Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas. Programa de Pós-graduação em Farmacologia / Made available in DSpace on 2012-10-22T05:43:25Z (GMT). No. of bitstreams: 1 214258.pdf: 1297635 bytes, checksum: 49a0f749ba4797216ae231728523905a (MD5) / A influência da genética nas características relacionadas com os transtornos de ansiedade tem sido amplamente demonstrada tanto em humanos, quanto em modelos animais. No entanto, a comparação de linhagens de roedores em testes comportamentais de ansiedade/emocionalidade pode apresentar resultados não-reproduzíveis entre diferentes estudos e laboratórios, mesmo quando os genótipos são mantidos constantes. Então, além de se estudar os fatores genéticos, a identificação de fatores ambientais relevantes e as interações genótipo-ambiente parecem ser pontos importantes para aumentar a reprodutibilidade dos estudos genéticos e neurocomportamentais. Neste estudo, nós objetivamos avaliar a influência de fatores ambientais e genéticos sobre medidas comportamentais relacionadas à ansiedade e a possível relação entre modelos animais de ansiedade e alcoolismo. Para isso nós testamos um modelo genético animal (ratos das linhagens LEW e SHR) em: (a) três testes comportamentais de ansiedade, com algumas variações no ambiente de laboratório ou na situação de teste, (b) um protocolo de ingestão espontânea de etanol e (c) medidas de expressão gênica em duas regiões do cérebro relacionadas com comportamentos de ansiedade e alcoolismo. Além disso, um segundo modelo genético (ratos Floripa H e L) foi avaliado nos mesmos testes comportamentais de ansiedade e consumo de etanol. Os resultados mostraram que as linhagens LEW e SHR apresentaram diferenças relacionadas à ansiedade no teste da caixa branca/preta (CBP), tanto na fase clara como na fase escura do ciclo circadiano, e no labirinto em cruz elevado (LCE), tanto no teste como no reteste 24h depois, com os animais LEW parecendo mais "ansiosos" do que os animais SHR. Nós também mostramos que a posição da gaiola no biotério e o estado comportamental (sono/vigília) do animal logo antes do teste têm influência nos resultados dos testes comportamentais de ansiedade, com algumas destas influências sendo genótipo-dependentes. Foi ainda demonstrado que a linhagem considerada a mais "ansiosa" (LEW) no nosso modelo genético, foi a que consumiu maiores quantidades de etanol quando este foi oferecido em livre escolha a concentrações de 6% e 10%. Além disso, foram encontrados menores níveis de expressão gênica de NPY e maiores níveis de expressão gênica de receptores 5-HT1A no hipocampo, mas não no hipotálamo, dos ratos LEW em relação a ratos SHR. Outro gene investigado neste estudo, Grin2b, não diferiu no hipocampo ou no hipotálamo entre os ratos LEW e SHR. Finalmente, o protocolo de auto-administração de etanol aplicado às linhagens Floripa H e L sugeriu novamente uma correlação positiva entre os comportamentos de "ansiedade" e o consumo de álcool, pois a linhagem Floripa L, que foi a mais "ansiosa" neste modelo genético, também foi a que ingeriu maiores quantidades de etanol. Em conclusão, os resultados deste trabalho: (a) sugeriram que o teste e o reteste do LCE podem compartilhar componentes psicológicos comuns, (b) reforçaram as linhagens LEW e SHR como um importante modelo genético para o estudo da ansiedade, (c) mostraram que, apesar de sua robustez, as diferenças genéticas entre ratos LEW e SHR podem ser influenciadas por alguns detalhes do ambiente de laboratório, (d) sugeriram uma correlação positiva entre índices experimentais de ansiedade e consumo de etanol e (e) reforçaram a hipótese de participação do NPY e dos receptores 5-HT1A do hipocampo nas variações genéticas nestes comportamentos.

Existem crescentes evidências sobre a contribuição da liberação de noradrenalina (NA) central na consolidação das memórias. Teoricamente, o Núcleo do Trato Solitário (NTS) recebe informações e diversos estímulos periféricos, que são então projetados ao Núcleo Paragigantocelular (PGi). Este, por sua vez, utiliza neurotransmissores, predominantemente excitatórios, para influenciar a ativação do Locus Coeruleus (LC). Então, o LC envia projeções noradrenérgicas ao hipocampo e à amígdala, influenciando os processos mnemônicos. Aqui nós demonstramos que a inibição pelo muscimol do NTS, PGi ou LC até 3 horas após o treino na tarefa de reconhecimento de objetos (RO) impede a consolidação da memória medida 24 h após o treino. Adicionalmente, a infusão de timolol, um antagonista de receptores β-adrenérgicos, na região CA1 do hipocampo também impede a consolidação deste tipo de memória. A infusão de NA na região CA1 do hipocampo não altera a retenção da memória, mas, reverte o prejuízo causado pela inibição do NTS, PGi ou LC. A infusão de NMDA no LC após a inibição do NTS ou PGi também reverte essa amnésia. Concomitantemente, verificamos que a inibição NTS, PGi ou LC bloqueia o aumento da expressão do fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF, do inglês brain-derived neurotrophic factor) que ocorre 120 min após o treino na tarefa de reconhecimento de objetos na região CA1 do hipocampo. Também a infusão de NA na região CA1 do hipocampo após a inibição do NTS, PGi ou LC ou de NMDA no LC após a inibição do NTS ou PGi promovem novamente o aumento do BDNF120 min após o treino no RO. Com isso conclui-se que a ativação da via NTS-PGi-LC-Hipocampo é necessária para que ocorra consolidação da memória de RO, na qual desempenha um papel o BDNF hipocampal. / There is evidence of the contribution of brain noradrenaline release (NA) to memory consolidation. The Nucleus of the Solitary Tract (NTS) receives information originated by peripheral stimuli and projects to the Paragigantocellularis Nucleus (PGi), which influences the Locus Coeruleus (LC) through excitatory neurotransmitters. The LC sends noradrenergic projections to the hippocampus and amygdala, influencing the memory processes. Here we show that inhibition by muscimol of NTS, PGi or LC up to 3 h after object recognition training impairs the consolidation of the memory measured 24 h later. Additionally, the infusion of timolol in the CA1 region of hippocampus also inhibits consolidation of this type of memory. The infusion of NA into the CA1 region of hippocampus does not alter memory consolidation of this task, but reverts the deleterious effect of NTS, PGi or LC inhibition. The infusion of NMDA in LC after inhibition of NTS or PGi also reverts the amnesia. Concomitantly, the inhibition of NTS, PGi or LC blocks the increase of brain-derived neurotrophic factor (BDNF) expression in CA1 that occurs 120 min after training in the object recognition task. Further, the infusion of NA in CA1 after inhibition of NTS, PGi or LC; or of NMDA in LC after inhibition of NTS or PGi promotes the BDNF increase seen 120 min after object recognition training. Thus, it is concluded that the activation of NTSPGi- LC-Hippocampus pathway is necessary for consolidation of the object recognition memory, and hippocampal BDNF is involved in this process.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The endogenous poliaminas, putrescine, spermidina and spermine are aliphatics amines that are present in high concentrations in the central nervous system (SNC). The action of the poliamines involves the modulation of several ionic channels, including the subtype of glutamatergic N-methyl-D-aspartate receptor (NMDA). The processes mediated by NMDA receptor include synaptic plasticity and formation of neural circuitry. It is believed that these plasticities happening in some cerebral areas specifies, as the hippocampus, are critical for the learning and memory processes. It is described that spermidine (SPD), as well as the protein kinase are directly involved with processes of formation of the memory. Therefore, we investigated the involvement of the Ca2+ dependent (PKC) and cAMP-dependent (PKA) protein kinase in the facilitatory effect induced by SPD on the memory of males Wistar rats. For that, the rats were bilaterally cannulae in the hippocampus, after the surgical recovery, the animals were trained in the inhibitory avoidance task and injected (0.5 μL) bilaterally in the hippocampus. A subset of the animals was euthanized 30 or 180 min after injections and activity of PKC, PKA and cAMP response element-binding protein (CREB), in the hippocampus, was determined for Western blot. The other animals had a testing session, 24 h pos-training in the inhibitory avoidance apparatus. The post-training administration of the 3-[1-(Dimethylaminopropyl)indol-3-yl]-4-(indol-3-yl)maleimide hydrochloride [GF 109203X, 2.5 ρmol intrahippocampal (ih)], inhibitor of PKC, N-[2-bromocinnamylamino ethyl]-(5-isoquinoline sulfonamide) [H-89, 0.5 ρmol intrahippocampal (ih)], PKA inhibitor or arcaine (0.02 nmol ih), the antagonist of the NMDA receptor polyamine-binding site prevented memory improvement induced by SPD (0.2 nmol ih). The SPD (0.2 nmol), in the hippocampus, facilitated PKC 30 min, PKA and CREB phosphorylation 180 min after administration, and increased translocation of the catalytic subunit of PKA into the nucleus. GF 109203X, (2.5 ρmol) prevented the stimulatory effect of SPD on PKC, PKA and CREB phosphorylation. Furthermore, arcaine (0.02 nmol) and H-89 (0.5 ρmol) prevented the stimulatory effect of SPD on PKA and CREB phosphorylation 180 min after administration. None of the drugs studies altered the locomotor activity of the animals. These results suggest that the facilitatory effect of the memory induced by the ih administration SPD involves the cross talk between PKC and PKA/CREB, with PKC activation follow by PKA/CREB pathways activation in rats. / As poliaminas endógenas, putrescina, espermidina e espermina, são aminas alifáticas que estão presentes em altas concentrações no sistema nervoso central (SNC). As poliaminas modulam diversos canais iônicos, incluindo o subtipo de receptor glutamatérgico N-metil D-aspartato (NMDA). Os processos mediados pelo receptor NMDA incluem plasticidade sináptica e formação de circuitos neurais. Acredita-se que estas plasticidades ocorrendo em algumas regiões cerebrais específicas, como o hipocampo, são críticas para os processos de aprendizado e memória. Está descrito que a espermidina (SPD), assim como as proteínas quinase, esta diretamente envolvida com os processos de formação da memória. Assim, investigamos o envolvimento das proteínas quinases dependente de AMPc (PKA) e dependente de Ca2+ (PKC) sobre a melhora da memória induzida por SPD em ratos. Para isso, ratos Wistar machos foram canulados bilateralmente no hipocampo e após a recuperação cirúrgica treinados na tarefa de esquiva inibitória. Imediatamente após o treino os animais receberam através das cânulas (0,5 μl/sítio) a administração de N-[2-bromocinamilamino etil]-(5-isoquinolina sulfonamida) [H-89, 0,5 ρmol intrahipocampal (ih)], inibidor da PKA, 3-[1-(Dimetilaminopropil)indol-3-il]-4-(indol-3-il)maleimida hidrochloride [GF 109203X, 2,5 ρmol (ih)], inibidor da PKC, arcaína (0,02 nmol, ih), antagonista do sítio de ligação das poliaminas no receptor NMDA ou SPD (0,2 nmol, ih). Um grupo de animais foi eutanasiado 30 ou 180 minutos após a administração das drogas e a atividade da PKC, PKA e o elemento ligante responsivo ao AMPc (CREB), no hipocampo, foi determinada por Western blot. Os outros animais foram submetidos à sessão de teste, 24 horas depois do treino na esquiva inibitória. A administração de H-89, GF 109203X ou arcaína preveniu a melhora da memória induzida por SPD. A SPD (0,2 nmol) aumentou a fosforilação da PKC 30 min, da PKA e do CREB 180 min após a injeção e aumentou a translocação da subunidade catalítica da PKA do citosol para o núcleo. GF 109203X, (2,5 ρmol) preveniu o efeito estimulatório da SPD sobre a fosforilação da PKC, PKA e CREB. Além disso, arcaína (0,02 nmol) e H- 89 (0,5 ρmol) preveniram o efeito estimulatório da SPD sobre a fosforilação da PKA e CREB 180 min depois da injeção. Nenhuma das drogas alterou a atividade motora dos animais. Estes resultados sugerem que o efeito facilitatório da memória induzido pela administração ih de SPD envolve um cruzamento entre PKC e PKA/CREB, com a ativação inicial da PKC, seguida da ativação da cascata PKA/CREB em ratos. Assim, poderemos determinar um possível mecanismo de ação da espermidina nos processos de formação da memória, e desta forma, fornecer subsídios para o desenvolvimento de fármacos.

O objetivo deste estudo foi investigar os efeitos do enriquecimento ambiental (EA) sobre a memória e a morfologia hipocampal, estriatal e cortical, estado oxidativo e níveis do fator neurotrófico derivado do encéfalo (BDNF), em ratos Wistar submetidos à hipóxia-isquemia (HI) neonatal. No capítulo 1 foram examinados os efeitos do EA sobre o prejuízo na memória observado no labirinto aquático de Morris (LAM) e sobre a atrofia hipocampal e cortical em animais hipóxicos-isquêmicos adultos. Ratos Wistar machos, no 7º dia pós-natal (DPN) foram submetidos ao modelo de Levine-Rice de HI neonatal, no qual a artéria carótida comum direita é ocluída permanentemente e, na seqüência, os animais foram mantidos em uma atmosfera hipóxica (90 min, 8% O2-92% N2). Duas semanas após a HI, os animais foram estimulados em um ambiente enriquecido (1h/dia, por 9 semanas). No LAM, os animais HI mantidos em ambiente padrão apresentaram pior performance quando comparados aos grupos CT e o grupo HI enriquecido teve mesmo comportamento que os grupos CT. Uma significante atrofia hipocampal e cortical foi identificada nos animais hipóxico-isquêmicos, porém, nesta análise, o EA não resultou em proteção significativa. O capítulo 2 teve como intuito investigar se a manutenção em ambiente enriquecido precocemente (8º-30 DPN) seria efetiva na recuperação da atrofia hipocampal pela HI, e, se os efeitos cognitivos vistos no EA diário seriam extensivos a outro tipo de memória e, também a outros períodos do desenvolvimento. Ratos e ratas Wistar machos foram submetidos à HI (conforme descrito acima) e, no dia seguinte, foram colocados em um ambiente enriquecido. Na seqüência, a memória de reconhecimento, no teste de reconhecimento de objetos e a memória espacial no LAM são analisadas. Na vida adulta, os animais foram submetidos a mais uma sessão experimental no LAM. O déficit cognitivo observado na memória de reconhecimento nos animais HI foi revertido pela estimulação. Porém, o prejuízo na memória espacial foi parcialmente revertido pelo EA; a memória de trabalho nas fêmeas, no período da adolescência, foi mais claramente beneficiada por este efeito. E, corroborando os resultados do primeiro experimento, a HI resultou em dano tecidual ao hipocampo e também ao estriado, sem indicação de efeito significativo pela estimulação. O capítulo 3 teve como objetivo investigar se a modulação do estado oxidativo e os níveis de BDNF cerebrais podem estar envolvidos no efeito neuroprotetor cognitivo do EA em animais adultos submetidos à HI. Ratos Wistar machos foram utilizados neste experimento; os procedimentos de HI e EA foram os mesmos do primeiro experimento. Os animais foram sacrificados 24 horas após o término do período de enriquecimento (85º DPN), quando hipocampo e córtex foram dissecados para a posterior determinação dos parâmetros de estresse oxidativo (quantificação de radicais livres, dano em macromoléculas e atividade da enzima superóxido dismutase - SOD) e dos níveis de BDNF. Os resultados demonstraram uma diminuição na quantidade de radicais livres no hipocampo esquerdo dos animais HI e um aumento destes níveis no córtex direito; e, também, um aumento na atividade da SOD no hipocampo direito dos animais HI e uma diminuição desta atividade no hipocampo esquerdo nos animais não estimulados. Além disso, os níveis de BDNF foram aumentados no hipocampo dos animais HI mantidos em ambiente padrão. Estes resultados sugerem que o efeito neuroprotetor cognitivo do EA diário pode não ser dependente da expressão de BDNF nem do estado oxidativo do hipocampo e córtex. / This study was undertaken to investigate the environmental enrichment (EE) effects over memory function and hippocampus and cortex morphology, oxidative status and brain-derived neurotrophic factor (BDNF) levels, consequent to neonatal hypoxiaischemia (HI) in Wistar rats. The objective of chapter 1 was to examine, in adulthood, the effects of daily EE on memory deficits in the Morris water maze (MWM) and hippocampal and cerebral damage, caused by neonatal HI. Male wistar rats at the 7th postnatal day were submitted to the Levine-Rice model of neonatal HI, comprising permanent occlusion of the right common carotid artery and a period of hypoxia (90 min, 8%O2-92%N2). Two weeks after the HI event, animals were stimulated by the enriched environment (1h/day for 9 weeks). In the MWM, non-stimulated HI animals had worse performance than controls and HI-enriched rats showed memory performance as good as that of controls. There was a reduction of both hippocampal volume and cortical area, ipsilateral to arterial occlusion, in HI animals; EE did not affect these morphological measurements, despite its clear cognitive neuroprotective effect. The chapter 2 investigated whether early continuous housing in an enriched environment would be effective in recovering hippocampal atrophy consequent to the neonatal HI, as well as if the benefits of continuous EE would extending to other memory types, both in adult and adolescent female and male rats. As described above, animals were submitted to HI and, starting 1day after the event, they were housed in an enriched environment (8th-30th PN day). Performances of animals in the novel-object recognition were assessed in the adolescence period and in the MWM task in the adolescence and, again, in adulthood. Cognitive deficits arising after neonatal HI in the novel-object recognition test were completely recovered by the environmental stimulation, in animals of both genders. However, spatial memory impairment in the MWM was partially prevented by EE; the effect was observed especially in female adolescent rats on the working memory. Corroborating the findings of the first experiment, there was no enrichment effect over hippocampus volume and striatum area. These data indicate that early housing in an enriched environment recovered performance in the object recognition task and, in adolescent females, in the working memory spatial task after a neonatal hypoxicischemic event. No effects of enrichment were revealed in adult animal performance nor in tissue atrophy of hippocampus and striatum consequent to HI. The chapter 3 was designed to investigate whether the modulation of brain oxidative status and/or BDNF content in adulthood are involved in functional neuroprotection caused by EE after neonatal HI. Protocols of the HI and EE utilized in this experiment were the same as of the first experiment. Male rats were sacrificed 24 hours after the enrichment period, i.e., at PN day 85. We have determined BDNF levels and several oxidative stress parameters, specifically the free radicals levels, macromolecules damage and superoxide dismutase (SOD) activity, in hippocampus and frontal cortex samples. It was found a decrease in free radical content in the left hippocampus of HI animals and an increase in non-stimulated rats in the right cortex; also, increased SOD activity in the right hippocampus of HI and a decrease of enzyme activity in the left hippocampus of stimulated groups were found. Moreover, BDNF levels were increased in the hippocampus of the non-stimulated HI group. These results suggest that the neuroprotective cognitive effect of daily environmental enrichment may not be dependent on BDNF expression nor on the oxidative status in hippocampus and cortex.

O presente estudo tem por objetivo investigar a influência da privação dietética de ácidos graxos ω3 no sistema glutamatérgico no hipocampo de ratos Wistar em parâmetros ontogenéticos e relacionados à neuroproteção. Os ratos foram alimentados, desde a gestação até a vida adulta, com duas dietas diferentes: uma dieta contendo ácidos graxos ω3 (grupo controle, C) e outra deficiente nestes ácidos graxos (grupo deficiente, D). Nos experimentos ontogenéticos, foram avaliados os imunoconteúdos das subunidades de receptores glutamatérgicos ionotrópicos do tipo NMDA (NR2 A/B) e AMPA (GluR1), bem como da isoforma alfa da cinase dependente de cálcio e calmodulina do tipo II (αCaMKII). Também foram avaliados a capacidade do glutamatode ligar-se a seus receptores e a captação de [3H]glutamato em fatias de hipocampo. Para investigar o efeito da privação de ácidos graxos ω3 na resposta cerebral frente à injúria isquêmica, fatias de hipocampo foram submetidas à privação de glicose e oxigênio (OGD), um modelo de isquemia in vitro. O grupo D apresentou imunoconteúdo reduzido de todas as proteínas avaliadas aos 02 dias de vida, o que foi sendo normalizado aos 21 dias (exceto pela αCaMKII) e aos 60 dias. O mesmo padrão foi observado na capacidade de ligação do glutamato aos seus receptores. Porém a captação de [3H]glutamato não foi afetada pelas dietas. Nos experimentos de OGD, o grupo D apresentou maior dano celular e uma queda na captação de [3H]glutamato mais acentuada que o grupo controle. Ainda, a privação de ácidos graxos ω3 influenciou a resposta celular anti-apoptótica após OGD, afetando a fosforilação das proteínas GSK3β e ERK1/2, mas não a fosforilação da Akt. Estes resultados sugerem que os ácidos graxos ω3 são importantes para o desenvolvimento do sistema glutamatérgico e para a proteção celular após dano isquêmico, além de ser importante para ativação de rotas de sinalização anti-apoptóticas. / The effect of dietary deprivation of essential omega-3 fatty acids on parameters of the glutamatergic system related to brain ontogeny and neuroprotection was investigated in this study. Rats were fed with two different diets: omega-3 diet (control group) and omega-3 deprived-diet (D group). In ontogeny experiments, it was evaluated the hippocampal immunocontent subunits of the of ionotropic glutamatergic receptor NMDA and AMPA (NR2 A\B and GluR1, respectively) and the alfa isoform of the calcium-calmodulin protein kinase tipe II (αCaMKII), as well as the binding and uptake of [3H]glutamate. To assess the influence of omega-3 fatty acids deprivation on brain responses to ischemic insult, hippocampal slices were submitted to oxygen and glucose deprivation (OGD), a model of in vitro ischemia. The D group showed lower immunocontent of all proteins analyzed at 02 days of life (P2) than the control group, and it was normalized at P21 (except for αCaMKII) and P60. The same pattern was found for [3H]glutamate binding, while [3H]glutamate uptake was not affected. In the OGD studies, the D group showed higher cell damage and stronger decrease in the [3H]glutamate uptake. Moreover, omega-3 deprivation influenced anti-apoptotic cell response after OGD, affecting GSK-3beta and ERK1/2, but not Akt phosphorylation. Taken together, these results suggest that omega-3 fatty acids are important for the glutamatergic development and cell protection after ischemia, and also seem to play an important role on activation of anti-apoptotic signaling pathways.

As deficiências de aprendizado são características comuns em pacientes afetados pela doença do xarope do bordo (DXB) ou pela acidemia metilmalônica. Os sintomas predominantemente neurológicos destas doenças incluem o retardo mental, atraso no desenvolvimento neuropsicomotor, convulsões e alterações neuroradiológicas variadas. Na DXB, a deficiência da atividade do complexo enzimático desidrogenase dos a-cetoácidos de cadeia ramificada acarreta o acúmulo tecidual dos aminoácidos leucina, valina e isoleucina, dos a-cetoácidos correspondentes, ácido a-cetoisocapróico, a-cetoisovalérico e a-ceto-b-metilvalérico, bem como dos a-hidroxiácidos que destes se derivam, ácido a-hidroxiisocapróico, ácido a-hidroxiisovalérico e ácido a-hidroxi-b- metilvalérico. Na acidemia metilmalônica, por sua vez, ocorre um acúmulo tecidual do ácido metilmalônico devido à deficiência da enzima metilmalonil-CoA mutase. Os níveis teciduais destes metabólitos aumentam ainda mais durante crises de descompensação metabólica. No presente trabalho investigamos o efeito da administração intrahipocampal dos metabólitos ácidos acima citados sobre o comportamento de ratos adultos, dez minutos antes ou imediatamente após o treino, em tarefas aversivas (esquiva inibitória) e não aversivas (habituação ao campo aberto). Déficits de aprendizado nas tarefas da esquiva inibitória e da habituação ao campo aberto foram observados para os metabólitos supracitados quando administrados antes do treino, mas não quando foram injetados após o treino. O o ácido metilmalônico injetado dez minutos antes do treino provocou déficit somente no teste de memória espacial, não surtindo efeito sobre a memória quando os animais foram testados na tarefa de esquiva inibitória. O pré-tratamento destes animais com substratos energéticos foi capaz de prevenir o déficit de memória causado por metabólitos acumulados nas doenças estudadas. Quando utilizou-se a creatina monohidratada ou o ácido succínico evidenciou-se prevenção do déficit de memória espacial causado pela administração do ácido a-hidroxiisovalérico no hipocampo de ratos adultos. Por sua vez, apenas o prétratamento com creatina monohidratada foi o único capaz de prevenir o déficit de memória de ratos administrados intrahipocampalmente com o ácido metilmalônico. Os estudos de captação de glutamato por fatias de córtex cerebral de ratos jovens evidenciaram diminuição na captação de L-[3H]glutamato quando as fatias eram incubadas por 23 minutos na presença dos ácidos CIC e HMV (25-50% de diminuição). Em contrapartida, a incubação com o ácido HIV aumentou a captação em 110%, acréscimo que foi prevenido quando ao meio de incubação foi adicionado 1mM de creatina monohidratada. Por último, verificamos que a viabilidade de células de córtex cerebral ou de hipocampo de ratos jovens não foi alterada quando medida através do método do MTT e da determinação da DHL no meio de incubação onde as fatias eram imersas. Em resumo, nossos resultados apontam para alterações importantes no aprendizado de animais tratados intrahipocampalmente com os metabólitos ácidos da DXB em tarefas aversivas e não aversivas, bem como alterações de aprendizado não essencial quando da administração do principal metabólito que se acumula na acidemia metilmalônica (MMA). Além disso, estes déficits comportamentais parecem estar ligados a um comprometimento do metabolismo energético cerebral, visto que o prétratamento com creatina em estudos com metabólitos que se acumulam nas duas doenças (HIV para a DXB e MMA para a acidemia metilmalônica) preveniu o déficit de memória destes animais, bem como o pré-tratamento com succinato evitou o déficit de aprendizado espacial causado pelo HIV nos animais. Por outro lado, antioxidantes ou o antagonista do receptor glutamatérgico NMDA MK-801 não preveniu esses efeitos. Além disso, apresentamos evidências de que o CIC e o HMV ativam o sistema glutamatérgico, bloqueando a captação de glutamato por fatias de córtex cerebral de ratos jovens, levando a um aumento da quantidade dos neurotransmissores na fenda sináptica. / Learning disability is a common feature of patients affected by maple syrup urine disease (MSUD) or methylmalonic acidaemia. The neurological symptoms include mental retardation, delay on neuropsychomotor development, seizures and alteration on neuroradiological images. MSUD is caused by severe deficiency of the branched-chain L-a-keto acid dehydrogenase complex (BCKAD) activity leads to tissue accumulation of aminoacids leucine, valine and isoleucine, the branched chain keto acids, a-ketoisocaproic, a-ketoisovaleric and a-keto-b-methylvaleric, and corresponding a-hydroxyacids, a-hydroxyisocaproic, a-hydroxyisovaleric and a- hydroxy-b-methylvaleric. The tissual accumulation of methylmalonic acid is the biochemical hallmark of the methylmalonic acidaemia because the methylmalonyl-CoA mutase is defective on this disease. The tissual levels of these metabolites are more proeminents in crisis of metabolic decompensation. In the present study we investigated the effect of acute administration of the acid metabolites cited above on the behavior of adult rats in the inhibitory avoidance and open field habituation tasks. The DXB acid metabolites producing learning deficits on aversive and spatial learning when infused 10 minutes before the training session of the tasks but not when infused immediatelly after training. The MMA injected 10 minutes before training provokes deficit only in the spatial task, and do not caused any effect on animals submitted to inhibitory avoidance task. The pretreatment with energetic substrates was the only effective on prevent the memory deficit caused by metabolites accumulating on MSUD or methylmalonic acidaemia. The prevention of the spatial memory deficit caused by a-hydroxyisovaleric acid was achieved by administration of creatine monohydrated or succinic acid. The creatine monohydrated was the only effective on prevention of learning deficit of open field habituation provoked by methylmalonic intrahippocampal administration. The results of cerebral glutamate uptake of 30 day-old rats showed a reduction of 25-50% by 30 min treatments with a-ketoisocaproic acid and a-hydroxy-b-methylvaleric acid, respectively. Differently, the a-hydroxyisovaleric acid elevated by 110% the glutamate uptake and the creatine monohydrated pretreatment (1mM) was effective on prevented this effect. We veryfied that cellular viability of cerebral cortical slices incubated with acid metabolites of MSUD was normal when the studies on cellular viability were performed by MTT method and by mean of the LDH activity in the incubation bath of the cells. The results of cerebral glutamate uptake of 30 day-old rats showed a reduction of 25- 50% by 30 min treatments with a-ketoisocaproic acid and and a-hydroxy-b- methylvaleric acid, respectively. Differently, the a-hydroxyisovaleric acid elevated by 110% the glutamate uptake on cortical slices of yang rats, and the creatine monohydrated pretreatment was effective on the prevention of this effect. In conclusion, our results pointing to strong alterations on learning of animals treated with MSUD acids metabolites on aversive and non aversive tasks., and suggest that non essential alterations occur on learning of animals treated with methylmalonic acid, which may be of value to elucidate some aspects of the neurological dysfuncion occuring on these diseases. The behavioral deficits may be linked to a compromise on cerebral energetic metabolism because the pre treatment with energetic substrates was effective on prevention in memory deficits caused by HIV and MMA. Otherwise, focal effects on glutamatergic system may be the causative of learning deficits provoked by administration of CIC and HMV, it is reasonable because the uptake of glutamate was reduced on rats treated with these metabolites, and it is causative of elevation on neurotransmitter levels in the synaptic cleft.

O aumento da longevidade da população mundial tem como conseqüência uma maior prevalência de doenças neurodegenerativas. A Doença de Alzheimer (DA) é a desordem neurodegenerativa mais prevalente e a principal causa de demência após os 60 anos. A DA caracteriza-se por um crescente declínio na função mental e memória do paciente. Esses sintomas são explicados por uma marcante perda neuronal e pela presença de alterações estruturais no tecido cerebral: os emaranhados neurofibrilares (NFTs) intracelulares constituídos pela proteína tau hiperfosforilada e as placas senis extracelulares constituídas pela proteína beta-amilóide (Aß). Estudos recentes têm evidenciado que um processo inflamatório crônico, desencadeado pelo acúmulo de Aß, possui um papel central no processo neurodegenerativo da DA. Alguns dos componentes característicos da neuroinflamação na DA são astrogliose, microgliose e elevação dos níveis de citocinas. Estratégias terapêuticas para o tratamento de doenças do SNC têm sido amplamente pesquisadas. Dentre essas moléculas a melatonina tem demonstrado potencial atividade neuroprotetora, porém os mecanismos celulares e moleculares para esta atividade permanecem pouco conhecidos. Diante disso, o presente trabalho teve como objetivo investigar o efeito neuroprotetor da melatonina em modelo in vitro de toxicidade do Aß25-35. Para esse propósito foram utilizadas culturas de hipocampo de rato tratadas cronicamente com melatonina, nas concentrações de 25µM, 50µM ou 100µM, e expostas a 25µM do peptídeo Aß por 6h, 12h, 24h ou 48h.A morte celular foi quantificada pela medida da incorporação de iodeto de propídeo (IP), um marcador de morte celular. Os resultados do presente estudo mostraram que o tratamento com melatonina nas concentrações de 50µM e 100µM preveniu a morte celular induzida pela exposição das culturas organotípicas de hipocampo de rato ao peptídeo Aß por 48h. A melatonina em todas as concentrações usadas nesse trabalho preveniu a hiperfosforilação da proteína tau induzida pela exposição por 48h ao peptídeo Aß. A ativação da GSK-3ß observada após 12h de exposição ao Aß25- 35 foi prevenida pelo pré-tratamento com 100µM de melatonina. Uma significante ativação glial foi observada após 48h de exposição das culturas organotípicas ao Aß, evidenciado através do aumento do imunoconteúdo da GFAP e da reatividade da Isolectina B4, enquanto que o tratamento com melatonina 100µM foi capaz de prevenir a ativação de astrócitos e microglia. Os níveis de TNF-a mostraram-se aumentados após 24h e 48h de exposição ao Aß e foi observada redução significativa desses nas culturas pré-tratadas com melatonina 100µM. Os níveis de IL-6 aumentaram apenas após 48h de exposição ao Aß25-35, sendo esse efeito prevenido pela melatonina na concentração de 100µM. O tratamento das culturas com melatonina por 14 dias antes da exposição ao peptídeo Aß25-35 apresentou efeito neuroprotetor no modelo in vitro de toxicidade ao peptídeo beta-amilóide. Embora mais estudos sejam necessários para compreensão do mecanismo neuroprotetor da melatonina nessa patogênese, os resultados desse trabalho sugerem que a melatonina possa exercer sua neuroproteção através da inibição da hiperfosforilação da proteína tau, diminuição da atividade da GSK-3ß, prevenção da ativação de astrócitos e da microglia e inibição da liberação dos mediadores pró-inflamatórios TNF-a e IL-6. / The increase of the average life expectancy of the world-wide population has been followed by increase in the prevalence of neurodegenerative diseases. Alzheimer's disease (AD) is the most prevalent age-related neurodegenerative disorder affecting people 60 years and older. The AD is characterized for an increasing decline in the mental function and memory of the patient. These symptoms are explained by a marked neuronal loss and the presence of structural alterations in the cerebral tissue: the intracellular neurofibrilary tangles (NFTs) of the hyperphosphorylated protein tau and extracellular amyloid-beta (Aß) into senile plaques. Recent evidence suggests that a chronic inflammatory process, triggered by Aß deposition, plays an important role in the pathogenesis of AD. Neuroinflammation associated with AD is characterized by astrogliosis, microgliosis and citokyne elevation. Therapeutic strategies for the treatment of CNS diseases have been widely researched. Substantial evidence indicates that melatonin has neuroprotective effects; however, the cellular and molecular mechanisms remain poorly informed. Therefore, the present work was designed to investigate the neuroprotective effects in an in vitro model of toxicity by Aß25-35. For this purpose, organotypic slice cultures of rat hippocampus were treated chronically with melatonin, 25µM, 50µM or 100µM, and then exposed to 25µM of Aß25-35 for 6h, 12h, 24h or 48h. Cell death was quantified by measuring propidium iodide (PI) uptake, a marker of necrotic dead cell. The results of the present study had shown that the pretreatment with melatonin, at concentrations of 50µM and 100µM, prevented cell damage in hippocampus induced by the exposure to 25µM of Aß25-35 for 48h. The treatment with melatonin in all the concentrations prevented the hyperphosphorylation of protein tau induced by 25µM of Aß25- 35 peptide. Melatonin also prevents GSK-3ß activation after 12h of Aß exposition. A marked glial activation was showed after exposure of hippocampal cultures to Aß25-35 for 48h, as evidenced by GFAP and Isolectin B4 increase in reactivity, and the treatment with 100µM of melatonin prevented the activation of astrocytes and microglia.The exposure to 25µM of Aß25-35 for 24h and 48h increased the TNF-α concentration in the medium and the pretreatment with 100µM of melatonin significantly reduced the levels of this cytokine after 48h of exposure to peptide. In addition, IL-6 levels increased only after 48h of exposition to Aß25-35 and the pretreatment with 100µM of melatonin also prevented this increase. The treatment of cultures with melatonin for 14 days before the peptide exposure exercised neuroprotective effects in the in vitro model of toxicity by Aß25-35. Although further studies are necessary for understanding the neuroprotective mechanisms in AD, the data suggests that the melatonin could to exert neuroprotection through the inhibition of tau hyperphosphorylation, reduction of GSK-3ß activity, prevent microglial and astroglial activation and reduce the release of pro-inflammatory factors, as TNF-a and IL-6.

A hipóxia-isquemia (HI) é a principal causa de mortalidade no período perinatal e, nos sobreviventes, a incidência de seqüelas neurológicas é elevada. O encéfalo imaturo, altamente susceptível ao insulto hipóxico-isquêmico, é vulnerável a estímulos ambientais tais como o enriquecimento ambiental (EA). O objetivo deste estudo foi investigar o desempenho comportamental no teste do campo-aberto, reconhecimento de objetos, esquiva-inibitória e no rota-rod, bem como a densidade de espinhos dendríticos no hipocampo, utilizando o método de Golgi, em ratos submetidos à HI e expostos ao EA (1h/dia, 6 dias/semana, 9 semanas). Ratos de 7 dias de idade foram submetidos ao procedimento de HI e divididos em 4 grupos experimentais: controle mantido em ambiente padrão (CTAP), controle em ambiente enriquecido (CTAE), HI em ambiente padrão (HIAP) e HI em ambiente enriquecido (HIAE). Parâmetros comportamentais e morfológicos foram avaliados após 9 semanas de estimulação ambiental. Os dados indicaram que a memória de reconhecimento de objetos foi prejudicada em ratos HI adultos e recuperada após a estimulação pelo ambiente enriquecido; no teste de esquiva-inibitória os animais apresentaramum prejuízo na memória aversiva em animais HI, independentemente do ambiente. Surpreendentemente, no teste do campo-aberto, um maior número de crossings foi identificado nos grupos HI no primeiro minuto quando comparados aos grupos controle. No teste de rota-rod não foram detectadas diferenças entre animais controle e animais HI. Resultados morfológicos demonstraram uma diminuição na densidade de espinhos dendríticos no hipocampo de animais HI, com recuperação pelo EA. A densidade de espinhos dendríticos do hemisfério esquerdo (contralateral à oclusão arterial) obteve os melhores resultados, indicando uma recuperação total do dano hipóxico-isquêmico pelo EA. Os dados dos espinhos dendríticos do hemisfério direito indicaram uma recuperação parcial pela estimulação ambiental nos animais HI. Concluindo, o enriquecimento ambiental foi efetivo na recuperação do déficit comportamental e da densidade de espinhos dendríticos nos neurônios hipocampais conseqüente à hipóxia-isquemia neonatal em ratos. / Hypoxia-ischemia (HI) is the main mortality cause in perinatal period and, in survivors, the incidence of neurological disabilities is elevated. The immature brain, highly susceptible to hypoxic-ischemic insult, is responsive to environmental stimuli, as environmental enrichment (EE). The aim of this study was to investigate behavioral performance in the open field apparatus, objects recognition, inhibitory avoidance and in the Rota-rod apparatus, and dendritic spines density in the hippocampus, using the Golgi technique, in rats submitted to the HI and exposed to EE (1h/day, 6 days/week, 9 weeks). Seven-days old rats were submitted to the HI procedure and divided in 4 groups: control in standard conditions (CTSE), control in enriched environment (CTEE), HI in standard conditions (HISE) and HI in enriched environment (HIEE). Behavioral and morphological parameters were evaluated after 9 weeks of environmental stimulation. Data indicated that object-recognition memory was impaired in HI adult rats and recovered after stimulation by the EE; in the inhibitory avoidance task was demonstrated aversive memory impairment in HI animals, independent of the environment. Interestingly, in the open field task, significant more crossing responses were identified in HI groups, in the first minute, comparing to control groups. No differences between control and HI adult animals were detected in the rota-rod test. Morphological results demonstrated a decreased spines density in the hippocampus of the HI animals, with recovery by the EE. Dendritic spines density from left hemisphere (contralateral to arterial occlusion) obtained the better results, indicating a total recovery effect of the EE on HI damage. Data of dendritic spines from right hemisphere indicated a partial recovery by the environmental stimulation on HI animals. Concluding, environmental enrichment was effective in recovery behavioral impairment and dendritic spine density in hippocampal neurons, consequent to neonatal hypoxia-ischemia in rats.

Os mecanismos envolvidos nas atividades toxicológicas e/ou farmacológicas dos compostos orgânicos de selênio são pouco conhecidos. Os compostos orgânicos de selênio (disseleneto de difenila e ebselen) e organotelúrio (ditelureto de difenila) foram alvo dos trabalhos realizados“in vitro”, neste estudo. Os compostos organocalcogênios apresentaram efeitos diversos sobre o influxo de 45Ca2+ medido em sinaptossomas de cérebro de rato, dependendo das condições e agentes despolarizantes usados. Ebselen, (PhSe)2 e (PhTe)2 alteram a captação de 45Ca2+ de maneira distinta quando expostos a aminopiridina ou KCl. Enquanto (PhTe)2 inibe a captação de cálcio em todas as condições experimentadas, (PhSe)2, apresenta este efeito apenas quando incubado em condições basais ou sob a ação de aminopiridina. Ebselen, por sua vez, aumenta a captação de cálcio em altas concentrações em condições basais e sob a ação de aminopiridina, porém, apresenta efeito inverso quando os sinaptossomas são despolarizados por KCl. Ebselen evitou a inibição da captação de 45Ca2+ “in vitro” provocada por cloreto de mercúrio(HgCl) em sinaptossomas de cérebro de rato em condições basais do ensaio, no entanto, ebselen não afetou a inibição da captação de glutamato “in vitro” por HgCl, indicando que ebselen pode atuar dependendo das proteínas-alvo consideradas.Os compostos de mercúrio, MeHg e HgCl, inibiram a captação de glutamato em córtex cerebral de ratos de 17 dias e ebselen reverteu somente o efeito do MeHg porém, não, o do HgCl. Disseleneto de difenila não alterou os parâmetros avaliados na exposição de ambos os compostos de mercúrio.Os compostos de mercúrio estudados provocaram a morte celular das fatias de córtex, porém, ebselen protegeu as fatias dos efeitos lesivos provocados por MeHg e não pelo HgCl.

Made available in DSpace on 2016-06-02T19:23:03Z (GMT). No. of bitstreams: 1 855.pdf: 559851 bytes, checksum: 08f3a617df4d329d9bcffbc390988348 (MD5) Previous issue date: 2005-09-02 / Universidade Federal de Sao Carlos / It has been demonstrated that serotonin (5HT) plays a dual role on anxiety states. Depending on the type of 5HT receptor and cerebral sites serotonin increases or decreases anxiety. Several studies have emphasized a role of the 5HT2 receptors on anxiety modulation. In rats, intra-hippocampus or intra-amygdala infusions of 5HT2 receptor ligands result in inconsistent effects in many animal models of anxiety. This study investigated the effect of the 5HT2B/2C receptor agonist mCPP bilaterally microinjected into dorsal (DH: 0, 0.3, 1.0 or 3.0 nmol/0.2 µl) or ventral (VH: 0, 0.3, 1.0 or 3.0 nmol/0.2 µl) hippocampus and amygdaloid complex (0, 0.15, 0.5, 1.0 or 3.0 nmol/0.1 µl) in mice exposed to the elevated plus maze (EPM). Test sessions were videotaped and subsequently scored for conventional indices of anxiety (percentage of open arm entries and percentage of open arm time) and locomotor activity (closed arm entries). Results showed that mCPP microinfusions into DH or VH did not affect any behavioral measure in the EPM. However, when injected into the amygdaloid complex this 5HT2 receptor agonist selectively increased anxiety at 1 nmol dose. In addition, none dose of mCPP changed locomotor activity when injected into the amygdaloid complex. Our results suggest that the 5HT2B,2C receptors located within the amygdaloid complex (but not within the hippocampus) play a role on anxiety in mice exposed to the EPM. / Tem sido demonstrado que a serotonina (5HT) desempenha um papel dual nos estados de ansiedade. Dependendo do tipo de receptor e dos locais cerebrais esta monoamina pode aumentar ou diminuir a ansiedade. Existem vários estudos que demonstram que a 5HT modula a ansiedade quando interage com os receptores 5HT2. Em ratos, infusões intrahipocampo e intra-amígdala de ligantes de receptores 5HT2 resultam em efeitos inconsistentes em muitos modelos animais de ansiedade. O presente estudo investigou o efeito do agonista de receptores 5HT2B/2C, mCPP micoinjetado bilateralmente no hipocampo dorsal (HD, 0; 0,3; 1 e 3 nmoles/0,2µl), hipocampo ventral (HV, 0; 0,3; 1 e 3 nmoles/0,2µl) e complexo amigdalóide (0; 0,15; 0,5; 1 e 3 nmoles/0,1µl) sobre a ansiedade em camundongos expostos ao labirinto em cruz elevado (LCE). Os testes foram gravados e subseqüentemente registrados para índices de ansiedade (porcentagem de entradas e de tempo nos braços abertos) e atividade locomotora (entradas nos braços fechados). Os resultados mostraram que microinfusões de mCPP em ambas as regiões do hipocampo não afetaram a atividade locomotora bem como não alteraram os índices de ansiedade. Todavia, quando injetado no complexo amigdalóide, esse agonista 5HT2 aumentou a ansiedade na dose de 1nmol, um efeito que se mostrou seletivo, pois nenhuma dose de mCPP afetou a atividade locomotora. Nossos resultados sugerem que os receptores 5HT2B,2C localizados no complexo amigdalóide, mas não os localizados no hipocampo, estão envolvidos na ansiedade eliciada pelo LCE em camundongos.