Submitted by Automa??o e Estat?stica (sst@bczm.ufrn.br) on 2018-04-02T15:02:43Z No. of bitstreams: 1 GustavoHenriqueOliveiraCavalcante_DISSERT.pdf: 14332647 bytes, checksum: 07f54cbd966599c411e90b07dbb86ba8 (MD5) / Approved for entry into archive by Arlan Eloi Leite Silva (eloihistoriador@yahoo.com.br) on 2018-04-05T13:57:34Z (GMT) No. of bitstreams: 1 GustavoHenriqueOliveiraCavalcante_DISSERT.pdf: 14332647 bytes, checksum: 07f54cbd966599c411e90b07dbb86ba8 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-04-05T13:57:34Z (GMT). No. of bitstreams: 1 GustavoHenriqueOliveiraCavalcante_DISSERT.pdf: 14332647 bytes, checksum: 07f54cbd966599c411e90b07dbb86ba8 (MD5) Previous issue date: 2018-02-23 / O papilomav?rus humano (HPV) ? um pequeno v?rus de DNA de dupla fita circular, caracterizado como um dos mais comuns agentes sexualmente transmiss?veis no mundo, cuja detec??o e genotipagem acuradas s? s?o poss?veis por meio de t?cnicas de biologia molecular. Diferentes propriedades biol?gicas t?m sido reportadas dentre os mais de 170 tipos j? caracterizados, de maneira que um grupo particular de HPVs est? fortemente relacionado a infec??es persistentes, les?es intraepiteliais de diferentes graus e progress?o para c?nceres tais como cervical, anal, vulvar, vaginal, orofar?ngeo e de p?nis. No presente trabalho foram realizadas an?lises de variabilidade gen?tica e evolu??o molecular nos genomas dos principais HPVs de import?ncia cl?nica. Reconstru??es filogen?ticas e an?lises dos perfis de assinatura gen?tica nos genomas de cada gen?tipo sugeriram a presen?a de subgrupos de HPVs definidos por diferen?as nas sequ?ncias dos genes E1, E6, L1 e L2. Testes de evolu??o em n?vel de DNA revelaram uma atua??o mais forte da sele??o natural em c?dons espec?ficos, mais frequentemente nos genes E1, E2, L1 e L2. A partir dos dados obtidos nas an?lises de variabilidade, foi desenhado um novo conjunto de primers para a detec??o e genotipagem dos HPVs de import?ncia cl?nica por meio da t?cnica de rea??o em cadeia da polimerase (PCR). O gene E1 foi escolhido como alvo molecular devido a presen?a de uma regi?o conservada com tamanho vari?vel entre gen?tipos. O sistema proposto teve sua efici?ncia avaliada in vitro e foi comparado ao protocolo de PCR mais utilizado para detec??o do HPV em amostras cl?nicas. Utilizando a amplifica??o de ?cido nucleico de forma semianinhada (seminested), o sistema proposto foi capaz de detectar com boa sensibilidade alguns dos principais HPVs de alto risco oncog?nico e mostrou melhor especificidade em rela??o aos primers gen?ricos GP5+/6+, mesmo aplicando uma temperatura de anelamento consideravelmente maior. A an?lise do tamanho dos fragmentos amplificados usando a separa??o por eletroforese em gel de agarose pode favorecer a identifica??o do tipo de HPV presente nas amostras, permitindo a discrimina??o entre aqueles mais prevalentes na popula??o e a redu??o do tempo e do custo necess?rios para a identifica??o do agente. Opcionalmente, a separa??o dos produtos em matrizes de alta resolu??o e o sequenciamento direto podem ser usados para a tipagem, possibilitando a identifica??o de uma ampla variedade de gen?tipos de HPV descritos. / Human papillomavirus (HPV) is a small circular double-stranded DNA virus, characterized as one of the most common sexually transmitted agents in the world, whose accurate detection and genotyping is only possible through molecular biology techniques. Different biological properties have been reported among the more than 170 types already characterized, so that a particular group of HPVs is strongly related to persistent infections, intraepithelial lesions of different degrees and progression to cancers such as cervical, anal, vulvar, vaginal, oropharyngeal and penis. In the present work, analyzes of genetic variability and molecular evolution were performed in the genomes of the main clinically important HPVs. Phylogenetic reconstructions and analyzes of genetic signature profiles in the genomes of each genotype suggested the presence of subgroups of HPVs defined by differences in the E1, E6, L1 and L2 gene sequences. Evolution tests at DNA level have shown a stronger acting of natural selection at specific codons, more often in the E1, E2, L1 and L2 genes. From the data obtained in the analyzes of variability, a new set of primers was designed for the detection and genotyping of HPVs of clinical importance by polymerase chain reaction (PCR) technique. E1 gene was chosen as the molecular target due to the presence of a conserved region of variable size among genotypes. The proposed system had its efficiency evaluated in vitro and was compared to the most used PCR protocol for HPV detection in clinical samples. Using the seminested nucleic acid amplification, the proposed system was able to detect some of the major oncogenic HPVs with good sensitivity and showed a better specificity than the generic primers GP5+/6+, even applying a considerably higher annealing temperature. The analysis of the size of the amplified fragments using agarose gel electrophoresis may favor the identification of the HPV type present in the samples, allowing the discrimination between those more prevalent in the population and the reduction of the time and cost necessary for the identification of the agent. Optionally, the separation of products into high resolution matrices and direct sequencing can be used for typing, enabling the identification of a wide variety of HPV genotypes described.

A utilização da terapia antiretroviral, atualmente mais amplamente acessível, implica na permanência da identificação da resistência viral e monitoramento da doença como itens importantes em adultos e pacientes pediátricos infectados pelo vírus da imunodeficiência humana tipo 1. Os principais marcadores da infecção por HIV-1, utilizados no monitoramento da infecção e curso da doença, são as contagens de células T CD4+ e a carga viral. Ambos são úteis como parâmetros indicadores para o início da terapia e na avaliação de sua eficácia. Além disto, a sua associação a testes de genotipagem para a identificação de mutações de resistência viral, pode auxiliar na indicação da conduta clínica mais adequada. No presente estudo, analisamos os valores da carga viral e taxas de linfócitos T CD4+ e CD8+ na avaliação do status imunológico de 25 crianças com indicação para a terapia antiretroviral, condicionando o regime terapêutico aos resultados do teste de genotipagem. A identificação dos subtipos virais foi feita por análise filogenética e a genotipagem incluiu a análise dos genes protease e transcriptase reversa do HIV-1. Dezoito amostras foram agrupadas no subtipo viral B e três no subtipo F1; cepas recombinantes também foram observadas, sendo uma BF, duas BD e uma DF. Dezoito crianças apresentaram mutações conferindo resistência viral aos inibidores da transcriptase reversa análogos de nucleosídeo e sete crianças apresentaram resistência aos inibidores não-análogos, com seis relatando resistência a nevirapina, delavirdina e efavirenz. Além disto, duas crianças, nas quais a terapia havia sido descontinuada dois a três anos antes da avaliação do teste de genotipagem, apresentaram as mutações K101E, K103N e G190A, conferindo resistência às três drogas. As mutações mais frequentes para o gene da transcriptase reversa foram observadas nos codons M41L, M184V e T215FY. Entretanto, dez crianças apresentaram relevante número de mutações de resistência viral, variando entre cinco a dez, que conferiram resistência a no mínimo quatro e até onze drogas antiretrovirais. Para o gene da protease, as mutações de resistência mais comuns foram observadas nos codons M46I, D30N e I54LV. Treze crianças apresentaram resistência viral a, no mínimo, duas e até 12 drogas. A adequação da terapia antiretroviral altamente potente (HAART), de acordo com o padrão de resistência viral, permitiu observar aumento dos valores de células T CD4+ em 12 dos 25 pacientes pediátricos, demonstrando melhoria na sua condição de imunodeficiência associada ao HIV. Decréscimos importantes da carga viral foram observados em 17 crianças, com níveis indetectáveis de RNA HIV alcançados em 13 delas, sendo 11 com linhagens virais resistentes a múltiplas drogas. O desenvolvimento de linhagens virais resistentes é uma das principais razões da falha terapêutica. Mesmo considerando outros fatores causais, tais como aderência, metabolismo e níveis adequados das drogas, a identificação do perfil de resistência viral é um importante fator na conduta para a adequação de esquemas terapêuticos, dando suporte ao uso racional das drogas antiretrovirais em programas de tratamento. / With antiretroviral therapy becoming more widely available nowadays, Human Immunodeficiency Virus type 1 resistance identification and monitoring of disease remains of great importance in adults and infected children. The major HIV-1 infection markers usually used for monitoring viral infection and disease course are CD4+ T cell counts or percentages and HIV viral load. Both of them are helpful indicating when to start therapy and evaluating its efficacy. Also, their association with genotyping tests to identify viral resistant mutations may help clinicians for the most adequate clinical conduct. In the present study, we assessed HIV-1 viral load and CD4+ and CD8+ T lymphocyte rates for the immunological status evaluation of 25 antiretroviral-treated children managing therapeutic regimens according to genotyping test results. Drug resistance evaluation was done using genotyping covering protease and reverse transcriptase genes. Additionally, all of the 25 vertically HIV-1 infected children were assessed for viral subtyping throughout phylogenetic analysis. Eighteen samples clustered at B subtype and three clustered at F1 subtype; one BF, two BD and one DF recombinant strains were also observed. Eighteen children presented, at least, one mutation conferring resistance to the nucleoside reverse transcriptase inhibitors, and seven children presented resistance to the non-nucleoside inhibitors, with six resistant to all three drugs, nevirapine, delavirdine, and efavirenz. In addition, two children in whom the therapy had been discontinued two to three years before testing presented K101E, K103N, and G190A mutations conferring resistance to the all three drugs. Reverse transcriptase gene mutations were more frequently observed at codons M41L, M184V, and T215FY. However, ten children presented an important number of viral resistance mutations, ranging from five to ten mutations, conferring resistance to at least four to up to eleven antiretroviral drugs. Protease gene mutations were more frequently seen at codons M46I, D30N, and I54LV. Thirteen children presented viral resistance to at least two to up to twelve drugs. The management of the highly active antiretroviral therapy (HAART) according to viral resistance in our group of pediatric patients allowed an increase in CD4+ T cell counts and/or percentage in 12 of the 25 children, showing an improvement in their HIV-associated immunodeficiency status. Important viral burden declines were observed in 17 children, and HIV RNA undetectable levels were reached in 13 of them. Among these 17 children, 11 were multi-drug resistant. The development of resistant viral strains is one of the main reasons for failure of antiretroviral therapy. Even considering other causal factors such as compliance of the patient, metabolism of drugs and drug levels, viral resistance profile identification is an important factor in the management of therapeutic regimens, supporting the rational use of antiretroviral drugs by treatment programs.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Sporothrix schenckii é um fungo dimórfico e agente etiológico da esporotricose, uma micose profunda que apresenta diferentes manifestações clínicas. As diversas manifestações clínicas desta e de outras doenças infecciosas podem ser relacionadas ao status imune do hospedeiro, a fatores de virulência do patógeno ou a diferentes genótipos. Dados anteriores do nosso grupo demonstram que diferenças na expressão de adesinas do S. schenckii para fibronectina estão diretamente relacionadas à virulência de diferentes cepas. Neste trabalho visamos avaliar caracteres morfológicos bioquímicos e genotípicos de doze isolados de geofílicos, zoofílicos e antropofílicos de S. schenckii, de diferentes origens geográficas, que apresentam diferentes graus de virulência. Foi analisada a morfologia das formas de micélio e levedura de cada isolado. Foi observado que a fase de micélio dos isolados estudados apresentaram morfologia típica com hifas finas e septadas, com conídios obovóides ou ovóides alongados. As leveduras apresentaram pleomorfismo típico da espécie, com células variando do formato ovóide ao alongado. Verificamos ainda a expressão de adesinas para fibronectina e laminina, do antígeno gp70 e, o padrão de bandas antigênicas reconhecidas por anticorpos IgG presentes em soro de pacientes com esporotricose ou de camundongos infectados. Para isso, foram extraídas proteínas de superfície da forma de levedura de cada isolada, sendo os extratos ensaiados por Western blot. Nestes ensaios observamos que os isolados mais virulentos de S. schenckii expressavam mais adesinas para fibronectina e laminina. A presença da gp70 foi detectada em dez dos doze isolados, sendo que apenas os isolados zoofílicos não expressam esta glicoproteína. O padrão antigênico foi variável entre os isolados, não havendo clara relação com a origem e/ou distribuição geográfica. Os dados fenotípicos foram confrontados com dados genotípicos. Para isso, sequenciamos os loci da calmodulina (CAL) e do Internal Transcribed Spacer 1/2 (ITS 1/2) a fim de averiguar se haviam diferenças genotípicas entre os isolados estudados. As análises do sequenciamento do loci CAL e ITS, contudo, apontam a divisão dos isolados em duas espécies filogenéticas, S. schenckii e S. brasiliensis não correlacionada com a distribuição geográfica dos mesmos. Nosso estudo reforça a hipótese de haver uma correlação entre virulência e expressão de adesinas, porém, sem qualquer relação entre a distribuição geográfica dos isolados zoofilicos, antropofílicos ou geofílicos, bem como dos genótipos encontrados. / The dimorphic fungus Sporothrix schenckii is the etiological agent of sporotrichosis, a deep mycosis that presents different clinical manifestations. The diverse manifestations of this and other infections can be related the host immunity, virulence factors or different genotypes of the pathogen. Previous data of our group demonstrated that differences in the expression of adhesins to fibronectin are directly related to the virulence of the different strains of S. schenckii. In the present work we have evaluated the morphological, biochemical and genotypic characteristics of twelve strains of S. schenckii (isolated from human and cat cases of sporotrichosis and from environment) from different geographic regions that present distinct virulence levels. The mycelium and yeast phases of each strain were morphologically analyzed. The strains has presented the typical morphology, with thin and septated hyphae. The conidia exhibited obovoidal or ovoidal elongated form. The yeast phase presented the ovoid or elongated cell form. Furthermore, we have verified the adhesins expression to fibronectin, to laminin, to gp70 antigen and to the antigenic bands pattern of all protein extracts, recognized by patients or infected mice sera antibodies. For this, the proteins were extracted from the surface of each strain yeast phase and assayed by Western blot technique. We have observed that the most virulent strains of S. schenckii expressed more adhesins to fibronectin and to laminina than less virulent strains. The presence of the gp70 was confirmed in ten isolates of twelve. Just strains isolated from infected cats did not present this glycoprotein. The antigenic bands pattern was variable between the different extracts, with no clear correlation with origin or geographical distribution of the isolates of S. schenckii. In order to cross phenotypic and genotypic data we have sequenced the calmodulin loci (CAL) and the Internal Transcribed Spacer 1/2 (ITS 1/2) in order to check if there was differences between the strains studied. In this analysis we found that this strains are divided in two species, S. schenckii and S. brasiliensis, again with no correlation with the geographical distribution. Our study reinforces the hypothesis on the correlation between adhesins expression pattern and virulence levels with no connection among geographical distribution or genotype of the different strains of S. schenckii.

Submitted by Automa??o e Estat?stica (sst@bczm.ufrn.br) on 2017-06-02T22:15:26Z No. of bitstreams: 1 FelipeEmmanuelDoEspiritoSantoGomes_DISSERT.pdf: 3727906 bytes, checksum: 5ccaabce900c234137ecb8f5d64843dd (MD5) / Approved for entry into archive by Arlan Eloi Leite Silva (eloihistoriador@yahoo.com.br) on 2017-06-08T18:54:49Z (GMT) No. of bitstreams: 1 FelipeEmmanuelDoEspiritoSantoGomes_DISSERT.pdf: 3727906 bytes, checksum: 5ccaabce900c234137ecb8f5d64843dd (MD5) / Made available in DSpace on 2017-06-08T18:54:49Z (GMT). No. of bitstreams: 1 FelipeEmmanuelDoEspiritoSantoGomes_DISSERT.pdf: 3727906 bytes, checksum: 5ccaabce900c234137ecb8f5d64843dd (MD5) Previous issue date: 2017-03-16 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Cient?fico e Tecnol?gico (CNPq) / Coordena??o de Aperfei?oamento de Pessoal de N?vel Superior (CAPES) / A criptococose, causada pelas esp?cies f?ngicas Cryptococcus neoformans e Cryptococcus gattii, ? uma das micoses oportun?sticas e/ou sist?micas mais importantes no mundo. Cada esp?cie possui quatro gen?tipos, usualmente definidos pelo PCR-RFLP do gene URA5, os quais apresentam diferen?as em sua ecologia, epidemiologia, distribui??o geogr?fica e susceptibilidade a antif?ngicos. Marcadores moleculares de acesso mais direto s?o atrativos para um r?pido reconhecimento de gen?tipos ou de carater?sticas relevantes como virul?ncia e susceptibilidade antif?ngica. Neste sentido, introns autocatal?ticos do grupo I, no rRNA LSU mitocondrial foram aqui avaliados como potencial marcador molecular para os gen?tipos de C. neoformans e C. gattii, bem como quanto a sua rela??o com a susceptibilidade a antif?ngicos. Foram utilizados 77 isolados brasileiros, sendo a maioria do gen?tipo VNI (39 cepas), seguido de 20 VGII, 5 VNIV, 4 VNII, 3 VNIII, 2 VGI, 2 VGIII e 2 VGIV. Os introns Cne.mL2449 e Cne.mL2504 foram amplificados em um s? PCR com primers complementares a regi?o do gene rRNA LSU flanqueadora dos introns. Os produtos de PCR mostraram um polimorfismo de comprimento significativo entre gen?tipos de C. neoformans e C. gattii. O sequenciamento destes produtos indicou que algumas cepas apresentaram nenhum, um, dois, tr?s ou quatro introns em s?rie. Estes dois novos introns, n?o descritos anteriormente, foram nomeados de Cne.mL2439 e Cne.mL2584 em C. neoformans e Cga.mL2439 e Cga.mL2584 em C. gattii. Os introns Cne.mL2439/Cga.mL2439 foram classificados como pertences a subclasse IB2 ao passo que Cne.mL2584/Cga.mL2584, pertencentes a subclasse IA1. Curiosamente, os gen?tipos com isolados sem introns, VNI, VGII, VGI e VNIV, s?o aqueles conhecidos como mais virulentos e menos suscept?veis a agentes antif?ngicos. De fato, tais isolados apresentaram MICs significativamente superiores para 5-flucitosina. Estes achados sugerem que estes elementos podem ser utilizados como potenciais marcadores moleculares para a resist?ncia deste antif?ngico. Por fim, an?lises filogen?ticas sugeriram alta similaridade de sequ?ncia entre os introns Cne.mL2449, Cne.mL2504, Cne.mL2439/Cga.mL2439 e Cne.mL2584/Cga.mL2584 com outros introns mitocondriais presentes nos genes COX1, COX2, COX3, NAD5, ATP9, COB, LSU de fungos distintos, sustentando a hip?tese de origem antiga dos introns (hip?tese ?introns early?), al?m da dispers?o destes elementos em s?tios heter?logos, via splicing reverso. / Cryptococcosis, caused by the fungal species Cryptococcus neoformans or Cryptococcus gattii, is one of the most important systemic and/or opportunistic diseases in the world. Each species has four genotypes, usually accessed by PCR-RFLP of the URA5 gene, which present differences in their ecology, epidemiology, geographical distribution and antifungal susceptibility. Easier accessible molecular markers are attractive for rapid recognition of genotypes or relevant characteristics such as virulence and antifungal susceptibility. In this way, group I autocatalytic introns in the mitochondrial LSU rRNA were evaluated as potential molecular marker for the genotypes of C. neoformans and C. gatti, as well as their relationship to antifungal susceptibility. Seventy-seven Brazilian isolates were used, most of the genotype VNI (39 strains) followed by 20 VGII, 5 VNIV, 4 VNII, 3 VNIII, 2 VGI, 2 VGIII and 2 VGIV. The introns Cne.mL2449 and Cne.mL2504 were amplified in a single PCR with complementary primers to the flanking region of the introns LSU rRNA gene. PCR products showed a significant polymorphism between C. neoformans and C. gattii genotypes. Sequencing of the PCR products indicated that some strains had none, one, two, three or four introns followed. This new two introns, not previously described in the mitochondrial genome of Cryptococcus, were named Cne.mL2439 and Cne.mL2584 in C. neoformans and Cga.mL2439 and Cga.mL2584 in C. gattii. Cne.mL2439/Cga.mL2439 introns were classified as belonging to IB2, whereas Cne.mL2584/Cga.mL2584, as belonging IA1 subclass. Interestingly, genotypes with some intronless strains, VNI, VGII, VGI and VNIV, are those known to be more virulent and less susceptible to antifungal agents. Here, we observed that those intronless isolates had significant higher MICs values for 5-flucytosine. The findings suggest that these elements can be used as potential molecular markers for antifungal resistance. Finally, phylogenetic analyzes suggested high sequence similarity between the introns Cne.mL2449, Cne.mL2504, Cne.mL2439/Cga.mL2439 and Cne.mL2584/Cga.mL2584 with other mitochondrial introns present in the genes COX1, COX2, COX3, NAD5, ATP9, COB, LSU of fungi supporting the ?introns early? hypothesis, as well as its dispersion to heterologous sites by reverse splicing.

As encefalopatias espongiformes transmissíveis (EETs), ou doenças do príon, ocorrem tanto nos animais como no homem, são responsáveis por doenças transmissíveis e hereditárias e provocam lesões degenerativas no encéfalo. A presença de uma forma protéica anormal (PrPSc), ao invés da sua forma normal (PrPC), no tecido encefálico e linforreticular é característica peculiar das EETs. Essa proteína é altamente insolúvel, resistente à degradação por proteases e se deposita eventualmente sob forma de placas amiloides na substância cinzenta. Tais placas provocam a morte maciça de neurônios e células gliais, causando vacuolização intensa no tecido afetado. A partir da implantação do programa de vigilância epidemiológica da encefopatia espongiforme bovina (EEB), coordenado pelo Programa Nacional de Controle da Raiva dos Herbívoros e Outras Encefalopatias (PNCRH) do Ministério da Agricultura Pecuária e Abastecimento (MAPA), o Setor de Patologia Veterinária da UFRGS tem sido requisitado frequentemente para realização de exames de necropsias e de materiais de animais com suspeita de scrapie. A técnica de imuno-histoquímica (IHQ) é o teste para o diagnóstico das EETs mais específico disponível até o momento, sendo cada vez mais utilizado para diagnóstico, rastreamento, estudo da patogênese e fornecimento de informações comparativas em nível molecular. Por outro lado, a genotipagem é uma ferramenta importante no auxílio da identificação da suscetibilidade genética a scrapie, tornando o diagnóstico mais seguro, além de possibilitar a identificação de casos atípicos de scrapie, como a Nor98. Este trabalho consistiu na realização da IHQ para proteína priônica no tecido nervoso e no tecido linforreticular, como método diagnóstico de scrapie em ovinos e caprinos, associado à genotipagem dos ovinos. Entre 2009 e 2012 foram realizadas colheitas de materiais para exames de IHQ e coloração por hematoxilina-eosina em amostras de tecidos de ovinos das raças Suffolk, Santa Inês, Dorper e mestiços. As amostras foram obtidas a partir de biopsias e necropsias para diagnóstico de scrapie. Foi realizada também a genotipagem nos animais para os códons 136, 154 e 171 da proteína PRP, e em alguns casos no códon 141. Foram realizadas três repetições da IHQ para cada amostra positiva para PrPSc. O diagnóstico por IHQ no tecido linforreticular foi considerado positivo quando o material apresentou um número de, no mínimo, três folículos linfoides com centros germinativos marcados pela técnica. Entre os resultados obtidos neste trabalho pode-se incluir o primeiro diagnóstico positivo para scrapie de genótipo resistente (ARR/ARR) não Nor98, na espécie ovina no Brasil, com marcação por IHQ nas tonsilas palatínicas, terceira pálpebra e mucosa reto-anal. Este animal era pertencente a um rebanho de ovinos mestiços Sufolk, no qual foram diagnosticados mais nove animais positivos para scrapie nas tonsilas palatínicas, terceira pálpebra e mucosas reto-anal. A coleta e envio de material de vários órgãos linfoides foi considerada importante por possibilitar a confirmação da presença ou não do agente em pelo menos dois deles, reduzindo o número de casos considerados suspeitos, o risco de falsos positivos, e parte, senão a totalidade, dos casos com material insuficiente para diagnóstico. Em necropsia, a coleta de tonsilas palatínicas mostrou-se eficaz pelo seu alto índice de marcação positiva. A coleta de amostras de sangue foi importante para a realização do teste de genotipagem, permitindo avaliar o grau de resistência/susceptibilidade do animal, complementando os resultados de IHQ. / Transmissible spongiform encephalopathies (TSEs), the prion diseases, occurs both in animals and in humans, are responsable for a transmissible and hereditary disease, and cause degenerative lesions in the brain tissue. The presence of an abnormal protein (PrPSc), instead of its normal form (PrPC), on the nervous and lymphoreticular tissue is characteristic of TSEs. This protein is highly insoluble and resistant to degradation by proteases and eventually settles in the gray matter in the form of amyloid plaques that causes massive death of neurons and glial cells, causing intense vacuolization in the affected tissue. After the establishment of the Bovine Spongiform Encephalopathy surveillance program, coordinated by the National Rabies and Other Encephalopathies Control Program, the Setor de Patologia Veterinária of UFRGS has been usually required to proceed necropsy and other diagnosis in suspicious animals. The immunohistochemistry (IHC) is the most specific technique actually used to TSEs identification, being increasingly used to diagnosis, traceability, pathogenesis study and providing comparative information on the molecular level. On the other hand, genotyping is an important tool on scrapie genetic susceptibility identification, making more secure the diagnosis, beyond to enable the atypical scrapie cases identification, like Nor98. This work consisted to performing IHC to prionic protein, on nervous system and lymphoreticular tissue, as scrapie diagnostic method in sheep and goat, associate to genotyping in sheep. Sheep tissues were sampled from Suffolk, Santa Inês, Dorper and crossbreed to proceed IHC and hematoxilin-eosin staining between 2009 and 2012. The samples were obtained by biopsy and necropsy to scrapie diagnose. Genotyping of codons 136, 154 and 171 of PRP protein was performed, as well as a few of codon 141. The monoclonal antibody anti-prion F98/160.1.5 and F99/97.6.1 was used at the IHC. For each positive sample three repetitions were performed. The diagnostic by IHC at lymphoreticular tissue was considered positive when it shows at minimum three follicles with germinal centers stained. Among the obteined results, could be included the first diagnostic of scrapie not Nor98 in resistant genotype (ARR/ARR) sheep in Brazil. This animal belongs to a Suffolk sheep flock in which were diagnosed more nine scrapie positive animals showing IHC staining on tonsils, third eyelid and rectal mucosa. The sampling and dispatch of many lymphoid tissues was considered important to enable the confirmation of agent presence or not in at least two of them, reducing the number of suspicious cases, the risk of false positive, and part, if not all, of cases with insufficient material for diagnosis. At necropsy, the tonsils collecting showed efficient by the it high positive staining level. Blood sampling becomes important to proceed genotyping test, allowing measure the animal resistance/susceptibility grade, complementing the IHC results.

Existem diversos trabalhos publicados sobre a utilização de diferentes métodos imunológicos para diagnosticar infecções do trato respiratório causadas por vírus parainfluenza bovino tipo 3 (bPIV-3). Entretanto, é escassa a literatura sobre a utilização da técnica de isolamento viral. Até o presente momento não havia sido relatada a utilização da Transcrição Reversa - Reação em Cadeia da Polimerase (RT-PCR), na detecção de bPIV-3. O objetivo deste estudo foi contribuir para uma melhor caracterização dos bPIV-3 através do desenvolvimento de técnicas de RTPCR para a sua detecção. Utilizando-se uma amostra referência de bPIV-3 (SF-4) e uma amostra de bPIV-3 isolada no Rio Grande do Sul (amostra DIO) foram desenvolvidas técnicas de RT-PCR para a amplificação de diferentes regiões do gene da hemaglutinina-neuraminidase (HN). Após seqüenciamento parcial do gene HN e alinhamento das seqüências da amostra DIO, os resultados revelaram homologia de 99% em relação à amostra referência, 98% a 91% quando comparada com outras amostras de bPIV-3 previamente publicadas na rede e 79% a 80% quando comparada com as amostras de hPIV-3. Foi desenvolvida, também, uma técnica de RT-PCR para amplificação de parte do gene da HN do bPIV-3 e do hPIV-3. Nos experimentos de otimização, a técnica de RT-PCR, comparada com o isolamento viral, apresentou sensibilidade de 140 DICC50, boa especificidade e reprodutibilidade. Os resultados, após seqüenciamento da amostra de vírus bPIV-3 isolada no RS, apresentaram, grande homologia com os das amostras de bPIV-3 comparadas, especialmente a amostra referência. Os dados obtidos neste estudo mostraram que a RT-PCR desenvolvida para a detecção de PIV-3 foi capaz de amplificar um fragmento de 1009 bp do gene da HN de amostras de PIV-3 isoladas de bovinos e humanos, possibilitando a sua utilização em diagnóstico e em estudos epidemiológicos. / There are several published studies on the application of different immunological methods for diagnosis of respiratory infections caused by bovine type 3 Parainfluenza virus (bPIV-3). However, the literature on viral isolation procedure is very scarce. At present there is no report about the utilization of reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) for bPIV-3 detection. The aim of this study was to contribute to a better caracterization of bovine type 3 Parainfluenza virus by developing RT-PCR techniques to its detection. A reference sample (SF-4) and a sample of bPIV-3 isolated in Rio Grande do Sul (DIO sample) were used to develop RT-PCR techniques by amplification of different regions of hemagglutinin-neuraminidase gene (HN). After HN gene partial sequencing of DIO sample and sequence alignment, the results revealed 99% homology when compared to reference sample, 98% the 91% homology in relation to bPIV-3 samples previously published and 79% the 80% if compared to hPIV-3 samples. It was also developed a RT-PCR for amplification of a part of bPIV-3 and hPIV-3 NH gene. In optimization experiments, compared to viral isolation procedure, the RTPCR displayed a sensitivity of 140 DICC50, good specificity and reproductibility. Results after sequencing of bPIV-3 sample isolated in RS displayed strong homology with those of bPIV-3 tested samples, specially the reference sample. Data obtained in this study showed that the RT-PCR technique developed for PIV- 3 detection was able to amplify an 1009 bp HN gene fragment of bovine and human PIV-3 samples which enables its utilization in diagnostic and epidemiological studies.

Toxoplasma gondii é um protozoário formador de cistos capaz de infectar diversas espécies de aves e mamíferos domésticos e selvagens, incluindo o homem. Apesar de evidências sorológicas da infecção por T. gondii em animais selvagens, pouco se sabe sobre o papel da vida selvagem na cadeia epidemiológica e tampouco a susceptibilidade das variadas espécies a este parasito. O presente trabalho consistiu no isolamento e caracterização genotípica de T. gondii de tecidos de animais selvagens, de vida livre e de cativeiro, provenientes de diversas localidades do Brasil e na detecção sorológica de anticorpos contra o parasito nas amostras em que foi possível obter o soro. A sorologia foi realizada em 54 amostras de soros de aves e mamíferos de várias espécies por meio do Teste de Aglutinação Modificado (MAT). Deste total, 18 amostras (cinco de aves e 13 de mamíferos) foram positivas para anticorpos anti-T. gondii. Para o isolamento do parasito foi realizado o bioensaio em camundongos. Homogenados de coração e cérebro de cada um dos animais foram submetidos à digestão péptica e inoculados em grupos de cinco camundongos. Tecidos dos camundongos que vinham à óbito eram examinados para constatar a presença de formas de T. gondii. Seis semanas após inoculação, foi colhido sangue dos camundongos para a realização de testes sorológicos (MAT) para detecção de anticorpos anti-T. gondii e dois meses após a inoculação estes animais foram submetidos à eutanásia para a procura por cistos teciduais do parasito. Por meio desta prova biológica foi possível isolar T. gondii em 18 animais selvagens (16 de diversas espécies de mamíferos e duas de aves) provenientes de diferentes localidades. T. gondii foi isolado em uma coruja-buraqueira (Athene cunicularia), um pica-pau-de-banda-branca (Dryocopus lineatus), um gato-do-mato-pequeno (Leopardus tigrinus), um lobo-guará (Chrysocyon brachyurus), uma mucura (Didelphis marsupialis), uma paca (Cuniculus paca), três queixadas (Tayassu pecari), uma raposa-do-campo (Pseudalopex etulus), três tamanduás-mirim (Tamandua tetradactyla), três tatus-galinha (Dasypus novemcinctus) e dois tatuspeba (Eufractus sexcinctus). Dezesseis dos 18 isolados obtidos foram letais para 100% dos camundongos infectados. O isolado de um tatu-peba não causou mortalidade em camundongos e o isolado da coruja-buraqueira causou 50% de mortalidade. A caracterização genotípica dos isolados foi realizada pela técnica de PCR/RFLP utilizando 12 marcadores genotípicos. As amostras primárias dos tecidos provenientes dos animais selvagens que foram positivas na PCR de triagem também foram submetidas à caracterização genotípica. Por meio da PCR/RFLP foi possível obter o genótipo completo de 22 amostras, 15 delas provenientes de isolados e sete de amostras primárias de tecidos. Dos 18 isolados obtidos através do bioensaio, em três (tatu-peba, coruja-buraqueira e mucura) não foi possível obter a caracterização completa de todos os 12 marcadores utilizados. Pela análise das 22 amostras caracterizadas foram observados 17 genótipos diferentes, sendo que 13 deles são inéditos. A mortalidade de camundongos infectados foi comparada com a ocorrência dos diferentes alelos no marcador CS3 nos 15 genótipos provenientes de isolados, dos quais, sete apresentaram o alelo tipo I, seis o alelo tipo II e os alelos u-1 e u-3 foram encontrados em um isolado cada. Todos os isolados apresentaram 100% de mortalidade para os camundongos infectados. / Toxoplasma gondii is an intracellular protozoan parasite that infects almost all warmblooded animals, including humans. Although studies indicate that wild animals are frequently positive for antibodies anti-T. gondii, the role of wild life in the epidemiology of this parasite is not well understood nor the susceptibility of different wild species. The present study aimed to isolate T. gondii from free-living and captive wild birds and mammals from different locations from Brazil, to perform the genotipic characterization of T. gondii found in the analyzed tissue samples and to detect aintibodies anti-T. gondii in samples which were possible to obtain the serum. Serology was performed in 54 serum samples from different species of wild birds and mammals by the Modified Agglutination Test (MAT). From this total, 18 samples (five from birds and 13 from mammals) were seropositive for antibodies anti-T. gondii. For the isolation of the parasite, mice bioassay was performed. Brain and heart homogenates were submitted to peptic digestion and were inoculated in groups of five mice per animal sampled. Tissues of mice that died were examined for the presence of T. gondii. Mice were bled six weeks post-inoculation, and their sera were tested for anti-T. gondii antibodies by MAT. Surviving mice were euthanized two months after the inoculation and their brains were examined for the presence of T.gondii tissue cysts. T. gondii was isolated in 18 wild animals (16 from different species of mammals and two from birds) from different locations. T. gondii was isolated from one burrowing owl (Athene cunicularia), one lineated woodpecker (Dryocopus lienatus), three collared anteater (Tamandua tetradactyla), one hoary fox (Pseudalopex vetulus), one maned wolf (Chrysocyon brachyurus), one oncilla (Leopardus tigrinus), one opossum (Didelphis marsupialis), one paca (Cuniculus paca), three nine-banded armadillo (Dasypus novemcinctus), two six-banded armadillo (Euphractus sexcincticus) and three white-lipped peccary (Tayassu pecari). Sixteen of the 18 isolates were lethal to 100% of inoculated mice. The genotypic characterization was performed using 12 PCR-restriction fragment length polymorphism (RFLP) Primary tissue samples which were positive in a trial PCR were also submitted to genotypic characterization. It was possible, by PCR/RFLP, to obtain the complete genotype of 22 samples, 15 from isolates and seven from primary tissue samples. It was not possible to accomplish the complete genotypic characterization in three isolates; one burrowing owl, one opossum and one sixbanded armadillo. In this 22 samples characterized, a total of 17 different genotypes were found with 13 of them described for the first time. Mortality of infected mice was compared between the different alleles of the marker CS3 in the 15 genotypes originated from isolates, which seven were type I, six were type II and alleles u-1 and u-3 were found in one isolate each. All the isolates presented 100% of mortality in infected mice.

Existem diversos trabalhos publicados sobre a utilização de diferentes métodos imunológicos para diagnosticar infecções do trato respiratório causadas por vírus parainfluenza bovino tipo 3 (bPIV-3). Entretanto, é escassa a literatura sobre a utilização da técnica de isolamento viral. Até o presente momento não havia sido relatada a utilização da Transcrição Reversa - Reação em Cadeia da Polimerase (RT-PCR), na detecção de bPIV-3. O objetivo deste estudo foi contribuir para uma melhor caracterização dos bPIV-3 através do desenvolvimento de técnicas de RTPCR para a sua detecção. Utilizando-se uma amostra referência de bPIV-3 (SF-4) e uma amostra de bPIV-3 isolada no Rio Grande do Sul (amostra DIO) foram desenvolvidas técnicas de RT-PCR para a amplificação de diferentes regiões do gene da hemaglutinina-neuraminidase (HN). Após seqüenciamento parcial do gene HN e alinhamento das seqüências da amostra DIO, os resultados revelaram homologia de 99% em relação à amostra referência, 98% a 91% quando comparada com outras amostras de bPIV-3 previamente publicadas na rede e 79% a 80% quando comparada com as amostras de hPIV-3. Foi desenvolvida, também, uma técnica de RT-PCR para amplificação de parte do gene da HN do bPIV-3 e do hPIV-3. Nos experimentos de otimização, a técnica de RT-PCR, comparada com o isolamento viral, apresentou sensibilidade de 140 DICC50, boa especificidade e reprodutibilidade. Os resultados, após seqüenciamento da amostra de vírus bPIV-3 isolada no RS, apresentaram, grande homologia com os das amostras de bPIV-3 comparadas, especialmente a amostra referência. Os dados obtidos neste estudo mostraram que a RT-PCR desenvolvida para a detecção de PIV-3 foi capaz de amplificar um fragmento de 1009 bp do gene da HN de amostras de PIV-3 isoladas de bovinos e humanos, possibilitando a sua utilização em diagnóstico e em estudos epidemiológicos. / There are several published studies on the application of different immunological methods for diagnosis of respiratory infections caused by bovine type 3 Parainfluenza virus (bPIV-3). However, the literature on viral isolation procedure is very scarce. At present there is no report about the utilization of reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) for bPIV-3 detection. The aim of this study was to contribute to a better caracterization of bovine type 3 Parainfluenza virus by developing RT-PCR techniques to its detection. A reference sample (SF-4) and a sample of bPIV-3 isolated in Rio Grande do Sul (DIO sample) were used to develop RT-PCR techniques by amplification of different regions of hemagglutinin-neuraminidase gene (HN). After HN gene partial sequencing of DIO sample and sequence alignment, the results revealed 99% homology when compared to reference sample, 98% the 91% homology in relation to bPIV-3 samples previously published and 79% the 80% if compared to hPIV-3 samples. It was also developed a RT-PCR for amplification of a part of bPIV-3 and hPIV-3 NH gene. In optimization experiments, compared to viral isolation procedure, the RTPCR displayed a sensitivity of 140 DICC50, good specificity and reproductibility. Results after sequencing of bPIV-3 sample isolated in RS displayed strong homology with those of bPIV-3 tested samples, specially the reference sample. Data obtained in this study showed that the RT-PCR technique developed for PIV- 3 detection was able to amplify an 1009 bp HN gene fragment of bovine and human PIV-3 samples which enables its utilization in diagnostic and epidemiological studies.

As encefalopatias espongiformes transmissíveis (EETs), ou doenças do príon, ocorrem tanto nos animais como no homem, são responsáveis por doenças transmissíveis e hereditárias e provocam lesões degenerativas no encéfalo. A presença de uma forma protéica anormal (PrPSc), ao invés da sua forma normal (PrPC), no tecido encefálico e linforreticular é característica peculiar das EETs. Essa proteína é altamente insolúvel, resistente à degradação por proteases e se deposita eventualmente sob forma de placas amiloides na substância cinzenta. Tais placas provocam a morte maciça de neurônios e células gliais, causando vacuolização intensa no tecido afetado. A partir da implantação do programa de vigilância epidemiológica da encefopatia espongiforme bovina (EEB), coordenado pelo Programa Nacional de Controle da Raiva dos Herbívoros e Outras Encefalopatias (PNCRH) do Ministério da Agricultura Pecuária e Abastecimento (MAPA), o Setor de Patologia Veterinária da UFRGS tem sido requisitado frequentemente para realização de exames de necropsias e de materiais de animais com suspeita de scrapie. A técnica de imuno-histoquímica (IHQ) é o teste para o diagnóstico das EETs mais específico disponível até o momento, sendo cada vez mais utilizado para diagnóstico, rastreamento, estudo da patogênese e fornecimento de informações comparativas em nível molecular. Por outro lado, a genotipagem é uma ferramenta importante no auxílio da identificação da suscetibilidade genética a scrapie, tornando o diagnóstico mais seguro, além de possibilitar a identificação de casos atípicos de scrapie, como a Nor98. Este trabalho consistiu na realização da IHQ para proteína priônica no tecido nervoso e no tecido linforreticular, como método diagnóstico de scrapie em ovinos e caprinos, associado à genotipagem dos ovinos. Entre 2009 e 2012 foram realizadas colheitas de materiais para exames de IHQ e coloração por hematoxilina-eosina em amostras de tecidos de ovinos das raças Suffolk, Santa Inês, Dorper e mestiços. As amostras foram obtidas a partir de biopsias e necropsias para diagnóstico de scrapie. Foi realizada também a genotipagem nos animais para os códons 136, 154 e 171 da proteína PRP, e em alguns casos no códon 141. Foram realizadas três repetições da IHQ para cada amostra positiva para PrPSc. O diagnóstico por IHQ no tecido linforreticular foi considerado positivo quando o material apresentou um número de, no mínimo, três folículos linfoides com centros germinativos marcados pela técnica. Entre os resultados obtidos neste trabalho pode-se incluir o primeiro diagnóstico positivo para scrapie de genótipo resistente (ARR/ARR) não Nor98, na espécie ovina no Brasil, com marcação por IHQ nas tonsilas palatínicas, terceira pálpebra e mucosa reto-anal. Este animal era pertencente a um rebanho de ovinos mestiços Sufolk, no qual foram diagnosticados mais nove animais positivos para scrapie nas tonsilas palatínicas, terceira pálpebra e mucosas reto-anal. A coleta e envio de material de vários órgãos linfoides foi considerada importante por possibilitar a confirmação da presença ou não do agente em pelo menos dois deles, reduzindo o número de casos considerados suspeitos, o risco de falsos positivos, e parte, senão a totalidade, dos casos com material insuficiente para diagnóstico. Em necropsia, a coleta de tonsilas palatínicas mostrou-se eficaz pelo seu alto índice de marcação positiva. A coleta de amostras de sangue foi importante para a realização do teste de genotipagem, permitindo avaliar o grau de resistência/susceptibilidade do animal, complementando os resultados de IHQ. / Transmissible spongiform encephalopathies (TSEs), the prion diseases, occurs both in animals and in humans, are responsable for a transmissible and hereditary disease, and cause degenerative lesions in the brain tissue. The presence of an abnormal protein (PrPSc), instead of its normal form (PrPC), on the nervous and lymphoreticular tissue is characteristic of TSEs. This protein is highly insoluble and resistant to degradation by proteases and eventually settles in the gray matter in the form of amyloid plaques that causes massive death of neurons and glial cells, causing intense vacuolization in the affected tissue. After the establishment of the Bovine Spongiform Encephalopathy surveillance program, coordinated by the National Rabies and Other Encephalopathies Control Program, the Setor de Patologia Veterinária of UFRGS has been usually required to proceed necropsy and other diagnosis in suspicious animals. The immunohistochemistry (IHC) is the most specific technique actually used to TSEs identification, being increasingly used to diagnosis, traceability, pathogenesis study and providing comparative information on the molecular level. On the other hand, genotyping is an important tool on scrapie genetic susceptibility identification, making more secure the diagnosis, beyond to enable the atypical scrapie cases identification, like Nor98. This work consisted to performing IHC to prionic protein, on nervous system and lymphoreticular tissue, as scrapie diagnostic method in sheep and goat, associate to genotyping in sheep. Sheep tissues were sampled from Suffolk, Santa Inês, Dorper and crossbreed to proceed IHC and hematoxilin-eosin staining between 2009 and 2012. The samples were obtained by biopsy and necropsy to scrapie diagnose. Genotyping of codons 136, 154 and 171 of PRP protein was performed, as well as a few of codon 141. The monoclonal antibody anti-prion F98/160.1.5 and F99/97.6.1 was used at the IHC. For each positive sample three repetitions were performed. The diagnostic by IHC at lymphoreticular tissue was considered positive when it shows at minimum three follicles with germinal centers stained. Among the obteined results, could be included the first diagnostic of scrapie not Nor98 in resistant genotype (ARR/ARR) sheep in Brazil. This animal belongs to a Suffolk sheep flock in which were diagnosed more nine scrapie positive animals showing IHC staining on tonsils, third eyelid and rectal mucosa. The sampling and dispatch of many lymphoid tissues was considered important to enable the confirmation of agent presence or not in at least two of them, reducing the number of suspicious cases, the risk of false positive, and part, if not all, of cases with insufficient material for diagnosis. At necropsy, the tonsils collecting showed efficient by the it high positive staining level. Blood sampling becomes important to proceed genotyping test, allowing measure the animal resistance/susceptibility grade, complementing the IHC results.

Submitted by Lucelia Lucena (lucelia.lucena@ufpe.br) on 2015-03-13T19:32:24Z No. of bitstreams: 2 Nunes,_MJG-_Dissertação_final_2012.pdf: 4070100 bytes, checksum: bc731749f56a74be967907ff824bd9a2 (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-03-13T19:32:24Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Nunes,_MJG-_Dissertação_final_2012.pdf: 4070100 bytes, checksum: bc731749f56a74be967907ff824bd9a2 (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Previous issue date: 2012-02-15 / CAPES, FACEPE / A infecção pelo HPV (Papilomavírus humano) é o fator de risco mais comum para o desenvolvimento de Neoplasia Intraepitelial Anal (NIA). Além do fator viral deve-se considerar história de intercurso anal, infecção pelo HPV em outros sítios (vulvar, vaginal ou cervical) e tabagismo, bem como processos inflamatórios crônicos anorretais que, associados à imunodepressão, podem acelerar a divisão celular e dar origem à neoplasia. Objetivo: Identificar a presença do HPV e avaliar a expressão da proteína p16 em amostras anais de mulheres HIV negativas portadoras de lesões visíveis a anuscopia. Métodos: O estudo foi realizado com pacientes atendidas no Hospital de Câncer de Pernambuco, submetidas a anuscopia de magnificação. Diante da presença de lesões entre o canal anal e a zona de transição com o reto, realizava-se a coleta de células anais e biópsia. Foi extraído DNA para posterior análise da identificação do HPV através da Reação em Cadeia Polimerase (PCR), utilizando-se os primers GP5+/6+ e MY09/11 e genotipagem através do PapilloCheck®. Os fragmentos de tecido obtidos por biópsia foram submetidos a rotina histológica, corados pela Hematoxilina-Eosina e a reação imunohistoquímica para identificação da expressão da proteína p16. Resultados: Foram classificadas histologicamente 65 amostras e agrupadas como: I-Negativo para displasia: Ia-Normal, alterações benignas e/ou inflamatórias 52,31%, Ib-alterações proliferativas 41,54% e II-Neoplasias 6,15%. Entre os casos negativos para displasia 93.44% não apresentaram marcação para p16. Em 75% dos casos de neoplasias observou-se marcação nuclear e/ou citoplasmática, quanto ao padrão de marcação nesses casos verificou marcação em um terço e três terços do epitélio para NIA I e III, respectivamente. Todas as lesões com diagnóstico histológico de neoplasia apresentaram positividade para HPV para o método da PCR utilizando os primers GP5+/6+ e MY09/11. O primer GP5+/6+ mostrou-se mais eficiente para detecção do DNA-HPV em amostras anais do que o MY09/11. Foram genotipadas 82 amostras e destas 50% apresentaram positividade para 20 genótipos do HPV, sendo HPV6 (18.84%) o mais prevalente seguido por HPV16 (15.94%) e HPV53 (10.14%). Foi observada múltipla infecção em 24.64%, mostrando variação entre 2 – 8 tipos virais. Conclusões: O uso de ferramentas adicionais como método molecular (PCR e genotipagem) e imunohistoquímico associados ao exame histológico pode oferecer um diagnóstico do HPV mais preciso nas lesões intraepiteliais anais.