Submitted by Alisson Mota (alisson.davidbeckam@gmail.com) on 2015-07-10T20:24:13Z No. of bitstreams: 1 Tese - Simone Maria Costa de Oliveira Moreira.pdf: 1289049 bytes, checksum: 9344c925a8f9e3e24da8a85c9fd2b648 (MD5) / Approved for entry into archive by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2015-07-10T20:41:32Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Tese - Simone Maria Costa de Oliveira Moreira.pdf: 1289049 bytes, checksum: 9344c925a8f9e3e24da8a85c9fd2b648 (MD5) / Approved for entry into archive by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2015-07-10T20:46:27Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Tese - Simone Maria Costa de Oliveira Moreira.pdf: 1289049 bytes, checksum: 9344c925a8f9e3e24da8a85c9fd2b648 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-07-10T20:46:27Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tese - Simone Maria Costa de Oliveira Moreira.pdf: 1289049 bytes, checksum: 9344c925a8f9e3e24da8a85c9fd2b648 (MD5) Previous issue date: 2012-09-03 / CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Interest in the use of entomopathogenic microorganisms in agriculture have increased significantly in recent years, faced with problems of inadequate use of pesticides, the accumulation of waste on the environment and ecological imbalances. Currently, the research institutions are concerned to identify a greater number of microorganisms with potential use in biological control of pests that are adapted to the local ecosystem. On economic issues, has increased the demand for technologies that contribute to sustainable agriculture and in response, microbial control, more precisely with entomopathogenic fungi is a promising alternative. Cacao is the main crop of the Trans Territory and Xingu, Pará, and the municipality of Medicilândia the largest Brazilian producer. The coffee is a crop that had great expression in the region, especially Coffea canephora cv. Conilon, and has the potential to become important culture due to availability of culturable areas. In this context, the study aimed to identify naturally occurring entomopathogenic fungi that could be used in biocontrol of insect pests of cultivated plants, seeking the lowest imbalance to the environment. The specific objectives aimed to: i) collect, isolate, identify and characterize the occurrence of entomopathogenic fungi in insect pest of coffee and cocoa, ii) evaluate the effectiveness of microbial agents identified as the pathogenicity and virulence under controlled conditions and iii) testing the production of chitinase enzymes, pectinases, amylases, cellulases and lipases in the isolates obtained and identify them by molecular and classical methods. The work began with several hits on pastures, barns and crops of cocoa and coffee in the municipalities of Altamira, Brazil and New Medicilândia. The parasitized insects were coffee borers (H. hampei) one insect of the order Hemiptera, unidentified, and M. annulipes (monalônio) in cocoa, all colonized by fungi. Where were found parasitized insects, soil was collected for possible identification of entomopathogenic isolates, except where it was found monalônio. We found 14 isolates of fungi colonizing insects, being the main species Verticillium spp., Penicillium citrinum, Hiphopichia burtonii and Fusarium sp. and soil Rhinocladiella sp., Cladosporium sphaerospermum, Verticillium sp. and Pseudallescheria boydii. The analysis of enzymatic activity observed that soil isolates showed the largest degradation of substrates. In bioassay performed against coffee berry borer, with 7 isolates, which have shown highest mortality two H. burtonii, and Icaf 5 were the most pathogenic. Monalônio against the isolated Fusarium sp, colonized 96% of the insects in the ten-day trial. Thus, it is considered that the strains showed significant potential to be introduced in biocontrol programs, with prospects promising results for microbial control of insect pests and enzyme activity. / O interesse pelo uso de microrganismos entomopatogênicos na agricultura vêm aumentando significativamente nos últimos anos, diante dos problemas inerentes à inadequada utilização de agrotóxicos, pelo acúmulo de resíduos no ambiente e desequilíbrios ecológicos. Atualmente, as instituições de pesquisa estão preocupadas em identificar um maior número de microrganismos com potencial de utilização no controle biológico de pragas que sejam adaptados ao ecossistema local. Por questões econômicas, tem aumentado a procura por tecnologias que contribuam para uma agricultura sustentável e como resposta, o controle microbiano, mais precisamente com fungos entomopatogênicos é uma alternativa promissora. O cacaueiro é a principal cultura do Território da Transamazônica e Xingu, Pará, sendo o município de Medicilândia o maior produtor brasileiro. O cafeeiro é uma cultura que teve grande expressão na região, especialmente Coffea canephora cv. Conilon, e apresenta potencial para se tornar grande cultura devido a disponibilidade de áreas. Neste contexto, o trabalho teve como objetivo a identificação de fungos entomopatogênicos de ocorrência natural que poderão ser utilizados no biocontrole de insetos-praga de plantas cultivadas, visando o menor desequilíbrio ao meio ambiente. Como objetivos específicos propôs-se a: i) coletar, isolar, identificar e caracterizar fungos entomopatogênicos de ocorrência em insetos-praga das culturas do cafeeiro e cacaueiro; ii) avaliar a eficácia de agentes microbianos identificados quanto à patogenicidade e virulência em condições controladas e; iii) testar a produção de enzimas quitinases, pectinases, amilases, celulases e lipases nos isolados obtidos e identificá-los por métodos clássico e molecular. O trabalho teve inicio com várias visitas em áreas de pastagens, capoeiras e lavouras de cacaueiros e cafeeiros nos municípios de Altamira, Brasil Novo e Medicilândia. Os insetos parasitados encontrados foram brocas-do-café (Hypothenemus hampei), no cafeeiro, um inseto da ordem Hemiptera, não identificado, e monalonium (Monalonium annulipes), no cacaueiro, todos colonizados por fungos. Nos locais onde foram encontrados os insetos parasitados, coletou-se solos para possível identificação de isolados entomopatogênicos, exceto onde foi encontrado o monalônio. Foram encontrados 14 isolados de fungos colonizando insetos, sendo as principais espécies Verticillium spp., Penicillium citrinum, Hiphopichia burtonii e Fusarium sp. e no solo Rhinocladiella sp., Cladosporium sphaerospermum, Verticillium sp. e Pseudallescheria boydii. Na análise da atividade enzimática observou-se que os isolados do solo apresentaram as maiores degradações dos substratos testados. No bioensaio realizado contra broca-do-café, com 7 isolados, os que apresntaram maior índice de mortalidade foram H. burtonii, e Icaf 5, com 96, 94 e 62%, respectivamente, sendo os mais patogênicos. Contra o monalônio, o isolado Icac 3, Fusarium sp, colonizou 96% dos insetos nos dez dias de avaliação. Assim, considera-se que os isolados estudados demonstraram potencial importante para serem introduzidos em programas de biocontrole, com perspectivas de resultados promissores para controle microbiano de insetos-praga e atividade enzimática.

Submitted by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2014-12-18T10:55:48Z No. of bitstreams: 1 Dissertação - Juliana Camila Lopes Cavaion - 2012.pdf: 2928983 bytes, checksum: 908363ad8b87e3a821dd54fe80dcb4ce (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2014-12-18T14:24:31Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Dissertação - Juliana Camila Lopes Cavaion - 2012.pdf: 2928983 bytes, checksum: 908363ad8b87e3a821dd54fe80dcb4ce (MD5) / Made available in DSpace on 2014-12-18T14:24:32Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertação - Juliana Camila Lopes Cavaion - 2012.pdf: 2928983 bytes, checksum: 908363ad8b87e3a821dd54fe80dcb4ce (MD5) Previous issue date: 2012-06-04 / Filamentous fungi have cytochrome P450 enzyme system similar to mammals whose application allows catalyze phase I oxidative reactions of metabolism. Obtaining functionalized derivatives by these microorganisms was the main purpose of this dissertation. Studies in silico to predict metabolism in the programs MetaPrint2D and SMARTCyp indicated S-oxidation, aromatic hydroxylation and dealkylation reactions, as the most likely S-oxidation in thiomorpholine ring of 2-[4-(1,4-thiazinan-4-ylsulfonyl)phenylcarbamoyl]benzoic acid (LASSBio-596). The filamentous fungi Absidia blakesleana ATCC 26617, Aspergillus candidus ATCC 1009, Beauveria bassiana ATCC 7159, Cunninghamella echinulata ATCC 9244, Cunninghamella echinulata ATCC 9245, Cunninghamella elegans ATCC 36112, Fusarium roseum ATCC 14717 and Streptomyces vendulae ATCC 8664 were used for biotransformation of LASSBio-596. In the reaction conditions applied, substrate dissolved in methanol with concentration of 0.25 mg/mL added to liquid culture medium PDSM and incubated at 27 °C with 200 rpm for 96 hours, the fungus Beauveria bassiana ATCC 7159 performed S-oxidation in the thiomorpholine ring resulting in sulfone derivative of LASSBio-596, called LaBioCon 214, yield of 5.84 %, and it was found the hydrolysis of amide reaction obtaining the compound 4-(thiomorpholinosulfonyl)aniline, LaBioCon 202, yield of 13.8 %. It was noted the solvent used affects the biotransformation process. The monitoring of the reactions and purification of the derivatives obtained were performed by high performance liquid chromatography with ultraviolet detector at 267 nm and preparative chromatography with column Microsorb 100-5 C18 (250 x 10 mm, 5 μm). Subsequently, sulfone derivative was obtained, called LaBioCon 223, by synthesis. Structural characterization was made by classical methods such as 1H NMR and mass spectrometry. / Os fungos filamentosos possuem o sistema enzimático citocromo P450 semelhante ao de mamíferos, cuja aplicação permite catalisar reações oxidativas de fase I do metabolismo. A obtenção de derivados funcionalizados por estes microrganismos foi o objetivo principal deste trabalho. Estudos in silico de previsão do metabolismo nos programas MetaPrint2D e SMARTCyp indicaram reações de S-oxidação, hidroxilação aromática e desalquilação, sendo mais provável a S-oxidação no anel tiomorfolina do ácido 2-[4-(1,4-tiazinan-4-ilsulfonil)fenilcarbamoil]benzóico (LASSBio-596). Os fungos filamentosos Absidia blakesleana ATCC 26617, Aspergillus candidus ATCC 1009, Beauveria bassiana ATCC 7159, Cunninghamella echinulata ATCC 9244, Cunninghamella echinulata ATCC 9245, Cunninghamella elegans ATCC 36112, Fusarium roseum ATCC 14717 e Streptomyces vendulae ATCC 8664 foram empregados para biotransformação do LASSBio-596. Nas condições reacionais aplicadas, substrato solubilizado em metanol com concentração de 0,25 mg/mL adicionado ao meio de cultura líquido PDSM e incubado a 27 °C com 200 rpm por 96 horas, a Beauveria bassiana ATCC 7159 promoveu a S-oxidação no anel tiomorfolina resultando no derivado sulfona do LASSBio-596, denominado LaBioCon 214, com rendimento de 5,84 %, e constatou-se a reação de hidrólise da amida obtendo o composto 4-(tiomorfolina-sulfonil)anilina, LaBioCon 202, com rendimento de 13,8 %. Verificou-se que o solvente utilizado interfere no processo de biotransformação. O monitoramento das reações e a purificação dos derivados obtidos foram realizados por cromatografia líquida de alta eficiência com detector ultravioleta em 267 nm e cromatografia preparativa com coluna Microsorb 100-5 C18 (250 x 10 mm, 5 μm). Posteriormente, foi obtido o derivado sulfona, LaBioCon 223, por via sintética. A caracterização estrutural foi realizada por métodos clássicos como a espectroscopia de ressonância magnética nuclear de hidrogênio e espectrometria de massas.

Made available in DSpace on 2017-07-10T19:23:55Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Alexandre_ Carvalho de Moura.pdf: 1339346 bytes, checksum: c6c44c93413060ef90d9799424d1bb5d (MD5) Previous issue date: 2015-02-24 / wastewater use in agricultural soils has been adapted as an important pratice for agriculture. Due to the reduction of the availability of the quality of water resources is becoming increasingly important to add value to the use of water. The swine wastewater is rich in organic matter, composed of various elements of chemical origin, physical and biological. Its addition in soil and water resources without previous studies and knowledge of its components, can cause changes in the soil, contamination of surface and groundwater, biology changes in these environments, as well as the contribution and accumulation of groups of microorganisms in the environment, including pathogens. Most studies on swine wastewater, mainly in Brazil, are restricted to its physical and chemical components, evaluating its impact directly on the ground, water bodies or in plant productivity. Few studies focus on the microbial composition of this type of waste and especially on the risk of environmental contamination by pathogenic microorganisms or even on the impact of this element in the soil microbial community. Thus these animal manure may have an important role as initiators of infectious diseases in animals and humans. Thus, this thesis consists of two papers. In the first article, a study was done to check the bacterial composition present in swine wastewater, and to verify the possibility of eliminating these microorganisms through the main anaerobic treatment systems used in Brazil. It was evaluated in particular pathogenic microorganisms of gastrointestinal origin of the pigs and microbial environmental markers. The wastewater samples were taken from pig farms that use bio-manure storage tanks and digesters as treatment methods for the waste. The results clearly showed the presence of biomarkers and pathogens in swine wastewater. Despite the possibility of decrease of certain microbial groups throughout the stages of the treatment process, no elimination of pathogens in either treatment systems. Thus, demonstrates the possibility of the spread of pathogens and microorganisms in the environment. In the second paper, the objective was to evaluate the effect of application of swine wastewater associated with mineral fertilizer in agriculture, after a long time of application of swine wastewater in the soil microbial community. Thus, samples were collected from soils after 18 production culture cycles, with the application of wastewater from pig farms and assessed the quantitative effects (basal respiration, microbial biomass and metabolic quotient) and qualitative (DGGE, biodiversity indices, correlation between the chemical conditions and soil microbial activity) in the soil microbial community. The results showed that the application of swine wastewater, especially after long time and in higher concentrations, can change the dynamics of soil microbial community, impacting the dump site. The results of these studies show the need for further studies to apply this type of waste in agricultural soils, in order to minimize the risk of environmental contamination and/ or spread of pathogens. / A utilização de água residuária em solos agrícolas vem sendo praticada como importante opção para agricultura. Devido à redução na disponibilidade de recursos hídricos, a reutilização de água residuária vem ganhando espaço na agricultura com a agregação de valor para o uso de água. A água residuária da suinocultura é rica em matéria orgânica, composta por diferentes elementos de origem química, física e biológica. Sua adição no solo e recursos hídricos, sem estudos prévios e conhecimento de seus componentes, pode provocar contaminação de águas superficiais e subterrâneas, alterações da biologia destes ambientes, bem como o aporte e acúmulo de grupos de microrganismos no ambiente, incluindo patógenos. A maior parte dos estudos sobre água residuária da suinocultura, principalmente no Brasil, se restringe aos seus componentes físicos e químicos, avaliando seu impacto diretamente sobre o solo, corpos d´agua ou na produtividade vegetal. Poucos estudos se concentram na composição microbiana deste tipo de resíduo e principalmente sobre o risco de contaminação ambiental por microrganismos patogênicos ou mesmo sobre o impacto deste elemento na comunidade microbiana do solo. Desta forma estes dejetos animais podem apresentar importante papel como iniciadores de doenças infecciosas em animais e seres humanos. Este trabalho de tese é constituído de dois artigos. No primeiro artigo, foi feito um estudo para verificar a composição bacteriana presente na água residuária da suinocultura, bem como verificar a possibilidade de eliminação destes microrganismos através dos principais sistemas de tratamento anaeróbicos utilizados no Brasil. Foram avaliados em especial os microrganismos patogênicos, de origem gastrointestinal dos suínos e bioindicadores microbianos. As amostras de água residuária utilizadas foram provenientes de granjas que utilizavam de sistemas anaeróbicos com esterqueiras e biodigestores no tratamento do resíduo. Os resultados obtidos mostraram claramente a presença de coliformes, mesofilos aeróbios, bolores e leveduras, enterococos e patógenos na água residuária da suinocultura. Apesar da possibilidade de decréscimo de determinados grupos microbianos ao longo das etapas dos processos de tratamento, não houve eliminação de patógenos em nenhum dos dois sistemas de tratamento, o que pode possibilitar a disseminação de microrganismos e patogenos no meio ambiente. No segundo artigo, o objetivo foi avaliar o efeito da aplicação da água residuária da suinocultura associada a adubação mineral, em área agrícola, após longo tempo de aplicação, na comunidade bacteriana do solo. Assim, foram coletadas amostras de solo com 18 ciclos de produção, com aplicação de água residuária de suinocultura e avaliados os efeitos quantitativos (respiração basal, biomassa microbiana e quociente metabólico) e qualitativos (DGGE) na comunidade bacteriana do solo. Os resultados mostraram que a aplicação de água residuária da suinocultura, principalmente após longo tempo e em concentrações maiores, pode alterar a dinâmica da comunidade bacteriana do solo, impactando no local de despejo. Os resultados dos artigos mostram a necessidade de maiores estudos para aplicação deste tipo de resíduo na agricultura, a fim de minimizar os riscos de contaminação ambiental e ou disseminação de patógenos.

No presente estudo, duas espécies de fungos isoladas do ambiente marinho tiveram seus extratos brutos ativos contra Staphylococcus aureus e Candida albicans para uma espécie de P. citrinum e, atividade citotóxica e contra Mycobacterium tuberculosis para uma espécie de P. oxalicum. Estas foram estudadas com a finalidade de otimizar suas condições de crescimento para produção de metabólitos secundários. Foram realizadas análises multivariadas utilizando planejamento fatorial fracionário. Foram obtidas duas condições ótimas de crescimento para as duas linhagens de Penicillium. O crescimento em maior volume em condições de cultura otimizadas para P. oxalicum permitiu observar a presença de três metabólitos secundários no extrato do meio de cultura. Dois puderam ser isolados e identificados: a meleagrina 52 e a oxalina 26. A metodologia utilizada para se obter uma maior quantidade de metabólitos secundários proporcionou, ainda, o incremento em cerca de 150% na área do pico da oxalina. A partir do crescimento em maior volume em condições de cultura otimizadas para P. citrinum foi possível observar presença de pelo menos onze diferentes metabólitos na análise dos extratos obtidos do meio de cultura. Foi possível identificar e isolar quatro compostos já conhecidos: a (8E)-1-(2,3-diidropirrol-1-il)-2-metildec-8-eno-1,3-diona 56; a 1-(2,3-diidropirrol-1-il)-2-metildecano-1,3-diona 58; a 2-((E)-hept-5-enil)-6,7,8,8a-tetraidro-3-metilpirrolo[2,1-b][1,3]oxazin-4-ona 59 e a citrinina 31. Também foram isolados dois novos alcalóides indólicos contendo um grupo nitro na molécula que foram nomeadas de citrinalinas A 60 e B 62. Foi realizado, também, um estudo com P. citrinum visando a maior produção das citrinalinas, que possibilitou o incremento na produção da citrinalina B. / In this study, two species of fungi isolated from the marine environment had their active extracts against Staphylococcus aureus and Candida albicans to a strain of P. citrinum, and activity cytotoxic and against Mycobacterium tuberculosis to a strain of P. oxalicum. This studied aims the optimization their growth conditions for the production of secondary metabolites. Multivariate analysis using a fractional factorial design were used to establish optimal growth conditions for both Penicillium strains. Two optimal growth conditions were obtained for both Penicillium strains. A largest growth volume of P. oxalicum using optimized conditions enabled the detection of three secondary metabolites in the culture media crude extract. Two of such compounds were isolated and identified: meleagrin 52 and oxaline 26. The methodology used to increase the production of secondary metabolites by P. citrinum enabled an increase of 150% in the peak area of oxaline. A largest growth volume of P. citrinum led to the detection of eleven different metabolites in the culture media. Four of these compounds were isolated and identified as the known (8E)-1-(2,3-dihydropyrrol-1-yl)-2-methyldec-8-ene-1,3-dione 56; the 1-(2,3-dihydropyrrol-1-yl)-2-methyldecane-1,3-dione 58; the 2-((E)-hept-5-enyl)-6,7,8,8a-tetrahydro-3-methylpyrrolo[2,1-b][1,3]oxazin-4-one 59 and citrinin 31. Two new indole alkaloids containing a nitro group were also isolated and identified, named citrinalins A 60 and B 62. A further study with P. citrinum aiming an enhanced production of citrinalins allowed a significant increase in the production of citrinalin B.

A presença de bactérias na base de microplantas estabelecidas in vitro, acarreta o descarte da cultura, tornando a técnica onerosa. Entretanto, há de se considerar que nem sempre a presença dos microrganismos afeta o desenvolvimento das plantas em diferentes fases da micropropagação, inferindo que essas colônias são resultantes de exsudações de endófitos da espécie cultivada. Neste contexto, o presente trabalho visou verificar as possíveis influências da manifestação bacteriana endofítica no desenvolvimento in vitro de clones de Eucalyptus benthamii. Para tanto, foram útilizados quatro clones (BP101; BP115, BP118 e BP120), em duas etapas de desenvolvimento: multiplicação e alongamento e, embora o processo in vitro fosse o principal foco da pesquisa, as análises estenderam-se para a fase de aclimatização, ou seja, desenvolvimento ex vitro. As microcepas foram mantidas in vitro sob dois tipos de manifestações bacterianas, as quais por sua vez, foram distintas quanto à coloração em: manifestação de colônias amarelas e manifestação de colônias brancas e, o controle, sem manifestação. Para compreender o desenvolvimento das microplantas na presença dos microrganismos, foram avaliados os parâmetros referentes ao incremento em massa seca, número de brotações, brotações alongadas e enraizamento, bem como características anatômicas e bioquímicas (produção de malondealdeído e teor de nitrogênio) das mesmas. Por meio da identificação molecular por BOX-PCR os isolados bacterianos foram agrupados e posteriormente identificados por sequenciamento parcial do gene 16S rRNA. As linhagens bacterianas identificadas foram analisadas quanto à produção de AIA e fixação de nitrogênio, sendo as linhagens com os melhores resultados utilizadas na bacterização de microcepas de duas diferentes espécies de eucalipto (E. benthamii e E. cloeziana). Os resultados evidenciaram que nem toda presença microbiana in vitro é prejudicial às plantas micropropagadas, pelo contrário, observou-se que na maioria dos casos em E. benthamii, as manifestações possuem efeito neutro ou benéfico, promovendo o desenvolvimento das microplantas. As manifestações brancas e/ou amarelas constituíam uma associação de bactérias, com alta especificidade na interação endófito/microplanta. As análises moleculares identificaram similaridade com seis gêneros bacterianos: Curtobacterium (Actinobacteria), Bacillus e Aneurinibacillus (Firmicutes), Delftia (Betaproteobacteria), Bradyrhizobium, e Novosphingobium (Alphaproteobacteria), onde alguns deles mostraram-se comuns nos diferentes clones, sendo a Curtobacterium presente em todas as manifestações de todos os clones de E. benthamii analisados. Os resultados obtidos com a bacterização de diferentes espécies de eucalipto reforçam a especificidade da microbiota endofítica manifestada com seu hospedeiro, uma vez que a introdução de um isolado (inóculo) pode ocasionar alteração no equilíbrio do sistema de interação estabelecido, acarretando na redução ou simplesmente mantendo estável a taxa de crescimento das microplantas. Dessa forma, diante do atual panorama das biofábricas, as quais descartam inúmeras microplantas cultivadas in vitro em decorrência das manifestações bacterianas, evitar o descarte das microcepas e controlar sua manifestação, representa minimizar consideravelmente os prejuízos para as empresas e setores de pesquisas. / The occurrence of bacteria growing together with microplants in vitro conditions frequently lead to discard of the material, increasing the costs on the micropropagation techniques. However, the microorganisms presence on the bacterial cultures do not always affect the plant development during the different phases of micropropagation because the bacteria colony probability are originated from self microplants as endophytic manifestations. This study evaluated the possible influences of the endophytic bacterian manifestation in the development of Eucalyptus benthamii growing on in vitro conditions. To access the evaluations were used four clones (BP101, BP115, BP118 e BP120) in two phases of microplants in vitro development: multiplication and elongation. The microstumps were grown under two different kinds of bacterial manifestations, distinguishable by colors in: white colony manifestations, yellow colony manifestations and no manifestations (control). To elucidate the microstumps development under the microorganisms presence, were evaluated referent parameters to the dry mass increasing, number of shoots, elongated shoots and rooting, as well as anatomical and biochemical characteristics alterations (malondialdehyde and nitrogen content). After bacterial isolation, they were grouped and identified by BOX-PCR, using partial sequencing of 16S rRNA gene. On the sets of the identified bacteria were analyzed for the AIA production and the nitrogen fixation, and those with better results were used to bacterizate another microstumps of two different Eucalyptus species (E. benthamii and E. cloeziana). The results indicate that the presence of in vitro microrganisms and microstumps together not always affect negatively the plant development. In opposite, bacterial manifestations brought benefits, stimulating the microstumps growth or do not affecting the growth of E. benthamii in vitro conditions. Actually, the white and yellow manifestations represents clusters of different bacteria, with high specificity in the interaction microstumps and endophytic. Molecular approaches identified through similarity analysis, six bacterial genus: Curtobacterium (Actinobacteria), Bacillus and Aneurinibacillus (Firmicutes); Delftia (Betaproteobacteria), Bradyrhizobium and Novosphingobium (Alphaproteobacteria). The occurrences of several of the bacteria were common among some clones, and Curtobacterium was present in all clones of E. benthamii analyzed. The results obtained by bacterization of two different Eucalyptus species confirmed that there is a high specificity between endophytic microorganisms\" manifestations and its host plants, because the artificial bacteria introduction can causes alterations on the equilibrium of the establishment system of plant-microorganism interactions, reducing or stabilizing growth rates on microstumps. Considering the current situation about the biofactories, which usually discard great amount of cultivate microplants in vitro because of the bacterial manifestation, it´s possible avoid these plant discard and make a control of their manifestations, with the intention to minimize substantially the losses in biofactories and also in research laboratories.

A cultura de tecidos tem sido uma importante ferramenta amplamente utilizada para diversas finalidades, dentre elas a micropropagação tem merecido destaque devido à rápida produção de mudas saudáveis num espaço físico reduzido. Dentro deste contexto, o termo, plantas axênicas, tem sido difundido como um ideal a ser atingido nesta técnica, havendo a busca cada vez maior de métodos que eliminem de forma eficaz toda e qualquer contaminação que possa, eventualmente, crescer no meio de cultura. No entanto, cada vez mais se observa que a concepção de contaminação dentro da cultura de tecidos deve ser revista, assim como a de planta axênica, pois inúmeros trabalhos têm mostrado, que mesmo em microplantas assintomáticas consideradas axênicas, existe uma comunidade endofítica onipresente e que na sua grande maioria desempenha papel fundamental no estabelecimento, desenvolvimento e aclimatização das culturas, sendo, portanto, microrganismos benéficos que devem ser conservados no cultivo in vitro. Dessa forma, o presente trabalho teve como principal objetivo investigar a microbiota endofítica presente em diversas espécies de microplantas assintomáticas consideradas axênicas, independente de seu protocolo de cultivo in vitro, local, método de micropropagação e manipulação. Para tal, foram utilizadas microplantas assintomáticas, em fase de multiplicação por mais de um ano, provenientes de três laboratórios diferentes, submetidas à caracterização por meio de testes histoquímicos, à análises ultraestruturais, a isolamento em diferentes meios de cultura por dois métodos (trituração e fragmentação), à análises moleculares utilizando a extração do DNA genômico total e PCR-DGGE, além da extração e sequenciamento do DNA dos isolados obtidos. Os resultados obtidos pelo isolamento, testes moleculares e análises ultraestruturais, evidenciaram a presença de uma comunidade endofítica, colonizando os tecidos de diferentes espécies de microplantas, provenientes de três laboratórios distintos. Dessa forma, conclui-se que a inexistência de plantas axênicas deve ser considerada, futuramente, como um aspecto positivo dentro da cultura de tecidos, uma vez que, essa comunidade endofítica pode atribuir características de interesse agronômico às diferentes espécies vegetais. / Tissue culture has been an important tool widely used for various purposes, among them the micropropagation has been highlighted due to the rapid production of healthy seedlings in a small space. Within this context, the term axenic plant has been distributed as an ideal to be achieved in this technique, which the search based on numerous methods that effectively eliminate any contamination that may eventually grow into the culture medium. However, it is seen that the conception of contamination in tissue culture should be reviewed as well as axenic plants, because several studies have shown that even in asymptomatic microplants considered axenic, there is an ubiquitous and that the endophytic community mostly plays a fundamental role in the establishment, development and acclimatization of cultures, therefore, beneficial microorganisms that should be preserved in vitro. Thus, this study aimed to investigate the endophytic microbiota present in several species of micro asymptomatic considered \"axenic\" regardless of their protocol for in vitro culture, location, method of micropropagation and manipulation. For this purpose, were used asymptomatic microplants in multiplication stage by more than one year, from three different laboratories, and were submitted to characterization by histochemistry tests, ultrastructural analysis, isolation in different culture medium by two methods (grinding and fragmentation), molecular analyses using the extraction of total genomic DNA and PCR-DGGE, in addition to extracting and sequencing the DNA of the isolates obtained. The results obtained by the isolation, molecular and ultrastructural analysis, showed the presence of an endophytic community colonizing the tissues of different species of microplants, from three different laboratories. Thus, it was concluded that the inexistence of axenic plants should be considered in future as a positive aspect in the tissue culture, since this endophytic community can give agronomical traits to different crop species.

Tecidos vegetais, incluindo as sementes, são habitados por microrganismos denominados endofíticos, cuja interação com a planta pode conferir características vantajosas ao hospedeiro. Sabe-se que o crescimento de plantas é influenciado por fatores como a síntese de ácido-indolacético (AIA), solubilização de fosfato, fixação de nitrogênio e controle de fungos fitopatogênicos. Antes da comercialização, as condições de armazenamento de sementes de soja podem restringir o desenvolvimento de microrganismos devido à baixa temperatura e umidade. Esse fato leva ao interesse de exploração de microrganismos endofíticos resistentes a essas condições. O estudo e a caracterização dessas comunidades são de grande interesse agronômico e biotecnológico, sendo possível sua aplicação em sementes, introduzindo no campo plantas com superior potencial de produção. Com os objetivos de comparar a comunidade bacteriana endofítica de sementes de soja geneticamente modificadas e convencionais; e de isolar e caracterizar essas comunidades, sementes de 12 cultivares de soja foram amostradas, de onde 3504 isolados bacterianos foram obtidos. Os isolados foram agrupados morfologicamente de acordo com a coloração e taxa de crescimento das colônias, sendo representantes de cada grupo morfológico (no total 176 isolados) agrupados pela técnica de ARDRA (Análise de Restrição de DNA Ribossomal Amplificado). Um total de 12 ribotipos foi observado compondo a comunidade cultivada de bactérias endofíticas de sementes de soja. Representantes destes ribotipos tiveram seus genes 16S rDNA parcialmente sequenciados, identificando os integrantes desta comunidade como: Acinetobacter sp., Bacillus sp., Brevibacterium sp., Chryseobacterium sp., Citrobacter sp., Curtobacterium sp., Enterobacter sp., Methylobacterium sp., Microbacterium sp., Micromonospora sp., Pantoea sp., Paenibacillus sp., Pseudomonas sp., Ochrobactrum sp., Streptomyces sp. e Tsukamurella sp. A comunidade bacteriana endofítica de sementes de soja provenientes de plantas genticamente modificadas apresentou uma diversidade maior comparada à comunidade bacteriana de plantas convencionais. Em relação ao potencial biotecnológico desta comunidade, os resultados demonstraram que os isolados foram capazes de controlar o crescimento de fungos fitopatogênicos por antagonismo (18%), sintetizar AIA (100%), solubilizar fosfato (39%) e fixar nitrogênio (18%). Os isolados com os melhores resultados nas análises in vitro foram inoculados em sementes de soja e avaliados em casa de vegetação quanto à habilidade de promover o crescimento das plantas. As plantas apresentaram diferentes respostas à inoculação das bactérias. A maior parte dos tratamentos mostrou influência negativa das bactéria nas plantas, enquanto que um isolado de Enterobacter sp. aumentou a massa da matéria seca de raiz. Mesmo não diferindo estatisticamente, alguns isolados mostraram tendência de aumento e outros de diminuição de biomassa da planta. / Plant tissues, including seeds, are inhabited by microorganisms called endophytes, whose interaction with the plant can offer advantages to the host. It is known that plants growth promotion is induced by indole acetic acid (IAA) synthesis, phosphate solubilization and nitrogen fixation, among others. The control of phytopathogenic fungi is also related to a good plant development. Before commercialization, the seed storage conditions can restrict the development of microorganism, due to the low temperature and humidity. This fact leads to the interest of exploring resistant microorganisms to those conditions. The study and the characterization of these communities are of great agronomic and biotechnological interest, being possible its application onto seeds, introducing in the field plants with a greater production potential. In this context, the aim of this study was to isolate and identify the endophytic bacteria community in soybean seeds and study the capacity of these isolates to promote growth in the host plant, including: phosphate solubilization, nitrogen fixation, IAA synthesize and antagonism against phytopathogenic fungi. From seeds of 12 cultivars, 3504 bacteria were isolated. The isolates were morphologically grouped according to the coloration and growth rate of the colony. Representatives of each morph group, totalizing 176, were analyzed using the Amplified Ribosomal Restriction Analysis (ARDRA) technique. A total of 12 ARDRA ribotypes were observed in the cultivable endophytic community of soybean seeds. Representatives of each ribotype had their 16S rDNA gene partially sequenced, allowing to the identification of the members of this community as: Acinetobacter sp., Bacillus sp., Brevibacterium sp., Chryseobacterium sp., Citrobacter sp., Curtobacterium sp., Enterobacter sp., Methylobacterium sp., Microbacterium sp., Micromonospora sp., Pantoea sp., Paenibacillus sp., Pseudomonas sp., Ochrobactrum sp., Streptomyces sp. and Tsukamurella sp. The endophytic bacterial community of soybean seeds from genetically modified plants showed a greater diversity compared to the bacterial community of conventional seeds. In relation to the biotechnological potential of the community, the outcomes demonstrate that the isolates were able to antagonist phytopathogenic fungi (18%), synthesize IAA (100%), solubilize phosphate (39%) and fix nitrogen (18%). The isolates with best in vitro outcomes were inoculated onto seeds and tested in greenhouse for their ability to promote growth in soybean. The plants answered differently to the inoculation of each bacterial isolate. The major part of the treatments demonstrated a negative influence of bacteria onto plants, while one Enterobacter sp. isolate increased the dry mass weight of roots. Even not differing statistically, some isolates showed a tendency to increase, meanwhile others to decrease the biomass of the plant.

O cultivo in vitro de plantas possibilita o controle de fatores ambientais e nutricionais, facilitando o estudo da interação planta-bactéria e a interpretação de eventuais alterações morfofisiológicas nas microplantas, decorrentes dessa interação. Entretanto, a presença de bactérias endofíticas na micropropagação é quase sempre caracterizada como contaminação microbiana prejudicial, sendo prontamente eliminada com o uso de quimioterápicos. Essa abordagem desconsidera os efeitos benéficos que bactérias endofíticas podem trazer ao desenvolvimento vegetal, aniquilando a possibilidade de se explorar esse potencial no ambiente in vitro. Em geral, devido a sua baixa culturabilidade, as comunidades bacterianas endofíticas requerem o uso de técnicas independentes de cultivo para seu estudo. Neste contexto, o presente trabalho teve como objetivo principal comprovar a presença de uma comunidade bacteriana endofítica em microplantas de abacaxizeiro (Ananas comosus (L.) Merrill) cv. IAC Gomo-de-mel consideradas axênicas e os efeitos dessa comunidade na morfofisiologia vegetal após antibioticoterapia. Para tanto, técnicas de PCR-DGGE, PCR-ARISA, clonagem, sequenciamento, análises estruturais e ultraestruturais foram utilizadas. Os resultados evidenciaram que existe uma comunidade bacteriana endofítica composta por membros de Alfa, Beta, gama -proteobactérias, actinobactérias e cianobactérias, que coloniza as microplantas. Os resultados convergentes de PCR-DGGE e PCR-ARISA mostraram que essa comunidade apresentou alteração na sua estrutura e diversidade de acordo com seu nicho de colonização e com o período de cultivo da planta hospedeira, sem renovação de meio de cultura. A ação da antibioticoterapia influenciou a estrutura da comunidade bacteriana, promovendo impactos diferenciados em cada grupo bacteriano avaliado. A antibioticoterapia não promoveu a total eliminação das bactérias endofíticas. Contudo, os tratamentos ocasionaram alterações na comunidade bacteriana, resultando na redução do crescimento de raízes e outras alterações histológicas no sistema radicular das microplantas. As análises ultraestruturais comprovaram a presença de bactérias endofíticas colonizando intracelularmente o mesofilo foliar e o córtex de raízes, mesmo após a antibioticoterapia. Dessa forma, conclui-se que em microplantas de abacaxizeiro assintomáticas existe uma comunidade bacteriana endofítica intracelular, rompendo o principal paradigma da cultura de tecidos vegetais, no qual microplantas são obrigatoriamente axênicas. / The in vitro culture of plants by the control of environmental and nutritional factors, allows the study of the plant-bacteria interaction and the interpretation of possible morphophysiological changes in the microplants, from such interaction. However, the presence of endophytic bacteria in micropropagation is often characterized as harmful microbial contamination, which is promptly eliminated by the use of chemotherapeutics. This approach does not take into account the beneficial effects that endophytic bacteria can bring to the plant development, and annihilates the possibility of exploiting this potential in the in vitro environment. In general, due to its low culturability, endophytic bacterial communities require the use of culture-independent techniques for their study. In this context, this work aimed to prove the presence of bacterial endophytes in pineapple (Ananas comosus (L.) Merrill) cv. IAC Gomo-de-mel microplants considered axenics, and the effects of these in plant morphophysiology after antibiotictherapy. For this, PCR-DGGE, ARISA-PCR, cloning, sequencing, structural and ultrastructural analysis were used. The results showed that there is an endophytic bacterial community, composed of members of , , -proteobacteria, actinobacteria and cyanobacteria, which colonizes the microplants. The converging results of PCR-DGGE and ARISA-PCR showed that this community changed in its structure and diversity according to its niche of colonization and the period of cultivation of the host plant, without renewal of culture medium. The action of antibiotics influenced the bacterial community structure, promoting differential impacts on each bacterial group evaluated. Antibiotictherapy did not promote the total elimination of endophytic bacteria. However, the treatments caused changes in bacterial community, resulting in reduced growth of roots and other histological changes in the root system of the microplants. The ultrastructural analysis confirmed the presence of endophytic bacteria colonizing the intracellularly the leaf mesophyll and the cortex of roots, even after antibiotictherapy. Thus, it is concluded that in asymptomatic pineapple microplants there is an intracellular endophytic bacterial community, breaking the main paradigm of plant tissue culture, in which axenic microplants are mandatory.

Os microrganismos endofíticos são aqueles, cultiváveis ou não, que habitam o interior da planta hospedeira sem causar danos aparentes ou estruturas externas visíveis. Essa interação planta-microrganismo é intrínseca a determinadas espécies de plantas e/ou bactérias. Nas últimas décadas os estudos de microrganismos endofíticos têm sido realizados em diversas plantas hospedeiras, sendo esses estudos direcionados, principalmente, para a diversidade e características benéficas induzidas, como o controle biológico de doenças. As doenças com sintomas de murcha e cancro são consideradas emergentes no setor florestal. O Brasil está entre os maiores produtores mundiais de Eucalyptus e a expansão do setor, juntamente com o cultivo clonal, tem acarretado o aumento da incidência de patógenos. O surgimento de novas doenças exige estudos relacionados tanto a interação do agente patogênico com hospedeiro quanto de todos os componentes do patossistema. Neste contexto, os microrganismos endofíticos e do rizoplano têm sido descritos como potenciais controladores biológicos de doenças. Dessa forma, o presente trabalho teve por objetivos avaliar a interação da comunidade bacteriana associada a Eucalyptus sp. com fungos causadores de murcha e cancro. Foi também estudada a diversidade e colonização desses endófitos em sementes e o efeito da germinação nessa interação. Adicionalmente, foi realizada uma busca por bactérias associadas a Eucalypus sp. com capacidade de controlar fungos causadores de murcha e cancro. Foi observado que a densidade bacteriana endofítica não difere entre as espécies de Eucalyptus citriodora, E. urophylla e E. globulus x E. grandis avaliadas e que esta comunidade cultivada é composta por bactérias pertencentes às classes Actinobacteria, Proteobacteria e Firmicutes. Com uso de diferentes ferramentas de estudo foi observado que a quantidade de bactérias endofíticas nas sementes aumenta proporcionalmente ao tempo de germinação. Foi observado também que os sintomas de murcha e cancro causados, principalmente, por Ceratocystis fimbriata podem ser causados por outros fungos patogênicos. Foram identificados 41 isolados bacterianos endofíticos e do rizoplano com capacidade de controlar fungos patogênicos causadores de murcha e cancro em Eucalyptus sp. Adicionalmente ao potencial para uso no controle biológico do cancro e da murcha de Eucalyptus, as bactérias de sementes aqui relatadas, podem ter papel importante de proteção das plantas no campo. Futuros estudos devem ser direcionados para identificação de genes associados a essa inibição, bem com análise dos fatores responsáveis por este controle biológico no campo. / The endophytic microorganisms are those, cultivated or not, that inhabit the interior of the plant host without causing apparent damages or visible external structures. This interaction plant-microorganism is specific to certain species of plants and/or bacteria. In the last few years studies of endophytic microorganisms have been carried out for several plant hosts, which are focused mainly to diversity and biotechnological potential, such as biological control of disease. Brazil is one of the largest world Eucalyptus producers and the increasing of the Eucalyptus production associated to clonally reproduction has allowed an increasing incidence of some pathogens. These new disease demands on studies related to causal agent and biotic and abiotic factors associated to the diseases. The canker of Eucalyptus is considered an emerging disease by several reforestation companies. In that way, the rhizoplane and endophytic microorganisms has been described as potential diseases biological control agents. In this context, the aims of the present work were to assess the bacterial community associated to Eucalyptus sp. plants and seeds, besides the interaction with the wilt and canker pathogenic fungi. We also assessed the diversity and colonization effect of seed germination on bacterial community. Additionally, was carried out a screening of the Eucalypus sp. associated bacteria against pathogenic fungi that cause wilt and canker. We observed that endophytic bacterial density doesn\'t differ among the species of Eucalyptus citriodora, E. urophylla and E. globulus x E. grandis and that this cultivated community is composed by follow bacterial classes Actinobacteria, Proteobacteria and Firmicutes. Using different study approaches was observed that the amount of endophytic bacteria in the seeds increases proportionally at the germination time. We also observed that the symptoms of wilt and canker caused, mainly, by Ceratocystis fimbriata may be caused by other pathogenic fungi too. Additionally, were identified 41 endophytic and rhizoplane bacterial isolates able to control pathogenic fungi that cause Eucalyptus wilt and canker. Besides to the wilt and canker biological control potential of that bacteria, the seed endophyte identified in the present work can have important function on plant protection in the field. New studies should be addressed for identification of genes related to antagonism, besides of factors responsible for biological control occurrence in the field.

A Clorose Variegada dos Citros (CVC), doença que causa graves prejuízos à citricultura no estado de São Paulo, é causada pela bactéria Xylella fastidiosa que é transmitida pelas cigarrinhas Bucephalogonia xanthophis (Berg), Dilobopterus costalimai (Young), Acrogonia citrina (Marucci & Cavichioli) e Oncometopia facialis (Signoret). Durante a alimentação em plantas afetadas, esses insetos adquirem a bactéria, que coloniza o pré-cibário e o cibário, e depois são capazes de transmitir a doença para plantas sadias. Colonizando o xilema das plantas de citros encontram-se também bactérias endofíticas, que são microrganismos capazes de colonizar internamente tecidos de plantas sem causar dano aparente, e que podem interagir com patógenos no interior do hospedeiro. Este trabalho teve como objetivo avaliar a comunidade bacteriana associada as cigarrinhas vetoras de CVC, e observar as possíveis interações que ocorrem entre insetos vetores de X. fastidiosa e bactérias endofíticas de citros. Primeiramente foi feito um isolamento das bactérias da cabeça de cigarrinhas coletadas em pomares de citros afetados com CVC. Foram isoladas um total de 17230 bactérias de três espécies de cigarrinhas (O. facialis, D. costalimai e A. citrina) em três datas diferentes (22/março, 05/maio e 14/junho de 2002), que foram primeiramente classificadas em 9 grupos morfológicos. Do total, 120 bactérias representantes foram avaliadas por ARDRA e classificadas em 16 haplótipos, dos quais alguns foram identificados, por seqüenciamento da região 16S do rDNA, como Methylobacterium sp. e Curtobacterium sp., que são bactérias endofíticas de citros já descritas e que interagem com X. fastidiosa em citros. Primers específicos para estas bactérias foram utilizados para PCRs com o DNA total da cabeça de cigarrinhas e variou de 39,1% a 89,6% nas diferentes espécies. A comunidade bacteriana associada às cigarrinhas foi também avaliada por DGGE e apresentou variações quanto ao inseto hospedeiro e quanto à época das avaliações. Um isolado de M. mesophilicum expressando o gene da proteína verde fluorescente (GFP ? Green Fluorescent Protein) foi utilizado para experimento de transmissão deste endófito por B. xanthophis. Os insetos se alimentaram em membrana contendo a solução da bactéria e depois foram colocados em plantas de Catharanthus roseus. Das plantas, 13% apresentaram a bactéria fluorescente colonizando tecidos endofiticamente, o que indica que a cigarrinha é capaz de transmitir o endófito. Testes para a avaliação da produção de moléculas de quorum sensing (AHLs - Acil Homocerina Lactonas) foram feitos para M. mesophilicum e M. extorquens. Foram ainda desenvolvidos mutantes de M. extorquens, defectivos para a produção de biofilme e AHLs. / The Citrus Variegated Chlorosis (CVC), a very important disease which attacks citrus trees in the state of São Paulo, is caused by the xylem-limited bacteria, Xylella fastidiosa, which is transmitted by four species of sharpshooters (Cicadellidae) Bucephalogonia xanthophis (Berg), Dilobopterus costalimai (Young), Acrogonia citrina (Marucci & Cavichioli) and Oncometopia facialis (Signoret) which are capable of acquiring X. fastidiosa from the xylem while feeding. In plants, endophytic bacteria, which inhabit the interior of aerial plant parts developing an asymptomatic infection and show potential benefits as biocontrol agents of pests and diseases, may colonize the same niche of pathogens, such as X. fastidiosa, what could allow endophytes to interact with the pathogen. Bacteria were isolated from head of insect vectors, collected on affected citrus plants. From 17230 bacteria isolated from the heads of three insect species (O. facialis, D. costalimai and A. citrina) in three different days (22/march, 05/may and 14/june of 2002), 120 bacteria were tested with ARDRA and classified into 16 different haplotypes. The most frequent strains had their 16S rDNA fragment sequenced and they were identified as Methylobacterium sp. and Curtobacterium sp., bacteria which have been described as citrus endophytes which interact with X. fastidiosa. Total DNA of insect heads was used in Nested PCRs for detection of these citrus endophytes in insects. The frequencies of detection ranged from 39,1% to 89,6%. The bacterial community associated to sharpshooters was also evaluated by DGGE and presented variations due to insect host and time of the evaluations. One M. mesophilicum isolate, expressing the GFP (Green Fluorescent Protein), was used to test the transmission of endophytes by B. xanthophis. Insects fed on membranes containing a bacterial solution and after were trapped on Catharanthus roseus. From the evaluated plants, 13% presented the fluorescent protein colonizing endophytically, indicating that the insect is able to transmit the endophytic bacteria. Biofilm and quorum sensing molecules (AHLs - Acyl Homocerine Lactones) production by Methylobacterium sp. were tested, and M. extorquens mutants for both features were produced.