir dos retentados tratados a 68°C também apresentaram menores índices de proteólise. A análise de Perfil de Textura (TPA) e o teste de Creep demonstraram que os queijos obtidos do leite tratado a 80°C/4s são mais moles que os obtidos do leite tratado a 72°C/15 min. A microestrutura dos queijos também mostra uma matriz protéica mais densa e compacta para os queijos produzidos a partir de leite tratado a 80 °C/4 s. Sensorialmente os queijos não diferiram entre si em nenhum dos atributos avaliados / Abstract: The knowledge of milk and retentate heat treatment effect on quality of Minas Frescal light cheese (low fat content) may assist the development of technologies which will improve its sensorial quality and yield. Therefore, the objective of this work was to determine the effect of heat treatment of milk and retentate on the composition, yield, coagulation time, water retention capacity, proteolysis, microstructure and sensory acceptance of Minas Frescal cheese with low fat content. The heat treatments were: a) milk heat treatment (72°C/15s or 80°C/4s) and b) retentate heat treatment (68°C/2minutes or 63°C/2minutes). Raw milk was standardized to 2,0% fat, heat treated and ultrafiltered until reach concentration factor of 3,5. The retentate was divided in two parts, respectively treated at 68°C/2 minutes and 63°C/2minutes. To manufacture this cheese, the retentate was added of salt, lactic acid and rennet and coagulated directly in the packaging. Milk, retentate and permeate were weighed and their compositions determined. The manufacture yield was also calculated. The composition, water retain capacity, rheology, texture, proteolysis, microstructure and sensory acceptance of cheese were determined. Increasing the intensity of milk and retentate heat treatment resulted in a longer coagulation time and higher water retention capacity of the cheese. The more intense heat treatment applied to the retentate resulted in cheese with higher casein content. Cheese made from the retentate treated at 68°C/2 min presented the lowest rate of proteolysis. The Texture Profile Analysis and the Creep test showed that cheese from the milk treated at 80°C/4s were the softest. The protein matrix was more compact for the cheese made from the treated milk at 80°C/4s. From the sensorial point of view, there was non significant difference among the cheeses / Mestrado / Mestre em Tecnologia de Alimentos

Metodologia proteômica baseada em eletroforese bi-dimensional (2D-PAGE) foi usada para auxiliar no entendimento dos mecanismos moleculares envolvidos na injúria renal induzida pelo flúor (F) e definir biomarcadores potenciais para fluorose. Três grupos de ratos Wistar machos recém-desmamados (21 dias de vida) foram tratados com água de beber contendo 0 (controle), 5 ou 50 ppm F, por 60 dias (n=6/grupo). Durante o período experimental, os animais foram mantidos individualmente me gaiolas metabólicas, a fim de que o consumo de água e ração fosse avaliado, bem como as excreções urinária e fecal de F. Os animais foram mortos e o rim esquerdo e o soro foram coletados para análises histopatológica e de F, respectivamente. Para análise proteômica foram coletados o rim direito e a urina (no dia anterior ao sacrifício, num coquetel contendo inibidores de protease em gelo). Após o isolamento das proteínas, os perfis proteômicos renal e urinário foram examinados usando 2D-PAGE e coloração com azul de Coomassie brilhante. Foi possível detectar uma doseresposta em relação à ingestão e excreção de F, bem como em relação aos níveis de F presentes no soro e nos rins dos animais. As análises histológicas não revelaram danos aos rins induzidos pelo F, com exceção de uma congestão vascular no grupo de 50 ppm F. Para os rins, a análise quantitativa de intensidade (software Image Máster Platinum, alterações de 2 vezes) revelou 30 e 17 proteínas diferencialmente expressas, respectivamente, entre os grupos controle X 50 ppm F e controle X 5 ppm F. Para a urina, 9, 10 e 13 proteínas aumentaram ou diminuíram nos grupos controle X 5 ppm F, 5 ppm F X 50 ppm F e controle X 50 ppm F, respectivamente. Nove proteínas foram identificadas satisfatoriamente por MALDI-TOF TOF MS. As proteínas identificadas estão relacionadas principalmente ao metabolismo, desintoxicação e housekeeping. Esses dados indicam que a análise proteômica de rim e urina de animais tratados com F é capaz de identificar proteínas diferencialmente expressas, mesmo em casos de baixas doses de F. Assim, essa ferramenta pode contribuir para o entendimento dos mecanismos envolvidos na fluorose, apontando proteínas-chave que deveriam ser melhor investigadas, bem como potenciais biomarcadores de toxicidade. / Two-dimensional gel electrophoresis (2D-PAGE) based proteomics approach was used to better understand the molecular mechanisms of renal injury induced by fluoride (F) and define potentials biomarkers of fluorosis. Three groups of weanling male Wistar rats (21 days old) were treated with drinking water containing 0 (control), 5, or 50 ppm F for 60 days (n=6/group). During the experimental period, the animals were kept individually in metabolic cages, in order to analyze the water and food consumption, as well as fecal and urinary F excretion. Animals were killed and left kidney and serum were collected for histopathological examination and F analysis, respectively. For proteomic analysis, right kidney and urine (one day before sacrifice, in protease-inhibitors cocktail for 8 hours in ice box) were collected. After protein isolation, renal and urinary proteome profiles were examined using 2D-PAGE and coomassie brilliant blue staining. It was possible to detect a dose-response regarding F intake and F excretion, as well as F levels in serum and kidneys. The histological analysis revealed no damage in kidneys induced by F, except for a vascular congestion in the 50 ppm F group. For kidney, quantitative intensity analysis (Image Master Platinum software, 2-fold changes) revealed 30 and 17 differentially expressed proteins between control X 50 ppm F, and control X 5 ppm F groups, respectively. As for urine, 9, 10 and 13 proteins increased or decreased in control X 5 ppm F, 5 ppm F X 50 ppm F and control X 50 ppm F groups, respectively. Nine proteins were successfully identified by MALDI-TOF TOF MS. The identified proteins are mainly related with metabolism, detoxification and housekeeping. These data indicate that proteomic analysis in kidney and urine of F-treated animals is able to identify differentially expressed proteins, even in cases of low F doses. Thus, this approach can contribute for the understanding of the mechanisms underlying fluorosis, by indicating key-proteins that should be better addressed, as well as potential toxicity biomarkers.

Orientador: Denise Vaz de Macedo / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-16T10:10:49Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Gandra_PauloGuimaraes_D.pdf: 3901290 bytes, checksum: ee5d5ae8b4367d8ada3a77f8e845aec2 (MD5) Previous issue date: 2010 / Resumo: A presente tese apresenta os resultados de dois estudos utilizando análise proteômica, sobre os efeitos agudos e crônicos do exercício de endurance no músculo de ratos. No primeiro estudo foram coletadas amostras de gastrocnemio de animais controle não exercitados, e exercitados em teste incremental de media duração em esteira ate a exaustão. Os ratos foram sacrificados 3h e 24h após o exercício. Utilizamos a abordagem clássica da análise proteômica quantitativa, que utiliza a eletroforese bidimensional (2DE) para separação das proteínas, e a espectrometria de massas para identificação destas proteínas. Seis spots apresentaram alterações significativas no volume relativo. Os spots identificados como gliceraldeido-3-fosfato desidrogenase, triose fosfato isomerase 1, subunidade beta da piruvato desidrogenase E1, carnitina palmitoil transferase 2 e HSC70 mostraram-se mais abundantes apos o exercício. Já o spot identificado como ?-actina mostrou-se menos abundante apos o exercício. Estes resultados sugerem que um único estímulo de endurance em animais destreinados não estimula a síntese de proteínas miofibrilares, mas sim de proteínas sarcoplasmáticas e mitocondriais. Essas alterações no músculo destreinado serviriam para precondicionar o músculo para realização de um exercício subsequente. No segundo estudo apresentamos a análise proteômica da porção vermelha (GV) e branca (GB) do gastrocnemio de ratos controle não treinados (C), de ratos bem adaptados ao exercício de endurance (T1), e de ratos treinados e submetidos a um período de overtraining (T2). Os ratos do grupo T2 foram subdivididos ainda em grupo overreaching funcional (FOR), que exibiram aumento ou manutenção do desempenho após o overtraining, e grupo overreaching não funcional (NFOR), cujo nível de desempenho estava diminuído apos o overtraining. Na comparação entre C, T1 e T2, 32 spots demonstraram alterações no GV e 22 no GB. No GV as maiores alterações ocorreram no grupo T2. As proteínas com aumento na abundancia indicam aumento da biogênese mitocondrial, da capacidade de captar lipídeos, maior capacidade antioxidante, maiores abundancia de chaperonas e transformação das fibras no sentido de rápidas para lentas, sugerindo que um período de overtraining e eficiente em adaptar o músculo esquelético. Já no GB as adaptações esperadas com o treinamento de endurance não foram aparentes. A diminuição da abundância de spots da aconitase sugere um maior ataque oxidativo no GB do que no GV. Após o estímulo crônico proteínas do miofilamento e de interação com o miofilamento e citoesqueleto demonstraram abundância alterada. No seu conjunto, nossos resultados sugerem que a resposta inicial do músculo a um único estimulo de endurance envolve um aumento inespecífico da capacidade de produção de ATP, enquanto a estimulação crônica aumenta somente a capacidade oxidativa, com uma concomitante diminuição da abundancia de proteínas glicoliticas. Além disso, chamam a atenção para um papel chave das mitocôndrias e proteínas dos miofilamentos e citoesqueleto no processo adaptativo e maldaptativo ao exercício. / Abstract: In the present work the acute and chronic changes in rat skeletal muscle in response to endurance exercise were investigated by proteomic analysis. The results are presented in two separated studies. In the first study gastrocnemius muscle were sampled from control non exercised animals and from animals exercised to exhaustion in an incremental manner in a treadmill. Exercised rats were sacrificed 3 and 24h after exercise cessation. We used the classic proteomic approach which utilizes two dimensional electrophoresis (2DE) to separate the proteins and mass spectrometry to identify these proteins. Six spots presented significant alterations in their relative volume. Spots identified as GAPDH, triose phosphate isomerase 1, beta subunit of pyruvate dehydrogenase E1, carnitine palmitoil transferase 2 and HSC70 were up-regulated after exercise. The spot identified as ?-actin was down-regulated after exercise. This results suggests that one bout of endurance exercise in untrained muscle may stimulate sarcoplasmic and mitochondrial proteins synthesis but not myofibril proteins. Proteins presenting increased abundance after one single bout of endurance exercise may be important for the preconditioning of skeletal muscle for a subsequent exercise bout. In the second study we present the proteomic analysis of the red (RG) and white portion (WG) of gastrocnemius muscle sampled from rats well adapted to endurance exercise (T1), well trained and submitted to an overtraining period (T2) and from control non exercised rats (C). Rats from group T2 were also subdivided in a functional overreaching group (FOR) which is composed by rats demonstrating an enhanced or unchanged performance after the overtraining period or a non functional overreaching group (NFOR) which is composed by rats demonstrating decreased performance levels after the overtraining period. When comparing C, T1 and T2, 32 spots demonstrated altered abundance in RG and 22 in the WG. The main alterations in RG were observed in the T2 group and indicated increased mitochondrial biogenesis, increased capacity of lipid uptake, antioxidant capacity, chaperone function, and a shift of fiber type from a fast-glycolytic to a slow-oxidative pattern. All these changes demonstrated the efficiency of an intensified training period to adapt skeletal muscle. The expected adaptations to endurance training were not evident in WG and the results such as decreased aconitase spots volume suggest higher oxidative stress levels in WG than in RG during overtraining. Myofilament and myofilament interacting proteins abundance were altered after chronic endurance stimuli. The results presented here suggests that the initial response of skeletal muscle to one single bout of endurance exercise encompasses an nonspecific increase of ATP production capacity while chronic stimulation increases only the oxidative capacity with a concomitant decrease in glycolytic proteins abundance. Also the results draw attention to the roles of mitochondria and myofilament proteins in adaptation and maladaptation to endurance exercise. / Doutorado / Bioquimica / Doutor em Biologia Funcional e Molecular

Orientador: Maria Luiza Moretti / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-05T06:00:21Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Menezes_DulcineaBlum_D.pdf: 1620753 bytes, checksum: 0d62ea2ae59bfb2f69d0243a4b9e4be5 (MD5) Previous issue date: 2005 / Resumo: A inserção de cateter venoso central (CVC) representa um importante risco para as infecções sistêmicas nosocomiais, e para estas infecções, Staphylococcus epidermidis é o patógeno mais importante. Com o objetivo de analisar os perfis de DNA genômico, detectar a presença e expressão de gene responsável pela produção de biofilme e estudar a dinâmica da colonização, cepas de S. epidermidis obtidas de episódios de isolamento deste microrganismo em culturas microbiológicas de ponta de CVC e/ou hemoculturas foram comparadas com cepas coletadas da microbiota do paciente hospitalizado no Hospital das Clínicas da UNICAMP. Este estudo também objetivou analisar os procedimentos médico-hospitalares intervencionais destes pacientes. Pacientes com culturas microbiológicas de ponta de CVC (>15 UFC) e/ou hemoculturas positivas para S. epidermidis foram selecionados para a coleta de microbiota presente na pele e mucosa nasal, através de coleta local com zaragatoas umedecidas. As cepas de S. epidermidis foram analisadas através do método de PFGE; teste de sensibilidade a antimicrobianos; detecção da presença do gene ica, através da técnica de PCR e detecção de biofilme, através do método CRA. Fizeram parte deste estudo 247 cepas obtidas de 12 pacientes selecionados em 18 episódios estudados. Foram encontrados 26 distintos perfis genotípicos e 4 perfis fortemente relacionados. Em 10 episódios o mesmo perfil genotípico de DNA foi detectado simultaneamente em cepas clínicas e de microbiota, onde 6 destes episódios ocorreram quando o período de implantação da CVC foi superior a 15 dias. Nos 7 episódios em que não houve concordância entre os perfis genotípico de DNA em cepas clínicas e de microbiota, 5 destes episódios ocorreram igualmente em período inferior a 15 dias, não havendo diferença estatística entre os grupos. Por PFGE foram identificados 6 perfis genotípicos predominantes nas cepas de microbiota. Estes perfis representaram 68% (132/193) das cepas de microbiota, e um destes perfis se mostrou prevalente (77/193) nas cepas de microbiota. Em 10 episódios (8 pacientes), o perfil genotípico prevalente foi identificado compondo a microbiota. Foi comprovado, por comparação da diversidade dos perfis genotípicos, que durante o período de hospitalização o perfil geral da microbiota sofre mudanças de um perfil de diversidade genotípica policlonal para um perfil de diversidade oligoclonal, com predominância de um perfil genotípico. A mudança de diversidade genotípica foi relacionando a administração prévia de ciprofloxacina. As cepas com perfis genotípicos predominantes não apresentaram maior prevalência da presença do gene ica, em relação às cepas não predominantes, o que não foi justificado que cepas potencialmente produtoras de biofilme se sobrepusessem em relação às cepas desprovidas deste gene. Oito dos 12 pacientes apresentaram concomitante ou posterior infecção por bacilos Gram negativos, destes 2 foram a óbito por septicemia. De acordo com os resultados, nós concluímos que pacientes submetidos a longos períodos de hospitalização são colonizados por microbiota de diversidade oligoclonal de S. epidermidis e a colonização ou infecção de CVC por destas cepas, potencialmente produtoras de biofilme em contato com a corrente sanguínea, pode ser uma oportunidade para infecções posteriores por outros microrganismos devido a potencial produção de biofilme inerente a S. epidermidis / Abstract: Central vascular catheters (CVC) represent an important risk for nosocomial bloodstream infections and Staphylococcus epidermidis is the most important pathogen of these systemic infections. To analyze the genomic DNA profiles, to detect the presence and expression of the responsible gene for biofilm production and to study the colonization dynamic, S. epidermidis strains isolated from tip CVC and blood positive cultures were compared with the strains isolated from skin and nasal swab in patients hospitalized in a tertiary care university hospital, the Hospital das Clínicas of UNICAMP. It was analyzed the previous medical care proceedings that the same patients underwent. Patients with microbiologic cultures for S. epidermidis from blood and/or catheter tip (>15 CFU) were selected to have swabs from skin and nasal. S. epidermidis were typed using PFGE, antibiotic susceptibility testing, presence of ica gene detection, by PCR, and biofilm detection, by Congo red method, were performed. Twelve patients with 18 episodes of colonization or catheter-related infection were included in this study and 247 strains were analyzed. It was found 26 distinct genotypic profiles and 4 strongly related genotypic profiles. In 10 episodes, the same DNA profile was detected in clinical and in microbiota strains, 6 of them occurred when the period of catheter implantation were higher than 15 days. In 7 episodes, there was not concordance among genotypic profiles from clinical and microbiota strain, and 5 of them occurred when the period of catheter implantation were lower than 15 days, too. It was not found statistic difference between the groups. PFGE identified six predominant genotypic profiles that were present in 68 % (132/193) of microbiota strain, and one of them was prevalently present (77/193). The prevalent genotypic profile was found compounding the microbiota in 10 episodes (8 patients). It was proofed, by comparison of the diversity of genotypic profiles, that during the hospitalization period the microbiota general profile changes from the diversified genotypic profile (polyclonal) to a poorly diversified genotypic profile (oligoclonal), with a predominant genotypic profile. It found was related with the previous ciprofloxacin administration. The predominant DNA profiles strains did not presented higher prevalence according to the presence of ica gene when comparing to non predominant strains, what it was not justified that potentially biofilm producers can superpose over non ica strains. Eight of 12 patients presented concomitant or posterior infection by negative Gram rots, whose 2 were to obit by sepsis. According to the results, we concluded that patients with long-term hospitalization were previously colonized by oligoclonal-diversified microbiota S. epidermidis and CVC colonization or infection by this agent, potentially biofilm producer present at bloodstream can be an opportunity to other microorganism posterior infections, due to potential biofilm production inherent to S. epidermidis / Doutorado / Ciencias Medicas / Doutor em Clínica Médica

Hydric deficit is one of the main limiting factors for the sugarcane productivity increase in the Brazilian northeast. The process can be worsened due to the global climatic changes and it is estimated the episodes of hydric restrictions will be much more frequent, including in other cultivation areas in Brazil. When plants are submitted to the hydric stress, there is an induction of a series of genes and specific proteins as an adaptation mechanism to this condition. Therefore, proteome studies can be a powerful tool to identify proteins and find out their mechanisms of response and adaptation to the hydric stress. The present study aimed to evaluate changes in the proteome of the RB72910 (tolerant of the hydric stress) and RB72454 (sensitive) genotypes of sugarcane as well to identify the proteins involved when submitted to hydric stress. To carry out these goals, plants were cultivated in a greenhouse, and after two months of cultivation (control), the irrigation was suspended for 2 days (stress), which was monitored by the hydric potential determination (Ψw). After this period, the irrigation was restarted for two more days (recovery). For the proteome analysis, three extraction methods to prepare protein samples for two-dimensional electrophoresis were tested. The method that presented the best results on the number of spots, quality and reproducibility of the gels was the adapted method of phenol extraction. Results showed the presence of several exclusive spots with differences in the expression between sensitive and tolerant genotypes. It was detected 480 spots for the sensitive genotype and 352 spots for the tolerant genotype, and a total of 80 spots were identified by mass spectrometry (MS-MALDITOF) after the proteome analysis for the control, stress and recovery treatments. It was possible to see between both genotypes that 24% of the proteins identified and related to the stress were present in the tolerant genotype, while just 3% of the proteins associated to the hydric stress were observed in the sensitive genotype. The MS analysis of the identified spots showed the presence of proteins such as chaperona, ascorbato peroxidase, superoxide dismutase, heat shock, 14,3-3-like and isoflavone reductase, which have been described to participate in the plant defense mechanisms against biotic and abiotic stresses. / O deficit hídrico é um dos principais fatores limitantes para o aumento da produtividade da cana-de-açúcar no nordeste brasileiro. Essa situação pode ser agravada, pois, devido às preditas mudanças climáticas globais, estima-se que os episódios de restrição hídrica sejam ainda mais freqüentes, inclusive em outras áreas de cultivo no Brasil. As plantas, quando submetidas ao estresse hídrico, expressam uma série de genes e proteínas específicas como um mecanismo de adaptação a essa condição. Portanto, o estudo da proteômica pode ser uma poderosa ferramenta para a identificação de proteínas e determinação dos mecanismos de resposta e adaptação ao estresse hídrico. O presente estudo teve como objetivo verificar a alteração no proteoma e identificar as proteínas envolvidas, dos genótipos: RB72910 (tolerante ao estresse hídrico) e RB72454 (sensível) de cana-de-açúcar quando submetidos ao estresse hídrico. As plantas foram cultivadas em casa de vegetação, e após dois meses de cultivo (controle), suspendeu-se a rega por 2 dias (estresse) que foi monitorado pela determinação do potencial hídrico (Ψw). Após esse período, retomou-se a irrigação na capacidade de campo por mais dois dias (Recuperação). Três métodos de extração para preparação de amostras protéicas para eletroforese bidimensional foram testados. O método que apresentou os melhores resultados no número de spots, qualidade e reprodutibilidade dos géis foi o método modificado de extração fenólica. Após a análise do proteoma dos tratamentos (controle, estresse e recuperação) para os dois genótipos, constatou-se a presença de vários spots exclusivos e com diferenças de expressão entre os genótipos sensível e tolerante. Foram detectados 480 spots para o genótipo sensível e 352 spots para o genótipo tolerante e um total de 80 spots foram identificados por espectrometria de assas. Foi possível observar que dentre as proteínas possivelmente envolvidas com o estresse hídrico 24% estavam presentes no genótipo tolerante, enquanto apenas 3% foram observadas no genótipo sensível. A análise dos spots identificados via espectrometria de massas demonstrou para a cana-de-açúcar, a presença de proteínas como Chaperonas, Ascorbato peroxidase, Superóxido dismutase, choque térmico, 14,3-3-like e Isoflavona reductase, proteínas que têm sido descritas por participar de mecanismos de defesa das plantas contra estresses bióticos e abióticos.

Orientador: Helena Teixeira Godoy / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-08-15T07:26:27Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Bizzotto_CarolinaSchaper_D.pdf: 1638844 bytes, checksum: 02d02a3b31cb8fd2bf5d15d5464fe34c (MD5) Previous issue date: 2010 / Resumo: A otimização simultânea de múltiplas respostas foi utilizada no desenvolvimento de um método por eletroforese capilar (EC) para a determinação de cafeína em café descafeinado. O método foi desenvolvido utilizando o planejamento composto central para otimizar a concentração de dodecilsulfato de sódio (SDS), a concentração de carbonato de sódio e a voltagem. Os experimentos foram conduzidos com uma amostra de café descafeínado, onde o resíduo de cafeína foi extraído com clorofórmio, ressuspenso em água e filtrado. As condições otimizadas foram encontradas pela avaliação dos efeitos de seis respostas: separação de interferentes, área, ruído, variação na linha de base, corrente e tempo de análise. Modelos de regressão lineares e quadráticos foram gerados para cada conjunto de respostas. Os modelos de regressão, coeficientes de correlação e a análise de componentes principais (PCA) foram usados na determinação das condições experimentais ótimas. Os melhores resultados foram obtidos usando-se um capilar de 50 mm x 48 cm, tampão contendo 10 mmol. L-1 de carbonato de sódio e 50 mmol. L-1 de SDS (pH 11,0), 15 kV, 25,0 ºC e detecção a 206 nm. Sob as condições otimizadas, a cafeína foi separada dos interferentes. O tempo de análise foi de 5,5 min. O método desenvolvido foi validado e comparado a um método por CLAE quanto à eficiência de separação, tempo de análise, custo por análise e volume de resíduos gerados. O método por EC foi então aplicado a amostras de café descafeinado torrado moído e instantâneo e amostras de bebida enérgética. A quantidade total de xantinas presentes nas bebidas chimarrão e tererê, a base de erva-mate (Ilex paraguariensis), também foi avaliada. Estas bebidas foram preparadas como são tradicionalmente consumidas. Os valores de cafeína das amostras analisadas tanto por EC quanto por CLAE não foram estatisticamente diferentes a 95% de confiança. A sensibilidade do método por CLAE foi 42 vezes maior que a do método por EC, porém este apresentou um tempo total de análise 30,4% menor. O volume de resíduos gerados foi 33 vezes maior no método por CLAE, e o custo em reagentes foi 76,5 vezes menor por EC. A vantagem mais importante do método por EC foi o uso de tampão aquoso econômico e ecológico no processo de separação. Com relação às amostras analisadas, sete amostras de café de quatro diferentes marcas apresentaram teor de cafeína acima do permitido pela legislação brasileira, e 76% das bebidas energéticas possuíam menos cafeína do que o valor informado no rótulo do produto. O teor de cafeína e teobromina variou nos diferentes tipos comerciais de erva-mate empregados no preparo das bebidas. Além disso, o tererê apresentou níveis de xantinas 2,5 vezes maior que o chimarrão / Abstract: Multiple response simultaneous optimization was used to develop a micellar electrokinetic chromatography (MECK) method for caffeine determination in decaffeinated coffee samples. The method was developed using a central composite design to optimize the concentration of sodium dodecylsulfate (SDS), sodium carbonate and voltage (V). The experiments were carried out using a sample of Brazilian decaffeinated coffee extracted with chloroform, which was subsequently recovered with water and then filtered. Optimized conditions were found by evaluating the effects of six responses: interferent separation, area, noise, baseline variation, current e analysis time. Each set of response values was regressed on the factor levels of the experimental design using linear and quadratic models. The regression models, correlation coefficients involving both factor levels and response values, and a principal component analysis (PCA) were used to determine the optimum experimental conditions. Successful results were obtained using a fused-silica capillary of 50 mm x 48 cm total length, buffer containing 10 mmol. L-1 of sodium carbonate and 50 mmol. L-1 of SDS (pH 11.0), voltage of 15 kV, temperature of 25.0 ºC, with detection at 206 nm. Under optimized conditions, caffeine was separated from the interferents. The analysis time was of 5.5 min. After validation, the capillary electrophoresis (CE) method was compared to a HPLC method regarding separation performance, quantification of caffeine in twenty samples, analysis time, costs per analysis and volume of generated residue. CE method was applied to decaffeinated instant and groundroasted coffee, and energy drinks. The total amount of xanthines in mate (Ilex paraguariensis) beverages, ¿chimarrao¿ and ¿terere¿ obtained in the same way as they are traditionally consumed, was also estimated using the CE method. Caffeine content of the samples analyzed with both CE and HPLC methods did not differ statistically at 95% confidence level. HPLC method sensitivity was 42 times greater than by CE method. In another hand, CE presents total analysis time 30.4% lower than HPLC. The volume of generated residues was 33 times greater in HPLC and the cost in reagents for CE was 76.5 times lower than for HPLC. The most important advantage of CE is the use of economical and ecological aqueous buffer in the separation process. Regarding samples analyzed, seven decaffeinated coffee samples of four different brands showed higher levels than the limit specified by Brazilian legislation and 76% of the energy drinks samples had caffeine content lower than the value informed to the consumer. Caffeine and theobromine levels varied in different commercial types of mate employed for the beverages preparation. Besides, ¿terere¿ presented quantities 2.5 times higher than the ¿chimarrao¿ beverage / Doutorado / Doutor em Ciência de Alimentos