O fungo Moniliophthora perniciosa, fitopatógeno responsável pela doença vassoura-de-bruxa no cacaueiro, é responsável por reduzir a produtividade de frutos de cacau nas Américas. Visto que os métodos atuais de controle desta doença não são eficientes, faz-se necessário a busca por compostos para seu controle químico. Os produtos naturais têm contribuído na síntese de novos pesticidas e a família Solanaceae é reconhecida como uma fonte promissora de compostos antifúngicos. Neste contexto, este trabalho teve por objetivo explorar o potencial biológico e químico de metabólitos secundários produzidos por plantas da família Solanaceae com atividade antifúngica à M. perniciosa. Para tanto, extratos aquosos de folhas de dez plantas foram avaliados quanto sua atividade inibitória a M. perniciosa e, observou-se maior atividade antifúngica pelos extratos de Cestrum nocturnum, Solanum seaforthianum e Brunfelsia uniflora. Destas, as plantas S. seaforthianum e B. uniflora mostram-se como promissoras e foram selecionadas para isolamento de seus compostos ativos. A partir do extrato aquoso de S. seaforthianum obteve-se duas frações constituídas por saponinas furostanas, a mistura (25R)-karatavioside C / (25R)-purpureagitoside, com CI50 de 40,9 &mu;g mL-1, e a mistura (25R)-timosaponin H1/ (25R)-uttroside B, com CI50 de 22,3 &mu;g mL-1 ao crescimento micelial. E, a partir do extrato aquoso de B. uniflora obteve-se três compostos da classe das saponinas espirostanas, o composto karatavioside A e os compostos parcialmente identificados BuM8i4, com aglicona identificada como (25R)-yucagenina, e BuM8i6, com aglicona identificada como (25R)-diosgenina, todos com CI50.< 15,63 &mu;g mL-1 ao crescimento micelial de M. perniciosa. Todos os compostos caracterizados neste trabalho estão sendo relatados pela primeira vez a partir das plantas estudas e também para atividade antifúngica. / The fungal phytopathogen Moniliophthora perniciosa is the causal agent of Witches\' Broom disease and the main responsible by limiting cacao production in Americas. The current disease control methods are not efficient and new antifungal compounds are necessary to the chemical management. Natural products has contributed to the development of natural product-based pesticides and the Solanaceae plants are known as a promising source of antifungal compounds. In this context, this work aimed to explore the biological and chemical potential of secondary metabolites produced by Solanaceae plants with antifungal activity against M. perniciosa. For this, antifungal activity of water extracts from leaves of ten plants was evaluated against M. perniciosa and the best results were observed by using extracts from Cestrum nocturnum, Solanum seaforthianum e Brunfelsia uniflora. Among these plants, S. seaforthianum and B. uniflora were selected for active compounds isolation due to their promising characteristics. From water extract of S. seaforthianum two furostan saponin fractions were obtained, the mixture (25R)-karatavioside C / (25R)- purpureagitoside, with IC50 of 40,9 &mu;g mL-1, and the mixture (25R)-timosaponin H1/ (25R)-uttroside B, with IC50 of 22,3 &mu;g mL-1 to the mycelial growth. From water extract of B. uniflora three spirostan saponin compounds were obtained, the compound karatavioside A and the compounds partially identified BuM8i4, with aglycone identified as (25R)-yucagenina, and BuM8i6, with aglycone identified as (25R)- diosgenina, all these compounds showed IC50< 15,63 &mu;g mL-1 to the mycelial growth of M. perniciosa. All compounds characterized in this study were obtained for the first time from these plants and also described about their antifungal activity.

Submitted by JELENA PURIC (jelena0puric@gmail.com) on 2018-04-16T12:39:06Z No. of bitstreams: 1 Jelena Puric Dissertação de Mestrado.pdf: 2830343 bytes, checksum: 555cfd034f96e02e12c50107d2077d5f (MD5) / Rejected by Adriana Aparecida Puerta null (dripuerta@rc.unesp.br), reason: Prezada Jelena, Solicitamos que realize uma nova submissão seguindo as orientações abaixo: 1) A folha de aprovação está em local errado. No arquivo enviado, está em primeiro lugar, antes da capa. O correto de acordo com as normas vigentes é que a folha de aprovação venha após a ficha catalográfica (que o seu arquivo também não tem) e venha antes do Resumo. 2) Falta a ficha catalográfica, que deve ser solicitada pelo site da biblioteca da Unesp de Rio Claro e inserida após a folha de rosto no arquivo pdf e no verso da folha de rosto na versão impressa. O documento enviado não foi excluído. Para revisá-lo e realizar uma nova tentativa de envio, acesse: https://repositorio.unesp.br/mydspace Agradecemos a compreensão e aguardamos o envio do novo arquivo. Atenciosamente, Biblioteca Campus Rio Claro Repositório Institucional UNESP on 2018-04-16T14:20:27Z (GMT) / Submitted by JELENA PURIC (jelena0puric@gmail.com) on 2018-04-16T14:31:14Z No. of bitstreams: 1 Dissertação Jelena Puric.pdf: 2938364 bytes, checksum: b7379106bbe1a2cdf5ce930d5337096b (MD5) / Approved for entry into archive by Adriana Aparecida Puerta null (dripuerta@rc.unesp.br) on 2018-04-16T18:28:58Z (GMT) No. of bitstreams: 1 puric_j_me_rcla.pdf: 2383486 bytes, checksum: e2cb2e6c5d3d71426040a339c65c55ce (MD5) / Made available in DSpace on 2018-04-16T18:28:58Z (GMT). No. of bitstreams: 1 puric_j_me_rcla.pdf: 2383486 bytes, checksum: e2cb2e6c5d3d71426040a339c65c55ce (MD5) Previous issue date: 2018-02-22 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Este trabalho teve como objetivo obter extratos contendo metabólitos secundários de fungos filamentosos isolados de sedimentos marinhos da Antártica e avaliar sua potencial atividade antibacteriana em Xanthomonas citri subsp. citri, Xanthomonas euvesicatoria e Xanthomonas axonopodis pv. passiflorae (bactérias fitopatogênicas que causam doenças em cítricos, pimenta e tomate, e maracujá, respectivamente). Entre os 90 extratos brutos intracelulares e extracelulares obtidos a partir de fungos, 19 mostraram a capacidade de impedir o crescimento de X. citri subsp. citri e X. euvesicatoria in vitro e 22 mostraram a capacidade de dificultar o crescimento de X. axonopodis pv. passiflorae in vitro. Os extratos extracelulares inibiram em média 97,12% de X. citri subsp. citri, 95,94% de X. euvesicatoria e 96,58% de X. axonopodis pv. passiflorae a 3,0 mg / mL. / This work aimed to obtain extracts containing secondary metabolites from filamentous fungi isolated from marine sediments from Antarctic and assess their potential antibacterial activity on Xanthomonas citri subsp. citri, Xanthomonas euvesicatoria and Xanthomonas axonopodis pv. passiflorae (phytopathogenic bacteria causing diseases in citrus, pepper and tomato, and passionfruit, respectively). Among the 90 raw intracellular and extracellular extracts obtained from fungi, 19 showed the ability to hamper the growth of Xanthomonas citri subsp. citri and X. euvesicatoria in vitro and 22 showed the ability to hamper the growth of X. axonopodis pv. passiflorae in vitro. The extracellular extracts inhibited on average 97,12% of Xanthomonas citri subsp, 95,94% of X. euvesicatoria and 96,58% of X. axonopodis pv. passiflorae at 3,0 mg/mL.

Submitted by (lucia.rodrigues@ufrpe.br) on 2017-03-23T15:39:15Z No. of bitstreams: 1 Valter Alexandre Vieira da Silva.pdf: 281801 bytes, checksum: 0bb776ffcea4e506c269e4726b3eafa8 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-03-23T15:39:15Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Valter Alexandre Vieira da Silva.pdf: 281801 bytes, checksum: 0bb776ffcea4e506c269e4726b3eafa8 (MD5) Previous issue date: 2005-02-23 / Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq / One of the main diseases occurring in melon fields in Brazilian Northeastern is the bacterial fruit blotch caused by the bacterium Acidovorax avenae subsp. citrulli. This study aimed to survey the bacterial fruit blotch incidence in 12 melon planting areas in Juazeiro (BA), in two consecutive plantings, and determine the ability of A. avenae subsp. citrulli to survive epiphytically and endophytically on the leaves and roots, and also in the rhizosphere of melon by using a mutant resistant to rifampicin (Aac1Rif). The surveys were conducted to determine the disease incidence and prevalence in 12 commercial melon areas chosen randomly with plants at harvesting time. In each area 25 sub-plots with 100 m2 were marked and 20 fruits evaluated in a diagonal line. In the first survey performed in January 2004, the prevalence of bacterial blotch was 33.33% and there was low incidence in the four areas where the diseaseoccurred, ranging from 0.2 to 4.4%. In the second survey performed in the same areas in April 2004 the disease was not detected. For the survival study on leaves, melon plants with 18-day, grown in greenhouse and field, were sprayed with mutant suspensions at concentrations 3.4 x 102, 3.4 x 103 and 3.4 x 104 CFU mL-1. To determine survival on roots and rhizosphere, seeds of melon type Yellow were sown in soil infested with suspensions of Aac1Rif at 3.4 x 105, 3.4 x 106 and 3.4 x 107 CFU mL-1. At 6-day intervals samples of leaves, roots and rhizosphere soil were collected and processed for isolation on NYDA medium amended with refampicin. Bacterial populations were then determined as UFC g-1 of sample and the data were transformed to log10 for regression analysis. On melon leaves, in greenhouse and field Aac1Rifsurvived epiphytically for 54 days. These epiphytic bacterial populations increasedinitially and decreased after certain time. The final populations were similar in the two conditions and ranged from 103 to 104 CFU g-1 leaf. On the roots and rhizosphere in greenhouse bacterial populations decreased according to the inoculum concentration and at 60 days after planting ranged from 102 to 103 CFU g-1 roots and 101 to 102 CFU g-1 soil. AacRif was not detected as endophytic in leaves or roots of melon. / Uma das principais doenças que vem ocorrendo em campos de meloeiro do Nordeste brasileiro é a mancha-aquosa, causada pela bactéria Acidovorax avenae subsp. citrulli. Este trabalho teve por objetivos realizar o levantamento epidemiológico da incidência da mancha-aquosa em 12 áreas comerciais de meloeiro em Juazeiro (BA), em dois plantios sucessivos, e determinar a capacidade de sobrevivência de A. avenae subsp. citrulli como epifítica e endofítica nas folhas e raízes, e na rizosfera de meloeiro, através da utilização de um mutante resistente a rifampicina (Aac1Rif). Levantamentos foram conduzidos para determinar a prevalência e a incidência da mancha-aquosa em 12 áreas comerciais de meloeiro, escolhidas ao acaso, com plantas em estádio de colheita. Em cada área foram demarcadas 25 subparcelas de 100 m2 e avaliados 20 frutos/subparcela ao longo da diagonal. No primeiro levantamento, realizado em janeirode 2004, a prevalência da mancha-aquosa foi de 33,33%, com baixa incidência nas quatro áreas em que foi registrada, variando de 0,2 a 4,4%. No segundo levantamento, realizado nas mesmas áreas em abril de 2004, a doença não foi constatada. Para o estudo de sobrevivência em folhas, meloeiros com 18 dias, cultivados em casa de vegetação e no campo, foram pulverizados com suspensões do mutante nas concentrações (3,4 x 102, 3,4 x 103 e 3,4 x 104 UFC mL-1). Para determinar a sobrevivência em raízes e na rizosfera, sementes de melão Amarelo foram semeadas em solo infestado com suspensões de Aac1Rif a 3,4 x 105, 3,4 x 106 e 3,4 x 107 UFC mL-1. A intervalos de seis dias, amostras de folhas, raízes e solo rizosférico foram coletadas e processadas para isolamento em meio ágar nutritivo-extrato de levedura-dextrosecontendo rifampicina. As populações bacterianas foram determinadas em UFC g-1 deamostra e os dados transformados em log10 para análise de regressão. Nas folhas de meloeiro, em casa de vegetação e campo, o mutante Aac1Rif sobreviveu epifiticamente durante 54 dias, observando-se inicialmente aumento da população bacteriana epifítica, com posterior declínio, sendo as populações finais semelhantes nas duas condições estudadas, com valores variando de 103 a 104 UFC g-1 de folha. Nas raízes e rizosfera, em casa de vegetação, a população bacteriana decresceu variando em função da concentração utilizada até atingir aos 60 dias após o plantio, níveis de 102 a 103 UFC g-1 de raiz e 101 a 102 UFC g-1 de solo. AacRif não foi detectado sobrevivendo endofiticamente em folhas ou raízes de meloeiro.

O cancro cítrico é uma doença que afeta diversas espécies de Citrus, cujo agente causal é Xanthomonas axonopodis pv citri (XAC). O genoma desta fitobactéria consiste de um cromossomo de ~5 Mpb e dois plasmídeos, que juntos codificam 4313 CDS (seqüências codificadoras), das quais 2710 apresentam similaridade com proteínas conhecidas. Neste trabalho realizamos uma análise comparativa detalhada do genoma de XAC com genomas de três fitopatógenos, Xanthomonas campestris campestris, Xylella fastidiosa 9a5c e Xylella fastidiosa temecula. Com esta análise identificamos genes espécie e gênero-específicos, potencialmente relevantes para adaptação aos seus respectivos nichos ou hospedeiros, além de ilhas de inserção e deleção genômica putativas. Também identificamos vias metabólicas relacionadas com osmoproteção/osmorregulação e com degradação de compostos aromáticos em XAC, que possivelmente são determinantes na eficácia de sua interação com o hospedeiro. Analisamos o nível de expressão de 9 CDS após crescimento de XAC em diferentes concentrações de glicose e verificamos que este açúcar modula positivamente a expressão de CDS relacionadas à síntese de goma e ao sistema de osmoproteção. Além disso, descrevemos a construção de microarranjos de DNA representando 2760 CDS de XAC, constituindo-se uma nova ferramenta para estudos de genômica comparativa e expressão gênica deste fitopatógeno. / Xanthomonas axonopodis pv citri (XAC) is the bacterial pathogen that causes citrus canker disease in several species of Citrus plants. XAC genome consists of a main cromosome of ~5 Mpb and two plasmids that together encode 4313 CDS (coding sequences). Approximately 63% of the CDS have assigned biological functions. In this work, we present a detailed genomic comparison between the genomes of XAC and of three other phytopathogens, X. campestris campestris, Xylella fastidiosa 9a5c and X. fastidiosa Temecula. Based on this analysis, we identified species and genus-specific genes that might be relevant for adaptation to their niches and hosts. We mapped putative insertion/deletion regions in the XAC genome possibly related to gene gains and losses during the divergence of the four bacterial lineages. We have identified the metabolic pathways related to osmoprotection/osmoregulation and aromatic compound degradation important for XAC efficient host colonization and interaction. Expression levels of 9 CDS were analyzed after XAC growth under different glucose concentrations revealing that this sugar upregulates the expression of CDS related to gum synthesis and to osmoregulation. In addition, we describe here the construction of a DNA microarray representing 2760 CDS of XAC as a new tool for comparative genomic and gene expression studies in this phytopathogen.

O fitopatógeno Xylella fastidiosa coloniza o lúmen dos vasos do xilema de seus hospedeiros e o aparelho bucal do inseto-vetor. É responsável por doenças de extrema gravidade em videira, laranjeira, e oliveira, entre outras plantas de relevância econômica. Há evidência de especificidade entre cepas de X. fastidiosa e as diferentes espécies de plantas que colonizam, mas as bases moleculares desta interação são desconhecidas. O objetivo central deste trabalho foi elucidar o repertório completo de genes expressos e/ou diferencialmente expressos por diferentes cepas X. fastidiosa em meios e tempos de cultivo distintos e relacionar as respostas transcricionais a mecanismos de virulência, patogenicidade e especificidade ao hospedeiro. Foram sequenciados, analisados e comparados os transcritomas de cepas de laranjeiras (9a5c, J1a12, U24d e Fb7), de cafeeiro (3124), de hibisco (Hib4), ameixeira (Pr8x) e de videira (Temecula1), no início e fim da fase a exponencial de crescimento populacional em meio rico PWG e em meio mínimo PIM6, que mimetiza a seiva do xilema. Foi observado que a maioria dos genes de X. fastidiosa é expressa, ainda que, dependendo da cepa e da condição experimental, 40-80% dos transcritos sejam pouco abundantes. Por outro lado, foi verificado um conjunto de transcritos muito abundantes, uma parte deles comuns a todas as cepas, e que incluem os ncRNAs 6S e RNAse P, além de transcritos de microcinas, proteases, lipases, proteínas de resposta a estresse e proteínas de função desconhecida. Além da definição de perfis transcricionais, foram descritas as regiões 5\' e 3\' não-traduzidas dos transcritos. As estruturas de 545 e 386 operons expressos, respectivamente pelas cepas 9a5c e Temecula1, também foram mapeadas, e pela primeira vez foi obtido o perfil de sRNAs expressos por X. fastidiosa. As análises de expressão diferencial entre transcritomas das duas fases de crescimento no mesmo meio indicam que o estresse gerado pela limitação nutricional do meio PIM6 exigiu mudanças mais drásticas na expressão gênica do que no meio PWG. Foi também observado que diferentes cepas respondem de maneiras distintas a uma mesma condição, indicando que genes ortólogos são regulados de formas diferentes. Além disso, a transcritômica comparativa revelou diferenças relevantes na regulação gênica de cepas de hospedeiros vegetais distintos que podem estar relacionadas à especificidade ao hospedeiro. Por fim, as análises dos transcritomas evidenciaram vários genes candidatos que poderão ser futuramente investigados quanto ao seu papel na biologia e na virulência de X. fastidiosa. / The phytopathogenXylella fastidiosa colonizes the lumen of xylem vessels from its hosts and the mouth apparatus of the insect-vector. It is responsible for severe diseases in grapevine, orange and olive trees, among other plants of economic relevance. There is evidence for specificity between X. fastidiosa strains and the different plant species they colonize, but the molecular bases of this interaction are unknown. The main objective of this work was elucidate the complete repertoire of expressed and/or differentially expressed genes by different X. fastidiosa strains in distinct media and growth times and associate transcriptional responses to virulence mechanisms, pathogenicity and host specificity. Transcriptomes of orange strains (9a5c, J1a12, U24d and Fb7), coffee (3124), hibiscus (Hib4), plum (Pr8x) and grapevine (Temecula1), were sequenced, analyzed and compared from cells at the beginning and end stages of exponential growth phase in rich medium PWG and in minimum medium PIM6, which mimics xylem sap. It was observed that the majority of X. fastidiosa genes is expressed, although, depending of the strain and experimental condition, 40-80% of transcripts are less abundant. On the other hand, it was verified a set of more abundant transcripts, some of them shared by all strains, including 6S and RNAse P ncRNAs as well as transcripts for microcins, proteases, lipases, stress response proteins and proteins of unknown function. Besides the definition of transcriptional profiles, 5\' and 3\' untranslated regions of transcripts were described. The structure of 545 and 386 expressed operons, respectively for 9a5c and Temecula1 strains, were also mapped, and for the first time the expressed profile of sRNAs in X. fastidiosa was obtained. The differential expression analyzes between transcriptomes of two growth phases in the same medium indicate that the stress generated by nutritional limitation of PIM6 medium required more drastic changes in gene expression than PWG medium. It was also observed that different strains respond in distinct manners to a same condition, indicating that orthologous genes are regulated in different ways. Moreover, comparative transcriptomics revealed relevant differences in gene regulation of strain of distinct plant hosts that can be related to host specificity. Lastly, transcriptomic analyzes pointed to several gene candidates that could be further investigated for their roles in X. fastidiosa biology and virulence.

Xylella fastidiosa é uma bactéria Gram-negativa, do subgrupo das Gama-Proteobactérias, não-flagelada, que coloniza o xilema de diversas plantas cultivadas e silvestres, podendo ser causadora de doenças. Sua disseminação é feita por insetos conhecidos como cigarrinhas. Genomas de cepas de X. fastidiosa isoladas de distintos hospedeiros já foram sequenciados completa ou parcialmente: 9a5c de citros; Temecula-1 e GB514 de videira; Dixon, M12 e M23 de amendoeira; Ann-1 de espirradeira e EB92-1, isolada de sabugueiro e utilizada como bio-controle para Doença de Pierce de videiras. Estudos de genômica comparativa associados a abordagens de genômica funcional e de genética molecular têm possibilitado o estudo detalhado de mecanismos potencialmente relevantes tanto para a colonização de plantas e insetos por este fitopatógeno como para o desenvolvimento de sintomas associados a doenças específicas em seus respectivos hospedeiros vegetais. Exceto o genoma de 9a5c, todos os demais genomas conhecidos são de cepas isoladas na América do Norte. Neste trabalho descrevemos o pirossequenciamento dos genomas da cepa J1a12, que exibe fenótipo não-virulento em citros, e das cepas Pr8x e Hib4, isoladas, respectivamente, de ameixeira e hibisco. A cepa J1a12 possui além de seu cromossomo principal de 2.788.789 pb dois plasmídeos, pXF51 e pXF27, respectivamente de 51.180 pb e 27.268 pb. pXF51 já foi descrito também na cepa de citros 9a5c e pXF27 tem similaridade com outros plasmídeos de cepas de X. fastidiosa norte-americanas isoladas de amoreira e videira. A cepa Pr8x possui além de seu cromossomo principal de 2.666.242 pb um plasmídeo, pXF39, de 39.580 pb, o qual contém a maioria das CDS presentes no pXF51. A cepa Hib4, isolada de hibisco, tem o maior cromossomo (2.813.297 pb) e também o maior plasmídeo (pXF64 com 64.251 pb) já descritos para X. fastidiosa. pXF64 apresenta extensa similaridade com o plasmídeo pBVIE04 de Burkholderia vietnamensis cepa G4, sendo descrito pela primeira vez em cepas de X. fastidiosa. Análises comparativas destes genomas possibilitaram a identificação de alterações que podem ser correlacionadas com os fenótipos exibidos por estas cepas, além da variedade e diversidade de regiões relacionadas a bacteriófagos e de plasmídeos que co-existem nas diferentes cepas deste fitopatógeno. / Xylella fastidiosa is a Gram-negative bacteria, of the Gamma-proteobacterium subgroup, non-flagellated that colonizes the xylem of several cultivated and wild plants, where may cause disease. The bacterium is spread by insects known as sharpshooters. Genomes of X. fastidiosa strains isolated from different hosts have been completely or partially sequenced: 9a5c from citrus; Temecula-1 and GB514 from grapevine; Dixon, M12 and M23 from almond tree; Ann-1 from oleander and EB92-1, isolated from elderberry and used as bio-control for Pierce\'s disease of grapevines. Comparative genomics studies associated with approaches from functional genomics and molecular genetics have allowed a detailed study of mechanisms potentially relevant to the colonization of plants and insects by this pathogen as well as to the development of symptoms associated with specific diseases in their respective host plants. Except for 9a5c, all other known genomes are from strains isolated in North America. Here we describe the pyrosequencing of the genomes of strain J1a12, which displays non-virulent phenotype in citrus and of Pr8x and Hib4 strains isolated, respectively, from plum and hibiscus. J1a12 has a main chromosome of 2,788,789 bp and two plasmids, pXF51 and pXF27, respectively of 51,180 bp and 27,268 bp. pXF51 has been described also in the citrus strain 9a5c and pXF27 has similarity with other plasmids found in North American strains isolated from mulberry tree and grapevine. The strain Pr8x has a main chromosome of 2,666,242 bp and one plasmid, pXF39, of 39,580 bp which present similarities with pXF51. Hib4, the strain isolated from hibiscus, has the largest chromosome (2,813,297 bp) and the largest plasmid (pXF64 with 64,251 bp) described for X. fastidiosa. pXF64 shows extensive similarity with the plasmid pBVIE04 of Burkholderia vietnamensis G4 strain and is described for the first time in X. fastidiosa. Comparative analyzes of these genomes have identified several differences that may be correlated with the phenotypes displayed by these strains, in addition to the variety and diversity of regions related to bacteriophages and plasmids that co-exist in different strains of this pathogen.

Sugarcane (Saccharum spp) is an important commercial crop cultivated widely in tropical and subtropical countries. Primarily sugarcane is used to produce sugar and recently it is proven to be a valuable resource for bioethanol, biodiesel, bioplastic and bioelectricity. Smut is one of the most serious sugarcane disease and occurs in sugarcane fields all over the world. The disease is caused by the biotrophic fungus Sporisorium scitamineum. The fungus induces metabolic changes in the plant leading to the production of a whip-like structure where fungal sporogenesis take place. The objective of this study was to analyse the reactive oxygen species (ROS) production, antioxidant enzymes activity and expression of genes associated with the ROS metabolism in smut susceptible (IAC66-6) and resistant sugarcane genotypes (SP80-3280). In addition, this work assessed the relationship between antioxidant enzymes and sensitivity of S. scitamineum to exogenous hydrogen peroxide (H2O2). This thesis is presented in the format of two chapters (chapters 2 and 3). In the second chapter, the results revealed that there were variations in the antioxidant system as well as in the ROS production in resistant sugarcane genotype, whereas few changes occurred in the susceptible genotype inoculated with S. scitamineum. Microscopic analysis revealed that S. scitamineum teliospore germination and appressorium formation were delayed during early infection in the smut resistant genotype, which coincided with H2O2 accumulation. In chapter 3, the results demonstrated that S. scitamineum is highly resistant to exogenous H2O2. At 2 mM exogenous H2O2 concentration the fungus presented an effective antioxidant system in response to the secondary products of oxidative stress. Furthermore, S. scitamineum when exposed for a long time at 2 mM exogenous H2O2 concentration it can acquire an adaptive response to H2O2. The results obtained in this study contributed to increase the understanding of this very complex interaction between sugarcane and S. scitamineum and it will be helpful toward understanding which aspects are involved in the resistance to S. scitamineum. These informations are important to create strategies for improving smut resistance in sugarcane. / Cana-de-açúcar (Saccharum spp) é uma importante cultura comercial amplamente cultivada em países tropicais e subtropicais. A cana-de-açúcar é principalmente utilizada para produzir açúcar e recentemente é considerada uma valiosa fonte para produção de bioetanol, biodiesel, bioplásticos e bioeletricidade. O carvão é uma das doenças mais graves da cana-de-açúcar e ocorrem em canaviais do mundo inteiro. A doença é causada pelo fungo biotrófico Sporisorium scitamineum. Este fungo induz mudanças metabólicas na planta, levando a formação de uma estrutura chamada chicote, onde ocorre a esporogênese. O objetivo desse estudo foi analisar a produção de espécies reativas de oxigênio (EROs), atividade de enzimas antioxidantes e a expressão de genes associados ao metabolismo de EROs em genótipos de cana-açúcar susceptível (IAC66-6) e resistente (SP80-3280). Além disso, este trabalho avaliou a relação entre as enzimas antioxidantes e sensibilidade de S. scitamineum a peróxido de hidrogênio (H2O2) exógeno. Esta tese está apresentada no formato de 2 capítulos (capítulos 2 e 3). No segundo capítulo, os resultados revelaram que ocorreram alterações no sistema antioxidante, bem como na produção de EROs no genótipo resistente, enquanto que poucas mudanças ocorreram no genótipo susceptível inoculado com S. scitamineum. Análises de microscopia revelaram que a germinação de teliósporos e a formação de apressórios de S. scitamineum atrasou durante o início da infeção no genótipo resistente ao carvão, coincidindo com o acúmulo de H2O2. No capítulo 3, os resultados demonstraram que S. scitamineum é altamente resistente a H2O2 exógeno. O fungo crescendo na concentração de 2 mM de H2O2 apresentou um eficiente sistema antioxidante em resposta a produtos secundários do estresse oxidativo. Além disso, quando S. scitamineum foi exposto a 2 mM de H2O2 exógeno, ele pode adquirir uma resposta adaptativa ao H2O2. Os resultados obtidos neste estudo contribuíram para aumentar o entendimento dessa complexa interação entre cana e S. scitamineum e será útil para a compreensão de quais aspectos estão envolvidos na resistência a este fungo. Estas informações são importantes para criar estratégias para o melhoramento de cana a essa doença.

O gênero Phytomonas está associado a enfermidades devastadoras em plantações de interesse econômico, enquanto que outros vegetais parasitados não apresentam nenhum dano aparente. A seqüência-consenso de um agrupamento de ESTs de P. serpens determinado anteriormente apresentou alta similaridade com indolpiruvato descarboxilases (IPDCs) de fitobactérias e putativas piruvato/indolpiruvato descarboxilases de Leishmania spp. A enzima IPDC está na via de biossíntese do ácido 3-indolil acético, um dos hormônios vegetais mais importantes. Verificamos que o gene IPDC está presente em diversos isolados de Phytomonas, em múltiplas cópias (cerca de 104 cópias em P. serpens e 200 cópias em P. françai), contíguas e concentradas em uma banda cromossômica. Análises filogenéticas e amplificações por PCR com oligonucleotídeos degenerados apontam o clado Phytomonas-Leishmania como grupo-irmão de IPDCs de fitobactérias, sugerindo um processo de transferência horizontal anterior à separação dos tripanossomatídeos do clado que também inclui Leptomonas, Herpetomonas e Crithidia. / The genus Phytomonas is associated to devastating diseases in commercially important crops, whereas in other plant species no apparent damage is observed. The consensus sequence of one group of ESTs of P. serpens previously determined showed high similarity with indolepyruvate decarboxylases (IPDCs) from phytobacteria and putative pyruvate/indolepyruvate decarboxylases of Leishmania spp. The enzyme ipdC participates in the biosynthetic pathway of the indole-3-acetic acid, one of the most important plant hormones. We found that the IPDC gene is present in several Phytomonas isolates, in multiple copies (about 104 copies in P. serpens and 200 copies in P. françai, in tandem and concentrated in one chromosomal band. The phylogenetic analyses and data of PCR amplifications with degenerated primers point the clade Phytomonas-Leishmania as a sister group of IPDCs of phytobacteria, suggesting a process of horizontal gene transfer prior to the separation of the trypanosomatid clade that also includes Leptomonas, Phytomonas, Herpetomonas, Leishmania and Crithidia.

Em concentrações subletais, agentes antimicrobianos modulam a expressão gênica bacteriana, sendo que o conjunto de genes que é modulado depende tanto da cepa bacteriana, como da natureza do agente antimicrobiano. Neste trabalho, avaliamos o perfil de expressão gênica de Xylella fastidiosa cepa 9a5c em resposta ao tratamento por até 60 minutos com dose subletal do antibiótico estreptomicina. Esta é uma cepa virulenta, originalmente isolada de laranjeiras com sintomas de clorose variegada dos citros. A hibridização de microarranjos de DNA representando 2608 das 2848 sequências codificadoras (CDS) previamente anotadas no genoma desta cepa, revelou que 136 CDS apresentaram expressão gênica diferencial em resposta à exposição à estreptomicina, sendo que destas 109 foram negativamente moduladas e 27 positivamente moduladas. Realizamos, também, ensaios de PCR quantitativo precedido de transcrição reversa (RTqPCR) de 21 CDS para confirmar a modulação observada na análise global da expressão gênica. O perfil de expressão gênica de X. fastidiosa em resposta à estreptomicina foi analisado de forma integrada com outros perfis de expressão gênica desta bactéria. Entre as CDS positivamente moduladas, destacamos aquelas codificadoras das chaperoninas GroEL e GroES, que estão associadas a resposta de choque térmico, e CDS associadas à tradução, tais como proteínas ribossomais e fatores de tradução. Interessantemente, a exposição à estreptomicina induz a expressão da CDS que codifica poligalacturonase, que é um fator de virulência em algumas cepas de X. fastidiosa. Por outro lado, o tratamento com estreptomicina promoveu a modulação negativa de CDS relacionadas à formação e manutenção de biofilme ao contrário do observado quando estas bactérias foram submetidas ao tratamento com gomesina, um peptídeo antimicrobiano. O conjunto destas observações sugere que a exposição à dose subletal de estreptomicina possa promover um fenótipo de maior virulência, contrariamente ao efeito previamente observado com a gomesina. Neste trabalho, também descrevemos o pirosequenciamento do genoma da cepa J1a12 de Xylella fastidiosa, que exibe fenótipo menos virulento em citros e tabaco em relação à cepa 9a5c. A comparação da sequência genômica destas duas cepas confirma diferenças anteriormente observadas utilizando-se microarranjos de DNA e destaca genes potencialmente importantes para virulência de Xylella fastidiosa. / At sublethal concentrations, antimicrobials compounds modulate bacterial gene expression and the gene set that is modulated depends not only on the bacterial strain but also on the nature of antimicrobial agent. In this study, we evaluated changes in gene expression profile of Xylella fastidiosa strain 9a5c exposed up to 60 min to sublethal concentration of streptomycin. This a virulent strain originally isolated from orange trees with symptoms of citrus variegated chlorosis. Hybridization of DNA microarrays representing 2,608 out of 2848 coding sequences (CDS) previously annotated in strain 9a5c genome revealed 136 CDS differentially expressed upon streptomycin treatment. Of which 109 were down-regulated and 27 up-regulated. Differential expression for a subset of 21 CDS was further evaluated by reverse transcriptionquantitative PCR (RT-qPCR). In addition, we performed an integrated analysis of the gene expression profile of X. fastidiosa in response to streptomycin along with other gene expression profiles available for this bacterium. Among the up-regulated CDS, we highlight those encoding chaperonins GroEL and GroES, which are associated with heat shock response, and those CDS related to translation, such as ribosomal proteins and translation factors. Interestingly, exposure to streptomycin induces the expression of a CDS encoding polygalacturonase, which is a virulence factor for some X. fastidiosa strains. Furthermore, treatment with streptomycin down-regulates some CDS related to biofilm formation oppositely to treatment with gomesin, an antimicrobial peptide. Together, these observations suggest that exposure to sublethal dose of streptomycin might promote a higher virulent phenotype, in contrast to the effect previously observed with gomesin. In the present work, we also describe the pyrosequencing of J1a12 genome, a X. fastidiosa strain that exhibits a less virulent phenotype in citrus and tobacco if compared to strain 9a5c. A comparison of genome sequences of these two strains confirms differences previously observed using DNA microarrays and highlights important genes for virulence of X. fastidiosa.

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In a completely randomized design, conducted in artificial hydrophobic surface with three replications and eleven treatments composed of M. oryzae conidial suspension (105 con.ml-1) mixed with R. graveolens standardized extract (0.01 to 0.10 g.mL-1), or furocoumarins psoralen (0.18 to 1.82 μg. mL-1), or bergapten (0.29 to 2.91 μg. mL-1), or water (control). It was evaluated the inhibition of conidial germination and appressorium formation and the median lethal dose (LD50). A second assay, in a completely randomized design in three replications was conducted in greenhouse conditions. It was composed of 21 days old rice plants, which were sprayed with a mixture containing M. oryzae conidial suspension (3x105 con.ml-1) and R. graveolens extract, without dilution, or furocoumarins psoralen (18.26 μg. mL-1), or bergapten (29.14 μg. mL-1), or water (control). Nine days after inoculation, leaf blast severity was scored with a diagrammatic scale, the data were statistically analyzed and means compared. The standardized plant extract inhibited M. oryzae conidial germination (LD50=0.237mg) and appressorium formation (LD50=0.121 mg) up to 100% and reduced 80.84% of leaf blast. By fluorescence microscopy it was possible to observe that standardized plant extract did not damage M. oryzae cell wall and plasma membrane, indicating another type of interaction to inhibit conidia development. Isolated standards furanocoumarins psoralen and bergapten did not inhibit conidial germination and appressorium formation and reduce leaf blast severity proportionally, suggesting that synergistic interactions between extract and essential oil components were responsible for the success of R. graveolens in suppressing rice disease, making it an alternative to compose rice blast management. / Ruta graveolens é utilizada com sucesso no tratamento de diversas patologias humanas e possui potencial para o controle alternativo de fitopatógenos, pois também apresenta fitoalexinas em sua composição. O objetivo deste estudo foi padronizar o extrato vegetal líquido de R. graveolens e avaliar seu potencial para o controle da brusone foliar. O material vegetal foi caracterizado, o extrato líquido obtido e a metodologia para a quantificação dos padrões psoraleno e bergapteno foi validada por cromatografia líquida de alta eficiência. Os componentes do óleo essencial obtidos a partir do extrato líquido padronizado foram caracterizados por cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas. No ensaio conduzido em superfície hidrofóbica artificial, com três repetições e onze tratamentos, 10 μL da suspensão de conídios de Magnaporthe oryzae (105 con/mL) foram misturadas com o extrato vegetal padronizado (0,01 a 0,10 g/mL), ou as furanocumarinas psoraleno (0,18 a 1,82 μg/mL) e bergapteno (0,29 a 2,91 μg/mL), ou água (controle). Avaliou-se a inibição da germinação conidial e da formação dos apressórios determinando-se a dose letal capaz de inibir 50% dos indivíduos (DL50). No experimento conduzido em casa de vegetação e com três repetições, plantas de arroz com 21 dias após plantio foram pulverizadas com uma suspensão de conídios de M. oryzae (3x105 com/mL) misturada com extrato vegetal padronizado sem diluição, ou psoraleno (18,26 μg/mL), ou bergapteno (29,14 μg/mL), ou água (controle). Após nove dias da inoculação, avaliou-se a severidade de brusone foliar com uma escala de 10 graus, os dados foram analisados estatisticamente e as médias comparadas. O extrato vegetal padronizado inibiu a formação de tubo germinativo (DL50= 0,237 mg) e a formação de apressório (DL50= 0,121 mg) de M. oryzae em até 100%, e reduziu a severidade de brusone nas folhas em 80,84%. Através de microscopia de fluorescência, não foi observada ação do extrato padronizado em membrana plasmática e parede celular de M. oryzae, o que indica outro tipo de interação para inibir o desenvolvimento do conídio. Os padrões psoraleno e bergapteno não inibiram proporcionalmente a germinação e a formação de apressório, como também não reduziram a severidade de brusone nas folhas em sua forma isolada, o que sugere que interações sinérgicas entre os diversos componentes do extrato e do óleo essencial de R. graveolens foram responsáveis pelo sucesso do extrato padronizado em suprimir a brusone foliar, tornando-o uma alternativa para compor o manejo de brusone em arroz.