As manifestações bucais da AIDS têm sido relacionadas a diversas características clínicas da infecção pelo HIV como decréscimo de células T CD4+, aumento de carga viral e falha terapêutica, entre outras. Os avanços recentes da medicina mostram que a falha terapêutica, nesses pacientes, está diretamente vinculada a mutações na transcriptase reversa (TR) e na protease (PR). O objetivo deste estudo foi descrever, em pacientes HIV+ apresentando falha terapêutica, o perfil de mutações do vírus e o perfil de resistência a antirretrovirais, e correlacioná-los as manifestações bucais da imunodeficiência. Foram acessados prontuários, laudos de genotipagem e informações de bancos de dados digitais de pacientes com AIDS, que se submeteram a genotipagem no Centro de Referência e Treinamento em Doenças Sexualmente Transmissíveis e AIDS (CRT-DST/AIDS), entre 2003 e 2010. Os dados foram transferidos para o Epiinfo, onde foi construído um banco de dados informatizado para posterior análise estatística. O evento lesões orais foi escolhido como variável dependente. Calculou-se o odds ratio para cada variável independente, utilizando intervalo de confiança de 95%. Foram cruzados dados sobre mutações encontradas no vírus e resistência às medicações com a presença e tipo de manifestações bucais. O teste de Bartlett foi utilizado para testar a normalidade dos dados. Para variáveis sem distribuição normal foram aplicados os testes de Mann-Whitney ou Kruskal-Wallis. Para comparação entre frequências e proporções, foi utilizado o Teste de Exato de Fisher ou o Qui quadrado. O nível de significância foi estabelecido como 0,05 ou 5%. A análise de características sociocomportamentais e clínico laboratoriais permitiu verificar que a presença de lesões orais pode ser relacionada estatisticamente a baixas taxas de CD4 (p<0,05), faixa de carga viral (p=0,048) e ao uso prévio de mais de cinco esquemas antirretrovirais diferentes (p=0,021). Verificou-se maior prevalência de lesões virais (75%) e bacterianas (66,7%) do que de lesões fúngicas (37,3%) apenas em pacientes que apresentavam resistência a inibidores de protease (IP) (p=0,02). Foram encontradas 146 mutações diferentes nos pacientes que apresentavam lesões orais, dentre essas, quatro (101E, 20T, 188L, 93L) apresentaram correlação negativa com a presença de lesões orais (respectivamente, p=0,01, p=0,01, p=0,03, p=0,03) e oito (215Y, 118I, 20R, 44D, 71I, 82I E 84V) apresentaram correlação positiva (respectivamente p=0,04, p=0,05, p=0,03, p=0,01, p=0,01, p=0,04, p=0,0004). Subsequentemente, as mutações que apresentaram correlação positiva com a presença de lesões orais foram avaliadas para verificar se sua presença estaria realmente associada a resistência aos ARVs (aos quais seriam supostamente resistentes). Foram excluídas dessa avaliação as mutações 71I e 82I, por apresentarem uma quantidade extremamente pequena de ocorrências. Todas as mutações apresentaram correlação estatística positiva para a resistência aos respectivos antirretrovirais (p<0,05). Em pacientes HIV+, que apresentavam falha terapêutica e manifestações bucais, foram identificadas as mutações 84V e 20R na PR e as mutações 215Y, 44D e 118I na TR e a presença dessas mutações foi associada a resistência a inibidores de protease e inibidores de transcriptase reversa nucleosídeos, respectivamente. / Oral manifestation of AIDS have been associated with several clinical characteristics of HIV infection such as reduction in T CD4+ cells, increase in viral load and treatment failure, among others. Recent advances have shown that treatment failure in these patients is directly linked to mutations in reverse transcriptases (RT) and in proteases (PR). The objective of the present study was to describe the profile of virus mutations and of resistance to antiretroviral drugs in HIV+ patients in treatment failure, and to correlate mutations to the oral manifestations of the immunodeficiency. Patient charts, genotyping results and information from digital databases of AIDS patients, who underwent genotyping at the Sexually Transmissible Diseases and AIDS Training and Reference Center (CRT-DST/AIDS) between 2003 and 2010, were accessed. Data were transferred to the Epiinfo program, in which a computerized database was built for statistical analysis. The event oral lesions was chosen as a dependent variable. Odds ratio for each independent variable was calculated, using a 95% confidence interval. Data found on virus mutations and drug resistance was analyzed to check for correlation with presence and type of oral manifestations. The Bartlett test was used to test normality of data. Mann-Whitney or Kruskal-Wallis tests were used for variables without a normal distribution. The Fisher Exact or Chi-square Tests were used to compare frequencies and proportions. A 0.05 or 5% significance level was established. The analysis of socio-behavioral and clinical-laboratorial characteristics allowed concluding that the presence of oral lesions may be related to statistically low CD4 rates (p<0.05), viral load range (p=0.048) and previous use of more than five different antiretroviral regimens (p=0.021). A higher prevalence of viral (75%) and bacterial (66.7%) lesions in relation to fungal lesions (37.3%) was observed only in patients who were resistant to protease inhibitors (PI) (p=0.02). We found 146 different mutations in patients with oral lesions, among which, four (101E, 20T, 188L, 93L) with a negative correlation with the presence of oral lesions (p=0.01, p=0.01, p=0.03, p=0.03, respectively) and eight (215Y, 118I, 20R, 44D, 71I, 82I E 84V) with a positive correlation (p=0.04, p=0.05, p=0.03, p=0.01, p=0.01, p=0.04, p=0.0004, respectively). Subsequently, mutations with a positive correlation with the presence of oral lesions were assessed to check if their presence would really be associated with resistance to ARVs (to which they supposedly would be resistant to). Mutations 71I and 82I were excluded from this assessment because they had an extremely low frequency. All mutations had a statistically positive correlation for resistance to their respective antiretroviral drugs (p<0.05). Mutations 84V and 20R were identified in PR, and mutations 215Y, 44D and 118I in TR of HIV+ in patients undergoing treatment failure and presenting oral manifestations. Moreover, the presence of these mutations was associated with resistance to protease inhibitors and to nucleoside reverse transcriptase inhibitors, respectively.

As doenças causadas por patógenos emergentes e oportunistas são uma grande preocupação para os profissionais de Saúde Pública. A criptosporidiose é uma doença cosmopolita, cujo agente etiológico é o protozoário coccídia Cryptosporidium. Este parasita emergiu como um importante patógeno de veiculação hídrica, responsável por surtos em diferentes países e atualmente é considerado um problema para indivíduos imunocomprometidos e imunocompetentes. A taxonomia do gênero, baseada em aspectos morfológicos, é de difícil realização devido ao reduzido tamanho dos oocistos e também devido à perda de suas características morfológicas, principalmente em amostras ambientais. Essa limitação estimulou a aplicação de métodos moleculares na identificação das espécies destes microrganismos. Neste estudo, amostras de águas superficiais foram submetidas à ested-PCR para detecção de Cryptosporidium. No total 30 amostras de águas de 10 pontos de coleta situados no estado de São Paulo foram analisadas. Cryptosporidium foi detectado em 30% das amostras analisadas e a genotipagem permitiu a identificação de C. hominis, C. meleagridis e C. andersoni. Embora a identificação de Cryptosporidium em amostras ambientais seja uma tarefa complexa, os métodos moleculares são essenciais para determinação de espécies, ajudando a elucidar a epidemiologia deste protozoário em nosso país. / The illnesses caused by emerging and opportunist pathogens are a great concern for Public Health professionals. Criptosporidiosis is a cosmopolitan disease, whose etiologic agent is the coccidian protozoan Cryptosporidium. This parasite has emerged as an important waterborne pathogen, responsible for outbreaks in different countries, and it is currently considered a problem for immunocompromised and immunocompetent patients. The taxonomy of the genus, based on morphologic aspects, is of difficult accomplishment due to the small size of the oocysts, and also due to loss of its characteristics, mainly in environmental samples. This limitation has estimulated the application of molecular methods for species identification of these microorganisms. In this study, superficial water samples were submitted to nested-PCR to detect the presence of Cryptosporidium. A total of 30 water samples, from 10 points located in the state of São Paulo, were analyzed. Cryptosporidium was detected in 30% of the studied samples and genotyping allowed the identification of C. hominis, C. meleagridis and C. andersoni. Although the identification of Cryptosporidium in environmental samples is a complex task, molecular methods are essential for the species determination, helping to elucidate the epidemiology of this protozoan in our country.

Introdução - Giardia é um protozoário que parasita o intestino de quase todas as classes de vertebrados, podendo causar giardíase. Dentre os sete agrupamentos da espécie G. duodenalis, nomeados de A a G, apenas A e B foram encontrados no homem. Por se tratar de um patógeno de veiculação hídrica, a pesquisa de cistos desse microorganismo em água e esgoto é de interesse para a saúde pública. Uma vez que os métodos convencionais utilizados para a detecção desse protozoário em amostras ambientais não permitem diferenciar os isolados de Giardia potencialmente patogênicos para o homem dos demais, o emprego de técnicas que possibilitam a caracterização molecular do parasita em questão se torna necessário, principalmente no Brasil, onde as informações sobre os genótipos de Giardia do ambiente são escassas. Objetivos - Detectar a presença e identificar os genótipos de Giardia sp. em amostras de água e esgoto provenientes do estado de São Paulo, discutindo a importância dos achados para a saúde pública, bem como elaborar uma estratégia que possibilite a realização de tal proposta. Método - Amostras de esgoto bruto (5) e tratado (6), de águas superficiais (11), de poço (3) e de nascente (1) foram coletadas e concentradas pela técnica de membrana filtrante modificada ou por centrifugação. O DNA genômico foi extraído pelo método de fenol/clorofórmio/álcool-isoamílico. A amplificação do fragmento de 890pb do gene gdh, que codifica a produção de glutamato desidrogenase, foi realizada por nested PCR, seguida por clonagem e seqüenciamento de nucleotídeos. Resultados - Onze dentre as vinte e seis amostras analisadas (42,3por cento) foram confirmadas como sendo positivas para a presença de Giardia duodenalis. Os agrupamentos A, genótipo AII, e B foram encontrados. Conclusão - Esses achados indicam que, no estado de São Paulo, isolados de Giardia associados a giardíase humana estão presentes em esgoto tratado e em água superficial e de poço, de modo que o contato com esse tipo de matriz pode representar risco para a saúde pública. Além disso, a estratégia proposta possibilita a caracterização molecular de isolados de Giardia de amostras de água e esgoto. / Introduction - Giardia is a protozoan that parasitizes almost all classes of vertebrates, causing giardiasis. Among the seven assemblages of G. duodenalis, named A to G, only A and B have been found in humans by this moment. As considered a waterborne pathogen, the detection of cysts in water and sewage samples is of interest for public health. Once conventional methods are not able to distinguish Assemblages A and B of G. duodenalis from others, the application of techniques that allow a molecular characterization of Giardia isolates is an important issue, especially in Brazil, where there is scarce information about the genotypes of this parasite in the environment. Objective - To detect and identify Giardia genotypes in water and sewage samples from São Paulo state, discussing the importance of findings for public health, as well as develop a strategy that makes it possible. Method - Raw (5) and treated (6) sewage, surface (11), well (3) and spring (1) water samples were collected and concentrated by modified membrane filtration technique or centrifugation. Genomic DNA was extracted using phenol/chloroform/isoamilic alcohol method. A 890bp fragment of gdh gene, that codes the glutamate dehydrogenase production, was amplified by nested PCR. Cloning and sequencing were subsequently done. Results - 11 out of 26 (42,3 per cent) samples were confirmed to be positive for the presence of G. duodenalis. Assemblages A, genotype AII, and B were found. Conclusions - These findings indicate that, in São Paulo state, Giardia isolates associated to human giardiasis are present in treated sewage and in surface and well water. Thereby, the contact with these matrices can offer risk for public health. Besides, the approach described here allows the molecular characterization of Giardia isolates from water and sewage samples.

Canine brucellosis is a zoonotic disease, caused by Brucella canis, which is the main cause of abortion and infertility in dogs. This study had the objective to investigate a B. canis outbreak in a breeding kennel, to describe a multistep approach to characterize the B. canis isolates obtained, and to identify B. canis proteins specifically reacting with antibodies from naturally infected dogs. The kennel was located in São Paulo, SP, Brazil. At the time of sampling, in 2014, the kennel comprised 17 adult Pug dogs. Blood samples were used both to isolate the bacteria and to detect Brucella spp. DNA by the polymerase chain reaction. Serum samples were used to detect antibodies against B. canis using an immunocromatographic test, the rapid slide agglutination test with or without 2-mercaptoethanol and two ELISA kits. The Brucella isolates were characterized through the classical bacteriological tests, mass spectrometry and whole genome sequencing. The total protein content of Brucella isolates was extracted and separated using one and two-dimension polyacrylamide gel electrophoresis (1D and 2D, respectively), and then tested against sera collected from bacteremic, non-bacteremic and non-B. canis infected dogs using western immunoblotting. The reacting protein spots were identified using matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS). Vaginal discharge, abortion, stillbirth, conception failure and general lymphadenopathy were the clinical signs found in the infected dogs. Gram-negative, coccoid rod-shaped bacteria were isolated from 24 blood samples. Antibodies against B. canis were detected in all dogs at least once by the performed serological tests. Mass spectrometry analysis assigned all isolates to the genus Brucella. The phenotypic data clearly identified the isolates as B. canis with only slight differences in phage typing patterns. The 2D separated protein spots were identified by MALDI-TOF MS as 93 different proteins, out of them, 19 were identified in infected dogs (during the bacteremic and non-bacteremic phases of the infection) and were not identified in non-infected dogs. These proteins have the potential to be used as antigens in serological tests in an attempt to improve the diagnosis of the infection, since a reliable diagnosis is an essential measure for the control and prevention of canine brucellosis. The multistep approach using classical microbiological methods, mass spectrometry and whole genome sequencing allowed the characterization of the B. canis with high discriminatory power, which may be useful for outbreak investigations. / A brucelose canina é uma doença zoonótica, causada pela Brucella canis, que é uma das principais causas de abortamentos e infertilidade em cães. O objetivo deste estudo foi investigar um surto de B. canis em um canil, caracterizar os isolados de Brucella obtidos e identificar proteínas de B. canis reagentes especificamente a anticorpos de cães naturalmente infectados. O canil é localizado em São Paulo, SP, Brasil e no momento da amostragem, em 2014, o canil era composto por 17 cães adultos da raça Pug. Amostras de sangue foram utilizadas tanto para isolar as bactérias quanto para detectar o DNA de Brucella spp. pela reação em cadeia pela polimerase. Amostras de soro foram utilizadas para detectar anticorpos contra B. canis nos soros dos cães, utilizando um teste imunocromatográfico, o teste de soroaglutinação rápida em placa com ou sem 2-mercaptoetanol e dois kits de ELISA. Os isolados foram caracterizados pelos métodos bacteriológicos clássicos, espectrometria de massa e pelo sequenciamento do genoma completo. O conteúdo proteico total dos isolados de B. canis foi extraído e as proteínas separadas por eletroforese em gel de poliacrilamida de uma e duas dimensões (1D e 2D, respeectivamente), sendo então testadas frente aos soros dos cães infectados (com ou sem bacteremia) e não infectados, utilizando Western Immunoblotting. Os spots proteicos reagentes foram identificados usando espectrometria de massa por ionização/dessorção a laser assistida por matriz (MALDI-TOF MS). Secreção vaginal, aborto, natimorto, falha na concepção e linfoadenopatia foram os sinais clínicos observados nos cães infectados. Coco-bacilos gram-negativos foram isolados em 24 amostras de sangue. Anticorpos contra B. canis foram observadas em todos os cães, em pelo menos uma amostragem, pelos testes sorológicos empregados. A MS atribuiu todos os isolados ao gênero Brucella. Os dados fenotípicos identificaram claramente B. canis com apenas pequenas diferenças nos padrões de lise por fagos. Os spots de proteínas, separados por 2D, foram identificados por MALDI-TOF MS como 93 diferentes proteínas, dentre elas, 19 foram identificadas em cães infectados (com ou sem bacteremia) e não foram identificadas nos cães não infectados. Tais proteínas são candidatas a serem utilizadas como antígenos para o aprimoramento do sorodiagnóstico, uma vez que a existência de um diagnóstico confiável constitui uma medida essencial para o controle e a prevenção da brucelose canina. A abordagem múltipla utilizada, envolvendo métodos microbiológicos clássicos, espectrometria de massa e sequenciamento completo do genoma bacteriano possibilitou a caracterização dos isolados de B. canis com elevado poder discriminatório, o que pode auxiliar em investigações de surtos.

Submitted by Celso Magalhaes (celsomagalhaes@ufrrj.br) on 2017-08-08T14:42:16Z No. of bitstreams: 1 2016 - Rebecca Barbosa Silva.pdf: 755345 bytes, checksum: 51b2e7f47c9cc4e8177521a6ed62a89d (MD5) / Made available in DSpace on 2017-08-08T14:42:16Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2016 - Rebecca Barbosa Silva.pdf: 755345 bytes, checksum: 51b2e7f47c9cc4e8177521a6ed62a89d (MD5) Previous issue date: 2016-03-04 / Coordena??o de Aperfei?oamento de Pessoal de N?vel Superior - CAPES / Molecular markers are important tools in the marker assisted selection programs (MAS). Leptin is expressed hormone mainly in the adipocytes and involved in the regulation of energy metabolism, fat deposition, regulation of glycemia and reproductive physiology and thus has been investigated in association studies quality carcass characteristics and meat in different species. Objective with this work identify the polymorphism in the Leptin gene, changes in qualitative and quantitative characteristics of meat and goat carcass and relate variations of productive features to potential polymorphisms. They were used for genotyping 38 goats intact males, 21 Saanen and 17 crusaders Boer x Saanen. Genotypes for the marker were identified by PCR-RFLP technique based on standardized protocols for SNP305. DNA samples were isolated from leukocyte genomic and amplified through reaction technique Polymerase Chain Reaction (PCR). The generated PCR fragments of 94 base pairs (bp) were digested by Kpn2I enzyme yielding two fragments 75 (bp), 19 (bp) for all individuals analyzed, obtaining allelic frequency of 100% for T. Thus genotype, it was not possible to correlate the results obtained in the evaluation of quality meat and carcass to the results of the molecular study. For the evaluation of carcass quality and meat was used 18 male, 9 Saanen and Saanen x 9 crusaders Boer. t test was used for independent samples of the statistical program BioEstat the 5% significance (P<0.05) for morphometric measurements, live weight, live weight after fasting, hot carcass weight, cold carcass weight, cooling breaks, carcass yield, loss of cooling, thick fat cover, color, pH, water holding capacity and tenderness of the meat, weight and yield cuts (shoulder, hand saw, rib set, ham and loin) and compactness index of carcass. The grouping of the Crusaders animals showed significant differences (P<0.05) for wide shank and shear force. For Saanen animals, there was a significant difference (P<0.05) for the external length of the housing. Although Crossed have shown higher shear strength values (P<0.05), the two groups had average below 5.4 kg-f cm-?, featuring soft meats in goats (2.20 and 1, 57 kg f cm-2 for Crossed and Saanen, respectively). The results showed that the use of both the Crusaders animals, as the Saanen animals are a viable option for dairy farmers who wish to diversify their activities, taking advantage of the disposal of male goats for meat production / Os marcadores moleculares s?o importantes ferramentas nos programas de sele??o assistida por marcadores (MAS). A Leptina ? um horm?nio expresso principalmente nos adip?citos e est? envolvido na regula??o do metabolismo energ?tico, deposi??o de gordura, regula??o da glicemia e fisiologia reprodutiva e por isso tem sido investigado em estudos de associa??o a caracter?sticas de qualidade de carca?a e carne em diferentes esp?cies. Objetiva-se com este trabalho identificar o polimorfismo no gene da Leptina, as varia??es nas caracter?sticas qualitativas e quantitativas da carne e da carca?a de caprinos e relacionar as varia??es das caracter?sticas produtivas a poss?veis polimorfismos. Foram utilizados para a genotipagem 38 cabritos machos inteiros, sendo 21 Saanen e 17 Cruzados Saanen x Boer. Os gen?tipos para o marcador foram identificados pela t?cnica de PCR-RFLP com base nos protocolos padronizados para o SNP305. Foram isoladas amostras de DNA gen?mico a partir de leuc?citos e amplificados por interm?dio da t?cnica de Rea??o em Cadeia de Polimerase (PCR). A PCR gerou fragmentos de 94 pares de bases (pb) que foram digeridos pela enzima Kpn2I, originando dois fragmentos de 75 (pb) e 19 (pb) para todos os indiv?duos analisados, obtendo frequ?ncia al?lica de 100% para o gen?tipo T. Dessa forma, n?o foi poss?vel correlacionar os resultados obtidos na avalia??o de qualidade de carne e carca?a aos resultados obtidos no estudo molecular. Para a avalia??o de qualidade de carca?a e carne foram utilizados 18 machos inteiros, 9 Saanen e 9 Cruzados Saanen x Boer. Foi aplicado o teste t para amostras independentes do programa estat?stico BioEstat a 5% de signific?ncia (P<0,05) para as medidas morfom?tricas, peso vivo, peso vivo ap?s jejum, peso de carca?a quente, peso de carca?a fria, quebra de resfriamento, rendimentos de carca?a, perda por resfriamento, espessura de gordura de cobertura, cor, pH, capacidade de reten??o de ?gua e maciez da carne, peso e rendimento de cortes (paleta, serrote, carr?, pernil e lombo) e ?ndice de compacidade da carca?a. O grupamento dos animais Cruzados apresentou diferen?as significativas (P<0,05) para largura de pernil e for?a de cisalhamento. Para os animais Saanen, houve diferen?a significativa (P<0,05) para o comprimento externo da carca?a. Embora os Cruzados tenham apresentado maiores valores de for?a de cisalhamento (P<0,05), os dois grupos obtiveram m?dias abaixo de 5,4 kg-f cm-2, o que caracteriza carnes macias em caprinos (2,20 e 1,57 kg-f cm-2 para Cruzados e Saanen, respectivamente). Os resultados mostraram que a utiliza??o tanto dos animais Cruzados, quanto dos animais Saanen s?o uma op??o vi?vel aos produtores de leite que desejam diversificar as atividades, aproveitando os cabritos machos de descarte para a produ??o de carne

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / As espécies do gênero Acinetobacter são freqüentes no ambiente, mas nas últimas décadas vêm se destacando como patógenos hospitalares, especialmente Acinetobacter baumannii e as genoespécies 3 e 13TU, que formam o Complexo A. baumannii e cuja diferenciação só é possível pela utilização de metodologias moleculares. São associadas a diferentes apresentações clínicas, principalmente em pacientes internados em unidades de tratamento intensivo. Freqüentemente apresentam resistência a uma ampla variedade de antimicrobianos, incluindo os carbapenêmicos. Nestes casos as opções de tratamento podem, algumas vezes, limitar-se à polimixina. Esse trabalho objetivou avaliar a susceptibilidade a antimicrobianos, a diversidade genética e a dinâmica de colonização de Acinetobacter spp. isolados de pacientes internados no Centro de Tratamento Intensivo do Hospital Universitário Pedro Ernesto em um ano de estudo. Durante o ano de 2009 foram estudadas 76 amostras de Acinetobacter spp. isoladas de 34 pacientes, sendo a maioria obtida do trato respiratório (42,1 %), seguido de sangue (19,7%). Do total, 96,1% (73) foram identificadas como A. baumannii através da detecção do gene intrínseco blaOXA-51-like. Todas as amostras de A. baumannii foram produtoras da carbapenemase OXA-23 e apresentaram perfil de multirresistência, enquanto as três espécies não-baumannii foram sensíveis a todos os antimicrobianos testados. Não houve produto de amplificação para os genes blaOXA-24-like, blaOXA-58-like e blaOXA-143 pela técnica de PCR multiplex. As amostras apresentaram taxa de resistência maior que 70% para oito dos onze antimicrobianos testados: piperacilina-tazobactam, ceftazidima, cefotaxima, cefepime, amicacina, ciprofloxacina, imipenem e meropenem. A droga com melhor atividade in vitro foi a polimixina B. Quatro amostras foram resistentes com CIM determinada pelo E-test variando de 6 g/mL a 32 g/mL. Observou-se uma grande diversidade genética dentre as amostras, com dez grupos clonais identificados pelo PFGE. O grupo clonal B foi prevalente e persistente na unidade, representado por 32 (42,1%) amostras. Esse foi o mesmo clone descrito como o mais freqüente no Rio de Janeiro em estudo prévio. O clone associado a um surto ocorrido na mesma instituição entre 2007 e 2008 esteve presente em apenas sete (9,2%) amostras, tendo sido substituído pelo genótipo B. A análise prospectiva dos pacientes que permaneceram internados por pelo menos um mês mostrou casos de substituição clonal após terapia antimicrobiana, indicando a existência de reservatório ambiental dos genótipos circulantes. A colonização do trato respiratório por A. baumannii foi bastante comum, mas também foram observados casos de substituição de uma espécie não-baumannii por A. baumannii, além de infecção de corrente sanguínea por um genótipo diferente daquele responsável pela colonização. A presença de cepas resistentes à polimixina é preocupante, pois representa uma ameaça à terapia com a droga. A existência de um clone multirresistente disseminado no Rio de Janeiro, possivelmente pela transferência de pacientes e por profissionais que trabalham em mais de um hospital, aponta a necessidade de se adotar medidas de controle de infecção mais eficazes a fim de reduzir as taxas de morbidade e mortalidade. Além disso, a identificação de focos ambientais de dispersão das cepas epidêmicas parece essencial para garantir a eficácia das demais medidas de contenção de surtos / The species of the genus Acinetobacter are common in the environment, but in recent decades have gained prominence as nosocomial pathogens, especially Acinetobacter baumannii and genospecies 3 and 13TU, which form the A. baumannii Complex and whose differentiation is only possible by the use of molecular methodologies. They are associated with different clinical presentations, mainly in patients hospitalized in intensive care units. Often exhibit resistance to a wide range of antimicrobials, including carbapenems. In these cases, treatment options may sometimes be restricted to polymyxin. This study aimed to evaluate the antimicrobial susceptibility, genetic diversity and colonization dynamics of Acinetobacter spp. isolated from patients hospitalized in the Intensive Care Unit of Hospital Universitário Pedro Ernesto in a year of study. During 2009, 76 strains of Acinetobacter spp. isolated from 34 patients were studied, most of them obtained from the respiratory tract (42.1%), followed by blood (19.7%). Of the total, 96.1% (73) were identified as A. baumannii by detection of the intrinsic gene blaOXA-51-like. All strains of A. baumannii were OXA-23 carbapenemase producers and showed a multiresistant profile, whereas the three non-baumannii species were susceptible to all antimicrobials tested. There were no amplification products for the genes blaOXA-24-like, blaOXA-58-like and blaOXA-143 by multiplex PCR. The islates showed resistance rates greater than 70% for eight of eleven antimicrobials: piperacillin-tazobactam, ceftazidime, cefotaxime, cefepime, amikacin, ciprofloxacin, imipenem and meropenem. The drug with the highest activity in vitro was polymyxin B. Four strains were resistant with MICs determined by E-test ranging from 6 &#61549;g/mL to 32 &#61549;g/mL. A great genetic diversity was observed among the isolates, with ten clonal groups identified by PFGE. The clonal group B was prevalent and persistent in the unit, represented by 32 (42.1%) isolates. This was the same clone described as the most frequent in Rio de Janeiro in a previous study. The clone associated with an outbreak in the same institution between 2007 and 2008 was found in only seven (9.2%) isolates, having been replaced by genotype B. A prospective analysis of patients who were admitted for at least one month showed cases of clonal substitution after antimicrobial therapy, indicating the existence of environmental reservoir of circulating genotypes. Respiratory tract colonization by A. baumannii was quite common, but there were also cases of replacement of a non-baumannii species by A.baumannii, and bloodstream infection by a genotype different from that responsible for colonization. The presence of polymyxin-resistant strains is worrisome as it represents a threat to the therapy with this drug. The existence of a multiresistant clone widespread in Rio de Janeiro, possibly due to the transfer of patients and to sharing of common healthcare staff, points out the need to adopt more effective infection control measures in order to reduce the morbidity and mortality. In addition, the identification of epidemic strains environmental dispersion sources seems essential to ensure the efficiency of other outbreaks contention measures

Existem diversos trabalhos publicados sobre a utilização de diferentes métodos imunológicos para diagnosticar infecções do trato respiratório causadas por vírus parainfluenza bovino tipo 3 (bPIV-3). Entretanto, é escassa a literatura sobre a utilização da técnica de isolamento viral. Até o presente momento não havia sido relatada a utilização da Transcrição Reversa - Reação em Cadeia da Polimerase (RT-PCR), na detecção de bPIV-3. O objetivo deste estudo foi contribuir para uma melhor caracterização dos bPIV-3 através do desenvolvimento de técnicas de RTPCR para a sua detecção. Utilizando-se uma amostra referência de bPIV-3 (SF-4) e uma amostra de bPIV-3 isolada no Rio Grande do Sul (amostra DIO) foram desenvolvidas técnicas de RT-PCR para a amplificação de diferentes regiões do gene da hemaglutinina-neuraminidase (HN). Após seqüenciamento parcial do gene HN e alinhamento das seqüências da amostra DIO, os resultados revelaram homologia de 99% em relação à amostra referência, 98% a 91% quando comparada com outras amostras de bPIV-3 previamente publicadas na rede e 79% a 80% quando comparada com as amostras de hPIV-3. Foi desenvolvida, também, uma técnica de RT-PCR para amplificação de parte do gene da HN do bPIV-3 e do hPIV-3. Nos experimentos de otimização, a técnica de RT-PCR, comparada com o isolamento viral, apresentou sensibilidade de 140 DICC50, boa especificidade e reprodutibilidade. Os resultados, após seqüenciamento da amostra de vírus bPIV-3 isolada no RS, apresentaram, grande homologia com os das amostras de bPIV-3 comparadas, especialmente a amostra referência. Os dados obtidos neste estudo mostraram que a RT-PCR desenvolvida para a detecção de PIV-3 foi capaz de amplificar um fragmento de 1009 bp do gene da HN de amostras de PIV-3 isoladas de bovinos e humanos, possibilitando a sua utilização em diagnóstico e em estudos epidemiológicos. / There are several published studies on the application of different immunological methods for diagnosis of respiratory infections caused by bovine type 3 Parainfluenza virus (bPIV-3). However, the literature on viral isolation procedure is very scarce. At present there is no report about the utilization of reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) for bPIV-3 detection. The aim of this study was to contribute to a better caracterization of bovine type 3 Parainfluenza virus by developing RT-PCR techniques to its detection. A reference sample (SF-4) and a sample of bPIV-3 isolated in Rio Grande do Sul (DIO sample) were used to develop RT-PCR techniques by amplification of different regions of hemagglutinin-neuraminidase gene (HN). After HN gene partial sequencing of DIO sample and sequence alignment, the results revealed 99% homology when compared to reference sample, 98% the 91% homology in relation to bPIV-3 samples previously published and 79% the 80% if compared to hPIV-3 samples. It was also developed a RT-PCR for amplification of a part of bPIV-3 and hPIV-3 NH gene. In optimization experiments, compared to viral isolation procedure, the RTPCR displayed a sensitivity of 140 DICC50, good specificity and reproductibility. Results after sequencing of bPIV-3 sample isolated in RS displayed strong homology with those of bPIV-3 tested samples, specially the reference sample. Data obtained in this study showed that the RT-PCR technique developed for PIV- 3 detection was able to amplify an 1009 bp HN gene fragment of bovine and human PIV-3 samples which enables its utilization in diagnostic and epidemiological studies.

p. 1-144 / Submitted by Santiago Fabio (fabio.ssantiago@hotmail.com) on 2013-04-29T19:12:41Z No. of bitstreams: 1 88888888888888888.pdf: 1991557 bytes, checksum: 935c5a8ee336f8e4a6dfcb35cfa69802 (MD5) / Approved for entry into archive by Maria Creuza Silva(mariakreuza@yahoo.com.br) on 2013-05-04T17:37:44Z (GMT) No. of bitstreams: 1 88888888888888888.pdf: 1991557 bytes, checksum: 935c5a8ee336f8e4a6dfcb35cfa69802 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-05-04T17:37:44Z (GMT). No. of bitstreams: 1 88888888888888888.pdf: 1991557 bytes, checksum: 935c5a8ee336f8e4a6dfcb35cfa69802 (MD5) Previous issue date: 2011 / A utilização de técnicas para genotipagem de Mycobacterium tuberculosis possibilita um melhor entendimento da dinâmica de transmissão da tuberculose. Entretanto, há carência de investigações com esta abordagem no município de Salvador (BA), a fim de elucidar aspectos relacionados à ocorrência e manutenção da doença. Foi realizado um estudo transversal de base populacional para caracterizar e descrever a distribuição espacial de cepas de M. tuberculosis isoladas de casos bacilíferos residentes no município entre agosto de 2008 e dezembro de 2009. A captação dos dados sóciodemográficos foi realizada com a aplicação de questionário e amostras clínicas foram coletadas para isolamento do M. tuberculosis e enotipagem por RFLP IS6110 e spoligotyping. Um total de 326 casos foi analisado e 70 isolados (23,3%) formaram 27 clusters, enquanto 230 (76,7%) apresentaram perfis únicos. Alguns casos em cluster apresentaram diagnósticos realizados em meses subseqüentes e muitos clusters foram compostos por residentes em bairros limítrofes ou próximos e nos mesmos distritos sanitários. O 9° DS Cabula/Beiru apresentou a maior proporção de casos em cluster (34%), com associação estatisticamente significante em residir neste DS e cluster (RP = 1,61; IC 95%: 1,03 – 2,52). Sete famílias de M. tuberculosis foram identificadas: LAM (50,6%), Haarlem (10,7%), T (8,6%), X (7,4%), U (4,6%), S (0,3%) e EAI (0,3%), 57 (17,5%) isolados não puderam ser classificadas em famílias utilizando a base de dados SpolDB4. Observou-se um padrão diversificado na distribuição dos perfis genéticos de M. tuberculosis nos DS de Salvador, com maior concentração de casos nos bairros periféricos da cidade. Os dados apresentam um panorama preliminar sendo de interesse para a compreensão da epidemiologia da tuberculose. Concluímos que em Salvador há predomínio de uma população geneticamente diversificada de M. tuberculosis com circulação diferencial dos perfis e famílias genéticas nos diferentes espaços, indicando transmissão ativa de determinados perfis em áreas específicas. Sugere-se a realização de análise espacial mais refinada, com a integração de metodologias e dados de genotipagem e georeferenciamento. / Salvador

Submitted by Ana Maria Fiscina Sampaio (fiscina@bahia.fiocruz.br) on 2013-10-15T19:41:49Z No. of bitstreams: 1 Erivelton 1 Oliveira Souza Caracterizaçao dos perfis...2012.pdf: 2501634 bytes, checksum: c5ec35828b8fce881d7f6a1ae0ff2b45 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-10-15T19:41:49Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Erivelton 1 Oliveira Souza Caracterizaçao dos perfis...2012.pdf: 2501634 bytes, checksum: c5ec35828b8fce881d7f6a1ae0ff2b45 (MD5) Previous issue date: 2012 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisas Gonçalo Moniz. Salvador, BA, Brasil / A resistência aos fármacos utilizados no tratamento da tuberculose (TB) é um importante desafio no combate à doença. A rifampicina e a isoniazida são dois fármacos de primeira linha essenciais para a cura da doença, a qual tem como agente o M. tuberculosis. Pacientes com TB cujos isolados de M. tuberculosis apresentem resistência in vitro simultânea a estes dois fármacos desenvolvem a TB multirresistente (TBMR). A resistência do M. tuberculosis está relacionada com mutações em genes importantes para a sobrevivência do bacilo. O tratamento da TBMR é mais longo e utiliza fármacos anti-TB de segunda linha, os quais são de maior toxicidade, predispondo os pacientes à não adesão aos esquemas de tratamento. O paciente com TBMR, quando não devidamente tratado, pode selecionar cepas resistentes aos fármacos anti-TB de segunda linha, proporcionando o surgimento da TB extensivamente resistente (TBXDR). Por sua vez, estas cepas podem ser transmitidas em comunidades, constituindo um grave problema de saúde pública. Segundo a Organização Mundial de Saúde, a TBXDR tem sido documentada em alguns países, mas no Brasil estes dados são escassos. A caracterização genética de cepas de M. tuberculosis envolvidas com os casos TBMR/TBXDR pode facilitar a identificação de vias de transmissão. OBJETIVO: Pesquisar casos de TBXDR na Bahia e caracterizar perfis genéticos de isolados de M. tuberculosis de pacientes com TB multirresistente, associando o perfil genético encontrado com as características sócio-demográficas e clínicas dos pacientes envolvidos. MATERIAIS E MÉTODOS: Isolados de M. tuberculosis obtidos de pacientes com diagnóstico de TBMR entre 2008-2011 residentes no Estado da Bahia (Brasil) foram submetidos ao teste de sensibilidade utilizando fármacos anti-TB de primeira e segunda linha e genotipados pela técnica do Número Variável de Repetições em Tandem de Unidades Repetitivas Inter-espaçadas Micobacterianas (MIRU-VNTR) para obtenção de perfis genéticos que foram associados com perfis da base de dados internacional MIRU-VNTRplus. Isolados com perfis genéticos não associáveis a linhagens com o uso desta técnica foram adicionalmente genotipados por Spoligotyping e ambas as informações foram consideradas para assimilação de linhagens utilizando esta mesma base de dados. Informações clínico-epidemiológicas foram obtidas do banco de dados “Sistema TBMR” do Ministério da Saúde. RESULTADOS: Foram analisados 392 isolados. Destes, 35% foram excluídos por ausência de crescimento ou contaminação e 12% constituíam amostras em duplicata, resultando em 206 pacientes com TBMR no estudo. Comprovou-se a ocorrência da TBXDR em 7% (14/206) dos pacientes; destes, dois não possuíam registro anterior para qualquer tratamento anti-TB. Os pacientes estudados foram provenientes de 45 municípios do Estado. A capital, Salvador, concentrou 71% dos casos TBMR e 76% dos TBXDR. Dos casos TBXDR, 36% (5/14) apresentaram isolados resistentes a todos os fármacos testados. Observou-se associação de resistência combinada entre estreptomicina e etambutol (8/14, 57%) e o perfil TBXDR (RP 4,0; IC95% 1,2-13,8; P=0,01). Dos casos TBXDR, 71% (10/14) desenvolveram uma ou mais comorbidades (P=0,04), sendo o transtorno mental uma comorbidade significativa neste grupo (21%; 3/14; P=0,04). Encontrou-se 56 perfis genéticos, 38 únicos e 18 agrupados em clusters (contendo de 2 a 11 isolados). Quase a totalidade (92%) dos casos TBXDR esteve agrupada em clusters, diferindo dos casos não-TBXDR (P=0,049). Os perfis genéticos estiveram principalmente associados a seis famílias: LAM (70%), Cameroon (16%), Haarlem (10%) e as famílias X, S, Uganda I, que combinadas perfizeram 4%. Os casos TBXDR foram representados pelas famílias LAM (45%, ST’s 376, ST42, ST20), Cameroon (36%, ST61 único) e Haarlem (18%, ST50). CONCLUSÕES: A Bahia apresentou casos de TBXDR e as famílias de M.tuberculosis envolvidas com estes casos foram LAM, Cameroon e Haarlem. A genotipagem auxiliou na descoberta de casos epidemiologicamente relacionados. / Resistance to drugs used in tuberculosis (TB) chemotherapy is a major challenge to fighting this disease caused by M. tuberculosis. Rifampin and isoniazid are two main first-line drugs to achieve TB cure. TB patients whose M. tuberculosis isolates exhibit resistance simultaneously to these two drugs develop multidrug-resistant TB (MDR-TB). M. tuberculosis resistance is related to mutations in genes important for bacillus survival. MDR-TB treatment is longer and uses more toxic second-line anti-TB drugs, predisposing patients to non-adherence to treatment regimens. Patients with MDR-TB, when not properly treated, can select strains resistant to second-line anti-TB drugs leading to the emergence of extensively drug-resistant TB (XDR-TB). These strains can be transmitted in communities, constituting a serious public health problem. According to the World Health Organization, XDR-TB has been documented in some countries, but in Brazil these data are scarce. The genetic characterization of M. tuberculosis strains involved in MDR/XDR-TB cases could facilitate the identification of transmission chains. AIMS: To investigate cases of XDR-TB in Bahia and to characterize the genetic profiles of the isolates of M. tuberculosis from patients with multidrug-resistant TB, associating the genetic profiles observed with the socio-demographic and clinical characteristics of patients involved. MATERIALS AND METHODS: M. tuberculosis isolates obtained from patients diagnosed with MDR-TB between 2008-2011 resident in the State of Bahia (Brazil) were tested for sensitivity against first and second-line anti-TB drugs and genotyped by the Variable Number of Tandem Repeats in Repetitive Unit Inter- Mycobacterial spaced (MIRU-VNTR) technique to obtain the genetic profiles that were associated with profiles in the international database MIRU-VNTRplus. Isolates whose genetic profiles have not matched any lineage with the use of this technique were further genotyped by Spoligotyping and information from both methods were considered to test for the possible matching with lineages from the same database. Clinical and epidemiological data were obtained from the database "Sistema TBMR" of the Ministry Health. RESULTS: We analyzed 392 isolates. Of these, 35% were excluded due to absence of growth or contamination and 12% corresponded to duplicate samples, resulting in 206 patients with MDR-TB in the study. XDR-TB was found in 7% (14/206) of the patients, two of which had no previous record of any anti-TB treatment. The patients studied were from 45 cities of the State. The capital, Salvador, concentrated 71% of all MDR-TB and 76% of the XDR-TB cases. Among XDR-TB cases, 36% (5/14) had isolates resistant to all drugs tested here. Combined resistance to streptomycin and ethambutol (8/14, 57%) was associated with the XDR-TB profile (OR 4.0, 95% CI 1.2 to 13.8, P = 0.01). 71 %(10/14) of XDR-TB cases developed one or more comorbidities (P= 0.04), mental disorder being a significant comorbidity in this group (21%, 3/14, P=0.04). Genotyping yielded 56 profiles, 38 unique and 18 in clusters (containing 2 to 11 isolates). Almost all (92%) XDR-TB cases were clustered, differing from non-XDR-TB cases (P=0.049). The genetic profiles were mainly associated with six families: LAM (70%), Cameroon (16%), Haarlem (10%), and the families X, S, Uganda I, which altogether amounted to 4%. The XDR-TB cases were represented by LAM (45% ST's 376, ST42, ST20), Cameroon (36%, single ST61) and Haarlem (18% ST50). CONCLUSIONS AND STUDY CONTRIBUTIONS: Bahia presented cases of XDR-TB and the families involved with these cases were LAM, Haarlem and Cameroon. Genotyping helped in epidemiologically linked case finding.

Submitted by Nathália Faria da Silva (nathaliafsilva.ufv@gmail.com) on 2017-10-16T16:36:01Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 29196319 bytes, checksum: 6884bb9f5a2472d3848b481521f34322 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-10-16T16:36:01Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 29196319 bytes, checksum: 6884bb9f5a2472d3848b481521f34322 (MD5) Previous issue date: 1999-03-01 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientifico e Tecnologico / Foram desenvolvidos três sistemas de genotipagem multilocos (sistemas Multiplex) semi-automatizados, baseados na amplificação e análise simultânea de locos microssatélites via florescência, para análise genética de espécies do gênero Eucalyptus. Tabelas de frequências alélicas e estimativas do conteúdo de informação genética foram geradas para seis espécies comercialmente importantes do gênero Eucalyptus (subgênero Symphyomyrtus). Inicialmente, microssatélites desenvolvidos a partir de genótipos de E. grandis e E. urophylla foram avaliados quanto à especificidade de amplificação. Dentre os locos que apresentaram boa qualidade de amplificação, 11 foram selecionados para o desenvolvimento de sistemas Multiplex. Três sistemas Multiplex, comportando cada um a análise simultânea de três locos, foram selecionados. Foi estudado o tamanho mínimo de amostra necessário para se obterem estimativas acuradas da heterozigosidade de cada loco. Para isso, foram genotipados 192 indivíduos de E. grandis provenientes de uma população de melhoramento. Com essa informação, avaliou-se o comportamento de estimadores para heterozigosidade esperada com vários tamanhos de amostra, analisando-se a sua variância por meio da sua fórmula exata e por reamostragem numérica. Concluiu-se que uma amostra de 64 indivíduos dessa população seria satisfatória para estimar a heterozigosidade esperada com boa precisão. Os três sistemas Multiplex foram utilizados para genotipar indivíduos provenientes de cinco procedências de E. grandis. Com os dados genotípicos, foram construídas tabelas de frequências alélicas para cada loco e procedência, além de serem registrados 0 número de alelos/loco e a amplitude alélica e estimados os parâmetros heterozigosidade esperada, conteúdo de informação de polimorfismo, probabilidade de identidade e poder de exclusão, os quais indicaram que os locos utilizados possuía alto conteúdo de informação genética. Foram ainda estimadas as distâncias genéticas de Nei entre as procedências; uma AMOVA realizada entre as procedências indicou variação significativa entre elas, embora a maior porção da variabilidade fosse encontrada dentro de procedências. Em seguida, os sistemas Multiplex foram otimizados e caracterizados para outras cinco espécies do gênero Eucalyptus: E. camaldulensis, E. dunnii, E. globulus, E. saligna e E. urophylla. As estimativas dos parâmetros de informação genética da maioria dos locos indicaram que eles são apropriados para genotipagem de indivíduos dessas espécies. Finalmente, os sistemas Multiplex foram utilizados na avaliação de uma população de melhoramento de E. urophylla e de uma coleção de clones-elite, em que foi possível a detecção de erros de identificação do material genético, além de uma avaliação da diversidade genética e da similaridade entre clones. / Three semi-automated multilocus genotyping systems, based on microsatellites, were developed for the analysis of Eucalyptus species. Allele frequency tables and estimates of the genetic information content of these loci were generated for six economically important species of Eucalyptus (subgenus Symphyomyrtus). A set of microsatellites, developed from E. grandis and E. urophylla genotypes. was evaluated based on their PCR amplilication quality and transferability across species. Eleven microsatellites and tifteen combinations of three Ioci were tested. Among these, three triplex systems were chosen. The minimum number of individuals necessary to obtain accurate estimates of He was evaluated. A population of 192 individuals of E. Grandis was typed with six microsatellites and the behavior of the estimate of He with increased sample sizes was analyzed using the gene diversity variance formula and numeric resampling. Congruent results using both approaches showed that a sample size of 64 individuals would be appropriate to estimate He with good accuracy. The multiplex systems were used to type individuals from live Eucalyptus provenances. Allele frequency tables were generated for every locus, and estimates of parameters of genetic information content were obtained (He, PIC, I and Q). AII loci showed to be highly informative with average values of He (0,85), PIC (0,84), combined Q (99,99%) and combined I (10-14). Nei's genetic distances estimated among provenances. An AMOVA showed that there is significant genetic variation among provenances. Although the majority of the variation was found within provenances. The multiplex systems were then optimized and evaluated for other tive species of Eucalyptus: E. camaldulensis, E. dunnii, E. globulus, E. saligna and E. urophylla. The estimates of genetic information content parameters showed once more that these Ioci are highly appropriate for genotyping Eucalyptus species. As a final step to evaluate the usefulness of these genotyping systems, a breeding population of E. urophylla and a collection of elite clones were analyzed. Several clonal identification errors were detected within this population. Based on the multilocus genotypes, an evaluation of the genetic variability and similarity among clones was also performed.