Aplicou-se duas metodologias para isolamento de bactérias ainda \"não-cultivadas\" em amostras de água do mar de Ubatuba (SP, Brasil) e da Baía do Almirantado (Antártica). Pela adaptação do método de cultivo de alto desempenho (HTC), foi possível isolar 4 culturas bacterianas, nas quais duas podem ser consideradas ainda não-cultivadas e foram identificadas através das análises filogenéticas do gene rRNA 16S. Ao aplicar o método de inóculo em meio de cultura diluído 1/10, nas amostras de água do mar antártico, 81 isolados bacterianos foram identificados (gene rRNA 16S), sendo que um deles, é candidato a um isolado \"não-cultivado\". Outras abordagens fenotípicas e genômicas serão necessárias para definir a caracterização taxonômica destas bactérias \"não-cultivadas\" obtidas. A presença dos genes alk foi detectada em 11 isolados bacterianos antárticos, destes, um representante apresentou similaridade com uma sequência de gene alkM, recém-descrita em estudo prévio, em um dos clones de bibliotecas metagenômicas de sedimentos, na mesma região de amostragem. / Two different methods were applied for culturing marine bacteria in order to isolate uncultured representatives from Ubatuba seawater (SP, Brazil) and from Admiralty Bay (Antarctica). The adapted high-throughput culturing (HTC) procedures allowed to obtain four isolates. Two of them are uncultured bacteria candidates from coastal seawater studied and they were identified by phylogenetic analysis for 16S rRNA genes. The use of traditional plating on 1/10 dilution of agar media for the Antarctica seawater samples, allowed to isolate 81 cultures that were identified (16S rRNA gene), and one of these isolates is most likely to be an uncultured micro-organism. For taxonomic purposes, several others phenotypic and genomic methods must be applied for the further characterization of these uncultured bacteria. The alk genes were detected in eleven bacterial isolates from Antarctic. One of them, showed similarity to the sequence of an alkM gene, described in previous work in environmental clones libraries od sediments, from the same sampling area.

Neste trabalho foi realizado um estudo sobre a associação entre características da madeira importantes na produção de polpa celulósica e o genótipo dos indivíduos de uma população de híbridos de Eucalyptus grandis × Eucalyptus urophylla aos quatro anos de idade. Em termos de características da madeira determinou-se a densidade básica, teor de lignina klason, extrativos totais e holocelulose. A genotipagem foi realizada utilizando 14 combinações entre o iniciador arbitrário TRAP2 e iniciadores fixos relacionados às características de interesse. 36 marcadores microssatélites também foram utilizados na genotipagem. A densidade básica bem como os teores dos componentes químicos da madeira encontrados estão dentro do esperado para espécies do gênero. O estudo de associação fenótipo-genótipo, detectou oito associações, sendo quatro delas entre marcadores TRAP e as quatro entre marcadores microssatélites. As associações significativas detectadas foram principalmente entre marcadores e densidade básica sendo as maiores associações com os marcadores TRAP2/COMT (210 pb) (26%) e E2010 (24%). Igualmente e, em segundo lugar, entre marcadores e teor de lignina e extrativos totais. O maior grau de associação significativo foi detectado entre o marcador TRAP2/HCT (190 pb) e o teor de lignina sendo a associação de 32 %. Não foi detectada associação entre marcadores e teor de holocelulose. Mais de uma marca foi relacionada com uma característica o que reforça teorias de controle genético exercido por mais de um gene. Também foi detectada associação entre uma marca e duas características diferentes sugerindo que um mesmo gene possa exercer o controle sobre mais de uma característica. O estudo mostrou portanto correlações entre as propriedades da madeira e associação, em diferentes níveis, entre essas e marcas genéticas. / It was studied in this work the association between wood characteristics that are important to the cellulosic pulp and paper production and the hybrid population individual genotype Eucalyptus grandis × Eucalyptus urophylla at the age of four years. The basic density, characteristic of mayor interest, was valuated using the maximum humidity content method. The amount of Klason lignin, total extract and holocellulose were obtained using conventional analysis methods. The genotyping was done using 14 combinations between the arbitrary primer TRAP2 and fixed primers related to the characteristics of interest. 36 microsatellite markers were also used during the genotyping process. The basic density and the wood chemical components amounts were found between the expected values for each genus. The study revealed that there are negative co-relationships between the wood chemical characteristics. The relationship between the holocellulose amount and the total extracts value is approximately 71% as the corelationship between the holocellulose amount and the lignin value is 55%. It was detected a positive relationship between the Klason lignin amount and the basic density. The phenotypegenotype association study detected eight associations, four of them being between TRAP markers and the other four between microsatellite markers. The significant associations detected were mainly between the markers and the basic density, especially the association with the markers TRAP2/COMT (210 bp) (26%) and E2010 (24%). Equally and in second place it stands the association between the markers and the lignin value and the total extracts. The mayor significant association degree was detected between the TRAP2/HCT marker (190 bp) and the lignin value, being it 32 %. It was not detected any relationship between the markers and the holocellulose amount. More than one mark was related to one characteristic which enhances genetic control theories carried by more than one gene. It was also detected an association between one mark and two different characteristics suggesting that one same gene can have control over more than one characteristic. The study revealed therefore co-relationships between wood properties and association in different levels between those and genetic marks.

A mutagênese química utilizando o agente mutagênico N-ethyl-N-nitrosourea (ENU) seguida da observação do fenótipo deu origem a um mutante Anêmico. O tipo de herança é autossômica dominante, com morte intra útero dos mutantes homozigotos. O mapeamento genético foi feito utilizando-se marcadores microssatélites, sendo selecionados marcadores polimórficos entre as linhagens BALB/c e C57BL/6 envolvidas no mapeamento. Estabeleceu-se um painel de microssatélites distribuídos por todo o genoma do camundongo, que permitisse a localização do cromossomo portador da mutação. O gene mutante foi localizado no cromossomo 7 entre os marcadores D7Mit301 e D7Mit131 delimitando um intervalo entre 46,5cM e 51cM de 4,5cM. Através das análises fenotípicas do mutante Anêmico e estudo dos genes candidatos neste intervalo, foi selecionado o gene Hbb responsável pela síntese das globinas b-major e b-minor , sendo o gene que mais se identifica com as características do mutante, localizado a 50cM. A deficiência deste gene leva a uma das mais severas anemias humana, a b-Talassemia major. / Chemical mutagenesis, using the mutagenic agent N-ethyl-N-nitrosourea (ENU), and followed by observation of the phenotype, originated in an Anaemic mutant. The inheritance-type is dominant auto-somic, with intra-uterus death of the homozygotic mutants. Genetic mapping was undertaken by means of micro-satellite markers, polymorphic markers being selected from among the BALB/c and C57BL/6 lineages involved in the mapping itself. A panel was established of the micro-satellites distributed throughout the whole mouse genome, thereby permitting localization of the mutation bearing chromosome. The mutant gene was located in chromosome 7 between markers D7Mit301 and D7Mit131, these delimiting an interval between 46,5cM and 51cM of 4,5cM. Selection of the Hbb gene responsible for synthesis of the b-major and b-minor globins came about through phenotypic analysis of the Anaemic mutant and a study of candidate genes within this interval, the selected gene being that which was most identified with the mutants characteristics and located at 50cM. A deficiency in this gene leads to one of the most severe forms of human anaemia, b-Talhassemia major.

Atualmente a alta incidência de isolados multirresistentes a antibióticos utilizados na clinica tem-se tornado alarmante. Estudos recentes demonstraram que um dos motivos que contribuem para o aumento da resistência a antibióticos em bactérias é a ocorrência de linhagens que apresentam o fenótipo mutador. Deficiências nos genes do complexo mut, que incluem os sistemas de reparo dependente de metilação (MMR do inglês methyl-directed mismatch repair), e o sistema de reparo oxidativo (GO) podem gerar linhagens com um fenótipo mutador, que, por sua vez, levam ao aumento das taxas mutacionais espontâneas. Isolados clínicos com fenótipo mutador foram descritos em amostras de Escherichia coli patogênica empregando-se a resistência para antibióticos como rifampicina, cloranfenicol e quinolonas mas não há registros de estudos envolvendo o possível impacto do fenótipo mutador sobre a frequência de mutações espontâneas que levem à resistência aos antibióticos beta-lactâmicos. No presente trabalho estudamos a ocorrência do fenótipo mutador frente à resistência aos antibióticos beta-lactâmicos de amplo uso clínico em linhagens de E. coli patogênicas de origem humana, incluindo 48 amostras de E. coli uropatogênica (UPEC) e 5 amostras de E. coli associadas a infecções entéricas. Foram utilizadas como controles positivos para o fenótipo mutador linhagens de E. coli K12 deficientes nos genes mutY ou mutS. Testes qualitativos revelaram a ocorrência de 6 amostras de UPEC e 2 amostras de EHEC com fenótipo mutador para cefalotina, ceftazidima e rifampicina. Entre as amostras estudadas, 3 linhagens de UPEC (amostras 29, 32 e 47) e 1 linhagem de EHEC (amostra 80) apresentaram fenótipo mutador frente à cefalotina e à ceftazidima confirmado em testes quantitativos com valores de mutação espontânea variando entre 0,68 x 10-4 e 0,8 x 10-6. Os resultados baseados em amplificação por PCR revelaram ausência de alterações estruturais em 3 genes do complexo mut (mutS, mutY e mutL) nos quatro isolados que apresentaram fenótipo mutador. O trabalho também envolveu a determinação dos níveis de resistência em clones derivados das 4 linhagens mutadoras após exposição à cefalotina ou à ceftazidima. As colônias obtidas também foram analisadas para a determinação da natureza de mutação que resultou na resistência aos antibióticos beta-lactâmicos. Os resultados obtidos apontam para aumento nos níveis de expressão de uma beta-lactamase para os derivados resistentes da amostra 32, possíveis alterações de permeabilidade do envoltório celular, e, indiretamente, modificação dos alvos celulares para esses antibióticos. Esses resultados revelam a elevada ocorrência do fenótipo mutador entre amostras de UPEC oriundas da clínica e destacam a importância do fenômeno sobre a ocorrência de resistência aos beta-lactâmicos de uso clínico. / Currently the high incidence of isolates with multiple resistance to antibiotics used in the clinic is alarming. Recent studies show that one of the reasons that may contribute to increased resistance in bacteria is the occurrence of strains with the mutator phenotype. Deficiencies in mut genes complex including methylation-dependent repair system (MMR from English methyl-directed mismatch repair) and oxidative repair system (GO) can generated strains with a mutator phenotype, which in turn leads to increasing spontaneous mutation rates. Clinical isolates with the mutator phenotype were reported among pathogenic Escherichia coli with antibiotics such as rifampicin, chloramphenicol and quinolones. Nonetheless, there are no studies describing the involvement of the possible impact of the mutator phenotype on the frequency of spontaneous mutations leading to resistance to beta-lactam antibiotics. In this work we studied the occurrence of the mutator phenotype leading toresistance to beta-lactam antibiotics use in clinics. For this purpose we tested a set of pathogenic E. coli strains of human origin, including 48 strains of uropathogenic E. coli (UPEC) and 5 strains of E. coli associated with enteric infections. As positive controls for the mutator phenotype we used E. coli K12 strains deficient in mutY or mutS genes. Qualitative tests revealed 6 UPEC samples and 2 EHEC strains with mutator phenotype for cephalothin, ceftazidime and rifampicin. Three UPEC strains (samples 29, 32 and 47) and one EHEC strain (sample 80) showed spontaneous mutation frequencies ranging from 0.68 x 10-4 to 0.8 x 10-6 to cephalothin and ceftazidime. The results based on PCR amplification revealed no structural changes in the mut gene complex (mutS, mutY and mutL) in the four mutator strains. The work also involved determination of the resistance level to cephalothin or ceftazidime of clones derived from the mutator strains. The colonies obtained were also analyzed to determine the nature of mutation leading to beta-lactam resistance. The results indicated increased expression levels of of a beta-lactamase in derivatives of the 32 strain, possible reduction in cell envelope permeability and, indirectly ,modification of cellular targets for these antibiotics. These results showed the high occurrence of mutator phenotype among UPEC strains derived from clinical settings and highlight the importance of the phenomenon on the occurrence of resistance to beta-lactam antibiotics in clinical use.

No câncer de mama, o metabolismo tumoral, ação dos moduladores de estrógenos são fatores que podem influenciar as células dendríticas (DCs). Neste trabalho avaliou o fenótipo de DCs em amostras tumorais, a diferenciação de DCs a partir de células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) das pacientes e comparou com voluntárias saudáveis. Os resultados mostraram que há alteração na capacidade de geração, no fenótipo, na capacidade aloestimuladora, maior produção de interleucina 10 e expressão de HSP27 nas DCs de pacientes, comparadas com as DCs de voluntárias saudáveis que produzem mais Interferon-gama. A via p38MAPK parece ser importante na diferenciação de PBMCs em DCs, entretanto, estímulos estressantes podem ativar esta via e induzir a síntese de HSP27 inibindo este processo. O tratamento com tamoxifeno parece modular a expressão de algumas moléculas de membrana. Desta forma, os resultados sugerem que as DCs diferenciadas de pacientes com câncer de mama apresentam alterações fenotípicas e funcionais causadas pelo microambiente tumoral. / In breast cancer, the tumor metabolism, the action of estrogens antagonists can influence dendritic cells (DC) generation. The aim of this work was to evaluate the frequency of DCs in tumor tissue and the differentiation of DCs derived from peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) and compared the phenotypic and functionally of these cells from healthy individuals and breast cancer patients. The results showed that patients PBMCs were unable to generate phenotypicaly, functionally mature DCs and presented larger production of interleukin 10 and higher expression of HSP27 when compared with healthy volunteers\' DCs, presented higher production of Interferon-gamma. The p38 MAPK signaling pathway seems to be important in PBMCs differentiation into DCs, and its activation by stress can induce the synthesis of HSP27, that inhibits DC generation. The tamoxifen treatment caused modulation of membrane DC markers expression. Therefore, these results show that patients\' DCs present phenotypic and functional alterations which can be caused by tumor microenvironment.

Os métodos sorológicos para determinar o fenótipo Vel- requerem o uso de antissoros humanos raros e não permitem o rastreamento de muitas amostras ao mesmo tempo, limitando sua aplicação como ferramenta para busca de doadores raros. Neste estudo, desenvolvemos uma estratégia de triagem molecular de baixo custo, usando PCR em tempo real e reciclagem do DNA extraído de pools de plasma da rotina viral NAT (Teste de Ácido Nucleico) para identificar doadores Vel- e Vel+W. Um total de 25.322 doadores de sangue do Sudeste Brasileiro foram genotipados por PCR em tempo real para detectar a deleção de 17nt (c.64_80del17) no gene SMIM1, que determina o fenótipo Vel-, utilizando DNA extraído de pools de plasma de seis doadores rotineiramente descartados após a liberação dos resultados NAT para HBV, HCV e HIV. Cento e oitenta e oito (188) de 4.220 pools foram reativos para deleção. A deleção SMIM1*64_80del17 estava presente em 210 doadores sendo em 208 (0,4%) em heterozigose e em apenas dois (0,008%), em homozigose. A estratégia de genotipagem de pools de DNA, usando o ensaio de PCR em tempo real, desenhado para a identificação da deleção de 17 nucleotídeos no gene SMIM1, mostrou-se eficaz e acurada na identificação de doadores com fenótipo Vel- e Vel+W. A reciclagem do DNA da rotina NAT a torna uma técnica economicamente atrativa e definitivamente superior às técnicas sorológicas para o rastreamento deste fenótipo raro. / Serologic methods to determine the Vel- phenotype require the use of rare human antisera and do not allow for many samples to be tested simultaneously, which limits their application as a tool to search for rare donors. This study developed a low-cost molecular screening strategy using the real-time polymerase chain reaction (PCR) with DNA extracted from plasma pools used for viral nucleic acid test (NAT) screening, to identify Vel- and Vel+W donors. A total of 25,322 blood donors from the Brazilian southeast region were genotyped through real-time PCR targeting the 17-nucleotide (c.64_80del17) deletion in the SMIM1 gene, which determines the Vel- phenotype, by using leftover nucleic acid from plasma pools of six donors, routinely discarded after the release of viral NAT results. One hundred and eighty eight from 4,220 pools tested were reactive. The SMIM1*64_80del17 deletion was present in 210 donors, 208 (0.4%) in heterozygosity and only 2 in homozygosis (0.008%). The DNA pool genotyping strategy using real-time PCR designed to detect the deletion in the SMIM1 gene proved effective and accurate in identifying donors with the Vel- and Vel+W phenotypes. The fact that residual nucleic acid from routine viral NAT screening was successfully employed renders this technique economically attractive and definitely superior to the serologic techniques available to search for this rare phenotype

Aplicou-se duas metodologias para isolamento de bactérias ainda \"não-cultivadas\" em amostras de água do mar de Ubatuba (SP, Brasil) e da Baía do Almirantado (Antártica). Pela adaptação do método de cultivo de alto desempenho (HTC), foi possível isolar 4 culturas bacterianas, nas quais duas podem ser consideradas ainda não-cultivadas e foram identificadas através das análises filogenéticas do gene rRNA 16S. Ao aplicar o método de inóculo em meio de cultura diluído 1/10, nas amostras de água do mar antártico, 81 isolados bacterianos foram identificados (gene rRNA 16S), sendo que um deles, é candidato a um isolado \"não-cultivado\". Outras abordagens fenotípicas e genômicas serão necessárias para definir a caracterização taxonômica destas bactérias \"não-cultivadas\" obtidas. A presença dos genes alk foi detectada em 11 isolados bacterianos antárticos, destes, um representante apresentou similaridade com uma sequência de gene alkM, recém-descrita em estudo prévio, em um dos clones de bibliotecas metagenômicas de sedimentos, na mesma região de amostragem. / Two different methods were applied for culturing marine bacteria in order to isolate uncultured representatives from Ubatuba seawater (SP, Brazil) and from Admiralty Bay (Antarctica). The adapted high-throughput culturing (HTC) procedures allowed to obtain four isolates. Two of them are uncultured bacteria candidates from coastal seawater studied and they were identified by phylogenetic analysis for 16S rRNA genes. The use of traditional plating on 1/10 dilution of agar media for the Antarctica seawater samples, allowed to isolate 81 cultures that were identified (16S rRNA gene), and one of these isolates is most likely to be an uncultured micro-organism. For taxonomic purposes, several others phenotypic and genomic methods must be applied for the further characterization of these uncultured bacteria. The alk genes were detected in eleven bacterial isolates from Antarctic. One of them, showed similarity to the sequence of an alkM gene, described in previous work in environmental clones libraries od sediments, from the same sampling area.

Atualmente a alta incidência de isolados multirresistentes a antibióticos utilizados na clinica tem-se tornado alarmante. Estudos recentes demonstraram que um dos motivos que contribuem para o aumento da resistência a antibióticos em bactérias é a ocorrência de linhagens que apresentam o fenótipo mutador. Deficiências nos genes do complexo mut, que incluem os sistemas de reparo dependente de metilação (MMR do inglês methyl-directed mismatch repair), e o sistema de reparo oxidativo (GO) podem gerar linhagens com um fenótipo mutador, que, por sua vez, levam ao aumento das taxas mutacionais espontâneas. Isolados clínicos com fenótipo mutador foram descritos em amostras de Escherichia coli patogênica empregando-se a resistência para antibióticos como rifampicina, cloranfenicol e quinolonas mas não há registros de estudos envolvendo o possível impacto do fenótipo mutador sobre a frequência de mutações espontâneas que levem à resistência aos antibióticos beta-lactâmicos. No presente trabalho estudamos a ocorrência do fenótipo mutador frente à resistência aos antibióticos beta-lactâmicos de amplo uso clínico em linhagens de E. coli patogênicas de origem humana, incluindo 48 amostras de E. coli uropatogênica (UPEC) e 5 amostras de E. coli associadas a infecções entéricas. Foram utilizadas como controles positivos para o fenótipo mutador linhagens de E. coli K12 deficientes nos genes mutY ou mutS. Testes qualitativos revelaram a ocorrência de 6 amostras de UPEC e 2 amostras de EHEC com fenótipo mutador para cefalotina, ceftazidima e rifampicina. Entre as amostras estudadas, 3 linhagens de UPEC (amostras 29, 32 e 47) e 1 linhagem de EHEC (amostra 80) apresentaram fenótipo mutador frente à cefalotina e à ceftazidima confirmado em testes quantitativos com valores de mutação espontânea variando entre 0,68 x 10-4 e 0,8 x 10-6. Os resultados baseados em amplificação por PCR revelaram ausência de alterações estruturais em 3 genes do complexo mut (mutS, mutY e mutL) nos quatro isolados que apresentaram fenótipo mutador. O trabalho também envolveu a determinação dos níveis de resistência em clones derivados das 4 linhagens mutadoras após exposição à cefalotina ou à ceftazidima. As colônias obtidas também foram analisadas para a determinação da natureza de mutação que resultou na resistência aos antibióticos beta-lactâmicos. Os resultados obtidos apontam para aumento nos níveis de expressão de uma beta-lactamase para os derivados resistentes da amostra 32, possíveis alterações de permeabilidade do envoltório celular, e, indiretamente, modificação dos alvos celulares para esses antibióticos. Esses resultados revelam a elevada ocorrência do fenótipo mutador entre amostras de UPEC oriundas da clínica e destacam a importância do fenômeno sobre a ocorrência de resistência aos beta-lactâmicos de uso clínico. / Currently the high incidence of isolates with multiple resistance to antibiotics used in the clinic is alarming. Recent studies show that one of the reasons that may contribute to increased resistance in bacteria is the occurrence of strains with the mutator phenotype. Deficiencies in mut genes complex including methylation-dependent repair system (MMR from English methyl-directed mismatch repair) and oxidative repair system (GO) can generated strains with a mutator phenotype, which in turn leads to increasing spontaneous mutation rates. Clinical isolates with the mutator phenotype were reported among pathogenic Escherichia coli with antibiotics such as rifampicin, chloramphenicol and quinolones. Nonetheless, there are no studies describing the involvement of the possible impact of the mutator phenotype on the frequency of spontaneous mutations leading to resistance to beta-lactam antibiotics. In this work we studied the occurrence of the mutator phenotype leading toresistance to beta-lactam antibiotics use in clinics. For this purpose we tested a set of pathogenic E. coli strains of human origin, including 48 strains of uropathogenic E. coli (UPEC) and 5 strains of E. coli associated with enteric infections. As positive controls for the mutator phenotype we used E. coli K12 strains deficient in mutY or mutS genes. Qualitative tests revealed 6 UPEC samples and 2 EHEC strains with mutator phenotype for cephalothin, ceftazidime and rifampicin. Three UPEC strains (samples 29, 32 and 47) and one EHEC strain (sample 80) showed spontaneous mutation frequencies ranging from 0.68 x 10-4 to 0.8 x 10-6 to cephalothin and ceftazidime. The results based on PCR amplification revealed no structural changes in the mut gene complex (mutS, mutY and mutL) in the four mutator strains. The work also involved determination of the resistance level to cephalothin or ceftazidime of clones derived from the mutator strains. The colonies obtained were also analyzed to determine the nature of mutation leading to beta-lactam resistance. The results indicated increased expression levels of of a beta-lactamase in derivatives of the 32 strain, possible reduction in cell envelope permeability and, indirectly ,modification of cellular targets for these antibiotics. These results showed the high occurrence of mutator phenotype among UPEC strains derived from clinical settings and highlight the importance of the phenomenon on the occurrence of resistance to beta-lactam antibiotics in clinical use.

Submitted by Cássio da Cruz Nogueira (cassionogueirakk@gmail.com) on 2017-03-27T14:16:04Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Dissertacao_FenotiposMicrogliaisTratamento.pdf: 5341802 bytes, checksum: 9c43c6974bd1c1aa2a1870b9a38dd2c2 (MD5) / Approved for entry into archive by Edisangela Bastos (edisangela@ufpa.br) on 2017-04-10T14:30:37Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Dissertacao_FenotiposMicrogliaisTratamento.pdf: 5341802 bytes, checksum: 9c43c6974bd1c1aa2a1870b9a38dd2c2 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-04-10T14:30:37Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Dissertacao_FenotiposMicrogliaisTratamento.pdf: 5341802 bytes, checksum: 9c43c6974bd1c1aa2a1870b9a38dd2c2 (MD5) Previous issue date: 2016-12-23 / CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / As células microgliais são componentes fundamentais do sistema imune inato que fazem, continuamente, uma varredura completa do parênquima neural em busca de alterações teciduais sutis para a preservação da integridade tecidual. Estes macrófagos residentes do sistema nervoso central (SNC), correspondem a cerca de 20% da população celular encefálica. Em desordens neurais agudas e crônicas, incluindo lesão cerebral e da medula espinhal, acidente vascular encefálico experimental (AVE), doenças de Alzheimer, Parkinson e Huntington, células microgliais são ativadas, o que é refletido em alterações morfológicas e bioquímicas. Nestas doenças, acredita-se que a ativação microglial contribua tanto para neuroproteção como para a exacerbação do processo lesivo. Diversas evidências experimentais sugerem que a ativação microglial excessiva pode contribuir para a exacerbação do processo lesivo após AVE experimental. No entanto, nossos estudos prévios sugerem que as células microgliais podem liberar fatores tróficos após AVE experimental em regiões anatomicamente distintas da população microglial com fenótipos prejudiciais. Inexistem estudos que tenham descrito os padrões de reatividade dos diferentes fenótipos microgliais após isquemia experimental. No presente projeto, investigaremos os padrões de ativação de células microgliais apresentando fenótipos benéficos e prejudiciais, avaliando que populações microgliais são inibidas pela tetraciclina minociclina após isquemia cortical focal. Os animais foram submetidos à isquemia focal no córtex motor por microinjeções de 80 pMol de endotelina-1 (ET-1). Os mesmos foram sacrificados 7, 14 e 30 dias após a indução isquêmica. Foi feita a técnica de imuno-histoquímica para a observação da perda neuronal (NeuN+) e imunofluorescência dupla para avaliar a densidade de células microgliais M1 e M2 na área lesionada. A análise estatística da densidade de células NeuN+ foi feita pelo test t de Student dos grupos de 07 dias de sobrevida controle e tratado enquanto que a análise das células microgliais M1 e M2 foram feitas pela análise de variância dos grupos de 07, 14 e 30 dias sobrevida controle, adotando em todos os testes o nível de significância P<0.05. Foi comprovada uma preservação no numero de neurônios presentes no parênquima lesionado dos animais tratados com minociclina. Foi observada uma diminuição no numero de células microgliais M1 nos animais tratados com minociclina, sugerindo que o fármaco pode apresentar efeitos em vias de expressão dos fenótipos microgliais M1. Entretanto, quando comparados os animais de 07, 14 e 30 dias controle, há um aumento do numero desse fenótipo M1 que se estende do 07 dia até o 30 dia de sobrevida. Concluímos que há um efeito neuroprotetor do fármaco minociclina relacionada ao acidente vascular encefálico, sugerindo que esse fármaco pode estar envolvido na modulação dos fenótipos microgliais necessitando de maiores estudos sobre a sua função nas vias de expressão desses fenótipos. / Microglial cells are fundamental components of the innate immune system that continually make a complete scan of the neural parenchyma in search of subtle tissue changes for the preservation of tissue integrity. These resident macrophages of the central nervous system (CNS) correspond to about 20% of the encephalic cell population. In acute and chronic neural disorders, including brain and spinal cord injury, experimental stroke, Alzheimer's, Parkinson's and Huntington's disease, microglial cells are activated, which is reflected in morphological and biochemical changes. In these diseases, it is believed that microglial activation contributes to both neuroprotection and exacerbation of the injury process. Several experimental evidences suggest that excessive microglial activation may contribute to the increase of the injury process after experimental stroke. However, our previous studies suggest that microglial cells may release trophic factors after experimental stroke in anatomically distinct regions of the microglial population with deleterious phenotypes. There are no studies that have described the reactivity patterns of the different microglial phenotypes after experimental ischemia. In the present project, we will investigate the patterns of activation of microglial cells presenting beneficial and harmful phenotypes, evaluating which microglial populations are inhibited by tetracycline minocycline after focal cortical ischemia. The animals were submitted to focal ischemia in the motor cortex by microinjections of 80 pMol of endothelin-1 (ET- 1). They were sacrificed 7, 14 and 30 days after ischemic induction. The immunohistochemistry technique for the observation of neuronal loss (NeuN +) and double immunofluorescence to evaluate the density of M1 and M2 microglial cells in the lesioned area was used. Statistical analysis of NeuN+ cell density was performed by the Student's t-test from the 7-day of control and treated groups while the analysis of the M1 and M2 microglial cells were done by the analysis of variance in the 07, 14 and 30 control groups, adopting in all tests the level of significance P <0.05. A preservation in the number of neurons in the injured parenchyma of the animals treated with minocycline was confirmed. A decrease in the number of M1 microglial cells in minocycline-treated animals was observed, suggesting that the drug may present effects on expression pathways of M1 microglial phenotypes. However, when the animals of the control group of 07, 14 and 30 are compared, there is an increase in the number of this M1 phenotype that extends from day 7 to day 30. We conclude that there is a neuroprotective effect of the drug minocycline when associated to stroke, suggesting that this drug may be involved in the modulation of microglial phenotypes requiring further studies on its function in the pathways of expression of these phenotypes.

As proteínas que contem domínios ricos em leucina (LRR) mediam interações macromoleculares que estão envolvidas em muitos processos biológicos como infecção bacteriana em células hospedeiras e respostas imunológicas de plantas. Estudos anteriores em nosso laboratório identificaram um gene que codifica uma proteína contendo 6 LRRs (LaLRR17) em L. (L.) amazonensis. O LaLRR17 é um gene com expressão estágio regulada sendo abundantemente expresso na fase amastigota. Seqüências homólogas ao gene LaLRR17 foram encontradas em todas as espécies de Leishmania analisadas. Esse trabalho tem como objetivo a caracterização da proteína homóloga em L. (L.) major (LmLRR17). Anticorpos obtidos contra seqüências conservadas das proteínas LaLRR17 e LmLRR17 permitiram o estudo da abundância protéica em diferentes estágios do parasita. Curiosamente, a proteína LmLRR17 foi encontrada em maior abundância em promastigotas procíclicos em vez de amastigotas. Linhagens hiperexpressoras da proteína LmLRR17 ou expressoras da proteína LaLRR17 em fusão com o epitopo viral myc foram obtidas. As proteínas quiméricas foram expressas seguindo o mesmo padrão observado na cepa selvagem. O fenótipo desses mutantes foi avaliado mediante infecções de macrófagos in vitro. A hiperexpressão da proteína LmLRR17 em L. (L.) major não alterou o fenótipo da infecção in vitro. Por outro lado, a expressão da proteína heteróloga, LaLRR17, em promastigotas de L. (L.) major levou a incremento na virulência com maior número de células infectadas e de parasitas por célula. Esses resultados indicam que a expressão da proteína LmLRR17 em L. (L.) major é fortemente regulada. Esse trabalho também mostra que a expressão da proteína LaLRR17 em L. (L.) major leva a um aumento na infectividade. / Proteins containing leucine rich repeats (LRR) are known to be involved in macromolecular interactions in many processes such as signal transduction, cell-adhesion, RNA processing, apoptosis, disease resistance and immune response. A previous study in our laboratory identified a L. (L.) amazonensis gene encoding a protein containing 6 LRRs (LaLRR17). LaLRR17 is a stage-regulated gene expressed with increased abundance in the amastigote stage. Highly conserved homologues of LaLRR17 were found in all Leishmania species analyzed. Therefore, the aim of this study was to characterize the homologous protein of L. major (LmLRR17). Antibodies raised against peptide sequences common to LaLRR17 and LmLRR17 allowed the study of the steady-state protein abundance. Interestingly, LmLRR17 protein was found to be up-regulated in procyclic promastigotes, instead of amastigotes. Mutants of L. (L.) major overexpressing a myc-tagged version of LmLRR17 or of LaLRR17 protein were obtained. In these parasites, the chimeric proteins were expressed following the same pattern of expression observed in the wild type parasites. The phenotype of these mutants was assessed in vitro through macrophage infections. Overexpression of LmLRR17 protein in L. (L.) major resulted in an unaltered phenotype. On the other hand, overexpression of LaLRR17 in L. (L.) major induced an increase in virulence with a higher number of infected cells and intracellular parasites. These results indicate that the expression of LmLRR17 protein in L. major is tightly regulated and the expression of the heterologous LaLRR17 protein increased infectivity in vitro.