Made available in DSpace on 2015-07-22T20:50:31Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009-07-29. Added 1 bitstream(s) on 2015-08-11T03:25:25Z : No. of bitstreams: 1 Publico-00219.pdf: 991560 bytes, checksum: 343385f35ebbeebd043b4c217bc762ff (MD5) / Introducao: Nas duas ultimas decadas houve aumento do numero de pacientes imunocomprometidos, e como consequencia o numero de infeccoes fungicas, sobretudo por fungos filamentosos. Alem de fontes externas de contaminacao do ar de unidades de risco, recentemente investigacoes demonstraram que os sistemas de distribuicao de agua e reservatorios dos hospitais podem ser colonizados por fungos patogenicos constituindo uma importante fonte de infeccao. Objetivos: Quantificar e identificar os fungos isolados da agua e do ar de uma unidade de TCTH, e avaliar com o uso de tecnicas moleculares a relacao genetica entre amostras de A. fumigatus, A. flavus e F. solani, isoladas do ar e agua. Metodologia: O estudo foi realizado em uma unidade de TCTH, com coletas mensais em diferentes pontos ao longo de 12 meses. As coletas de ar das areas internas e externas da unidade, foram realizadas com bioamostrador de ar, com placas de petri contendo agar Sabouraud dextrose. Nas coletas de agua, amostras provenientes do sistema hidraulico da unidade, coletadas em frascos esterelizados, foram analisadas quanto aos parametros fisico-quimicos e filtradas em membrana de 0,45 ƒÊ, que posteriormente foram incubadas em agar Sabouraud dextrose para a analise microbiologica. A identificacao fenotipica foi realizada utilizando chaves de identificacao De Hoog et al (2000). Na analise genotipica, os isolados de A. fumigatus, A. flavus e F. solani foram tipados utilizando primers de minissatelite e microssatelite. Resultados: Foram realizadas 164 coletas de agua, onde observamos maior quantidade de propagulos nos meses correspondentes ao outono e verao. A media de propagulos foi de 6,07 UFC/L. Os generos mais prevalentes foram Paecilomyces, Penicillium e Cladosporium, sendo que dos fungos com potencial patogenico, Fusarium foi mais frequente na agua da unidade. A temperatura da agua foi o unico parametro correlacionado com o aumento de propagulos isolados. Na analise microbiologica do ar da unidade, um total de 264 coletas foram realizadas, com maior quantidade de propagulos nos meses de outono. A media de propagulos isolados foi de 11,09 UFC/m3 por ponto de coleta. Os generos prevalentes foram Cladosporium e Penicillium. Dente os fungos com potencial patogenico, Aspergillus foi o genero mais isolado no ar da unidade. Na analise molecular de F. solani nao identificamos similaridade entre cepas do ar e da agua, contudo, documentamos que o mesmo isolado permaneceu um periodo superior a 30 dias no sistema hidraulico da unidade. Duas amostras do ar, de ambientes distintos de A. fumigatus apresentaram alta similaridade na analise molecular. Na analise das amostras de A. flavus, perfis conflitantes foram obtidos com os diferentes primers, nao sendo possivel estabelecer relacao direta entre os isolados do ar e da agua. Conclusao: o monitoramento ambiental em unidades de risco e de grande importancia nao so aplicado em ocasioes de surtos, como tambem na avaliacao de potenciais fontes de infeccao nosocomial. Fungos patogenicos ao homem podem ser isolados, na agua e persistir meses no sistema hidraulico constituindo um reservatorio de infeccao. Nao identificamos relacao genotipica, entre amostras provenientes do ar e da agua, na analise de propagulos de A. fumigatus, A.flavus e F. solani. / Introduction: The expansion of the immunocompromised patient population in the last two decades has led to an increased incidence of invasive fungal infections, especially by filamentous fungi. Although external sources of contamination are well known related to airconditioning in units of risk, recent investigations have shown that water distribution systems or linked to tanks of hospitals have been also identified as an important source of infection when it is colonized by pathogenic fungi. Objectives: Quantify and identify samples of fungi isolated from water and air of a unit of HSCT, and evaluate them by using molecular techniques looking for their genetic relationship among strains of A. fumigatus, A. flavus and F. solani. Material and Methods: The current study was performed in a unit of HSCT, collecting samples monthly over 12-month period. Air samples were recovered from outdoor air, bathrooms, and rooms in hospital unit, the air sample was collected with six-faced Andersen collector, with Petri dishes containing Sabouraud-dextrose agar. All water samples were collected in sterile polystyrene bottles and passed through sterile 0.45um filters using a filtration apparatus. Using sterile forceps, the filters were place directly on Sabouraud-dextrose agar plates. The phenotypic identification was made using keys for identification of Hoog (2000). In the genotypic analysis, the isolates of A. fumigatus, A. flavus and F. solani were typing using oligonucleotide and microsatellite minisatellite. Results: A total of 164 samples of water where collected. We observed higher amount of conidia in the months corresponding to the autumn and summer. The average conidia were 6.07 CFU / l. The most prevalent genera were Paecilomyces, Penicillium and Cladosporium. Fusarium was more frequent in the water of the unit. The unique parameter correlated to the increasing isolation of fungi was the water temperature. In the microbiological analysis of air from the hospital unit, a total of 264 samples were collected recovering larger quantities of conidia during the fall. The individual average of conidia was 11.09 CFU/m3. The most prevalent genera were Cladosporium and Penicillium. The genus Aspergillus was isolated in the air mostly indoor. In the molecular analysis, it was observed poor similarity among F. solani strains from air and water, however, we reported that two isolates remained in the hydraulic system of the unit for a period over 30 days. Two samples of air, showed 2 distinct environment strains of A. fumigatus showing high similarity through molecular analysis. In our molecular analysis, conflicting profiles of A. flavus strains were obtained with different oligonucleotide, it was not possible to establish any direct relationship between samples of air and water. Conclusions: environmental surveillance in the units of risk is the highest importance not only applying to outbreaks, as well as to evaluate potential sources of nosocomial infection. Pathogenic fungi to humans can be often isolated, and persist in the water for months in the hydraulic system as a reservoir of infection. We did not identified genetic relationship among samples from air and water, propagules of A. fumigatus, A. flavus and F. solani. / TEDE / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Made available in DSpace on 2014-12-05T18:38:23Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) carlos_castro_ipec_dout_2011.pdf: 5337638 bytes, checksum: 01bdb8d35a9c2a777d82aa1aa6e41ab1 (MD5) Previous issue date: 2014-11-18 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto de Pesquisa Clínica Evandro Chagas, Rio de Janeiro, RJ, Brasil / A diferenciação sorológica entre casos incidentes e prevalentes de infecção pelo HIV tem sido descrita como uma importante ferramenta para subsidiar a análise das tendências da epidemia de HIV/AIDS. Considerando a importância de tal abordagem para avaliar eventuais tendências na diversidade viral, na resistência primária aos antirretrovirais nas infecções recentes e no monitoramento de grupos em risco, avaliamos indivíduos que buscaram a testagem para o HIV de novembro de 2004 a dezembro de 2008 em CTAs localizados em 4 cidades do estado do Rio de Janeiro (Rio de Janeiro, Nova Iguaçu, Duque de Caxias e São Gonçalo). As amostras soropositivas foram testadas para a diferenciação entre infecções recentes e de longo termo utilizando-se o teste BED-CEIA. Um subconjunto destas também foi avaliado pelo método de indice de avidez (IA) e por marcadores imunológicos - linfócitos TCD4+ e/ou \03B22 microglobulina, a fim de propor um algoritmo com maior especificidade para a detecção de amostras de indivíduos recém infectados pelo HIV-1. Amostras de soroconvertidos recentes (SR) e um subconjunto dos soroconvertidos de longo termo (SLT) foram selecionados para os protocolos de biologia molecular, sendo sequenciado um fragmento do gene pol da região que codifica a protease e a transcriptase reversa Nossos resultados destacam que os HSH continuam a ser uma população altamente vulnerável, tendo prevalência até onze vezes maior que os homens heterosexuais entre os SR. A aplicação de uma zona cinzenta e a avaliação do estado imune contribuiram para uma redução significativa da presença de amostras indeterminadas quando os testes BED-CEIA e de IA foram aplicados, sendo o de IA mais específico. Embora não tenha sido observado tendência de mudança importante no padrão de subtipos de HIV-1 quando comparou-se RS e LTS no primeiro ano, ao longo do estudo revelou-se um incremento da proporção de amostras recombinantes, bem como uma crescente proporção de amostras relacionadas com CRFs em comparação com URFs, o que alinha-se com dados recentes publicados pela OMS-UNAIDS. Em nosso estudo esta tendência se deveu ao aumento entre os homens, sendo este aumento mais pronunciado entre os heterossexuais do que entre os HSH. Entre estes genomas recombinantes foi encontrado pela primeira vez no Rio de Janeiro amostras relacionados ao subtipo K, assim como uma detecção crescente de amostras com recombinação envolvendo os subtipos A e G entre os indivíduos caracterizados como recém infectados. Nossos dados revelam que os níveis de resistência primária aos antirretrovirais permaneceram relativamente estáveis ao longo do tempo, mas em um patamar preocupante. Entre os HSH a taxa de resistência foi o dobro da registrada em homens heterosexuais, o que sugere uma distribuição desigual em relação a resistência primária em determinados subgrupos. Novos estudos devam ser realizados com foco em populações específicas de forma a contribuir para o monitoramento da dinâmica da epidemia nas mesmas / The serological differentiation between incident an d prevalent cases of HIV infection has been described as an important tool t o detect trends in HIV/AIDS. Considering the importance of such approach to asse ss possible trends in viral diversity and primary resistance to antiretroviral drugs in r ecent infections and monitoring of groups at risk, we evaluate individuals who sought testing for HIV from November 2004 to November 2008 in VCTs located in four cities in the state of Rio de Janeiro (Rio de Janeiro, Nova Iguaçu, Duque de Caxias and Sao Gonca lo). The seropositive samples were tested to differentia te between recent and long< term infections using the BED<CEIA test and a subse t was also evaluated by the avidity test (AI) and immunological markers, lymphocytes TC D4 + and/or β2 microglobulin, aiming to propose an algorithm with more specificit y for the detection of individuals newly infected with HIV<1. Samples of recent seroco nverted (SR) and a subset of long< term seroconverted (LTS) were selected for molecula r protocols, where sequences were obtained from the fragment of the pol gene region which encodes the protease and reverse transcriptase. Our results highlight that MSM continue to be a hig hly vulnerable population, with prevalence up to eleven times higher than among het erosexual men between the RS samples. In fact, prevention interventions focused on this group should be continuously implemented. The application of a gray zone area an d the evaluation of the immune status contributed to a significant reduction in th e presence of indeterminate samples when both BED<CEIA and AI tests were applied, and t he AI showed to be more specific than the BED<CEIA. Although no trend has been obser ved in the pattern of HIV<1 subtypes when RS and LTS in the first year were com pared, an increase in the proportion of recombinant samples as well as an inc reasing proportion of samples related to CRF compared with URFs < which aligns wi th recent data published by WHO< UNAIDS< were detected throughout the study. In ou r study this trend was due to the increase among men, and even more pronounced among heterosexual men than among MSM. Among the recombinant genomes, samples relate d to subtype K, were found for the first time in Rio de Janeiro and a growing prop ortion of samples with recombination involving subtypes A and G among individuals charac terized as newly infected was detected. Overall levels of primary resistance to a ntiretroviral drugs are a matter of concern, although remained relatively stable over t ime. Among MSM, the resistance rate was twice as high as among heterosexual men, sugges ting an uneven distribution in relation to primary resistance in certain groups. F urther studies should be implemented in order to monitor the dynamics of the epidemic in key populations

Made available in DSpace on 2016-04-04T12:40:39Z (GMT). No. of bitstreams: 2 brunna_marques_ioc_mest_2013.pdf: 2715065 bytes, checksum: aaa9be9dc694a52d7bf82b8c0cd65be7 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2013 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / O diagnóstico da infecção pelo vírus da hepatite C (HCV) é feito pela detecção de marcadores sorológicos e moleculares, porém o custo destas metodologias é bastante elevado e a coleta de sangue para a realização destes ensaios além de requerer pessoal treinado, é difícil em áreas remotas ou com poucos recursos. O objetivo deste estudo foi otimizar protocolos e padronizar métodos de diagnóstico molecular para infecção pelo HCV em amostras de sangue coletado em papel de filtro (SPF) para facilitar o acesso ao diagnóstico em áreas remotas ou com recursos limitados. Para isto, 99 indivíduos forneceram amostras pareadas de soro e SPF, dentre os quais 59 eram anti-HCV reagente e 40 eram não reagentes em suas amostras de soro. As amostras anti-HCV reagentes foram submetidas à técnica de quantificação comercial. Para o desenvolvimento da RT-PCR quantitativa (RT-qPCR) in house, uma curva padrão interna foi construída utilizando um plasmídeo contendo o inserto do HCV e iniciadores e sonda foram desenhados para a região 5´NC do HCV. Para otimização da técnica, a concentração de cDNA, transcriptase reversa e números de ciclos de reação foram avaliados. Para a extração de RNA de HCV em amostras de SPF, sete métodos foram avaliados. A sensibilidade, especificidade, correlação, reprodutibilidade e presença de inibidores da RT-PCR quantitativa também foram determinados. O conjunto de QIAamp DNA Mini Kit foi o método mais eficiente para extração do RNA do HCV em SPF. A RT-qPCR in house desenvolvida foi capaz de quantificar o HCV no soro de 44 amostras onde a mediana de carga viral foi inferior aquela observada na técnica comercial (log10 4,94 e log10 6 cópias de HCV/mL, respectivamente). A faixa de detecção do método in house foi de 10 a 109 cópias de HCV por reação Para a detecção de HCV em SPF foi necessário o aumento da transcriptase reversa e de cDNA, permitindo que 35 amostras fossem detectadas com um limite mínimo de detecção igual a 58,5 cópias/mL e a mediana de carga viral foi semelhante à observada nas respectivas amostras de soro avaliadas pela técnica comercial (log10 5,38 e log10 5,89 cópias de HCV/mL, respectivamente). Obteve-se boa reprodutibilidade da RT-qPCR in house através da análise da curva padrão e de amostras de soro e SPF. Não foi observada a presença de inibidores de reação utilizando o GAPDH como controle interno. Quando comparado com a metodologia comercial, a RT-qPCR apresentou sensibilidade de 74,58% (IC95% 61,5-85,0) em soro e 59,3% (IC95% 45,7-71,9) em SPF, e a especificidade foi igual a 100% para ambos espécimes. Quando a RT-qPCR foi avaliada entre os dois espécimes clínicos, a sensibilidade da técnica em SPF foi igual a 65,9% (IC95% 50,0-79,5) e a especificidade foi igual a 100%. Quarenta e cinco amostras de soro e quinze amostras de SPF foram amplificadas na RT-PCR qualitativa, onde 43 amostras de soro e 11 amostras de SPF foram sequenciadas. Entre as amostras de soro, 29 foram classificadas como subgenótipo 1b, 13 como subgenótipo 1a, 1 como genótipo 3. Entre as amostras de SPF, 9 foram classificadas como subgenótipo 1b e 2 como subgenótipo 1a. Foi observada alta homologia nucleotídica entre as sequencias de HCV das amostras pareadas de soro e SPF onde todas foram classificadas como genótipo 1. Conclui-se que o sangue em papel de filtro pode ser utilizado para detecção, quantificação e análise filogenética do HCV, sendo uma ferramenta promissora para estudos de epidemiologia da hepatite C / The d iagnosis of hepatitis C virus (HCV) infection is made by detection of molecular and serologic al markers, but the cost of these methodologies is quite high and blood sample collection requires trained personnel what it is difficult in remote areas or prese nting few resources. The aim of this study was to optimize protocols and standardize molecular diagnostic methods for HCV infection in dried blood samples (DBS) to facilitate access to diagnosis in remote areas or with limited resources. For this, 99 indiv iduals provided paired serum and DBS samples , where 59 of them were anti - HCV rea ctive and 40 were non - reactive in their serum samples. A nti - HCV positive samples were subjected to commercial quantification technique. For the development of quantitative RT - P CR (RT - qPCR) in house, an internal standard curve was constructed using a plasmid containing the insert and HCV primers and probe designed for the 5' non coding ( NC ) region of HCV. For optimization of these technique s , the concentration of cDNA, reverse tr anscriptase and numbers of cycles of reaction were evaluated. For the extraction of HCV RNA in DBS samples, seven methods were evaluated. The sensitivity, specificity, correlation, reproducibility and presence of inhibitors in quantitative RT - PCR were also determined. Q IAamp DNA Mini Kit was the most efficient method for HCV RNA extraction among DBS samples . The in house RT - qPCR was able to quantify HCV among 44 serum samples where the median viral load was lower than that observed in commercial technique ( 4.94 log 10 and 6 log 10 copies of HCV / mL, respectively). The range of HCV detection using in house RT - qPCR was 10 - 10 9 copies of HCV per reaction. For HCV detection in DBS , it was necessary to increase reverse transcriptase and cDNA concentration giving 35 HCV RNA reactive samples with a limit of detection equal to 58.5 copies of HCV / m L and the median viral load was similar to that observed in their sera evaluated by commercial technique (5.38 log 10 and 5.89 log 10 copies of HCV / mL, respectively). In hous e RT - qPCR presented good reproducibility using standard curve and paired DBS and sera samples . It was not observed the presence of inhibitors of the reaction using GAPDH as internal control. In house RT - qPCR showed a sensitivity of 74.58% (95% CI 61.5 to 8 5.0) in serum and 59.3% (95% CI 45.7 to 71.9) in DBS, and the specificity was 100% for both specimens compared to the commercial methodology . When the RT - qPCR was evaluated in two clinical specimens, the sensitivity of the technique in DBS was equal to 65. 9% (95% CI 50.0 to 79.5) and specificity was 100%. Forty - five serum samples and 15 DBS samples were amplified in qualitative RT - PCR, where 43 serum samples and 11 DBS samples were sequenced. Among the serum samples, 29 were classified as HCV subgenotype 1b , 1 3 as subgenotype 1a, genotype 1 and 3. Among DBS samples, 9 were 9 classified as HCV subgenotype 1b and 2 as HCV subgenotype 1a. HCV nucleotide sequences presented high homology between paired DBS and sera samples and all of them were classified as geno type 1. It is conclude that dried blood spot may be used for detection, quantification and phylogenetic analysis of HCV and it is a promising tool for studying the epidemiology of hepatitis C

Submitted by Gilvan Almeida (gilvan.almeida@icict.fiocruz.br) on 2016-09-20T14:28:59Z No. of bitstreams: 2 license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) 71971.pdf: 8611077 bytes, checksum: d7c7d933929609de42dfd8e3199d51cf (MD5) / Approved for entry into archive by Anderson Silva (avargas@icict.fiocruz.br) on 2016-10-03T13:30:02Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) 71971.pdf: 8611077 bytes, checksum: d7c7d933929609de42dfd8e3199d51cf (MD5) / Made available in DSpace on 2016-10-03T13:30:02Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) 71971.pdf: 8611077 bytes, checksum: d7c7d933929609de42dfd8e3199d51cf (MD5) / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / De acordo com a Organização Mundial da Saúde (OMS), as Doenças Tropicais Negligenciadas (DTNs), como a doença de Chagas, tripanossomíase africana, entre outras, afetam cerca de 1 bilhão de pessoas no mundo. Apesar do impacto causado por estas doenças, as mesmas continuam sendo pouco estudadas. O reino Protista, ao qual os agentes etiológicos dessas doenças pertencem, incluem espécies de importância veterinária que causam muitas perdas para a indústria pecuária. Com os avanços da genética molecular, técnicas como a genotipagem estão sendo usado cada vez mais utilizadas para o estudo de protozoários parasitos. Genes ortólogos conservados em protozoários podem ser utilizados como loci para genotipagem desses protozoários, de modo a obter uma melhor caracterização interespecífica. Neste estudo, foram utilizadas técnicas de PCR singleplex e multiplex para a genotipagem de 16 espécies de protozoários de três diferentes gêneros: Trypanosoma spp., Leishmania spp. (classe Kinetoplastea) e Plasmodium spp. (filo Apicomplexa). Como metodologia de biologia molecular foram utilizados PCR e sequenciamento, bem como em bioinformática, onde foi utilizado filogenia molecular. Para esta finalidade, foram desenhados 39 pares de iniciadores degenerados e usados com o DNA genômico de espécies de protozoários de dois grupos: filo Apicomplexa e classe Kinetoplastea, em seguida, as reações de PCR foram realizadas a fim de padronizar as reações para um PCR multiplex. Além disso, os seguintes parasitos de importância para a saúde pública: T. cruzi, Leishmania braziliensis, L. amazonensis, L. guyanensis, Plasmodium falciparum e P. Vivax, foram utilizados neste trabalho A partir dos 39 pares de iniciadores, 9 pares foram selecionados compreendendo 7 loci para o presente estudo: metionil-tRNA sintetase, leucil-tRNA sintetase, seril-tRNA sintetase, subunidade U5 snRNP do spliceossomo, mismatch repair ATPase, triosefosfato isomerase e GTP-binding protein. Os testes a partir de diluições seriadas dos DNAs de Trypanosoma spp., Leishmania spp. e Plasmodium spp., onde mostraram uma sensibilidade de até 1 pg/\03BCL de DNA (para o locus Leucyl-tRNA synthetase em Trypanosoma e Leishmania). A reação inicial de PCR singleplex padronizada foi eficiente para todos os loci, o que proporcionou o desenho da reação de PCR multiplex, onde o melhor resultado foi a reação número 5, a qual foi utilizada um conjunto de iniciadores dos genes GTP-binding protein, U5 snRNP spliceosome subunit e Leucyl-tRNA synthetase, que quando integrados permitiram a genotipagem multilocus de tripanossomatídeos dos gêneros Leishmania spp. e Trypanosoma spp. A metodologia aplicada para a genotipagem destas espécies de parasitas foi bem-sucedida, e pode-se destacar após a observação de conjunto de resultados que o melhor locus em termos de especificidade, sensibilidade e fidelidade aos dados encontrados na literatura, foi Leucyl-tRNA synthetase, que apresentou resultados satisfatórios em todas as análises / According to the World Health Organization (WHO), Neglected Tropical Diseases (NTDs), examples being Chagas disease, African trypanosomiasis, among others, affect about 1 billion people in the world. However, they are little studied, despite its great impact on health. Also, they include species of veterinary importance that cause great harm to the livestock industry. The kingdom Protista, containing etiological agents of NTDs, they include species of veterinary importance and that cause great harm to the livestock industry. With advances in molecular genetics, techniques such as genotyping are being used increasingly used for the study of parasitic protozoans. Orthologous genes conserved in protozoa can be used as loci for genotyping, in order to obtain a better interspecific characterization. In this study, we used singleplex and multiplex PCR techniques for genotyping of 16 species of three different genus of protozoans: Trypanosoma spp., Leishmania spp. (class Kinetoplastea) e Plasmodium spp. (phylum Apicomplexa). As molecular biology methods were used PCR and sequencing of PCR fragments, as well as bioinformatics, using molecular phylogeny. For this purpose, were designed 39 degenerated primers for species of 2 groups: phylum Apicomplexa and class Kinetoplastea, then, the PCR reactions were performed with the aim of standardizing multiplex PCR reactions. Moreover, parasites of importance to public health such as Trypanosoma cruzi, Leishmania braziliensis, L. amazonensis, L. guyanensis, Plasmodium falciparum and P. vivax were used in this study Based on the 39 pairs of primers, 9 pairs were selected comprising 7 loci for this study: methionyl-tRNA synthetase, leucyl-tRNA synthetase, seryl-tRNA synthetase, subunit U5 snRNP the spliceosome, mismatch repair ATPase, triosephosphate isomerase, and GTP- binding protein. The tests from serial dilutions of DNA from Trypanosoma spp., Leishmania spp. and Plasmodium spp., which showed a sensitivity of up to 1 pg/\03BCL DNA (for Leucyl-tRNA synthetase locus on Trypanosoma and Leishmania). The initial standardized singleplex PCR reaction was efficient for all loci, which resulted in the design of multiplex PCR reaction, where the best result was the number 5 reaction which was used a set of primers of the GTP-binding protein genes, U5 snRNP spliceosome subunit and Leucyl-tRNA synthetase, which when integrated allowed genotyping trypanosomatides multilocus of the genus Leishmania spp. and Trypanosoma spp. The methodology used for genotyping of these parasite species was successful, and can highlight after observation of the result set that the best locus in terms of specificity, sensitivity and fidelity to data found in literature, was LeucyltRNA synthetase, which showed satisfactory results in all analyzes

CRUZ, J. N. M. C. Estudo da prevalência dos genótipos e mutações de resistência associadas aos antivirais em pacientes com hepatite B crônica atendidos nos serviços de referência do Estado do Ceará. 2015. 86 f. Dissertação (Mestrado em Patologia) - Faculdade de Medicina, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2015. / Submitted by Erika Fernandes (erikaleitefernandes@gmail.com) on 2016-01-25T13:45:09Z No. of bitstreams: 1 2015_dis_jnmcruz.pdf: 963661 bytes, checksum: a5ede67c0a7089849113b951a9684ebc (MD5) / Approved for entry into archive by Erika Fernandes(erikaleitefernandes@gmail.com) on 2016-01-25T13:45:21Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2015_dis_jnmcruz.pdf: 963661 bytes, checksum: a5ede67c0a7089849113b951a9684ebc (MD5) / Made available in DSpace on 2016-01-25T13:45:21Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2015_dis_jnmcruz.pdf: 963661 bytes, checksum: a5ede67c0a7089849113b951a9684ebc (MD5) Previous issue date: 2015-09-25 / Infection with hepatitis B virus (VHB) is a serious public health problem. An estimated 450 million chronic carriers worldwide, where at least 600,000 people die annually from diseases related to hepatitis B. Viral load, HBe seroconversion-antiHBe, and specific genotype and viral mutations are acquired factors influence the progression of the disease. The aim of this study was to investigate the prevalence of VHB resistance mutations associated with antiviral and evaluate the genotype distribution in a sample of 142 patients with chronic hepatitis B, treated in the State of Ceará referral hospitals. Patients were considered reactive serum HBsAg for at least six months. Serological tests were performed by electrochemiluminescence (EQL), ABBOTT laboratory for HBsAg, HBeAg and anti-HBe. The results of the serological screening showed that all samples: 142 (100%) were reactive serum HBsAg (IgG), 87 (61.0%) were negative to serum and serum HBeAg to anti-HBe reagent, 55 (39, 0%) are seroreactive for HBe and serum non-reactive for anti-HBe. The quantitation of viremia (viral load) was performed by real time PCR (QPCR) in LACEN-EC. The viral load varied between the limits (2067 IU / ml to 3.41 billion IU / ml), with a median of 70 403 IU / ml. Eighty-eight (62%) of all samples were submitted to analysis of mutations associated with treatment and genotyping the Hepatitis laboratory of the FIOCRUZ-RJ, screened for sequencing as quality criteria and routine laboratory biosafety this. The identification of genotypes in the population studied showed the following distribution: F: 47 (53.4%) of A: 34 (38.6%), the D: 4 (4.6%), E: 2 ( 2.3%) and G 1 (1.1%). And the following mutations were detected: L180M (n = 10 / 9.9%), M204V (n = 8 / 7.9%), M204I (n = 4/4%), G173L (n = 1/1%) , T169L (n = 1/1%), T184I (n = 1/1%), L80V (n = 1/1%) while 74.3% showed no change. In the study it was observed that the F genotype (53.4%) was the most prevalent in the research population of Indian origin, followed by genotype (38.6%) due to migration of African slaves. And, the higher frequency of the detected mutations are associated with nucleoside inhibitors and nucleotides, especially lamivudine. / A infecção pelo vírus da hepatite B (VHB) é um grave problema de saúde pública. Estimam-se em 450 milhões os portadores crônicos no mundo, em que pelo menos 600 mil pessoas morrem anualmente por doenças relacionadas com o vírus da hepatite B. A carga viral, soroconversão HBe – anti-HBe, genótipo e mutações virais específicas e adquiridas são fatores que influenciam a progressão dessa doença. O objetivo do presente estudo foi investigar a prevalência de mutações de resistência do VHB associada aos antivirais e avaliar a distribuição genotípica numa amostragem de 142 pacientes com hepatite B crônica, atendidos nos hospitais de referência do Estado do Ceará. Foram realizadas sorologias por eletroquimioluminescência (EQL), laboratório ABBOTT para HBsAg, HBeAg e anti-HBe. O resultado da triagem sorológica no total das amostras mostrou que: 142 (100%) foram sororeagentes para HBsAg (IgG), 87(61,0%) foram soro não reagentes para HBeAg e soro reagentes para anti-HBe, 55(39,0%) são soros reagentes para HBe e soro não reagente para anti-HBe. A quantificação da viremia (carga viral) foi realizada por PCR em tempo real (QPCR), no LACEN-CE. A carga viral variou entre os limites de (2.067 UI/mL a 3.410.000.000 UI/mL), com mediana de 70.403 UI/mL. Oitenta e oito (62%) do total das amostras foram submetidas à pesquisa de mutações associadas ao tratamento e genotipagem no laboratório de hepatites da FIOCRUZ-RJ, triadas para sequenciamento conforme critérios de qualidade e biossegurança de rotina desse laboratório. A identificação dos genótipos na população estudada apresentou a seguinte distribuição: F: 47 (53,4%), A: 34 (38,6%), D: 4(4,6%), E: 2(2,3%) e genótipo G: 1(1,1%). E as seguintes mutações foram detectadas: L180M (n=10 / 9,9%), M204V (n=8 / 7,9%), M204I (n=4 / 4%), G173L (n=1 / 1%), T169L (n=1 / 1%), T184I (n=1 / 1%), L80V (n=1 / 1%) enquanto que 74,3% não apresentaram mutações. No estudo foi observado que o genótipo F(53,4%) foi o mais prevalente na população pesquisada de origem indígena, seguido do genótipo A (38,6%) devido à migração de escravos africanos. E, que a maior frequência das mutações detectadas está associada a inibidores de nucleosídeos e nucleotídeos, principalmente a lamivudina.

As encefalopatias espongiformes transmissíveis (EETs), ou doenças do príon, ocorrem tanto nos animais como no homem, são responsáveis por doenças transmissíveis e hereditárias e provocam lesões degenerativas no encéfalo. A presença de uma forma protéica anormal (PrPSc), ao invés da sua forma normal (PrPC), no tecido encefálico e linforreticular é característica peculiar das EETs. Essa proteína é altamente insolúvel, resistente à degradação por proteases e se deposita eventualmente sob forma de placas amiloides na substância cinzenta. Tais placas provocam a morte maciça de neurônios e células gliais, causando vacuolização intensa no tecido afetado. A partir da implantação do programa de vigilância epidemiológica da encefopatia espongiforme bovina (EEB), coordenado pelo Programa Nacional de Controle da Raiva dos Herbívoros e Outras Encefalopatias (PNCRH) do Ministério da Agricultura Pecuária e Abastecimento (MAPA), o Setor de Patologia Veterinária da UFRGS tem sido requisitado frequentemente para realização de exames de necropsias e de materiais de animais com suspeita de scrapie. A técnica de imuno-histoquímica (IHQ) é o teste para o diagnóstico das EETs mais específico disponível até o momento, sendo cada vez mais utilizado para diagnóstico, rastreamento, estudo da patogênese e fornecimento de informações comparativas em nível molecular. Por outro lado, a genotipagem é uma ferramenta importante no auxílio da identificação da suscetibilidade genética a scrapie, tornando o diagnóstico mais seguro, além de possibilitar a identificação de casos atípicos de scrapie, como a Nor98. Este trabalho consistiu na realização da IHQ para proteína priônica no tecido nervoso e no tecido linforreticular, como método diagnóstico de scrapie em ovinos e caprinos, associado à genotipagem dos ovinos. Entre 2009 e 2012 foram realizadas colheitas de materiais para exames de IHQ e coloração por hematoxilina-eosina em amostras de tecidos de ovinos das raças Suffolk, Santa Inês, Dorper e mestiços. As amostras foram obtidas a partir de biopsias e necropsias para diagnóstico de scrapie. Foi realizada também a genotipagem nos animais para os códons 136, 154 e 171 da proteína PRP, e em alguns casos no códon 141. Foram realizadas três repetições da IHQ para cada amostra positiva para PrPSc. O diagnóstico por IHQ no tecido linforreticular foi considerado positivo quando o material apresentou um número de, no mínimo, três folículos linfoides com centros germinativos marcados pela técnica. Entre os resultados obtidos neste trabalho pode-se incluir o primeiro diagnóstico positivo para scrapie de genótipo resistente (ARR/ARR) não Nor98, na espécie ovina no Brasil, com marcação por IHQ nas tonsilas palatínicas, terceira pálpebra e mucosa reto-anal. Este animal era pertencente a um rebanho de ovinos mestiços Sufolk, no qual foram diagnosticados mais nove animais positivos para scrapie nas tonsilas palatínicas, terceira pálpebra e mucosas reto-anal. A coleta e envio de material de vários órgãos linfoides foi considerada importante por possibilitar a confirmação da presença ou não do agente em pelo menos dois deles, reduzindo o número de casos considerados suspeitos, o risco de falsos positivos, e parte, senão a totalidade, dos casos com material insuficiente para diagnóstico. Em necropsia, a coleta de tonsilas palatínicas mostrou-se eficaz pelo seu alto índice de marcação positiva. A coleta de amostras de sangue foi importante para a realização do teste de genotipagem, permitindo avaliar o grau de resistência/susceptibilidade do animal, complementando os resultados de IHQ. / Transmissible spongiform encephalopathies (TSEs), the prion diseases, occurs both in animals and in humans, are responsable for a transmissible and hereditary disease, and cause degenerative lesions in the brain tissue. The presence of an abnormal protein (PrPSc), instead of its normal form (PrPC), on the nervous and lymphoreticular tissue is characteristic of TSEs. This protein is highly insoluble and resistant to degradation by proteases and eventually settles in the gray matter in the form of amyloid plaques that causes massive death of neurons and glial cells, causing intense vacuolization in the affected tissue. After the establishment of the Bovine Spongiform Encephalopathy surveillance program, coordinated by the National Rabies and Other Encephalopathies Control Program, the Setor de Patologia Veterinária of UFRGS has been usually required to proceed necropsy and other diagnosis in suspicious animals. The immunohistochemistry (IHC) is the most specific technique actually used to TSEs identification, being increasingly used to diagnosis, traceability, pathogenesis study and providing comparative information on the molecular level. On the other hand, genotyping is an important tool on scrapie genetic susceptibility identification, making more secure the diagnosis, beyond to enable the atypical scrapie cases identification, like Nor98. This work consisted to performing IHC to prionic protein, on nervous system and lymphoreticular tissue, as scrapie diagnostic method in sheep and goat, associate to genotyping in sheep. Sheep tissues were sampled from Suffolk, Santa Inês, Dorper and crossbreed to proceed IHC and hematoxilin-eosin staining between 2009 and 2012. The samples were obtained by biopsy and necropsy to scrapie diagnose. Genotyping of codons 136, 154 and 171 of PRP protein was performed, as well as a few of codon 141. The monoclonal antibody anti-prion F98/160.1.5 and F99/97.6.1 was used at the IHC. For each positive sample three repetitions were performed. The diagnostic by IHC at lymphoreticular tissue was considered positive when it shows at minimum three follicles with germinal centers stained. Among the obteined results, could be included the first diagnostic of scrapie not Nor98 in resistant genotype (ARR/ARR) sheep in Brazil. This animal belongs to a Suffolk sheep flock in which were diagnosed more nine scrapie positive animals showing IHC staining on tonsils, third eyelid and rectal mucosa. The sampling and dispatch of many lymphoid tissues was considered important to enable the confirmation of agent presence or not in at least two of them, reducing the number of suspicious cases, the risk of false positive, and part, if not all, of cases with insufficient material for diagnosis. At necropsy, the tonsils collecting showed efficient by the it high positive staining level. Blood sampling becomes important to proceed genotyping test, allowing measure the animal resistance/susceptibility grade, complementing the IHC results.

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A utilização da terapia antiretroviral, atualmente mais amplamente acessível, implica na permanência da identificação da resistência viral e monitoramento da doença como itens importantes em adultos e pacientes pediátricos infectados pelo vírus da imunodeficiência humana tipo 1. Os principais marcadores da infecção por HIV-1, utilizados no monitoramento da infecção e curso da doença, são as contagens de células T CD4+ e a carga viral. Ambos são úteis como parâmetros indicadores para o início da terapia e na avaliação de sua eficácia. Além disto, a sua associação a testes de genotipagem para a identificação de mutações de resistência viral, pode auxiliar na indicação da conduta clínica mais adequada. No presente estudo, analisamos os valores da carga viral e taxas de linfócitos T CD4+ e CD8+ na avaliação do status imunológico de 25 crianças com indicação para a terapia antiretroviral, condicionando o regime terapêutico aos resultados do teste de genotipagem. A identificação dos subtipos virais foi feita por análise filogenética e a genotipagem incluiu a análise dos genes protease e transcriptase reversa do HIV-1. Dezoito amostras foram agrupadas no subtipo viral B e três no subtipo F1; cepas recombinantes também foram observadas, sendo uma BF, duas BD e uma DF. Dezoito crianças apresentaram mutações conferindo resistência viral aos inibidores da transcriptase reversa análogos de nucleosídeo e sete crianças apresentaram resistência aos inibidores não-análogos, com seis relatando resistência a nevirapina, delavirdina e efavirenz. Além disto, duas crianças, nas quais a terapia havia sido descontinuada dois a três anos antes da avaliação do teste de genotipagem, apresentaram as mutações K101E, K103N e G190A, conferindo resistência às três drogas. As mutações mais frequentes para o gene da transcriptase reversa foram observadas nos codons M41L, M184V e T215FY. Entretanto, dez crianças apresentaram relevante número de mutações de resistência viral, variando entre cinco a dez, que conferiram resistência a no mínimo quatro e até onze drogas antiretrovirais. Para o gene da protease, as mutações de resistência mais comuns foram observadas nos codons M46I, D30N e I54LV. Treze crianças apresentaram resistência viral a, no mínimo, duas e até 12 drogas. A adequação da terapia antiretroviral altamente potente (HAART), de acordo com o padrão de resistência viral, permitiu observar aumento dos valores de células T CD4+ em 12 dos 25 pacientes pediátricos, demonstrando melhoria na sua condição de imunodeficiência associada ao HIV. Decréscimos importantes da carga viral foram observados em 17 crianças, com níveis indetectáveis de RNA HIV alcançados em 13 delas, sendo 11 com linhagens virais resistentes a múltiplas drogas. O desenvolvimento de linhagens virais resistentes é uma das principais razões da falha terapêutica. Mesmo considerando outros fatores causais, tais como aderência, metabolismo e níveis adequados das drogas, a identificação do perfil de resistência viral é um importante fator na conduta para a adequação de esquemas terapêuticos, dando suporte ao uso racional das drogas antiretrovirais em programas de tratamento. / With antiretroviral therapy becoming more widely available nowadays, Human Immunodeficiency Virus type 1 resistance identification and monitoring of disease remains of great importance in adults and infected children. The major HIV-1 infection markers usually used for monitoring viral infection and disease course are CD4+ T cell counts or percentages and HIV viral load. Both of them are helpful indicating when to start therapy and evaluating its efficacy. Also, their association with genotyping tests to identify viral resistant mutations may help clinicians for the most adequate clinical conduct. In the present study, we assessed HIV-1 viral load and CD4+ and CD8+ T lymphocyte rates for the immunological status evaluation of 25 antiretroviral-treated children managing therapeutic regimens according to genotyping test results. Drug resistance evaluation was done using genotyping covering protease and reverse transcriptase genes. Additionally, all of the 25 vertically HIV-1 infected children were assessed for viral subtyping throughout phylogenetic analysis. Eighteen samples clustered at B subtype and three clustered at F1 subtype; one BF, two BD and one DF recombinant strains were also observed. Eighteen children presented, at least, one mutation conferring resistance to the nucleoside reverse transcriptase inhibitors, and seven children presented resistance to the non-nucleoside inhibitors, with six resistant to all three drugs, nevirapine, delavirdine, and efavirenz. In addition, two children in whom the therapy had been discontinued two to three years before testing presented K101E, K103N, and G190A mutations conferring resistance to the all three drugs. Reverse transcriptase gene mutations were more frequently observed at codons M41L, M184V, and T215FY. However, ten children presented an important number of viral resistance mutations, ranging from five to ten mutations, conferring resistance to at least four to up to eleven antiretroviral drugs. Protease gene mutations were more frequently seen at codons M46I, D30N, and I54LV. Thirteen children presented viral resistance to at least two to up to twelve drugs. The management of the highly active antiretroviral therapy (HAART) according to viral resistance in our group of pediatric patients allowed an increase in CD4+ T cell counts and/or percentage in 12 of the 25 children, showing an improvement in their HIV-associated immunodeficiency status. Important viral burden declines were observed in 17 children, and HIV RNA undetectable levels were reached in 13 of them. Among these 17 children, 11 were multi-drug resistant. The development of resistant viral strains is one of the main reasons for failure of antiretroviral therapy. Even considering other causal factors such as compliance of the patient, metabolism of drugs and drug levels, viral resistance profile identification is an important factor in the management of therapeutic regimens, supporting the rational use of antiretroviral drugs by treatment programs.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / As espécies do gênero Acinetobacter são freqüentes no ambiente, mas nas últimas décadas vêm se destacando como patógenos hospitalares, especialmente Acinetobacter baumannii e as genoespécies 3 e 13TU, que formam o Complexo A. baumannii e cuja diferenciação só é possível pela utilização de metodologias moleculares. São associadas a diferentes apresentações clínicas, principalmente em pacientes internados em unidades de tratamento intensivo. Freqüentemente apresentam resistência a uma ampla variedade de antimicrobianos, incluindo os carbapenêmicos. Nestes casos as opções de tratamento podem, algumas vezes, limitar-se à polimixina. Esse trabalho objetivou avaliar a susceptibilidade a antimicrobianos, a diversidade genética e a dinâmica de colonização de Acinetobacter spp. isolados de pacientes internados no Centro de Tratamento Intensivo do Hospital Universitário Pedro Ernesto em um ano de estudo. Durante o ano de 2009 foram estudadas 76 amostras de Acinetobacter spp. isoladas de 34 pacientes, sendo a maioria obtida do trato respiratório (42,1 %), seguido de sangue (19,7%). Do total, 96,1% (73) foram identificadas como A. baumannii através da detecção do gene intrínseco blaOXA-51-like. Todas as amostras de A. baumannii foram produtoras da carbapenemase OXA-23 e apresentaram perfil de multirresistência, enquanto as três espécies não-baumannii foram sensíveis a todos os antimicrobianos testados. Não houve produto de amplificação para os genes blaOXA-24-like, blaOXA-58-like e blaOXA-143 pela técnica de PCR multiplex. As amostras apresentaram taxa de resistência maior que 70% para oito dos onze antimicrobianos testados: piperacilina-tazobactam, ceftazidima, cefotaxima, cefepime, amicacina, ciprofloxacina, imipenem e meropenem. A droga com melhor atividade in vitro foi a polimixina B. Quatro amostras foram resistentes com CIM determinada pelo E-test variando de 6 g/mL a 32 g/mL. Observou-se uma grande diversidade genética dentre as amostras, com dez grupos clonais identificados pelo PFGE. O grupo clonal B foi prevalente e persistente na unidade, representado por 32 (42,1%) amostras. Esse foi o mesmo clone descrito como o mais freqüente no Rio de Janeiro em estudo prévio. O clone associado a um surto ocorrido na mesma instituição entre 2007 e 2008 esteve presente em apenas sete (9,2%) amostras, tendo sido substituído pelo genótipo B. A análise prospectiva dos pacientes que permaneceram internados por pelo menos um mês mostrou casos de substituição clonal após terapia antimicrobiana, indicando a existência de reservatório ambiental dos genótipos circulantes. A colonização do trato respiratório por A. baumannii foi bastante comum, mas também foram observados casos de substituição de uma espécie não-baumannii por A. baumannii, além de infecção de corrente sanguínea por um genótipo diferente daquele responsável pela colonização. A presença de cepas resistentes à polimixina é preocupante, pois representa uma ameaça à terapia com a droga. A existência de um clone multirresistente disseminado no Rio de Janeiro, possivelmente pela transferência de pacientes e por profissionais que trabalham em mais de um hospital, aponta a necessidade de se adotar medidas de controle de infecção mais eficazes a fim de reduzir as taxas de morbidade e mortalidade. Além disso, a identificação de focos ambientais de dispersão das cepas epidêmicas parece essencial para garantir a eficácia das demais medidas de contenção de surtos / The species of the genus Acinetobacter are common in the environment, but in recent decades have gained prominence as nosocomial pathogens, especially Acinetobacter baumannii and genospecies 3 and 13TU, which form the A. baumannii Complex and whose differentiation is only possible by the use of molecular methodologies. They are associated with different clinical presentations, mainly in patients hospitalized in intensive care units. Often exhibit resistance to a wide range of antimicrobials, including carbapenems. In these cases, treatment options may sometimes be restricted to polymyxin. This study aimed to evaluate the antimicrobial susceptibility, genetic diversity and colonization dynamics of Acinetobacter spp. isolated from patients hospitalized in the Intensive Care Unit of Hospital Universitário Pedro Ernesto in a year of study. During 2009, 76 strains of Acinetobacter spp. isolated from 34 patients were studied, most of them obtained from the respiratory tract (42.1%), followed by blood (19.7%). Of the total, 96.1% (73) were identified as A. baumannii by detection of the intrinsic gene blaOXA-51-like. All strains of A. baumannii were OXA-23 carbapenemase producers and showed a multiresistant profile, whereas the three non-baumannii species were susceptible to all antimicrobials tested. There were no amplification products for the genes blaOXA-24-like, blaOXA-58-like and blaOXA-143 by multiplex PCR. The islates showed resistance rates greater than 70% for eight of eleven antimicrobials: piperacillin-tazobactam, ceftazidime, cefotaxime, cefepime, amikacin, ciprofloxacin, imipenem and meropenem. The drug with the highest activity in vitro was polymyxin B. Four strains were resistant with MICs determined by E-test ranging from 6 &#61549;g/mL to 32 &#61549;g/mL. A great genetic diversity was observed among the isolates, with ten clonal groups identified by PFGE. The clonal group B was prevalent and persistent in the unit, represented by 32 (42.1%) isolates. This was the same clone described as the most frequent in Rio de Janeiro in a previous study. The clone associated with an outbreak in the same institution between 2007 and 2008 was found in only seven (9.2%) isolates, having been replaced by genotype B. A prospective analysis of patients who were admitted for at least one month showed cases of clonal substitution after antimicrobial therapy, indicating the existence of environmental reservoir of circulating genotypes. Respiratory tract colonization by A. baumannii was quite common, but there were also cases of replacement of a non-baumannii species by A.baumannii, and bloodstream infection by a genotype different from that responsible for colonization. The presence of polymyxin-resistant strains is worrisome as it represents a threat to the therapy with this drug. The existence of a multiresistant clone widespread in Rio de Janeiro, possibly due to the transfer of patients and to sharing of common healthcare staff, points out the need to adopt more effective infection control measures in order to reduce the morbidity and mortality. In addition, the identification of epidemic strains environmental dispersion sources seems essential to ensure the efficiency of other outbreaks contention measures

The knowledge of the variability of antigens of blood groups is essential in the transfusional practice, mainly to avoid grave alloimmunizations. This study had as objective to evaluate the prevalence of the phenotypes from the blood donors from Santa Maria´s Blood Center. These donors were evaluated for the mainly antigens of ABO, Rh and Kell systems. About the phenotyped samples with Rh system, 1274 samples (54.18%) were phenotyped as positives Rh and 1077 samples (45.82%) phenotyped as negative Rh. From the phenotyped donors as negatives Rh, 103 samples (9.5%) were positives for the ―C‖ or ―E‖ antigen. Relating the percentage of the Kell system positive in donors with negative Rh, was gotten 8.3%. We concluded that the negative Rh donor must be analyzed for other antigens of Rh system and for the Kell antigen, exactly being less immunogenics, these antigens are able to cause Grave Hemolytic Disease and Alloimmunizations. The D antigen Phenotypic expression may vary due to changes qualitative/quantitative: weak D, partial D. This study analyzed a sample of donors by genotyping to identify the most common D variants in this region was found (44%) weak D, (3%) and partial D. Strengthens thus the importance of established protocols for use of rare blood and ensure the proper use of blood products, as well as the safety of blood transfusion. / O conhecimento da variabilidade dos antígenos de grupos sanguíneos é essencial na prática transfusional, principalmente para evitar aloimunizações graves. Assim, este estudo teve como objetivo avaliar a prevalência dos fenótipos dos doadores de sangue do Hemocentro de Santa Maria, os quais foram avaliados para os principais antígenos dos sistemas ABO, Rh e Kell. Das amostras fenotipadas quanto ao sistema Rh, 1274 amostras (54.18%) foram fenotipadas como Rh positivos e 1077 amostras (45,82%) fenotipadas como Rh negativo. Dos doadores fenotipados como Rh negativos, 103 amostras (9,5%) foram positivas para o antígeno ―C‖ e/ou ―E‖. Relacionando o percentual do sistema Kell positivo em doadores Rh negativos foi de 8,3%. Conclui-se, então, que o doador Rh negativo deve ser analisado para os demais antígenos do sistema Rh e para o antígeno Kell, pois, mesmo sendo menos imunogênicos, estes antígenos são capazes de causar doença hemolítica graves e aloimunizações. O antígeno D pode variar de expressão fenotípica, devido a alterações qualitativas/quantitativas: D fraco, D parcial. Este trabalho analisou uma amostragem de doadores, através de genotipagem para identificar quais as variantes de D mais freqüentes nesta região, foi encontrado (44%) D fraco, (3%) D parcial. Reforça, dessa forma, a importância de ser estabelecidos protocolos para utilização destes sangues raros e garantir o uso correto destes hemocomponentes, assim como a segurança transfusional.