O herpesvirus equino tipo 1 (EHV-1) é um importante patógeno que causa doença respiratória, abortamento e desordens neurológicas em equinos. O presente estudo foi realizado visando avaliar a resposta inflamatória causada pelo EHV-1 por meio da análise das manifestações clínicas, alterações histopatológicas e resposta imune do hospedeiro no sistema nervoso central (SNC). Camundongos das linhagens BALB/c (H2d), C57BL/6 (H2b) e C3H/HeJ (H2k) foram inoculados por via intranasal com as estirpes brasileiras A4/72 e A9/92 do EHV-1. Nesse estudo, associou-se a histopatologia, a resposta de citocinas pró-inflamatórias no SNC de camundongos das diferentes linhagens e o método de transcrição reversa seguida pela reação em cadeia da polimerase quantitativa em tempo real (RT-qPCR) para investigar a relação entre a infecção pelo EHV-1 e a resposta inflamatória com o desenvolvimento de lesões. As estirpes brasileiras A4/72 e A9/92 do EHV-1 causaram infecção aguda e letal nas diferentes linhagens de camundongos isogênicos. Os sinais clínicos e neurológicos, tais como perda de peso, pelos arrepiados, postura arqueada, apatia, dispneia, desidratação e sialorreia apareceram entre o 2º e 3º dia pós-infecção (dpi). Essas manifestações foram acompanhadas pelo aumento da sensibilidade a estímulos externos, convulsões, recumbência e morte. As alterações histopatológicas consistiram em necrose neuronal, edema, necrose de liquefação, leptomeningite neutrofílica, manguito perivascular, hemorragia focal, inflamação não supurativa, gliose multifocal e infiltração perivascular de células polimorfonucleares e mononucleares. As características e a extensão das lesões variaram entre as linhagens de camundongos. Animais inoculados com a estirpe A4/72 apresentaram lesões histopatológicas de maior grau de severidade quando comparados com aqueles inoculados com a estirpe A9/92. Observou-se aumento da concentração plasmática de TNF-α, IL-6, CCL2 e IFN-γ nos camundongos infectados pelo EHV-1 no 2º dpi. Detectou-se aumento da concentração plasmática e da expressão de mRNA para TNF-α, IL-6 e CCL2 no SNC dos camundongos infectados pelo EHV-1 no 3º dpi; entretanto, não houve aumento da concentração plasmática nem da expressão de mRNA para IFN-γ no 3º dpi. Evidenciou-se que a estirpe A4/72 do EHV-1 induz uma resposta imune sistêmica mais efetiva, enquanto que o vírus A9/92 culmina em uma resposta imunológica mais efetiva no SNC. Os camundongos com o fundo genético C57BL/6 e BALB/c mostraram níveis mais altos de expressão de mRNA para TNF-α, IL-6 e CCL2, quando comparados com os C3H/HeJ. A gravidade dos sinais clínicos observados em camundongos infectados pode ser correlacionada com o pico dessas citocinas pró-inflamatórias (TNF-α e IL-6) e da quimiocina CCL2, que são produzidas logo após a infecção viral por células residentes da glia e/ou infiltrativas no SNC. Esses achados indicam que as diferentes linhagens de camundongos isogênicos são susceptíveis à infecção por estirpes neuropatogênicas do EHV-1; as diferenças no padrão de alterações histopatológicas mostram que elas dependem do hospedeiro infectado, da estirpe viral e da resposta imunológica; e a supressão do interferon (IFN) tipo 1 sugere ser um mecanismo de escape do EHV-1 frente ao sistema imune. A baixa expressão de IL-6, TNF-α e da quimiocina CCL2 em camundongos C3H/HeJ se explica pela mutação no gene toll-like receptor 4 (TLR-4) existente nessa linhagem de camundongo. Adicionalmente, os camundongos C3H/HeJ apresentaram lesões histopatológicas mais severas no SNC quando comparados com BALB/c e C57BL/6. Sugere-se que o IFN tipo I e o gene TLR-4 apresentam importante papel na patogênese do EHV-1 bem como proteínas do agente viral responsáveis pela supressão do IFN e partículas virais que sejam reconhecidas pelo TLR-4 podem ser alvos para o desenvolvimento de novas abordagens para o tratamento da doença viral e para a eficiência de imunógenos / The equine herpesvirus type 1 (EHV-1) is an important pathogen that causes respiratory disease, abortion and neurological disorders in horses. This study was conducted to evaluate the inflammatory response caused by EHV-1 by the analysis of clinical manifestations, histopathological changes and the host immune response in the central nervous system (CNS). BALB/c (H2d), C57BL/6 (H2b) and C3H/HeJ (H2k) mice were inoculated intranasally with Brazilian EHV-1 strains A4/72 and A9/92. In this study, joined histopathology, the response of proinflammatory cytokines in the CNS of mice of different strains and reverse transcription method followed by quantitative polymerase chain reaction in real time (RT-qPCR) to investigate the relationship between infection by EHV-1 and inflammatory response in the development of lesions. Brazilian strains A4/72 and A9/92 EHV-1 caused acute lethal infection in different strains of inbred mice. Clinical and neurological signs such as weight loss, the bristly hair, hunched posture, apathy, dyspnoea, dehydration and salivary hypersecretion appeared between 2nd and 3rd day after infection (dpi). These events were accompanied by increase in the sensitivity to external stimuli, convulsions, recumbency and death. Histopathological changes were neuronal necrosis, edema, liquefaction necrosis, neutrophilic leptomeningitis, perivascular cuff, focal hemorrhage, non-suppurative inflammation, multifocal gliosis and perivascular infiltration of polymorphonuclear and mononuclear cells. The characteristics and the extent of the injuries varied between strains of mice. Animals inoculated with the A4/72 strain showed histopathological lesions of greater severity when compared with those inoculated with the A9/92 strain. There was an increase in plasma concentrations of TNF-α, IL-6, CCL2 and IFN-γ in mice infected by EHV-1 in 2nd dpi. Plasma concentrations and the expression of mRNA for TNF-α, IL-6 and CCL2 in the CNS of mice infected with EHV-1 at 3rd dpi were increased; however, there was no increase in plasma concentration or expression for the mRNA of IFN-γ at 3rd dpi. It was evident that the EHV-1 strain A4/72 induces a more effective systemic immune response, whereas the A9/92 virus culminates in a more effective immune response in the CNS. The C57BL/6 and BALB/c mice showed higher levels of mRNA expression for TNF-α, IL-6 and CCL2, compared to C3H/HeJ mice. The severity of clinical signs observed in infected mice can be correlated with the peak of these proinflammatory cytokines (TNF-α and IL-6) and CCL2 chemokine, which are then produced after viral infection by resident glial cells and/or infiltrative cells in the CNS. These findings indicate that different strains of inbred mice are susceptible to infection neuropathogenic EHV-1 strains; the differences in the pattern of pathological changes show that they depend on the infected host, the EHV-1 strain and the immune response; and the suppression of interferon (IFN) type I suggested to be an escape mechanism for the EHV-1 against the immune system. The low expression of IL-6, TNF-α and chemokine CCL2 in C3H/HeJ mice can be explained by a mutation in toll-like receptor 4 (TLR-4) gene existing in this mouse strain. Additionally, C3H/HeJ mice exhibited more severe histopathological lesions in the CNS as compared to BALB/c and C57BL/6. It is suggested that type I IFN and TLR-4 gene have important role in the pathogenesis of EHV-1 and viral agent proteins responsible for the suppression of IFN and the viral particles that are recognized by TLR-4 can be targets for the development of new approaches for the treatment of viral disease and the efficiency of immunogens

Submitted by Ana Maria Fiscina Sampaio (fiscina@bahia.fiocruz.br) on 2013-10-16T19:49:06Z No. of bitstreams: 1 Monica Cardozo Rebouças. Resposta a quimioterapia...2012.pdf: 2111449 bytes, checksum: c4c3f7eeb987c9afdfca54d06568dd45 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-10-16T19:49:06Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Monica Cardozo Rebouças. Resposta a quimioterapia...2012.pdf: 2111449 bytes, checksum: c4c3f7eeb987c9afdfca54d06568dd45 (MD5) Previous issue date: 2012 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisas Gonçalo Moniz. Salvador, BA, Brasil / Populações que residem em áreas endêmicas da doença de Chagas são submetidas a múltiplas infecções pelo Trypanosoma cruzi e podem estar infectadas com cepas ou clones com diferentes graus de virulência e susceptibilidade à quimioterapia. Este é um fator importante para o desenvolvimento e morbidade da doença. As cepas de Trypanosoma cruzi representam complexas populações multiclonais, homogêneas ou heterogêneas, com predominância de um clone principal. São biologicamente classificados em Biodemas (Tipos I, II e III) que apresentam diferentes graus de resistência à quimioterapia. Cepas do Tipo I são muito suscetíveis ao tratamento; cepas do Tipo II possuem uma média susceptibilidade (cepa 21SF); cepas de Tipo III são muito resistentes (cepa Colombiana). No presente estudo, é avaliado o resultado do tratamento de camundongos triplamente infectados com clones da cepa 21SF, em comparação com os infectados com a cepa parental. 50 camundongos foram infectados com a cepa 21SF (infecção única). O inóculo foi de 5 x 104 formas tripomastigotas sanguícolas. 80 camundongos foram infectados, sucessivamente, com 3 clones da cepa 21SF (C6, C7 e C8), inóculo: 1x104 formas tripomastigotas (infecção tripla). A infecção simples com cada clone também foi feita. Os camundongos de ambos os grupos foram divididos em dois subgrupos: tratados com Benzonidazol – BZ (100 mg/kg/dia - 60 doses) e controles não tratados. Após 60 dias do final do tratamento, os camundongos sobreviventes foram eutanasiados, por exsanguinação, pós-anestesia; o sangue foi coletado para o exame sorológico de imunofluorescência indireta; testes de cura foram realizados (parasitemia, xenodiagnósticos, hemocultura) e seções do coração e músculo esquelético foram coletadas, fixadas e processadas para o estudo histopatológico em cortes corados com Hematoxilina & Eosina. A PCR foi também usada como uma técnica diagnóstica complementar. Os testes parasitológicos mostraram uma positividade variando de 54,4% nos camundongos infectados com a cepa parental e tratados; 33,4 a 66,7% nos animais com infecção única pelos diversos clones e tratados e 26,7% nos camundongos com infecção tríplice, tratados. Os títulos sorológicos (TIFI) variaram de 1:20 a 1:280 nos infectados com cepa parental tratados com BZ e de 1:640 a 1:1280 para controles não tratados. Os títulos sorológicos na infecção única com cada clone variaram de 1:10 a 1:1280 em camundongos tratados e de 1:160 a 1:1280 nos controles não tratados. A PCR revelou positividade em todos os animais infectados, tratados. O resultado final foi obtido pela combinação dos testes parasitológicos com os títulos sorológicos revelando positividade de 6,6% nos camundongos infectados com a cepa parental e tratados; 0 a 18,2% nos animais com infecção única pelos diversos clones e tratados e 12% nos camundongos com infecção tríplice, tratados. Estudo histopatológico: Os camundongos infectados com a cepa parental apresentaram lesões que variavam de leves a moderadas, na maioria dos casos, predominante no miocárdio (animais tratados e controles não tratados) camundongos submetidos à infecção única por cada clone apresentaram lesões semelhantes aos demonstrados pela infecção com cepa parental. Os camundongos com infecção tripla apresentaram uma exacerbação de lesões, evoluindo para a miocardite crônica. Nestes casos, havia intensas lesões no músculo esquelético; animais tratados apresentaram uma nítida redução das lesões no miocárdio e no músculo esquelético. Os resultados da quimioterapia com Benzonidazol em animais triplamente infectados, considerando os testes parasitológicos e sorológicos, revelaram baixos índices de cura e agravamento das lesões tissulares nos camundongos submetidos a múltiplas infecções com clones obtidos da cepa 21SF. / People living in endemic areas of Chagas disease are submitted to multiple infections during their lives and could be infected with strains or clones with different virulence and susceptibility to chemotherapy. This is an important factor in the development and morbidity of the disease. Strains of Trypanosoma cruzi represent complex multiclonal populations, which can be homogeneous or heterogenous with predominance of a principal clone. The strains are biologically classified in different Biodemes (Types I, II and III) which disclose different degrees of resistance to chemotherapy. Type I strains are very susceptible to treatment; Type II strains disclose medium susceptibility (21SF strain); strains of Type III are very resistant (Colombian strain). The clones isolated from different strains can also present different degrees of resistance. In the present study the results of treatment of mice triple infected with clones of the 21SF strain is evaluated, in comparison with the infected with the parental strain. For the present study, 50 Swiss mice were infected with the 21SF strain (single infection).The inoculum was of 5 x 104 blood trypomastigotes. 80 mice were infected successively with 3 clones of the 21SF strain (C6, C7 and C8) inoculum: 1x104 trypomastigotes (triple infection). Single infection with each Clone was also done. The mice of both groups were divided into 2 sub-groups: treated with Benzonidazol –BZ (100mg/kg/day – 60 doses) and untreated controls. After 60 days of the end of treatment, surviving mice were killed by exsanguinations after anesthesia; the blood was collected for indirect immunofluorescence serological test; cure tests were performed (parasitemia, xenodiagnosis, haemoculture) and sections of the heart and skeletal muscle were collected, fixed and then processed for the histopathological study in sections stained with Hematoxilin end Eosin. PCR reaction was also performed in blood samples as a complementary diagnostic technique. Parasitological tests have shown positive results that varied from 54.4% for the group of mice infected with the parental strain and treated with BZ; 33.4 to 66.7% for the mice with single infection, with each clone, treated with BZ, and 26.7% with triple infection with the three clones, treated with BZ. Serology titers (IIFT) varied from 1:20 a 1:280 for the mice infected with parental strain treated with BZ and from 1:640 to 1:1280 for untreated controls. Serology titers in the single infection with each clone varied from 1:10 to 1:1280 in treated mice and from 1:160 to 1:1280 in the untreated controls. PCR reaction was positive in all the infected mice, treated. Parasitological tests combined with the sorological titers have shown a positivity of 6.6% for the mice infected with the parental strain and treated with BZ; 0 to 18.2% for the mice with single infection with each clone and treated an 12% for the mice with triple infection and treated with BZ. Histopathological examination revealed in mice infected with the parental strain, mild to moderate inflammatory lesions. Mice submitted to single infection with clones of the 21SF strain presented similar lesions to those determined by infection with parental strain. Mice with triple infection present an intensification of lesions, and evolution to a chronic myocarditis and intense lesions in skeletal muscle; Treated animals presented clear reduction of lesions in myocardium and in skeletal muscle. Results of chemotherapy with BZ in mice with triple infection with clones of the 21 SF T. cruzi strain, considering the results of parasitological and serological tests, revealed low cure rates and aggravation of tissue lesions in those animals submitted to triple infections with clones of the parental strain.

Changes in lifestyle of people has been dynamically observed in recent decades, emphasis is given to dietary issues. In this case, as directly responsible for chronic diseases, along with other aspects of lifestyle such as inactivity, smoking, quality of life. In the context of chronic diseases of high incidence and prevalence, the metabolic syndrome has gained prominence in clinical and experimental research in the search for early diagnostic methods for its various components such as the vascular, biochemical and liver, all also associated with diet. In this context, there was the inclusion of non-alcoholic fatty liver disease as liver component of the metabolic syndrome, which is the central object of this work. Objective: To evaluate the profile morphological, functional and redox balance in the liver of a novel induced-diet mice model for metabolic syndrome. Methods: Eleven isogenic male C57BL/6J mice were randomly divided into control (CT) and hypercaloric (HC) groups and fed with chow and hypercaloric diet, respectively, for 26 weeks. We did ratings serum markers of liver function (ALT, AST, ALP, γ-GT, LDH, albumin and total protein), analysis of local redox status (SOD, CAT and lipid peroxidation) and histological study of tissue. Results: There were significant elevations of the statistical point of view in the main markers of liver function in HC animals. This increase was approximately 1.5 times for ALT, 2.5 for AST and 7.4 for ALP. The activity of γ-GT followed the pattern of significant increase in the HC group, despite its low activity. There re no differences in the concentrations of albumin and total protein. On the local redox state, the activity of SOD was not different between groups, the catalase activity was significantly decreased in HC group and there re high levels of peroxidation in this same group. The histological findings corroborate these results, which corresponds to advanced liver disease in animals HC (default cirrhotic). Conclusion: The hepatic component in the novel induced-diet mice model for metabolic syndrome shows changes in your profile functional, redox balance and morphological. Keywords: Metabolic Syndrome, Liver Functions, Redox Balance, Novel Diet-induced Mice Model. / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / As alterações no estilo de vida das pessoas vem sendo dinamicamente observadas nas últimas décadas; destaque especial é dado aos aspectos dietéticos. Neste caso, como responsável direto por doenças crônicas, juntamente com outros aspectos do estilo de vida como sedentarismo, tabagismo, qualidade de vida. No contexto das doenças crônicas de elevada incidência e prevalência, a síndrome metabólica vem ganhando destaque nas pesquisas experimentais e clínicas na busca de métodos diagnósticos precoces para seus vários componentes a exemplo dos vasculares, bioquímicos e hepáticos, todos com associação também dietética. Neste contexto, destaca-se a inserção das doenças hepáticas gordurosas não alcoólicas como componente hepático da síndrome, sendo este o objeto central do presente trabalho. Objetivo: Avaliar o perfil morfológico, funcional e o balanço redox do fígado de um novo modelo murino dietético para síndrome metabólica. Métodos: Onze camundongos isogênicos machos C57BL/6J foram randomicamente divididos nos grupos Controle (CT) e Hipercalórico (HC) e alimentados com dieta chow e hipercalórica, respectivamente, durante 26 semanas. Foram procedidas avaliações plasmáticas de marcadores de função hepática (ALT, AST, ALP, γ-GT, LDH, albumina e proteínas totais), análise do estado redox local (SOD, CAT e peroxidação lipídica) e estudo histológico do tecido. Resultados: Foram encontradas elevações significativas do ponto de vista estatístico nos principais marcadores de função hepática nos animais HC. Esse aumento foi de aproximadamente 1,5 vezes para ALT, 2,5 para AST e de 7,4 para ALP. A atividade de γ-GT seguiu o padrão observado de elevação significativa no grupo HC, apesar de sua baixa atividade. Não foram observadas diferenças nas concentrações de albumina e proteínas totais. Relativo ao estado redox local, a atividade de SOD não foi diferente entre os grupos, a de catalase foi significativamente diminuída nos HC e os níveis de peroxidação elevados. Os achados histológicos corroboram esses resultados, sendo corresponde a doença hepática avançada nos animais HC (padrão cirrótico). Conclusão: O componente hepático no novo modelo murino dietético para síndrome metabólica estudado apresenta alterações em seu perfil morfológico, funcional e no balanço redox.

Os efeitos da administração de anfotericina B a camundongos suscetíveis ao P. brasiliensis foram avaliados. A L-AmB reverte o padrão de suscetibilidade para o de resistência de forma mais eficiente do que a c-AmB, como observado na quantificação de UFC, NO e IgG2b. Porém, os níveis de TNF-a, IL-12, IFN-g, GM-CSF, IgG total, IgM, IgG1, IgG2a e IgA não são significativamente alterados. Neutrófilos e macrófagos peritoneais co-cultivados com Pb e L-AmB tendem a apresentar maior capacidade fungicida, mas não maior síntese de mediadores. O melhor desempenho de L-AmB poderia se dever a sua interação com TLR4. Em TLR4-deficientes ou não, a progressão da doença é similar. A eficácia da terapia, porém, é menor nos deficientes, como observado na quantificação de UFC; os perfis leucocitários e as concentrações de NO, TNF-a, IL-12 e GM-CSF não são significativamente alterados. Logo, a droga é capaz de reverter os parâmetros micológicos, mas não os imunológicos. A interação entre TLR4, P. brasiliensis e L-AmB não parece ser importante para o estabelecimento da imunidade. / Amphotericin B effects in mice susceptible to P. brasiliensis were evaluated. L-AmB reverts the susceptibility pattern to the resistant one with more efficiency than c-AmB, as confirmed by the CFU, NO e IgG2b quantifications. However, TNF-a, IL-12, IFN-g, GM-CSF, total IgG, IgM, IgG1, IgG2a and IgA levels are not significantly altered. Neutrophils and macrophages cocultivated with Pb e L-AmB tend to present higher fungicidal ability, but not enhanced synthesis of mediators. The better performance of L-AmB could be due to its interaction with TLR4. In TLR4-deficient or sufficient mice, progression of the disease is similar. The efficiency of the therapy, however, is lower in deficient animals, as seen on CFU; leukocyte profiles and NO, TNF-a, IL-12 and GM-CSF levels are not significantly altered by L-AmB-TLR4 interaction. Therefore, the drug administration is capable of reverting mycological parameters, but not the immunological ones. Interaction between TLR4, P. brasiliensis and L-AmB does not seem to play a special role in the establishment of immunity.

A bovinocultura brasileira possui grande ênfase no mercado nacional. Doenças que acometem rebanhos comprometem o mercado além de gerarem grandes prejuízos econômicos. O Clostridium novyi tipo B provoca necrose hepática em bovinos através da produção da alfa toxina, uma potente exotoxina que reduz a produtividade através de alterações como hemoglobinúria, redução do apetite, febre, letargia, diminuição da produção de leite e sangue nas fezes. Conter o microrganismo causador torna-se uma busca necessária tanto do ponto de vista econômico quanto social. Entretanto, o controle da doença ainda é realizado por vacinas formuladas com múltiplos antígenos. A emulsão pode ser uma alternativa promissora para a melhoria da adsorção de antígenos nas formulações vacinais. Camundongos da linhagem Swiss foram utilizados a fim de se avaliar aspectos clínicos e validar resultados referentes a composição de uma nova formulação vacinal contendo adjuvante Montanide ISA 61 VG e antígeno inativado de C. novyi. Os testes de caracterização e antigenicidade indicaram a presença da proteína alfa toxina na composição avaliada. A imunogenicidade do antígeno inativado em emulsão W/O (água/óleo) foi verificada e a proporção empregada (40/60) mostrou ser ideal no uso de múltiplos antígenos, apresentando inocuidade, estabilidade do produto, liberação controlada e estímulo da resposta imune. A determinação da concentração de antígeno foi averiguada pela relação antígeno ativo e inativado com soros de animais doentes, visto a eficácia vacinal de 40%. A adequação da concentração de alfa toxina inativada na emulsão mostrou ser necessária para atingir melhores valores de proteção animal. Análises de hemograma, bioquímicas e morfologia de fígado, baço e coxa contribuíram para elucidar os efeitos da emulsão e comprovar necrose hepática nos grupos não imunizados, além de sugerir avanços na adsorção de vacinas. Os resultados possibilitaram o estabelecimento de um modelo murino de infecção de C. novyi com futuras aplicações relacionadas à produção vacinal com múltiplos antígenos emulsificados para controle das clostridioses. / Brazilian cattle breeding has great emphasis on the national market. Diseases that affect herds compromise the market as well as generate great economic losses. Clostridium novyi type B causes hepatic necrosis in cattle through the production of alpha toxin, a potent exotoxin that reduces productivity through changes such as hemoglobinuria, reduced appetite, fever, lethargy, decreased milk and stool production. Containing the causative micro-organism becomes a necessary quest both economically and socially. However, control of the disease is still performed by vaccines formulated with multiple antigens. The emulsion may be a promising alternative for the improvement of antigen adsorption in vaccine formulations. Swiss strain mice were used to evaluate clinical aspects and validate results regarding the composition of a new vaccine formulation containing Montanide ISA 61 VG adjuvant and C. novyi inactivated antigen. Characterization and antigenicity tests indicated the presence of the alpha toxin protein in the evaluated composition. The immunogenicity of antigen inactivated in W / O emulsion (water / oil) was verified and the ratio employed (40/60) showed to be ideal in the use of multiple antigens, presenting innocuousness, product stability, controlled release and stimulation of the immune response. The determination of the antigen concentration was investigated by the active antigen ratio and inactivated with sera from sick animals, since the vaccine efficacy was 40%. The suitability of the inactivated alpha toxin concentration in the emulsion was shown to be necessary to achieve better animal protection values. Hemogram, biochemical and liver, spleen and thigh morphology contributed to elucidate the effects of the emulsion and to verify hepatic necrosis in the nonimmunized groups, in addition to suggesting advances in the adsorption of vaccines. The results allowed the establishment of a murine model of C. novyi infection with future applications related to the vaccine production with multiple emulsified antigens to control clostridia.

Submitted by Edisangela Bastos (edisangela@ufpa.br) on 2014-01-23T20:26:23Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 23898 bytes, checksum: e363e809996cf46ada20da1accfcd9c7 (MD5) Tese_InfluenciasIdadeAmbiente.pdf: 35646132 bytes, checksum: 0e58f050b3a569f8927352c599ce214d (MD5) / Approved for entry into archive by Ana Rosa Silva(arosa@ufpa.br) on 2014-01-24T14:19:56Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 23898 bytes, checksum: e363e809996cf46ada20da1accfcd9c7 (MD5) Tese_InfluenciasIdadeAmbiente.pdf: 35646132 bytes, checksum: 0e58f050b3a569f8927352c599ce214d (MD5) / Made available in DSpace on 2014-01-24T14:19:56Z (GMT). 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Além disso, como os animais velhos apresentam menor declínio funcional em células T de imunidade adaptativa, testamos a hipótese de que camundongos AE velhos ao serem infectados pelo vírus da dengue apresentariam maior taxa de mortalidade do que animais AP pareados por idade, e isso estaria associado à maior hiperplasia dos linfócitos T. Para testar essas hipóteses implantamos regime de inoculações múltiplas em animais adultos de 9 e 18 meses de idade. Dois regimes de inoculação foram testados: inoculações múltiplas de homogeneizado cerebral infectado por um único sorotipo (IUS) ou inoculações alternadas daquele homogeneizado e de anticorpo heterólogo (ICAH). Em ambos os casos foram feitas inoculações múltiplas intraperitoneais encontrando-se diferenças significativas no curso temporal da doença nos animais submetidos a um ou outro regime de inoculação. Comparado ao grupo ICAH para o qual detectou-se diferenças significativas entre os grupos AE e AP (Kaplan-Meyer log-rank test, p = 0,0025), não foram detectadas diferenças significativas entre os grupos experimentais AP e AE submetidos ao regime IUS (Kaplan-Meyer log-rank test, p = 0,089). As curvas de sobrevivência dos grupos AE e AP sob o regime ICAH foram estendidas após a injeção de glicocorticoides reduzindo-se os sintomas e o número de mortes e esse efeito foi maior no grupo AE do que no AP (Kaplan-Meyer log-rank test, p = 0,0162). No regime ICAH, o grupo AE mostrou sinais clínicos mais intensos do que o AP e isso incluiu dispneia, tremor, postura encurvada, imobilidade, paralisia pré-terminal, choque e eventual morte. Comparado ao grupo AP, o grupo AE independentemente da idade apresentou maior mortalidade e sinais clínicos mais intensos. Esses sinais clínicos mais intensos nos animais do ambiente enriquecido submetidos ao regime ICAH foram associados à maior hiperplasia de linfócitos T no baço e maior infiltração dessas células no fígado, pulmões e rins. Embora a hiperplasia linfocítica e a infiltração tenham se mostrado mais intensas nos animais velhos do que nos jovens, a imunomarcação para os antígenos virais nos mesmos órgãos foi maior nos jovens do que nos velhos. A presença do vírus nos diferentes órgãos alvo foi confirmada por PCR em tempo real. Tomados em conjunto os resultados sugerem que o ambiente enriquecido exacerba a resposta inflamatória subsequente à infecção por dengue acentuada por anticorpo heterólogo, e isso está associado à sintomas clínicos mais intensos, maior taxa de mortalidade e ao aumento da expansão de células T. Os ensaios comportamentais e histopatológicos do presente trabalho permitiram testar e validar novo modelo murino imunocompetente para estudos em dengue permitindo testar numerosas hipóteses oriundas de estudos epidemiológicos e in vitro. / Because the enriched environment (EE) increases the activity of T cells, contribute to the immunopathogenesis of dengue virus infections (VDEN) we hypothesized that animals maintained in an enriched environment (AE) compared with animals from impoverished environment of standard laboratory cages (IE), would develop more severe forms of the disease. Because older animals have less functional decline in adaptive immunity T cells, we tested the hypothesis that AE old mice would show higher number of deaths and more intense clinical signs than age-matched IE animals, and this would be associated with greater expansion of T lymphocytes. To test these hypotheses we established scheme of multiple inoculations in adult animals of 9 and 18 months of age. Two regimens of inoculation were tested: multiple injections of single serotype (VDEN3 genotype III) infected brain homogenate (SS) or alternatively multiple injections with that infected brain homogenate followed 24h later by inoculation of heterologous antibody (SSHA). In both cases multiple i.p. inoculations were done. It was found significant differences in the temporal progression of the disease in the animals submitted to one or another scheme of inoculation: SSHA group (Kaplan -Meier log-rank test, p = 0.0025); IUS (Kaplan -Meier log-rank test, p = 0.089). The survival curves of AE and AP under SSHA regime were extended after a single injection of glucocorticoids, reducing the symptoms and the number of deaths, and these effects were greater in the EE group than in the IE (Kaplan-Meier log-rank test, p = 0.0162). In SSHA scheme, EE group showed clinical signs more intense than the AP and those included dyspnea, tremor, hunched posture, immobility, pre-terminal paralysis, shock and eventual death. Compared to the IE group, the AE group regardless of age showed higher mortality and more severe clinical signs. These more severe clinical signs in EE animals under SSHA regime were associated with increased hyperplasia of T lymphocytes in the spleen and increased infiltration of these cells in the liver, lungs and kidneys. Although lymphocytic hyperplasia and infiltration have been more intense in older than in younger animals, immunostaining for viral antigens in target organs was higher in young than in the aged mice. The presence of the virus in various infected organs were confirmed by real time PCR. Taken together the results suggest that the enriched environment life style exacerbates the subsequent inflammatory response to infection, and that is associated with more severe clinical symptoms, higher mortality and increased T cell expansion. Behavioral and histopathological data validate a new immunocompetent murine model for studies on dengue disease allowing in vivo tests of a number of hypothesis raised by epidemiological and in vitro studies.

Physical exercise has been implicated in several immunophysiological improvements especially during the aging process when an immunocompromised status could be established. Toxoplasma gondii is a protozoan parasite that causes a widespread opportunistic infection, which may present severe consequences, particularly to the fetus and immunocompromised patients. It is estimated that one-third of the human population worldwide has been infected by this parasite, being the reactivation during immunesenescence an unexplored public health issue. The present study was designed to assess the immunophysiological differences between exercised versus sedentary C57BL/6 male mice that have been infected by T. gondii. Before the two key set of experiments, several other sets were carried out to the prospection of the main found data of this study. There were two main sets of experiments: in the first set, the animals were infected after exercising and three groups were formed: experimental groups - infected sedentary (IS, n=6); infected exercised (IEx, n=6) and control group - non-infected sedentary (NIS, n=6). When splenocytes were stimulated by T. gondii-soluble tachyzoite antigens, it was found an significant increasing (P<0.0001) in interferon-gamma (IFN-&#61543;) production concomitant with any changes in IL-10, allowing a greater IFN-&#61543;/IL-10 ratios, produced by the cells from exercised group compared to sedentary one. However, there was no difference concerning quantification of T. gondii genomic DNA by qPCR and immunohistochemistry analysis in brain cysts (P>0.05). In order to further investigate the consequences of these data for the host, a second set of experiments was performed, when the animals were infected before exercising and four groups of animals were established for comparison purpose, as follows: experimental groups - infected sedentary (IS, n=7); infected exercised (IEx, n=6) and control groups - non-infected sedentary (NIS, n=6) and non-infected exercised (NIEx, n=6). It was found that exercised group survived longer (P<0.05) than sedentary one. In both sets of experiments, mice have been submitted to moderate exercises: running (14m/min; 3x/week) and strength (60-80% of one-repetition maximum; 2x/week). In summary, moderated aerobic and strength exercises are able to modulate immune responses against T. gondii infection, being these immunological features beneficial to the host. / A prática regular de exercício físico tem sido relacionado com melhoras imunopatológicas, especialmente durante o processo de envelhecimento quando pode haver um estado de imunocomprometimento. O Toxoplasma gondii é um parasito protozoário que causa infecção oportunista de forma global, podendo apresentar consequências severas, particularmente ao feto e pacientes imunocomprometimentos. É estimado que um terço da população mundial esteja atualmente infectado por este parasito, sendo a reativação durante a imunossenescência um tópico em saúde pública não explorado. O presente estudo foi projetado para avaliar parâmetros de diferenças imunológicas entre camundongos machos C57BL/6 exercitados e sedentários que tenham sido infectados por T. gondii. Antes dos experimentos chaves vários outros conjuntos de experimentos foram realizados para prospecção dos principais achados desta tese. Houve dois conjuntos de experimentos principais: no primeiro conjunto de experimentos, os animais foram infectados após o início dos exercícios formando-se três grupos: um grupo controle - sedentário não infectado (NIS, IS, n=4); dois grupos infectados - um sedentário (IS, n=4) e um exercitado (IEx, n=6). Quando esplenócitos foram estimuladas com antígeno de taquizoíto solúvel de T gondii (STAg), encontrou-se uma maior produção de IFN-&#61543;, concomitante à uma manutenção das taxas de IL-10, que permitiu uma maior razão de IFN-&#61543;/IL10 (P<0,0001) para o grupo exercitado comparado com o sedentário. No entanto, não houve diferenças no que diz repeito a quantificação de DNA genômico de T. gondii pelas análises de qPCR e imunohistoquímica de cistos cerebrais (P>0,05). Com objetivo de se pesquisar posteriormente as consequências destes dados para o hospedeiro, um segundo conjunto de experimentos foram realizados, quando os animais foram infectados antes do início dos exercícios, e quatro grupos foram estabelecidos para comparação deste propósito, como se segue: dois grupos controles não infectados - sedentário (NIS, n=6) e exercitado (NIEx, n=6), e dois grupos infectados - sedentário (IS, n=7) e exercitado (IEx, n=6). Encontrou-se que o grupo infectado exercitado teve sua longevidade aumentada (P<0,05) comparado com o infectado sedentário. Em ambos os conjuntos de experimentos, os camundongos foram submetidos à exercícios moderados: de corrida (14 m/min; 3 x/semana) e resistido (60-80% de uma repetição máxima; 2x/semana). Em síntese, exercícios físicos aeróbicos e resistidos moderados são capazes de modular a resposta do sistema imune no combate da infecção por T. gondii sendo estas características imunológicas benéficas para o hospedeiro. / Doutor em Imunologia e Parasitologia Aplicadas